INFORME DE PRÁCTICAS VACACIONALES

I. DE LAS PRACTICAS

1.1. Nombre y razón social de la institución:

 Universidad Nacional de Huancavelica

1.2. Duración de las practicas: 520 horas

1.3. Área de investigación:
 Laboratorio de biotecnología reproductiva
 Teléfono: 969345612

1.4. Resumen de las actividades realizadas:

Las actividades se realizaron en el laboratorio de biotecnología reproductiva de

la Universidad Nacional de Huancavelica, las muestras biológicas fueron
obtenidas de llamas y alpacas, procedentes del camal municipal de
Huancavelica. La Producción in vitro de embriones (PIVE) comprende tres
pasos que son: 1) la maduración in vitro de los oocitos (MIV) obtenidos de
ovarios por medio de aspiración o punción folicular, 2) la fertilización in
vitro (FIV) de los oocitos madurados y 3) el cultivo in vitro de los embriones.
La PIVE es una técnica bastante atractiva ya que ha posibilitado la disminución
de los costos en la producción de embriones para transferir, el diagnóstico
embrionario, la clonación de células embrionarias y somáticas, la producción
de vacas transgénicas e igualmente, ha posibilitado profundizar mucho más
sobre los mecanismos de fertilización y embriogénesis. El congelamiento de
semen y vitrificación de blastocistos de llamas y alpacas, son técnicas de crio
preservación que provocan que la célula que decidimos conservar se mantenga
en una condición tal que permite su viabilidad una vez revertido el proceso. Así
se pueden almacenar distintas camadas celulares durante largos períodos.

1
II. DATOS GENERALES DE LA INSTITUCIÓN

2.1. Nombre de la institución:

 Universidad Nacional de Huancavelica

2.2. Tipo de institución:

La Universidad Nacional de Huancavelica es un lugar de conocimiento,

Investigación y Desarrollo. Estos tres principios, son la base de estrategias en
el aprendizaje, enseñanza, y la investigación, que ayudan a interactuar con el
mundo globalizado de la actualidad. Es por eso que ha pasado a desempeñar un
papel vital para el desarrollo de la región alto andina, así como de todo el Perú
e Internacionalmente, gracias a los convenios con universidades extranjeras y
nacionales.

2.3. Localización geográfica y política

2.3.1. Localización geográfica:

 Ciudad Universitaria de Paturpampa s/n Huancavelica-Perú

2.3.2. Ubicación:

• Latitud: 12° 47’ 06” S

• Longitud: 74° 58’ 17” O
• Altitud: 3.676 msnm

2
2.3.3. Localización política:
2.3.3.1. Limites o colindantes:

Figura 01. Mapa político de la Universidad Nacional de Huancavelica.

 Norte : Quiralquichi
 Sur : Asociación Villa Agraria
 Este : Empresa nacional de edificaciones
(ENACE)
 Oeste : Rio Tacsanapampa

2.3.3.2. Croquis:

A Comedor universitario F Facultad de Educación

B Auditórium G Facultad de CC. Empresariales
C Video conferencia H Facultad de Ingeniería
D Biblioteca central I Facultad de Enfermería
E Laboratorio central J Facultad de Derecho y CC.PP.

Figura 02. Croquis de la Universidad Nacional de Huancavelica.

3
2.4. Áreas de investigación:
2.4.1. Área total:
 Laboratorio de ciencias e investigación (ver anexo 01).
2.4.2. Área de investigación:
 Laboratorio de biotecnología reproductiva (ver anexo 02).

2.5. Recursos:
2.5.1. Recursos humanos:
 01 Jefe de laboratorio: Dr. Jaime Ruiz Béjar
 01 Ing. Zootecnista: Leandra Landeo Jurado
 02 Tesistas
 02 Practicantes

2.5.2. Recursos financieros:

El laboratorio de biotecnología reproductiva está financiado por el
Fondo de Desarrollo Socioeconómico de Camisea – FOCAM.

