Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

Facultad de Ciencias Químicas

Laboratorio de Bioquímica II
Equipo 3: Cortez Orozco Soledad Guadalupe.
Gómez De los Santos Berenice.
¿SE PUEDE DETERMINAR LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA SUCCINATO DESHIDROGENASA A PARTIR DE Santander Villegas David.
UNA REACCIÓN COLORIMÉTRICA?
INTRODUCCIÓN. RESULTADOS.
Las células de la gran mayoría de los organismos vivos llevan a cabo un conjunto de reacciones de óxido reducción mediante la cual la gran cantidad de energía liberada
a través de la degradación de moléculas orgánicas es almacenada en moléculas de alto nivel energético (ATP). La succinato deshidrogenasa es una enzima clasificada
dentro del grupo de las oxidorreductasas, cataliza una reacción muy importante en el metabolismo oxidativo de la célula: la oxidación del succinato en fumarato. Esta
enzima se localiza en eucariontes en la membrana mitocondrial interna.

CO N C E P T O S .
• ENZIMA. Proteína globular, cuya acción es el aumento de la velocidad de una reacción química mediante la disminución de la energía de activación, resultando ser
un catalizador biológico, son específicas, cada conversión de un reactivo a un producto es catalizada por una enzima determinada. La sustancia sobre la que actúa la
enzima se denomina sustrato uniéndose la enzima a este en el sitio activo que es una región rodeada de cadenas laterales de aminoácidos que facilitan la unión y
por otras cadenas laterales que intervienen en la catálisis.
• CLASIFICACIÓN GENERAL DE LAS ENZIMAS.

OB J E T IV O S D E L A P R Á C T IC A .

• Apreciar la actividad de la enzima Succinato Deshidrogenasa mediante una reacción colorimétrica.

