MINISTERIO DE EDUCACIÓN CIENCIA Y TECNOLOGIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA RIOJA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS APLICADAS
A LA PRODUCCIÓN AL AMBIENTE Y EL URBANISMO

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

CATEDRA: MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
CARRERA: INGENIERÍA AGRO-INDUSTRIAL
PROF. TITULAR: ING. SERGIO MANUEL MORENO
PROF. ADJ.: ING. VIVIANA NOEMI MALDONADO
ALUMNO: ____________________________________
CUATRIMESTRE 2° AÑO 2012

Trabajo Práctico N ° 1: MEDIOS DE CULTIVO

Contenidos: Preparación y esterilización de medios de cultivos. Aplicaciones.
Diferentes técnicas de siembra.

Objetivo principal:
Que el alumno tome contacto con el material y aprenda las técnicas básicas de preparación
del mismo, así como también del medio de cultivo y esterilización.

Objetivos secundarios.

- Adquirir experiencia en el manejo de equipos de esterilización y aplicar métodos de

desinfección y esterilización empleando distintos agentes físicos
- Preparación y fraccionamiento de caldo y agar comúnmente utilizados en un
laboratorio de microbiología.
- Esterilización de caldo y agar por autoclave.
- Preparación y esterilización de material de vidrio por estufa.

Materiales:
Autoclave
Estufa
Algodón
Probetas
Vaso de Precipitados
Tijera
Hilo Lonero
Papel de envolver blanco
Mechero
Erlenmeyers
Pipetas
Pipetero
Tubo de cultivo
 Cajas de Petry
Marcador indeleble
Agua destilada
Medios de cultivo liquido y sólido.

Preparación de pipetas:
- Tomar al menos 15 pipetas limpias (10 de 1 ó 2 ml y 5 de 10 ó 5 ml).
- Colocares un trozo de algodón en el extremo superior con la ayuda de un alambre
de forma tal que no quede muy apretado ni tampoco suelto.
- Colocarlas en un pipetero vacío.
- Rotular el pipetero indicando volumen de las pipetas y fecha.
- Colocar la tapa del pipetero dejando los orificios abiertos

Preparación de Cajas de Petry

- Tomar una caja de petry y colocarla sobre el papel para envolver
- Envolver según la técnica que el docente explicará
- Llevar a estufa de esterilización
Preparación de frascos
- Tomar un frascos y envolver con la ayuda de un hilo la boca con la tapa puesta
- Envolver el frasco así tapado según la técnica que el docente explicará
- Llevar a estufa de esterilización.

Preparación de medios de cultivo.

- Leer atentamente la formula de los medios y calcular la cantidad de medio
necesario para preparar 250 ml.
- Pesar en balanza digital en un baso de precipitado
- Agregar la cantidad de agua necesaria
- Si es necesario llevar a mechero hasta disolución
- Medir pH.
- Fraccionar en tubos de cultivo 10 ml de medio liquido y 10 ml de medio sólido.
- Acondicionar para su esterilización en auto clave (20min. 121 ºC)
- Guardar en heladera hasta su utilización.

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
Calor húmedo (autoclave)

Procedimiento

Verificar el nivel de agua del autoclave asegurando que el mismo se encuentre a la altura
de la tapa de la base. Si fuera necesario reponer el agua con agua destilada.

Verificar que la junta esté en buenas condiciones, sin roturas ni grietas. Ante la
posibilidad de un mal cierre de la misma proceder a su reemplazo.

Colocar la carga a esterilizar o descontaminar dentro del autoclave en forma ordenada y

en recipientes de forma tal que ningún objeto quede suelto dentro de la misma y dejando
un espacio no menor a 5 centímetros entre dichos elementos y el borde superior del
autoclave.
 Colocar en el interior de la carga un control térmico de esterilización (ya sea químico y/o
biológico). Ubicar los controles en aquellos lugares donde considere más difícil el acceso
al vapor.

Cerrar la tapa superior del autoclave y ajustar las mancuernas con las manos y de a pares
enfrentados. Nota: No ajustar las mancuernas del autoclave empleando objetos como
palos, caños, etc. La tapa está diseñada para ser cerrada con la fuerza de las manos.

Verificar que la espita esté abierta. En caso contrario abrirla.

Abrir la llave de paso de gas y encender el mechero.

Regular la entrada de aire para que la llama del mechero sea máxima controlando que la
totalidad del mismo esté encendido.

Cuando de la boca de la espita se observe la salida de vapor en forma continua, proceder

a cerrar la espita.

Una vez alcanzada la presión de trabajo (1,2atm, 121ºC) regular la llave de gas de manera
tal que la presión se mantenga en dicho valor.