2.6. Organización:

El laboratorio de biotecnología reproductiva animal, se encuentra liderado por

el Dr. Jaime Ruíz Béjar, seguido de la ingeniera zootecnista Leandra Landeo
Jurado, quien tiene a su cargo los tesistas y practicantes de distintos
departamentos que realizan proyectos e investigaciones como equipo.

4
 2.6.1. Organigrama:

Asamblea universitaria

Comité de garantías
estatutarias

Comité electoral universitario

Tribunal de honor

Consejo universitario
Comisiones permanentes
y especiales

Órgano de control
Rectorado Comisión permanente
institucional
de admisión

Vicerrectorado administrativo Vicerrectorado académico

Sub sedes Escuela de post grado

Facultades
Facultad de educación
Facultad de enfermería

Facultad de ingeniería

Escuela académico
profesional de zootecnia
Laboratorio de
reproducción animal

Figura 03. Organigrama de la Universidad Nacional de Huancavelica

5
III. DEL PROCESO TECNOLÓGICO

3.1. Materiales, equipos y reactivos de laboratorio:

3.1.1. Materiales
3.1.1.1. Material biológico
Tanto los testículos como los ovarios, fueron colectados en el
camal municipal de Huancavelica, el cual se encuentra a 8
kilómetros de la ciudad, con un tiempo de transporte de 20
minutos. Las muestras de llamas y alpacas son recolectadas y
colocadas en bolsas de plástico por separado, luego puestos
en recipientes térmicos para su posterior transporte al
laboratorio.

Figura 04. Sala de oreo de camélidos en el camal municipal

de Huancavelica.

Figura 05. Extracción de testículos de alpaca para la colección

de espermatozoides epididimarios.

6
 3.1.1.2. Materiales de laboratorio (ver anexo 04)
 Estuche de disección
 Laminas porta y cubre objetos
 Papel toalla
 Papel aluminio
 Papel parafilm
 Guantes quirúrgicos
 Placas petri
 Eppendorf de 600 y 1500μl
 Puntillas para micropipeta
 Tubos Falcon graduados
 Cámara de neubauer
 Viales criogénicos
 Pajillas de 0.25cm3
 Vasos de precipitación
 Gradilla
 Caja de tecnopor
 Jeringas con agujas 21G

3.1.2. Equipos (ver anexo 03):

 Microscopio invertido
 Microscopio compuesto
 Platina caliente
 Cámara de flujo laminar
 Centrifuga
 Vortex
 Micropipetas
 Estereoscopio
 Balanza analítica
 Baño maría
 Refrigeradora

7
  Tanque de nitrógeno
 Estufa

3.1.3. Reactivos (ver anexo 05)

 NaCl 9%
 TCM-199
 HEPES
 Agua mili Q
 Aceite mineral
 Estradiol 17-β4
 Gentamicina
 BSA
 Etc.

3.2. Congelamiento de espermatozoides epididimarios de alpaca

3.2.1. Objetivos del proceso

 Evaluar calidad seminal de los espermatozoides epididimarios
 Mantener viable el material genético espermático de reproductores de
calidad.
 Evaluar características del semen post descongelado

3.2.2. Descripción del proceso

Los testículos recogidos del camal y llevados a laboratorio, son lavados
con solución fisiológica (NaCl al 9%) y puestos en una placa petri para
extraer cuidadosamente la cola del epidídimo.

8
 Figura 06. Placa petri con testículos de alpaca.

Figura 07. Placas petri con colas de epidídimo, retiradas con tijera y
pinza.

Una vez aislada la cola del epidídimo, se corta con bisturí para poder
extraer el líquido seminal, luego se diluye con 1ml de solución tris
yema (fracción A) que previamente estaba en baño maría a temperatura
de 37.5ºC.

Tabla 01. Solución base del dilutor tris yema.