• Relacionar la presencia de esta enzima con el ciclo de Krebs y el transporte de electrones. Figura 1. Tubo 1 con hígado de pollo y ácido Figura 2. Tubo 2 con hígado de pollo y ácido
succínico mezclado con fenol al 90 %, azul de succínico mezclado con azul de metileno y aceite
metileno y aceite mineral. mineral..
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: Es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que la medida de la actividad es MA T E R IA L . REACTIVOS.
dependiente de las condiciones. La regulación de la actividad enzimática adopta muchas formas: la regulación a nivel de sustrato depende simplemente de las • 2 tubos de ensaye. • Ácido succínico al 3 %
concentraciones de reactantes y productos en el medio, la regulación alostérica proporciona un control sensible por retroalimentación de las rutas metabólicas • 1 pipeta de 5 Ml. • Fenol al 90 %
complejas. • Baño María de 40-50 °C. • Azul de metileno al 0.1 %
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA • 1 pinza para tubo de ensaye. • Aceite mineral (para bebé).
• Concentración del sustrato. A mayor concentración del sustrato, a una concentración fija de la enzima se obtiene la velocidad máxima. Después de que se alcanza • Hígado de pollo.
esta velocidad, un aumento en la concentración del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reacción.
• Concentración de la enzima. Siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática hacia cierto DISCUSIÓN.
límite. En el mortero se lleva a cabo la primera reacción, debido a que tenemos el hígado de pollo muy bien triturado, al cual le agregamos ácido succínico. Esta
• Temperatura. Un incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción, hasta ciertos límites. El calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la consiste en la oxidación del ácido succínico en presencia de la succinato deshidrogenasa unida a su coenzima (FAD).
temperatura se eleva demasiada, la enzima pierde su actividad. PROCEDIMIENTO.
• pH. El pH óptimo de la actividad enzimática es 7, excepto las enzimas del estómago cuyo pH óptimo es ácido. En el tubo 1, al agregar el fenol, la enzima succinato deshidrogenasa fue desnaturalizada, por lo cual ésta no pudo llevar a cabo la reacción y por ende no se transfirieron
• Presencia de cofactores. Muchas enzimas dependen de los cofactores, sean activadores o coenzimas para funcionar adecuadamente. Para las enzimas que tienen los protones a FAD para que después fueran transferidos al azul de metileno y ser reducido. El azul de metileno se quedó en su estado oxidado (color azul observado).
cofactores, la concentración del cofactor debe ser igual o mayor que la concentración de la enzima para obtener una actividad catalítica máxima. Pesar 1 g. de hígado de En el mortero molerlo Determinando así que no hubo actividad de la enzima.
Transferir en partes
pollo, preferentemente, con 4 mL de ácido
iguales a 2 tubos y
REACCIONES OXIDO-REDUCCIÓN: son aquellas que implican la transferencia de electrones entre las sustancias que participan. La oxidación sucede cuando una especie recien sacrificado. succínico hasta obtener
proseguir según la tabla. En el tubo 2 se observó un cambio de coloración. En este caso, sin la presencia del fenol, al agregar el azul de metileno fue posible la transferencia de
pierde uno o más electrones e incrementa su estado de oxidación mientras que la reducción ocurre cuando una especie gana uno o más electrones, por lo tanto una masa.
electrones del FADH2 (producido en la reacción 1) al colorante REDOX, por esta razón se notó un cambio de coloración a incoloro, ya que el colorante
reduce su estado de oxidación.
fue reducido.
GRUPO PROSTÉTICO: Moléculas orgánicas con unión covalente a la enzima, estas ayudan a las enzimas a alcanzar su máxima actividad catalítica.
FLAVÍN ADENÍN DINUCLEÓTIDO (FAD): Este se deriva de la riboflavina o vitamina B2 la cual es una coenzima que interviene como dador o aceptor
de electrones y protones, en reacciones metabólicas redox; su estado oxidado (FAD) se reduce a FADH2 al aceptar dos átomos de hidrógeno. Las condiciones del experimento fue en anaerobiosis, utilizando el aceite mineral como barrera entre el medio ambiente y la reacción. De no haberse
METABOLISMO. Conjunto de todas las reacciones químicas que se llevan a cabo en los seres vivos. Actividad celular altamente coordinada con intencionalidad y hecho de esta forma, en nuestro tubo 2, el azul de metileno cambiaria de estado reducido a oxidado de manera prematura, por la presencia del oxígeno
Después de adicionar
orientación, en la que intervienen múltiples sistemas enzimáticos. Con la finalidad de obtener energía química. Degradar moléculas (catabolismo, fase exergónica) y como aceptor de protones, impidiendo la visualización de la actividad enzimática de la succinato deshidrogenasa.
los reactivos a los
ensamblar los componentes de los nutrientes en macromoléculas (anabolismo, fase endergónica). Observar los cambios. tubos incubar los tubos
10 min. en baño María
FU N D A M E N T O . a 40 - 50 °C.
CICLO DE KREBS CO N C L U S IO N E S .
Ruta central de oxidación de los hidratos de carbono, los lípidos y las proteínas. Un participante principal de esta cíclica es el piruvato producido en la glucólisis. Cada SE PUEDE DETERMINAR LA ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA MEDIANTE UNA REACCIÓN COLORIMÉTRICA
vuelta del ciclo del ácido cítrico comporta la entrada de dos carbonos en forma de grupo acetilo de la acetil – coenzima A y la pérdida de dos carbonos como 𝐶𝑂2 .
Durante el ciclo se generan transportadores electrónicos reducidos y su reoxidación en las mitocondrias aporta energía para la síntesis de ATP. . En eucariontes, las
SABIENDO QUE EL ACEPTOR DE PROTONES, EN ESTE CASO EL FAD LOS PUEDE TRANSFERIR AL AZUL DE METILENO; SE PUEDE
enzimas se encuentran en la matriz mitocondrial, excepto la succinato deshidrogenasa, que se localiza en la membrana mitocondrial interna. es una ruta anfibólica, es CORROBORAR CON LA TEORÍA QUE LA REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO SE LOGRA AÑADIENDO HIDRÓGENOS EN
decir, participa en procesos de degradación de compuestos, como carbohidratos, lípidos y cadenas carbonadas de aminoácidos y al mismo tiempo participa en FICHAS DE SEGURIDAD POSICIÓN TRANS, LOS CUALES FUERON CEDIDOS DESDE EL FADH2 QUEDANDO COMO PRODUCTOS FINALES FAD OXIDADO Y
procesos de síntesis de compuestos como glucosa, porfirinas, ácidos grasos, al ceder diferentes intermediarios del ciclo a las vías respectivas.
SUSTANCIA PROPIEDADES REACTIVOS CON QUE SE DEBE
AZUL DE METILENO REDUCIDO, POR TAL RAZÓN SE ADQUIRIÓ LA DECOLORACIÓN EN EL TUBO EN EL CUAL NO SE
La succinato deshidrogenasa, succinato-coenzima Q reductasa; succinato:quinona oxidorreductasa; EC 1.3.5.1, se trata de un complejo formado en mamíferos por 4 TENER ESPECIAL CUIDADO. DESNATURALIZÓ LA PROTEÍNA (TUBO 2).
subunidades proteicas, cataliza la deshidrogenación estereoespecífica de succinato a fumarato en el ciclo de Krebs, acoplándola con la reducción de la ubiquinona a
ubiquinol. Es una oxidoreductasa, el acoplamiento se realiza gracias a una cadena de oxidaciones en varios coenzimas redox incluidos en este complejo. Esta enzima es
la única del ciclo de Krebs unida a la membrana interna mitocondrial. Ácido succínico Tiene forma de cristales blancos, El polvo fino disperso en el aire
inodoro. Peso específico de 1.57 en concentraciones suficientes y
g/mol. Punto de fusión 188 °C y en presencia de fuente de
punto de ebullición 235 °C. ignición puede causar explosión. CU E S T IO N A R IO .
Es incompatible con óxidos y
bases. 1.- ¿Cuáles son los colores del azul de metileno en sus estados oxidado y reducido?
El azul de metileno presenta una coloración azul en su estado oxidado y es incoloro en su estado reducido.