Mantener a temperatura y presión constantes durante 15 minutos si se trata de medios de

cultivo y 30 minutos si se trata de material de vidrio o decontaminación. Verificar
periódicamente que se mantengan dichas condiciones.

Transcurridos los el tiempo indicado proceder a cerrar la llave de gas.

Una vez que la presión halla alcanzado el valor 0 atm. proceder a abrir la espita
permitiendo que se igualen las presiones interior y exterior.

Colocarse los guantes de amianto.

Liberar las mancuernas y proceder a abrir la tapa del autoclave, cuidando alejar el rostro
de la boca del autoclave.

Verificar se disponga de lugar para descargar el contenido del autoclave.

Retirar los elementos del interior del autoclave.

Si se hubieran derramado elementos en el interior del autoclave, proceder a su vaciado y

limpieza utilizando agua, detergente y esponja.

Colocar la tapa de manera tal que cubra la boca del autoclave.

Calor seco (Estufa de esterilización)

1- Preparación del material a hornear.

2- Carga del horno.
3- Control hasta llegar a la temperatura de esterilización.
4- Control del tiempo de esterilización.
5- Apagado, enfriado y apertura del horno.
Se esterilizarán materiales que no puedan ser autoclavados y/o que resistan altas
temperaturas.

Incineración por llama

Flameado de la boca de botellas, frascos y tubos y en la esterilización y decontaminación del
ansa que se emplea para transferir cultivos bacterianos.

TÉCNICAS DE SIEMBRA
MÉTODOLOGÍA:
 Limpiar y esterilizar el área de trabajo
 Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que esta presente un cono azul bien marcado.
 Identificar y organizar el material dentro del área de trabajo.
 Marcar los tubos con iniciales de la cepa a sembrar y fecha.a)

a) Siembra en medio líquido:

Transferir asépticamente, con el asa de siembra, una pequeña muestra de los
microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de
cultivo estéril. Sumergir el asa en el líquido y agitar para desprender y diluir la muestra.
Incubar el tubo recién sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura óptima de
crecimiento.

b) Siembra en medio semisólido:

La siembra en este tipo de medio, que contiene una proporción menor de agar que los
medios sólidos y que se envasa en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado,
con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en
profundidad hasta el fondo del tubo, retirándolo posteriormente por la misma trayectoria
utilizada al realizar

Técnicas de estriado:
a) estriado simple: estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte
de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cercas del mechero espera
que se enfríe el asa toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera,
ahora, toma una placa con agar estéril (donde se vaya a sembrar) y con cuidado de no
 romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posición
ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre
la superficie de una porción pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y
rápido de la muñeca.
b) estriado en cuadrantes: la mayor parte del inóculo e descarga en los cuadrantes 1y
2, lo que permite obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra,
previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se
extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con medio, en forma de estrías
muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el medio. Se flamea el asa, se enfría y
después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la
placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando
y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la
placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida. Mediante
esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado
número de bacterias.
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CUATRIMESTRE 2° AÑO 2012

Trabajo Práctico Nº 2 : CINÉTICA MICROBIANA

Contenidos: Cálculo de parámetros cinéticos. Aplicación de modelos matemáticos.
Utilización de software para cálculos.
Problema 1

Se ha inoculado un microorganismo en un medio de cultivo líquido en matraz. De forma

regular se han tomado muestras y se ha contado el número de microorganismos de la
muestra mediante microscopia. En la tabla se muestran los resultados obtenidos:

t N (cel./ml) t N (cel./ml)
0 218.00 6.50 4479
0.25 216 6.75 5669
0.50 210 7.00 6699
0.75 216 7.25 8742
1.00 217 7.50 8318
1.25 211 7.75 8304
1.50 212 8.00 8734
1.75 218 8.25 8594
2.00 215 8.50 8214
2.25 210 8.75 8489
2.50 215 9.00 8771
2.75 215 9.25 8396
3.00 220 9.50 8247
3.25 270 9.75 8676
3.50 319 10.00 8671
3.75 409 10.25 8244
4.00 526 10.50 6409
4.25 627 10.75 5105
4.50 761 11.00 3766
4.75 993 11.25 2782
5.00 1238 11.50 2222
5.25 1460 11.75 1721
 5.50 1840 12.00 1248
5.75 2391 12.25 955
6.00 2881 12.50 765
6.25 3454 12.75 572
13.00 419

Dibujar la curva de crecimiento y definir las distintas fases de la curva.

