TÉCNICAS

BIOQUÍMICAS:

FERNANDA FUENTEALBA FACULTAD DE MEDICINA

VALENTINA FUENTES ESCUELA DE MEDICINA
MACARENA LOBO BIOQUÍMICA
CARLA MORA DOCENTES: Dr. REGINALDO DEL POZO
ROMINA PULVERMÜLLER BQ. MIRNA MUÑOZ
JONATHAN RIQUELME MIÉRCOLES 30 DE JUNIO DE 2010
• Método usado principalmente para la
separación de los componentes de una
muestra, en el cual los componentes son
distribuidos entre dos fases:
Estacionaria
Móvil

• Las retenciones pueden tener su origen en

dos fenómenos de interacción entre las dos
fases:
Adsorción
Absorción
• Funciones:
Separar los componentes de la
mezcla.
Medir las proporciones de los
componentes.

• Tipos:
Cromatografía plana
Cromatografía en columna
Método de separación que permite la separación de
moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica.

• Fase Estacionaria: Insoluble, lleva en la superficie cargas

electrostáticas fijas que retienen contraiones móviles que
pueden intercambiarse por iones de la fase móvil.

• Fase Móvil: Disolución acuosa con cantidades

moderadas de metanol u otro disolvente orgánico
miscible con agua que contiene especies iónicas en
forma, generalmente de buffer. Los iones de la fase móvil
compiten con los analitos por los sitios activos de la fase
estacionaria.
Principio: las moléculas cargadas se adhieren a los
intercambiadores de forma reversible de modo que dichas
moléculas pueden ser unidas o desunidas cambiando el
ambiente iónico.

La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza

por lo general, en dos fases:

1. Las sustancias a separar se unen al intercambiador

utilizando condiciones que originan una unión fuerte y
estable.

2. Se eluye de la columna con tampones de diferentes pH o

diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes
del tampón con el material, por los sitios de unión.
Intercambiador Iónico: Polímero que tiene grupos
cargados unidos.

Intercambiador Catiónico: Si un grupo está cargado

negativamente, podrá intercambiar iones positivos.

Un grupo típico que se utiliza en los

intercambiadores de cationes es el grupo sulfónico,
SO3-. El grupo ácido sulfónico es un intercambiador
de cationes fuertemente acido. Otros grupos de
utilización corriente son el carbonilo e hidroxilo
fenólico, dos intercambiadores catiónicos débilmente
ácidos.
Intercambiador Aniónico: Si el
grupo cargado es positivo, es un
intercambiador de aniones. Los
intercambiadores aniónicos
débilmente básicos más
corrientes son grupos aminos
alifáticos o aromáticos.
(1) Columna de vidrio
(2) Matriz de intercambio
iónico (Resina)
(3) Eluyente
(4) Muestra a fraccionar
(5) Colectores.
Equilibrio: Toda la fase estacionaria se encuentra asociada a iones
complementarios (que pueden ser cloro o sodio).

Aplicación y Lavado: Aplicar la muestra la cual queremos filtrar a

través de la columna mediante un lavado específico. Se aplica un
buffer con el mismo pH y fuerza iónica que el buffer inicial para que
todas las proteínas cargadas se unan al intercambiador.

Elusión: Las moléculas captadas por el intercambiador son eluídas

debido a cambios en la composición del buffer.

Regeneración: Remover las partículas que aún están asociadas al

intercambiador. Se debe generar un cambio más drástico en el pH y la
concentración salina. La fase estacionaria puede volver a ser utilizada.
 • ADSORCIÓN • DESORCIÓN
-La fuerza de adsorción aumenta -Reducir la carga neta cambiando el pH
con el aumento de carga neta. -Agregar un ión que compita por las
cargas del intercambiador.
(A) (B) (C) (D) (E)

(A) Resina de intercambio catiónico antes de añadir la muestra.