2.- ¿Cuál es la función del fenol en la reacción?

Fenol Líquido incoloro de solubilidad Por calentamiento intenso se
El fenol es capaz de desnaturalizar a las proteínas alterando la estructura terciaria de cualquier enzima con la que entra en contacto. El pH óptimo de la enzima
moderada. Punto de fusión 182 producen humos tóxicos. La
La enzima (flavoproteína) contiene FAD unido covalentemente a un residuo de histidina, esta enzima es la única del ciclo de Krebs unida a la membrana interna succinato deshidrogenasa es de 7.3, el fenol provoca un descenso de pH hacia un medio ácido, provocando así la pérdida de su actividad.
°C y punto de fusión 43 °C. disolución en agua es un ácido
mitocondrial. La deshidrogenación del succinato produce FADH2, que debe reoxidarse antes de que la succinato deshidrogenasa pueda emprender otro ciclo catalítico.
Densidad de 1.06 g/cm3. débil. Reacciona con oxidantes ¿En qué vías metabólicas está involucrada la enzima succinato deshidrogenasa?
La reoxidación del FADH2 se produce cuando sus electrones se pasan a la cadena transportadora de electrones mitocondrial, así se ubica para dirigir los electrones
directamente dentro de la maquinaria de transporte electrónico de la membrana mitocondrial. originando peligro de incendio y Esta enzima está involucrada en el ciclo de Krebs (reacción 6) y a su vez está asociada con la cadena de transporte de electrones.
explosión.
El 𝐻2 aceptado por FAD se puede transferir al azul de metileno, este será reducido y al ser un indicador redox que al variar su estado de oxidación produce un viraje
(en este caso de azul a incoloro), se puede determinar si la succinato deshidrogenasas actuó o no sobre su sustrato.
Azul de metileno Aspecto sólido de color verde Es combustible, debe mantenerse
BIB L IO G R A F ÍA S .
oscuro con lustre bronceado. No alejado de las fuentes de
• Ayudas didácticas BIOQUÍMICA 1, unidad V.
posee olor. pH 3. Solubilidad 40 ignición. En caso de incendio • Ayudas didácticas BIOQUÍMICA 2, unidad II.
g/L en agua a 20 °C. pueden formarse vapores de SOx, • Complejo II en el transporte electrónico mitocondrial. (2017). Biomodel.uah.es. Recuperado el 8 de febrero Febrero 2017, de
NOx, HCl, Cl2. http://biomodel.uah.es/metab/mitoc/mitoE_cII.htm
Para la determinación de esta enzima se utiliza el método de coloración por medio del azul de metileno, el cual puede actuar como aceptor de electrones artificial • ESPAÑOL PARA LA ENSEÑANZA Y EL APRENDIZAJE DE ESTAS DISCIPLINAS CIENTÍFICAS.. Recuperado el 25 de Enero del 2017, de:
(agente oxidante), cuando el azul de participa en la reacción se torna incoloro a medida que se reduce, mientras los compuestos orgánicos involucrados en este http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en-placa_6527.pdf
metabolismo se van oxidando. El azul de metileno reducido puede ser oxidados nuevamente en presencia de oxígeno molecular, por el sistema de transporte de • EGG RCLASS: RC02800. (2017). Kegg.jp. Recuperado el 3 de Febrero del 2017, de: http://www.kegg.jp/dbget-bin/www_bget?rc:RC02800
electrones de la mitocondria, en la cadena respiratoria. Esta reacción causa que el colorante vuelva a adquirir su color azul propio de su estado oxidado. • Equilibrios REDOX. (2007). [libro digital] Humberto Gómez Ruiz, Recuperado de: el 5 de Febrero del 2017 de:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/REDOX_1276.pdf
En anaerobiosis, el azul, forma oxidada del azul de metileno, es reducido a un compuesto azul de leucometileno, incoloro, hidrogenado. Esta reducción ocurre en • LA LEVADURA DE PANADERÍA. [en línea] Congresosadbia.com. Recuperado el 23 de Enero del 2017 de:
presencia de FAD o de succinato. http://congresosadbia.com/ocs/index.php/tucuman2010/tucu2010/paper/viewFile/526/347
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• Voet, D., Voet, J. and Pratt, C. (2000). Fundamentos de bioquímica. 1ra ed. España: Grupo A - Artmed, pág.530.
En aerobiosis, el azul de leucometileno reducido es oxidado de modo espontáneo y el oxigeno molecular actúa como aceptor terminal de hidrógeno. La oxidación del
azul de metileno reducido produce peróxido de hidrogeno como producto final.