Nº componente Cantidad
1 Tris 3.634g
2 Glucosa 0.500g
3 Acido cítrico 1.990g
4 Agua destilada 74ml
5 Yema de huevo fresco 20ml

9
 Tabla 02. Fracciones del dilutor tris yema.
Componente Fracción A Fracción B
Solución base 50ml 44ml
Glicerol ------ 6ml
Total 50ml 50ml

La placa petri se coloca sobre una platina caliente para mantener

constante su temperatura, y se extrae el contenido con una micropipeta
p1000 ul, para verterlo sobre un tubo cónico de centrifuga Falcon
graduado 15ml.

Figura 08. Extracción con micropipeta sobre platina caliente de líquido

seminal diluido.

Se deja reposar en cámara de CO2 a 37.5ºC durante 30min; para la

activación de la motilidad. Mientras la solución tris glicerol (fracción
B) de 1ml, se pone a refrigerar a 4ºC.
La fracción A, después de salir de la cámara de CO2, se extrae una gota
y es llevada al microscopio para evaluar su motilidad.

10
 Tabla 03. Equivalencias entre grados y espermatozoides motiles.
Grado de motilidad descripción Porcentaje de motilidad
5 Movimiento de onda intenso 90% vivos y motiles
Movimiento de onda rápido 70-85% vivos y motiles
4
pero menos intenso
Ondas muy tenues pero buena 45-65% vivos y motiles
3
actividad
2 Actividad pobre 20-40% vivos y motiles
Movimiento muy tenue Menos del 10% vivos y
1
motiles
0 No hay movimiento 0% vivos y motiles

Figura 09. Vista al microscopio de espermatozoides de alpaca con

motilidad 4.

.
normal
cabezas anormales
gota citoplasmatica
colas anormales

Figura 10. Proporción de espermatozoides después de la evaluación

de morfología espermática.

11
 Se procede a refrigerar la fracción A, dentro de un vaso de precipitación
con agua, a 4ºC durante dos horas, se prepara las pajillas de 0.25cm3
rotulándolas y dejando en una placa petri el alcohol polivinilico para el
sellado.
Pasado este tiempo ambas fracciones deben estar a 4ºC, se procede a
combinar la fracción B dentro de la fracción A, en dos partes, con
lapsos de 10 minutos, no todo de golpe pues el proceso podría resultar
muy violento para los espermatozoides. Luego de la combinación se
espera otros 10 minutos, para que se homogenice a nivel celular.
El empajillado, se procede sujetando la pajilla y pipeteando el dilutor,
por el lado del algodón dejando 0.5cm de burbuja de aire, y se tapona
con alcohol polivinilico que se gelifica y sella en contacto con un
líquido. Posterior al sellado se coloca por 10 segundos la pajilla dentro
de un vaso de precipitación con agua a 4ºC, luego se expone las pajillas
a vapor de nitrógeno a 6cm de altura por 10 minutos, pasado este
tiempo se sumerge al nitrógeno liquido (-196ºC), para luego ser
conservados en el tanque de nitrógeno.

Figura 11. Conservación de pajillas en tanque de nitrógeno a -196ºC.

Pasadas 24 horas, se descongela la pajilla a 37.5ºC en baño maría por

20 minutos y se procede a hacer la prueba de motilidad espermática.

3.2.3. Evaluaciones post descongelado

El semen utilizado para la producción de pajuelas ya tiene su apto
reproductivo, por lo tanto la evaluación post descongelado tiene como

12
 finalidad conocer si ese semen fue capaz de superar el proceso de
congelación – descongelación. Los factores que puedan afectar los
valores de evaluación corresponden a factores intrínsecos del semen, o
factores de manejo del mismo (falta de N2 líquido en el termo de
almacenamiento, etc.).
La descongelación de la pajuela se realiza a agua 37ºC. Durante un
minuto. La evaluación consta de los siguientes pasos:

Movilidad individual:
De 0horas y dos horas incubado a 37ºC. A la 0horas el valor mínimo
40% y a las 2 horas: 30% de espermatozoides motiles. Según el
departamento de medicina del rodeo y teriogenologia de la universidad
de Saskatchewan, Canadá y que corresponden con las normas ISO
9002, los valores son: 0hs de 25% y a las 12hs de 15%.