(B) Se añade la muestra, una mezcla de Asp, Ser y Lys.
(C) Se añade Na+ (NaCl), el Asp, el aminoácido con menos carga
positiva eluye el primero.
(D) Se aumenta el Na+, a continuación eluye la Ser.
(E) Se aumenta el Na+, la Lys, el que posee más carga positiva eluye
el último.
Ventajas:
Alta capacidad
Alta resolución
Paso concentrador: Se puede sembrar un gran volumen para
luego eluirlo en un menor volumen.
Con una misma columna se puede utilizar a diferentes pH y
obtener diversos perfiles de elución.

Desventajas:
Las muestras deben estar desalinizadas antes de ser aplicadas a
este tipo de cromatografía
• Tiempo que un compuesto tarda en salir de la columna.

• Se basa en la atracción entre iones del soluto y la carga

complementaria de la fase estacionaria. Los intercambiadores
iónicos favorecen la unión de iones de mayor carga y radio inferior.
Cuando la retención de los compuestos se ve afectada, se favorece
la elusión de ellos para ser recolectados en una serie de fracciones.
• Los intercambiadores iónicos se clasifican en
ácidos o básicos, fuertes o débiles.

• Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas

incluso en disoluciones muy ácidas, en cambio
las resinas ácidas débiles se protonan a un pH
próximo a 4 y pierden su capacidad de
intercambio catiónico, reduciéndose así, el
tiempo de retención.

• Los grupos muy básicos de amonio cuaternario

siguen siendo catiónicos a cualquier valor de
pH. Los básicos débiles de amonio terciario se
desprotonan en disoluciones moderadamente
básicas y pierden entonces su capacidad,
reduciéndose también el tiempo de retención.
• La fuerza de enlace de la muestra depende de la magnitud de la
carga. La fuerza de retención es mayor y, por consiguiente la de
elusión es menor, mientras más cargado se encuentre el
compuesto, ya sea negativa (aniones) o positivamente (cationes).
• Los iones polivalentes se
unen con mayor fuerza a la
fase estacionaria que los
monovalentes.
• Aumentando la
concentración de la
fase móvil, los iones
compiten cada vez
más favorablemente
con la muestra por los
sitios activos cargados
de la fase
estacionaria.
 poro pequeño (menor poro grande
de 600Å) (mayor de
600Å)

• En membranas cuyo tamaño de poro es pequeño no hay espacio

suficiente para unir el ión dentro de dichos poros por lo que la
cantidad de intercambiador por unidad de superficie es menor.

• En membranas con tamaño de poro mayor, se puede unir el

compuesto móvil dentro de dichos poros, con lo que se incrementa
la cantidad de intercambiador por unidad de superficie. La
porosidad busca una mayor superficie de intercambio.
• La conductividad de la fase móvil se
hace muy elevada debido a la alta
concentración iónica necesaria para eluir
a la mayoría de los iones; esto hace muy
difícil la detección de pequeñas
concentraciones de analito.

• Este problema se resolvió mediante un

sistema supresor de conductibilidad
colocado a la salida de la columna
cromatográfica.

• Los primeros supresores fueron

columnas de intercambio iónico que
convierten los iones del disolvente en
especies moleculares poco ionizadas y
por lo tanto poco conductoras.
• El cromatograma es el resultado
gráfico de la cromatografía. En el
caso de separación óptima, los
diferentes picos o manchas del
cromatograma se corresponden a
los componentes de la mezcla
separada.

• La posición de los máximos nos

indica el ión presente (carácter
Cualitativo) y su área nos indica la
cantidad existente de dicho ión
(carácter Cuantitativo).
•Una vez separada, la muestra pasa
a través del detector donde se
registra la señal obtenida respecto
al tiempo de retención.

• Registran los cromatogramas.

• Se emplean en la determinación
de fluoruros, cloruros, nitritos,
nitratos, bromuros fosfatos y
sulfatos.
• MEDICIÓN DE LA
HEMOGLOBINA
GLICOSILADA.

• DETERMINACIÓN DE
PBG Y ALA EN LA
ORINA.
• El porcentaje de proteína unida a la glucosa
es lo que se denomina hemoglobina
glicosilada (HbA1). Cuanto mayor es la
cantidad de glucosa en la sangre, más se une
a las proteínas y su porcentaje de unión
indica cual ha sido la cantidad media de
glucosa circulante durante el tiempo de vida
de la hemoglobina.