Calcular para la fase exponencial de crecimiento los siguientes parámetros:

- constante de la velocidad de crecimiento (µ). R:1.15
- tiempo de duplicación (td) R:0.60

Problema 2

Un pastelero inocula un pastel con 214 células de Staphylococcus aureus. Dado que el pastel
no se conserva en condiciones adecuadas, los microorganismos, que presentan un tiempo de
generación de 0.8 horas, aumentan su población. Calcular el número de células que habrá en
el pastel tras 9 horas. R:0.86

El mismo pastelero, contamina otro pastel con otras 214 células, pero en este caso, los
microorganismos sufren una fase Lag de 1.25 horas. Calcula el número de células que habrá
en el pastel tras 9 horas. R: 496.816

Al preparar un tercer pastel, también se contamina con 214 células, pero en este caso,
durante las primeras 2.5 horas el pastel se mantiene en el frigorífico. Después, para mostrar
el pastel a un consumidor es sacado al mostrador y se deja sobre él durante 2.5 horas. De
pronto, cuando el pastelero ve el pastel, lo vuelva a meter en el frigorífico, y lo mantiene
dentro durante 2.75 horas. Finalmente, el pastel se saca del frigorífico y es vendido a un
cliente. El cliente mantiene el pastel a temperatura ambiente hasta ser consumido (1.25 horas
más). Calcula el número de células de Staphylococcus aureus que habrá en el pastel tras 9
horas si la fase Lag es de 1.25 horas. R:2.603

Compara los resultados obtenidos (número de células en el pastel) en las tres situaciones.

Problema 3

Escherichia coli se desarrolla en un medio de cultivo a 37ºC se determinó el peso seco (g/l) a
diferentes tiempos

Tiempo Peso seco

(min) (g/l)
0 0
30 0.01
60 0,03
90 0,09
120 0,12
150 0,25
180 0,35
210 0,45
 240 0,5
300 0,55
330 0,56

¿Calcule la tasa específica de crecimiento, tiempo de duplicación?

Problema 4

Utilizando el Modelo de Monod calcule la velocidad especifica de crecimiento de un

microorganismo para las siguientes concentraciones de glucosa:

[Glucosa] (g/1-1): 0.0; 0.1; 0.5; 1.0; 20 ; 40 ; 90

Datos:

µm = 0.65h-l

Ks= 0.05 g/l-1

Según los resultados obtenidos, analice que ocurre a concentraciones altas de glucosa,
Justifique su respuesta.

Problema 5

Una bacteria creciendo en condiciones óptimas duplica su biomasa cada 45 minutos. Si un

medio de cultivo con 0.5% de glucosa se inocula con 10 mg/l de biomasa.

Calcule la cantidad de biomasa que se producirá en mg/l a las 4, 8 y 12 horas de

incubación.

Si la concentración final de azúcares en el medio de cultivo es de 100 mg/l calcule

cual es su rendimiento de biomasa.
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Trabajo Práctico Nº 3 :UNIDAD FERMENTADORA.

CALCULO DE BIOREACTORES
Contenidos: cálculo de bioreactores. Parámetros de diseño. Diferentes casos.
Controles en una fermentación. Confección de informe

Problema 1

La levadura Rodotorula sp. en condiciones aerobias, tiene una tasa de crecimiento específico
de 0.3 hr-1 y consume 70% del sustrato inicial con un rendimiento de 0.4. Si se inocula un
fermentador de 10 litros con 0.8 g de biomasa, calcular la cantidad de glucosa que deberá
agregarse al fermentador para que el crecimiento no sea limitado por carbono.

Problema 2

Si la concentración celular al inicio de un cultivo es 104 cel/ml y después de 4 horas se

producen 108 cel/ml, calcular la velocidad de crecimiento y el tiempo de duplicación del
cultivo.

Problema 3

Una bacteria tiene un tiempo de duplicación de 3.5 hrs. Si se inocula con 2X106 cel/ml en un
fermentador, ¿cuánta biomasa se producirá después de 26 horas de fermentación?

Problema 4

Un microorganismo que tiene una velocidad de crecimiento de 0.08hr-1 es inoculado en un

fermentador que contiene 80 g/l de sustrato. El microorganismo produce 45 g/l de ácido
glutámico con un rendimiento de YP/S de 0.6. Si el inóculo fue de 0.6 g cel/l y tiene un
rendimiento de YX/S de 0.23, calcular el tiempo requerido para obtener los 45 g/l de ácido
glutámico.

Problema 5

Hansenula sp., es una levadura que cultivándola en condiciones aireadas, tiene un

rendimiento celular de 0.45. Si se inocula un fermentador de 50 litros que contiene 20 g/L de
glucosa con 0.5 litros de una suspensión (0.1% de BM), y quedan 15% de sustrato residual
al final de la fermentación. Calcule la cantidad de biomasa total producida.
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HOJA N° 1/2.-
Trabajo Práctico Nº 4 : FERMENTACIÓN.
ENSAYOS.CONTROLES.
Contenidos: Control de materia prima, selección de levaduras. Ensayo de masa panaria
esponjante. Graficas. Conclusiones. Elaboración de un informe..

