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GUÍA
PRÁCTICA
DE
MANEJO
Y
USO
DEL
EQUIPO
Y
SOFTWARE
DE
HPLC
Expositora:
Blga.
Michelle
Chirinos
Arias
1. EQUIPOS
Y
REACTIVOS
REQUERIDOS
EQUIPOS
• HPLC
(Shimadzu)
• Computadora
• Software
MATERIAL
Y
REACTIVOS
• Metanol
grado
HPLC
• Acetonitrilo
grado
HPLC
• Agua
grado
HPLC
• Estándar
de
inmunosupresor.
• Columna
C18
• Jeringas
• Filtro
para
HPLC
• Micropipetas
• Tips
de
10,
100
y
1000
ul.
2. Preparación
de
Estándares
Usar
fórmula
C1.V1=C2.V2
Siendo
1
inicial
y
2
final
3. MANEJO
DEL
EQUIPO
DE
HPLC
Y
SOFTWARE
• Prender
la
computadora
• Conectar
el
equipo
y
prender
el
desgasificador,
la
bomba,
el
horno
de
la
columna,
el
detector
y
por
último
el
controlador
del
sistema.
(ver
figura
1
con
las
partes
del
HPLC).
Siempre
en
ese
orden.
• Abrir
el
software
LC
Solution
y
seleccionar
1,
esto
debido
a
que
en
este
caso
la
computadora
solo
controla
1
equipo
de
HPLC.
Michelle C. Chirinos Arias
Jefa de Laboratorio
Centro de Diagnóstico Molecular
• Aparecerá
una
pantalla
emergente
pidiendo
la
contraseña,
dar
OK.
En
estas
máquinas
por
default
se
les
coloca
sin
contraseña.
• Se
escuchará
2
timbres,
el
primero
corresponde
a
la
conexión
y
revisión
del
todo
el
sistema
con
la
PC
y
el
segundo
a
la
autenticación.
En
otros
equipos
se
puede
escuchar
hasta
3
timbres
que
corresponden
a
lo
mismo.
• Luego
aparecerá
la
pantalla
en
tiempo
real.
• Esperar
20
minutos
a
que
el
equipo
se
estabilice
y
que
la
lámpara
caliente.
• Prender
la
bomba
(Pump)
en
el
software
haciendo
click
en
el
icono,
como
se
muestra
en
la
sgte.
Figura.
• Una
vez
alcanzada
la
temperatura
de
60°C,
se
puede
correr
la
línea
base.
Haciendo
click
en
el
siguiente
icono.
• Pasado
los
15
minutos
de
la
corrida
de
la
línea
base,
verificar
que
ésta
sea
recta,
si
no
volver
a
correrla.
• Abrir
el
inyector
de
muestra
y
voltear
la
perilla
hacia
la
izquierda.
• Inyectar
la
muestra,
asegurándose
que
no
exista
ninguna
burbuja.
• Click
en
el
botón
Single
start.
• Aparecerá
la
pantalla
Single
Run
donde
se
colocará
el
nombre
de
la
muestra,
su
ID,
el
método
a
usar
y
el
Data
File
(colocar
el
nombre
de
la
muestra)
y
dar
OK.
• Por
último
aparecerá
una
ventana
a
la
cual
se
le
debe
dar
OK,
al
mismo
tiempo
que
se
gira
la
perilla
del
inyector
a
la
derecha
(ya
que
en
nuestro
caso
es
un
HPLC
con
muestreador
manual).
Esta
ventana
indica
que
la
lectura
debe
empezar
por
ello
es
necesario
bajar
la
perilla
ya
que
en
ese
momento
la
muestra
estaría
entrando
a
la
columna.
• Luego
de
la
corrida,
hacer
click
en
post-‐run
Desgasificador
PC
Bomba
Muestreador
Detector
Horno de columna
El
área
del
pico
del
cromatograma
es
directamente
proporcional
a
la
concentración
de
la
muestra.
Para
determinar
la
concentración
del
inmunosupresor,
se
debe
tener
una
curva
de
calibración,
donde
se
conozca
la
absorbancia
y
el
tiempo
de
retención
de
los
estándares.
El
analito
(compuesto
de
interés)
aparecerá
en
el
mismo
tiempo
de
retención
que
los
estándares,
pero
su
pico
y
por
consiguiente
el
área
variará.
5. Purgado
de
equipo
Una
parte
del
mantenimiento
preventivo
de
la
bomba
del
HPLC
es
el
purgado,
que
significa
eliminar
burbujas
y
contaminantes
de
las
mangueras
que
llevan
la
fase
móvil.
Para
ello
es
necesario
abrir
el
método
de
limpieza
del
equipo
y
aumentar
el
flujo,
considerando
primero
al
solvente
A
hasta
que
no
haya
burbujas
y
al
solvente
B
de
la
misma
forma.
Para
ello
girar
la
manija
que
se
encuentra
en
la
bomba
hacia
la
dirección
open
(izquierda)
se
verá
salir
las
burbujas
por
un
tubo
que
conecta
al
desecho.
