TEMA: Análisis y observación de células sanguíneas a partir de muestras preparadas

mediante utilización de técnicas de tinción celular.

OBJETIVOS:
 Reconocer los distintos tipos de células componentes de la sangre mediante
microscopia de frotis sanguíneo.
 Preparar correctamente las placas para observación en el microscopio.

MARCO TEÓRICO:
Los leucocitos son células con núcleo, casi incoloras, más grandes que los eritrocitos, en
el flujo de sangre toman la forma circular, pero en los tejidos se pueden planas; no tienen
hemoglobina y defienden al organismo de virus y bacterias, por lo q al combatir una
infección son generalmente destruidos. (Curtis 2008)

La tinción de Wright se utiliza para teñir células sanguíneas utilizando un frotis de sangre,
el núcleo y citoplasma de leucocitos de tornan de colores entre azul, púrpura o rosa. Se
puede encontrar gránulos finos de color rojo a lila en el citoplasma de algunas células.
(Sigma-Aldrich. 2010)

La eosina y el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes
estructuras celulares, de forma que las que tienen carácter básico fijan la eosina mientras
que las que poseen propiedades ácidas fijan principalmente el azul de metileno. La
diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmáticas por dichos colorantes permite
clasificar a los leucocitos en: eosinófilos que fijan los colorantes ácidos y se tiñen de color
rojo- naranja; basófilos que fijan los colorantes básicos y se tiñen de color azul oscuro y
neutrófilos que fijan ambos colorantes simultáneamente, de ahí que se tiñen de color
pardo. (Rodak, 2004)

MUESTRAS: Sangre humana.

EQUIPOS: Microscopio.

MATERIALES DE PROTECCIÓN PERSONAL: Mandil, guantes.

REACTIVOS:
1. Colorante de Wright: para 100 mL se requiere de colorante de Wright (0.3g),
metanol (97.0 mL) y glicerol (3.0 mL). Disolver en un mortero el colorante con
el glicerol. Una vez disuelto se adiciona el metanol trasvasándolo a un frasco
oscuro.
Agitar. Filtrar antes de usar.
2. Solución amortiguadora tamponada: en un litro de agua destilada se agregan
3.76 g de hidrofosfato disódico (Na2HPO4* 2H20) y 2.10g de fosfato de potasio
dihidrogenado (KH2PO4). Mezclar todos los reactivos y guardar en frasco de
vidrio en lugar fresco. Ajustar el pH a 7.2.

MATERIALES E INSUMOS:
1. Rejilla horizontal o soporte de tinción.
2. Cubreobjetos.
3. Portaobjetos.
4. Muestra de sangre.
ORGANISMOS: Ninguno.

PROCEDIMIENTO: (Tomado de guía dos)

 Toma de muestra sanguínea
1. Con el procedimiento ya conocido de toma de muestras sanguíneas se
procedió a la obtención de aproximadamente 4 ml de sangre.
 Para realizar el frotis se siguió el siguiente procedimiento:
1. Se desinfectó sin exceso de alcohol el portaobjetos donde iba a ser puesta
la gota de sangre; se esperó a que se seque el alcohol.
2. Se depositó una gota de sangre en la parte lateral del portaobjetos
desinfectado.
3. Se acercó otro portaobjetos con el cual se deslizó la gota de sangre y se
esperó a que por capilaridad, ésta se extienda sobre la superficie de su
base.
4. Con un ángulo de 45 grados se deslizó el segundo portaobjetos sobre toda
la superficie del portaobjetos que contenía la sangre de manera que se
obtenga una fina película de sangre. El inicio del frotis se denomina cabeza
y la parte final del frotis se denomina cola.
5. Se esperó a que se seque la lámina dejándola sobre una rejilla o toalla de
papel, con la zona donde estaba la muestra mirando hacia arriba.

