PCR en tiempo Real (RT-PCR)

La PCR en tiempo real (o PCR cuantitativa) surgió para resolver el problema de la

cuantificación de la técnica de la PCR. En la PCR en tiempo real se emplean sondas
marcadas con fluorocromos. Las sondas de hidrólisis, frecuentemente empleadas en
esta técnica, son oligonucleótidos que presentan fluorocromos en ambos extremos y
tienen una secuencia complementaria a parte del fragmento de ADN que se quiere
amplificar. Uno de los fluorocromos actúa como donador de fluorescencia en el
extremo 5’ y el otro como aceptor de esta fluorescencia en el extremo 3’. La ADN
polimerasa se desplaza sobre la cadena de ADN sintetizando la cadena
complementaria a partir de un fragmento de ADN que sirve de molde (cebador). Al
llegar al punto en el que la sonda se ha hibridado, la hidroliza. El fluorocromo del
extremo 5’ de la sonda (el donador) es liberado. El fluorocromo aceptor no puede
entonces absorber la fluorescencia del donador por estar alejado de él
espacialmente. Un detector realiza la medida de esta emisión de fluorescencia, que
es proporcional a la cantidad de ADN presente, y la representa gráficamente.
Además de proporcionar información cuantitativa, la PCR en tiempo real presenta
otra serie de ventajas frente a la PCR tradicional. La fundamental es su mayor
sensibilidad lo que disminuye el riesgo de falsos negativos. El hecho de que los
datos sean tomados en la fase exponencial del proceso asegura que ningún
componente pueda estar limitando el proceso de amplificación. También es más
rápida y tiene menos probabilidad de contaminación con lo que disminuyen los falsos
positivos. Son muchas las aplicaciones de esta técnica en el campo de la medicina.
Cabe destacar la cuantificación viral, la cuantificación de la expresión de genes, el
control de la eficacia de fármacos, la detección de agentes infecciosos, el diagnóstico
de tumores y la detección de polimorfismos.

PCR Digital (dPCR)

La PCR digital (dPCR) es un perfeccionamiento de los métodos convencionales de
PCR que pueden ser utilizados para cuantificar directamente clonalmente y
amplificar los ácidos nucleicos (incluyendo ADN, ADNc, ADN metilado, o ARN). La
diferencia clave entre dPCR y PCR tradicional radica en el método de medición de
ácidos nucleicos, siendo el primero un método más preciso que el PCR. PCR lleva
a cabo una reacción por una sola muestra. dPCR también lleva a cabo una sola
reacción dentro de una muestra, sin embargo, la muestra se separa en un gran
número de particiones y la reacción se lleva a cabo en cada partición individual.
Esta separación permite una colección más fiable y sensible de medición de
cantidades de ácidos nucleicos. El método se ha demostrado tan útil para el
estudio de las variaciones en las secuencias de genes - como variantes de
número de copias, mutaciones puntuales, y que se utiliza habitualmente para la
amplificación clonal de las muestras de "secuenciación de próxima generación."

Diferencia entre PRC tiempo real y PCR punto final

A diferencia de la PCR de punto final (PCR convencional), la PCR en tiempo real
permite cuantificar el nivel de producto obtenido en cualquier momento de la
amplificación mediante la señal de fluorescencia (en realidad, mediante su nivel
sobre un umbral)

PCR convencional

Ventajas Desventajas

 Especificidad  Cuantificación difícil

 Sensibilidad  Tratamientos de post-PCR
(geles)

PCR a tiempo real

Combina amplificación por PCR y detección de fluorescencia, superando todas las

desventajas de la PCR convencional:

• Detección sensible y específica

• Cuantificación fácil y precisa

• Monitorización a tiempo real en ordenador

• No tratamiento post-PCR: detección en tubo

Bibliografìa

http://jornades.uab.cat/workshopmrama/sites/jornades.uab.cat.workshopmrama/files/Eppendorf
.pdf

http://digital-pcr.gene-quantification.info/

http://medmol.es/tecnicas/34/

http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-Q-PCR-Introduccion.pdf