• Como los eritrocitos son fácilmente

permeables a la glucosa, el nivel de la HbA1
en una muestra de sangre facilita la historia
glicémica de los 120 días anteriores, que
corresponde a la vida media de estas células.
HbA1c (%) Promedio de Calificación
Glicemias (mg/dl)
5-6 80-120 Excelente
6-7 120-150 Muy Bueno
7-8 150-180 Bueno
8-9 180-210 Regular
9-10 210-240 Problemático
10-11 240-270 Malo
11-12 270-300 Muy Malo
• El método de cromatografía de intercambio iónico se basa
en la elusión diferencial de la hemoglobina glicosilada por el
cambio de carga que se produce en la molécula debido a la
glicación del grupo amino terminal de la cadena. Para realizar
el procedimiento se utiliza carboximetil celulosa cargada (-).
• Porfirias: grupo de enfermedades de origen
genético o adquirido. Existe alteración en la
actividad de una o varias enzimas de la vía
metabólica del grupo HEM, lo que ocasiona
niveles anormalmente elevados de porfirinas
o sus precursores (ácido delta-aminolevulínico
[ALA] y porfobilinógeno [PBG]).

• Estos se acumulan en los tejidos y se

excretan en la orina y las heces. Las
manifestaciones patológicas son producidas
casi en su totalidad por los efectos sobre el
sistema nervioso y la piel.
• La Porfiria Intermitente Aguda (PAI) es un desorden
autosómico dominante, que causa deficiencia parcial de la
actividad de la porfobilinógeno desaminasa (PBGD), tercera
enzima de la ruta de síntesis del grupo HEM.

• Cuando los pacientes con PAI presentan una crisis aguda,

disminuye la actividad de la PBGD y, como consecuencia los
niveles de BPG y/o ALA en la orina se incrementan
significativamente.

• Durante la crisis aguda, el PBG urinario aumenta de 20 a 200

mg/día, cuyos valores de referencia son de 0-4 mg/día, y la
excreción de ALA se eleva aproximadamente a la mitad, 10-100
mg/día, cuando sus valores de referencia son 0-7mg/día.
• El método de Mauzerall-Granick es el más usados para la cuantificación
de estos dos precursores. Se basa en la técnica de cromatografía de
intercambio iónico, en la cual se utilizan columnas con resinas aniónicas y
catiónicas.

• El PBG se queda retenido en la aniónica y el ALA en la catiónica. En la

columna con PBG, se utiliza ácido acético 1M para que éste eluya y pueda
ser cuantificado. En la columna con ALA, se le agrega acetato de sodio 1M
para que éste eluya y sea cuantificado. Luego, el eluido de cada columna
reacciona con Reactivo de Ehrlich, formando un producto rojo intenso.
Este reactivo está conformado por 4-dimetilbenceno diluido en ácido
acético y ácido perclórico.

• El producto es medido espectrofotométricamente a 553 nm, y a partir de

esta medición se puede calcular la concentración de estos intermediarios.
•Extracción y purificación de ácidos nucleicos
•Purificación de agua
•Purificación del fibrinógeno de la leche
•Determinación de anticonvulsantes en el suero después
de la extracción de la fase sólida.
•Análisis de antibióticos de poliéter
•Determinación de pesticidas.
•Identificación de ácidos orgánicos en la fruta y en el jugo.
•Detección de derivación-fluorescencia post-columna para
análisis para varios tipos de pesticidas agrícolas .
•Determinación de metabolitos de Triptofan en el suero
umbilical.
•Extracción y purificación de ácidos nucleicos
•Purificación de agua
•Purificación del fibrinógeno de la leche
•Determinación de anticonvulsantes en el suero después
de la extracción de la fase sólida.
•Análisis de antibióticos de poliéter
•Determinación de pesticidas.
•Identificación de ácidos orgánicos en la fruta y en el jugo.
•Detección de derivación-fluorescencia post-columna para
análisis para varios tipos de pesticidas agrícolas .
•Determinación de metabolitos de Triptofan en el suero
umbilical.