Figura 1: Técnica de realización de frotis sanguíneo

 Una vez realizado el frotis, se continuó con el siguiente procedimiento

1. Se colocó el frotis secado al aire sobre una rejilla o cubeta de tinción con
la sangre hacia arriba.
2. Se cubrió completamente el portaobjetos con el colorante de Wright gota
a gota.
3. Se dejó que permanezca en el frotis aproximadamente de 5-8 minutos, para
fijar los glóbulos sanguíneos. El colorante debe cubrir completamente el
portaobjetos, pero no debe derramarse por los bordes.
4. En caso de que el colorante comenzara a evaporarse se agregó una
cantidad adicional a éste.
 5. Se lavó con agua cuidadosamente hasta que la extensión presente un
aspecto rosado al examinarlo a simple vista.
6. Se procuró limpiar también el dorso del portaobjetos.
7. Se secó al aire y se observó con el microscopio, desde el aumento 4x hasta
100X.

RESULTADOS PRIMARIOS: Obtención de una muestra apropiada para el análisis

sanguíneo.

CÁLCULOS MATEMÁTICOS Y ESTADÍSTICOS: Ninguno.

ANÁLISIS DE RESULTADOS:

Foto 1: Muestra de células sanguíneas 4x Foto 2: Muestra de células sanguíneas 10x

Tinción Wright Tinción Wright

Monocito

Glóbulos rojos

Foto 3: Muestra de célula sanguínea 100x

Tinción Wright, Monocito
 Glóbulos rojos

neutrófilo

Foto 4: Muestra de célula sanguínea 100x

Tinción Wright, neutrófilo

neutrófilo

linfocito

plaquetas

Foto 5: Muestra de célula sanguínea 100x

Tinción Wright, monocito y linfocito

- En los objetivos de 4x y10x se logró observar las células teñidas pero no se pudo
reconocer de forma precisa qué tipo de células sanguíneas eran.
- Con el objetivo de 100x se logró apreciar lo siguiente:
 Los eritrocitos se observaron de color rosado.
 El citoplasma de los monocitos presentó una tonalidad purpura oscuro y
su núcleo de color púrpura algo más claro.
 No se observaron eosinófilos ni basófilos en la muestra.
 Los gránulos de los neutrófilos se apreciaron de color lila.
 Las plaquetas tomaron coloración violeta o púrpura.

DISCUSIÓN:
Con tinción de Wright se tiñe células sanguíneas, el núcleo y citoplasma de leucocitos de
tornan de colores entre azul, púrpura o rosa. Las placas observadas con esta tinción
claramente se diferenciaban colores como purpura y algunos casos rosa. (Sigma-Aldrich.
2010)
Los leucocitos homólogamente glóbulos blancos. Los neutrófilos son un tipo de
leucocitos con propiedades fagocíticas, citoplasma granular y núcleo multilobulado. Se
pudo observar en mayor cantidad neutrófilos en las placas con diferentes tinciones.
(Madigan, 2004)

Los basófilos se parecen funcionalmente a los mastocitos. Poseen un núcleo relativamente

grande que puede tener diferentes formas. Con frecuencia redondeada y posee una
escotadura poco pronunciada o también bilobulado, en los extendidos a menudo está
oculto por grandes gránulos basófilos. No se pudo apreciar en las placas basófilos pero
comprendiose su estructura y morfología. (Welsch, 2006)

Los monocitos son los leucocitos más grandes con frecuencia exhiben un núcleo
arriñonado y a veces bilobulado con estructura “nubosa”. Se pudo apreciar monocitos con
las características anteriormente mencionada, en menor cantidad que los neutrófilos.
(Welsch, 2006)

CONCLUSIONES:
 Se realizó un frotis con la muestra seleccionada aplicando la técnica de barrido
para poder realizar las tinciones.
 La tinción Wright permite identificar células sanguíneas tiñendo las estructuras
celulares de acuerdo al ph.
 Se identificó y diferenció mediante observación microscópica tamaño, forma y
estructuras de las células sanguíneas (leucocitos, glóbulos rojos, plaquetas).
 Se reconoció los diferentes tipos de glóbulos blancos existentes en la sangre.
 El porcentaje de basófilos y eosinófilos en la sangre es muy pequeño por lo que
no se los observó en la mayoría de muestras.

