UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE

CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
BIOLOGÍA MOLECULAR III
NRC: 3734 Nombre: Janine Peralta Guevara Fecha: 17/12/17

Extracción de ADN amplificable de tejido de cadáver humano embalsamado

Introducción
La investigación médica y el análisis genético dependen de la extracción de ADN de
tejidos. La fijación con parafina fijada con formalina (FFPE) de los tejidos biológicos es una
técnica que ofrece la preservación de proteínas, ADN y ARN. La cantidad y calidad del ADN
extraído depende del tipo de tejido y del proceso de extracción. No se utilizan frecuentemente
los tejidos de cadáveres embalsamados para el aislamiento ADN, debido a la mala calidad de
la muestra (embalsamada). El proceso de embalsamamiento expone los tejidos a productos
químicos como el glutaraldehído y la formalina (formaldehído acuoso), que inducen el
entrecruzamiento intra e intermolecular. Los protocolos de extracción estándar de los tejidos
fijados con formalina dan como resultado un ADN altamente fragmentado que oscila entre
50 y 300pb de longitud, conduciendo a la dificultad para amplificar ADN de alto peso
molecular. Por lo que en este estudio se desarrolló un método simple y de bajo costo para el
aislamiento de ADN, que utiliza tejido cerebral de cadáver humano embalsamado.
Métodos
Cadáveres
 Los cadáveres fueron embalsamados con una mezcla de formaldehído, glutaraldehído
y metanol, por la Facultad de Medicina de la Universidad de Cincinnati, mediante un
método estándar de inyección en dos sitios.
 Los tejidos en este estudio se eliminaron y almacenaron en formalina al 10% y a
temperatura ambiente. Los tejidos se identificaron según su año académico de
disección y sexo (Gielda & Rigg, 2017).
Células A549
 Las células A549 se cultivaron en medio nutriente F12, con L-glutamina (ATCC cat
# 30-2004), suero fetal bovino al 10% (FBS) (ATCC cat # 30-2021) y penicilina-
estreptomicina (ATCC cat # 30-2300), a 37 ° C en una incubadora con humificación
al 5% de CO2.
 Las células se recogieron después de tres lavados con tampón fosfato salino (PBS),
seguido de incubación con una solución de 1xtripsina/EDTA (ATCC cat # 30-2101),
Extracción y cuantificación de ADN
 Las muestras de tejido disecadas (50-60mg) o las células A549 cultivadas se
homogeneizaron manualmente en PBS usando el mortero en una Nasco Whirl-pak
(Fisher cat # 01-812-5M).
  El tejido se lavó 2 veces con PBS y se suspendió en tampón Tris (Tris-HCl 10mM,
pH 8,5).
 Esta mezcla se agitó en el vortex, se calentó a 95ºC durante 15 minutos y se enfrió a
temperatura ambiente.
 Se realizó una extracción estándar de fenol-cloroformo.
 El volumen de la mezcla igual a 25:24:1 de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico
(Sigma-Aldrich cat # 2069) se añadió, se mezcló en el vortex y se centrifugó (5 min,
13 K rpm, 4°C).
 La fase acuosa se retuvo y se añadió un volumen igual de 24:1 de cloroformo/alcohol
isoamílico (Sigma-Aldrich cat # C0549), se agitó en vórtice y se centrifugó.
 Para eluir el ADN de la fase acuosa retenida, se añadió acetato de amonio 3M a una
concentración final de 0,75M y 2.5x volumen de etanol al 95% para precipitar el
ADN.
 Las muestras se centrifugaron para sedimentar el pellet de ADN (20min, 13 K rpm,
4°C).
 El pellet se lavó 2 veces con etanol al 80%, se suspendió en 50μl de tampón TE y se
almacenó a -20ºC.
 El ADN se cuantificó mediante espectrofotometría Nanodrop (ThermoFisher).

Resultados y conclusiones
 Se desarrolló un procedimiento que ayuda eficazmente a la eliminación de proteínas
entrecruzadas del ADN.
 Se observó un aumento significativo en la cantidad y calidad del ADN cuando los
tejidos se lavaron 2 veces con PBS, seguido de una incubación por 15 minutos a 95ºC
antes de la extracción con fenol/cloroformo y, por lo tanto, se eligió como el método
preferido.
 Para evaluar la variabilidad tisular, se extrajo ADN del cerebelo, la corteza cerebral
(materia gris y blanca), el corazón y el hueso de cuatro cadáveres. Se recuperaron
cantidades variables, con el rendimiento más alto del cerebelo (463,35 ng/μl) y el
corazón con el menor (7,9ng/μl).
 El tamaño del ADN extraído se vio afectado por la edad del tejido, con especies de
ADN de hasta 1 Kb solo aisladas de tejidos en un cadáver femenino.

Referencias
Gielda, L., & Rigg, S. (2017). Extraction of amplifable DNA from embalmed human cadaver
tissue. BMC Research Notes.