- LA LEVADURA COMO ESPONJANTE DE LA MASA PANARIA

A partir de harina de trigo, ariando las concentraciones de suspensión de levaura, se
prepara la masa a la que se añade glucosa o sacarosa. Se vierte en probeta y en ella se
determina cuantitativamente la esponjosidad de la masa por el aumento de volumen
que experimenta. Es una medida de la fuerza de la levadura.

Se utilizaran los siguientes materiales:

- Levadura Saccharomyces cerevisiae

- Glucosa
- Harina de trigo

Equipos:
c) 4 vasos de precipitado 250ml
d) 4 probetas de 100ml
e) 1 matraz Erlenmeyer 500ml
f) 1 probeta 50ml
g) 1 pipeta 10ml
h) Balanza, espátula, varilla de vidrio
i) Estufa a 30ºC

Procedimiento
1. Enumerar los 4 vasos de precipitado y las 4 probetas.
2. Añadir a cada vaso 25 gr de harina
3. Agregar 3 gr de glucosa a los vasos 1, 2 y 3
4. Al vaso 1 se le agregaran 22,5 ml de agua
5. Al vaso 2 se le agregaran 15 ml de agua
6. Preparar la suspensión de levadura en 120 ml a temperatura ambiente
7. Con pipeta agregar las siguientes proporciones de suspensión:
Vaso 1  7.5 ml
Vaso 2  15 ml
Vaso 3  30 ml
Vaso 4  30 ml
8. Se mezcla la masa con varilla de vidrio y se añade a la probeta
correspondiente
9. Se colocan las probetas en estufa
10. Se tomara nota de la altura al tiempo cero y cada 1 minuto durante 30min,
11. Observar, graficar el resultado y proponer una conclusión.
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CUATRIMESTRE 2° AÑO 2013

Trabajo Práctico Nº5 : ELABORACIÓN ACEITUNAS EN CONSERVA

Elaboración de aceitunas a escala laboratorio. Controles físicos y químicos de sodas y
salmueras utilizadas en la elaboración de aceitunas. Visita a un establecimiento elaborador de
aceitunas.
Se realizarán las determinaciones correspondientes a Ph, acidez, concentración de salmuera
(ClNa) y temperatura, cuyos valores característicos proporciona una herramienta efectiva
para realizar el control de la fermentación acética en la preparación de aceitunas en
conserva.
Determinación de Ph: se realiza por medio de un pH-metro previamente calibrado con
buffer 4 y 7
Determinación de concentración de salmuera: La determinación se realiza por medio de la
utilización de un densímetro calibrado.
Determinación de acidez:
 Tomar una alícuota de 10,00 ml de la dilución con pipeta de doble aforo y verterlo en
un Erlenmeyer de 250 ml.
 Agregar agua destilada hasta completar 50 ml y 2 gotas de fenolftaleína.
 Titular con la solución de NaOH 0,1 N
 Calcular la acidez de la muestra expresada como porcentaje de ácido láctico.
 Peso molecular Ácido Láctico 90,08

Acidez en ácido láctico= G x 9,008

m
G: ml de NaOH gastados
m :ml de muestra

Tabla de Datos:
Producto:
Fecha Temp. ºC Conc.Salmuera Acidez pH Observaciones
00/00/00
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CUATRIMESTRE 2° AÑO 2012

Trabajo Práctico Nº 6 : TRABAJO DE CAMPO

Contenidos: Se realizará trabajos prácticos guiados y supervisados en una/s industria/s
de alimentos. Elaboración de un informe.

Objetivo:
Que el estudiante se familiarice con las actividades que se llevan a cabo en industrias afines
poniendo especial interes en los controles y analisis que se realicen tanto en materias primas,
productos de elaboración y productos terminados.

El informe a realizar por los alumnos constará de los siguientes puntos basicos:
 Caratula: donde constará Carrera, Catedra, Equipo docente, Nombre del Alumno,
Fecha de visita.
 Indice de temas
 Introducción: Deberá detallar la industria que se visitó, sus carateristicas o rubro y su
importancia en la comunidad.
 Cuerpo:
Deberá detallar envergadura de la industria que se visita.
Deberá contener una descripcion del / los procesos que se llevan a cabo, cuales son los
pàrametros de controles que se utilizan y sus planes de contingencia si no son cumplidos.
Bosquejar un diagrama de flujo de los procesos.