RECOMENDACIONES:
 Tener cuidado al sobrepasar o amenorar el tiempo de los pasos de la tinción, el
resultado podría ser no obtener ninguna distinción al microscopio.
 Usar correctamente la bata de laboratorio y proteger al machar las superficies
donde se trabajan los reactivos colorantes suelen ser difíciles de lavar.
 Para obtener una buena imagen directamente con el lente 100x primero obtener
una visión de la muestra en el lente 10x
 Tener un previo conocimiento de los distintos tipos de células sanguíneas para
poder diferenciarlos correctamente y realizar un buen informe.

CUESTIONARIO:
1. ¿Qué características celulares se debe observar para diferenciar leucocitos y
poder clasificarlos?
Podemos dividir en dos tipos basándonos en sus características de tinción y
características morfológicas en la cual las principales estructuras por las que se
los diferencia son los gránulos que posee. Estos dos tipos son los granulocitos
(todos los que tienen gránulos en el citoplasma, gran cantidad de lisosomas) y los
agranulocitos (que no presentan gránulos en el citoplasma).

2. ¿Por qué es importante estar pendiente de los intervalos de tiempo de

permanencia de la placa con cada colorante al momento de la tinción? ¿Cómo
afecta esto en la observación de las células?
 Porque si no controlamos el tiempo nos podría producir una extensión sanguínea
muy rosa o demasiado azul, debido a un tiempo de coloración insuficiente o falta
de fijación del colorante respectivamente. Esto afectará en la observación de las
células ya no nos permitirá una identificación adecuada de las células sanguíneas.

3. ¿Qué posibles causas existen para la presencia de acantocitos dentro de la

muestra?
La presencia de acantocitos en la muestra puede darse por:
 Exceso de colesterol
 Hemangioma
 Hemangiosarcoma esplénico
 Enfermedad hepática
 Comunicaciones portosistémicas
 Dietas altas en colesterol
Pero también puede darse por fallas en la realización de toma de muestras o en la
realización del frotis sanguíneo por ejemplo obtener poca cantidad de sangre en el
tubo con anticoagulante, haciendo que la concentración del anticoagulante sea mayor
produciendo la modificación de los bordes de los eritrocitos.

4. ¿En qué animal es normal observar la presencia de cuerpos de Howell Jolly?

Es normal observar cuerpos de Howell Jolly en la sangre periférica de gatos sanos.

BIBLIOGRAFÍA
 Sigma-Aldrich (2010) Tinción Wright Accustain, Procedimiento número WS. Alemania
(http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/General_Information/1/insert_e
s_ws.Par.0001.File.tmp /insert_es_ws.pdf).
 Curtis, S.( 2008), Biología Curtis. Editorial Médica Panamericana S.A. Séptima
edición. España. Tomado de (01-01-2015):
https://books.google.com.ec/books?id=mGadUVpdTLsC&pg=PA699&dq=celulas+san
guineas&hl=es&sa=X&ei=rOWlVICFDYyngwTixYCIDg&redir_esc=y#v=onepage&q
=celulas%20sanguineas&f=false
 Rodak (2004) Hematología: Fundamentos y Aplicaciones Clínicas. Editorial
Médica Panamericana S.A. Segunda edición. Argentina. Tomado de (01-01-2015):
https://books.google.com.ec/books?id=rFqhpbKnWX8C&pg=PA178&dq=tincion+gie
msa&hl=es&sa=X&ei=WNilVOyZBoeqggTLkYOACw&redir_esc=y#v=onepage&q=t
incion%20giemsa&f=false
 Michael T. Madigan, John M Marktinko, Jack Parker,- Brock - Biología de los
microorganismos 10º Edición Pearson Prentice Hall
 Welsch (2006) .Histología Sobotta segunda edición. Editorial Medica
Panamericana S.A. Tomado (02-01-2015) de
https://books.google.com.ec/books?id=7zFxo6bmxl0C&pg=PA210&dq=tipos+d
e+leucocitos&hl=es&sa=X&ei=zeenVKPON8nyggTh-
oLADg&ved=0CB0Q6AEwAA#v=onepage&q=tipos%20de%20leucocitos&f=f
alse

ANEXOS:
Toma de muestras y frotis sanguíneo