6. Mantenimiento
y
limpieza
del
equipo
El
método
de
limpieza
del
equipo
de
HPLC
puede
cambiarse
dependiendo
del
operador,
usualmente
son
15
minutos
del
solvente
“A”
o
hasta
que
la
línea
base
que
se
está
corriendo
sea
estable.
Por
ultimo
hacer
lo
mismo
con
el
segundo
solvente
o
de
preferencia
agua
grado
HPLC.
7.
PREGUNTAS
DE
ENTENDIMIENTO
1. ¿Cuál
es
el
principal
indicio
que
mi
columna
está
sucia
o
que
su
tiempo
de
vida
ya
está
por
terminar?
2. Si
el
líquido
es
viscoso
¿qué
pasa
con
la
velocidad,
la
presión,
la
temperatura?
3. ¿Cómo
establezco
el
tiempo
de
retención
de
la
muestra?,
¿qué
pico
debo
considerar?
8.
CÁLCULOS
QUÍMICOS
La
curva
estándar
se
establece
de
acuerdo
al
rango
donde
se
espera
se
encuentren
los
resultados.
Por
ejemplo
si
los
resultados
usualmente
se
encuentran
en
el
rango
de
30
a
50ppb.
Se
recomienda
que
la
curva
estándar
conste
de
las
siguientes
concentraciones
20,
30,
40,
50
y
60
ppb.
Es
recomendable
que
se
usen
al
menos
3
puntos,
obviamente
si
hay
más
puntos
el
sesgo
es
menor.
1. A
partir
de
un
STD
de
1ppm
preparar
un
nuevo
STD
de
500ppb
2. A
partir
de
un
STD
de
100ppb
preparar
un
STD
de
10ng/mL
3. Preparar
500ml
NaOH
de
1M
4. Tengo
un
STD
stock
de
0.75
mg
(sólido)
¿cómo
preparo
a
partir
de
ello
mi
STD
de
75ppm?
5. ¿qué
significa
preparar
una
solución
al
20%
(p/v)?
Y
al
30%
(v/v)?
6. Si
mi
stock
está
a
500ng/mL
como
preparo
los
siguientes
STD
20,
30,
40,
50
y
60
ppb?
2
7. Los
valores
de
mi
curva
STD
arrojan
un
R
de
0.65
¿qué
puedo
decir
de
la
curva?
8. Los
valores
del
área
de
la
curva
de
la
pregunta
6
son
25,
35,
45,
67
y
70
respectivamente
y
el
valor
del
área
de
mi
muestra
es
de
48.
Según
esto
¿cuál
es
la
concentración
de
mi
muestra
en
ng/mL?
Michelle C. Chirinos Arias
Jefa de Laboratorio
Centro de Diagnóstico Molecular
SOLUCIÓN
PREGUNTAS
DE
ENTENDIMIENTO
1. La
presión
aumenta,
para
que
el
flujo
se
mantenga
constante.
2. La
velocidad
debería
disminuir
pero
para
que
no
ocurra
esto
la
presión
aumenta
y
la
temperatura
debería
aumentarse,
ya
que
al
aumentar
la
temperatura,
la
presión
disminuye.
Todo
está
relacionado.
3. Lo
establezco
de
acuerdo
al
pico
del
STD.
A
veces
pueden
aparecer
varios
picos,
el
que
debo
considerar
usualmente
es
el
más
grande
y
el
que
va
disminuyendo
a
medida
que
la
concentración
de
los
STD
que
coloco
van
disminuyendo.
CÁLCULOS
QUÍMICOS
1. 1ppm=
1000ppb
C1.V1=C2.V2
Yo elijo el V2
1000ppb.V1=
500ppb.
10ml
V1=
5ml
Tomar
5ml
del
stock
de
1ppm
y
enrazar
con
solvente
hasta
10ml
2. 1ppb=1ng/uL
C1.V1=C2.V2
100ppb.V1=
10ppb.
10ml
V1=
1ml
Tomar
1ml
del
stock
de
1ppb
y
enrazar
con
solvente
hasta
10ml
3. NaOH
peso
molecular
de
40g
M=(n/V)=
(w/PM)/V
El
volumen
debe
estar
en
litros
1=
(w/40)/0.5
despejo
y
hallo
w
en
gramos
w=
20
g
pesar
20g
de
NaOH
y
agregarlo
en
500ml
de
agua.
4. 1ppm=1mg/L
75ppm=
(0.75mg)/xL
X=
0.01
L
o
10
ml
Colocar
los
0.75g
del
STD
en
10ml
de
solvente.
5. 20
g
del
soluto
A
en
100ml
del
solvente
B
y
30
ml
de
la
solución
A
en
100ml
de
la
solución
B.
6. 500ng/uL=500ppb
para
20;
C1.V1=C2.V2;
500ppb.
V1=
20ppb.2000uL;
V1=80uL