Tabla 4. Escala basada en la velocidad de movimiento de las células

móviles Barth (2001)

Valor descriptivo Velocidad del movimiento

0 Sin movimiento
Leve movimiento de cola sin desplazamiento
1
progresivo
lento movimiento de cola con algo de movimiento
2
progresivo
3 Movimiento progresivo a velocidad lenta
4 Movimiento progresivo rápido

Viabilidad:
Los espermatozoides son traslucidos y virtualmente invisibles al
microscopio de luz directa, por lo tanto, se requiere el uso de colorantes
que provean de un fondo oscuro para visualizarlos. Lo más
recomendable es la técnica en un solo paso, (en donde se mezcla el
colorante con el espermatozoide sobre el porta objetos), porque todo lo

13
que se encuentra en el semen puede ser observado, Alguna de estas
funciones son cosa de bengala, tinta china, la tinción de eosina -
negrosina o llamada vital. (Vivos - muertos).
La coloración vital (eosina, azul de anilina, o eosina - negrosina) es la
más comúnmente usada en la exanimación morfológica de esperma, el
azul de anilina y negrosina proveen un fondo oscuro, sobre el cual
resaltan los espermatozoides, la eosina por su pare tiñe las células,
penetrando la membrana de las células dañadas, tiñendo las lesiones y
espermatozoides no viables o muertas de rosa.

Fig. 12. Método de coloración de una muestra de semen usando eosina

negrosina. (Barth, 1989)

Se coloca una gota de 5 - 6 mm de diámetro de tinción eosina negrosina

en un extremo de porta objetos tibio, y seguido se coloca una gotita de
semen de 3 a 5 mm de diámetro cerca de la tintura, luego de haber
mezclado la tintura con el semen, y dejar actuar un minuto, la mezcla es
extendida de un lado hasta el otro con otro portaobjetos tibio, formando
una película delgada en la cual después de seca se puede hacer la
evaluación con un objeto de inmersión de aceite a 1000 - 1250
aumentos. Aumentos menores no revelan la mayoría de los defectos que
existen. Cuando hay pocas anormalidades es suficiente contar 100
espermatozoides y cuando encontramos gran cantidad de anormalidades
es recomendado contar 300 o más.

14
3.3. Aspiración y selección de ovocitos de alpaca y llama

3.3.1. Objetivos del proceso

 Recolectar ovocitos viables mediante aspiración folicular.
 Mediante la selección, evitar un cultivo innecesario de ovocitos, que
terminaran por degenerarse sin llegar a blastocisto, inclusive a
dividirse.

3.3.2. Descripción del proceso

3.3.2.1. Aspiración folicular de complejo cumulus – ovocitos

Se utilizaron ovario de alpacas obtenidos en el camal
municipal de Huancavelica, los que fueron transportados en
un termo al laboratorio.
El transporte de ovarios a 4 ºC, hasta por 24 horas, no altera
la viabilidad de ovocitos obtenidos.

La obtención de complejo cumulus – ovocitos (COCs) se

realizó por punción folicular de folículos de 2 a 8 mm de
diámetro, con una aguja de 18G y una jeringa de 5 ml.
Los folículos, de los cuales se extraen los ovocitos se
prefieren de un tamaño no inferior a los 2mm de diámetro.

Figura 13. Lavado de ovarios con agua destilada a 37.5ºC

con fin de limpiar las impurezas.

15
 Figura 14. Aspiración folicular con jeringa 21G.

Se recuperaron 2,2 COCs/ovario de llama y 3,5 COCs/ovario

de alpaca con 66% y 69% COCs de llama y alpaca
respectivamente seleccionados como aptos para la
maduración in vitro.

3.3.2.2. Selección de ovocitos para maduración

Los ovocitos son seleccionados bajo una lupa estereoscópica
con aumento de 40x en base a sus características
morfológicas. Se debe cultivar solo los ovocitos que posean
un COCs denso, con un mínimo de 5 capas que cubran la
totalidad de la superficie del ovocito, que su citoplasma sea
de color gris oscuro uniforme y no contenga manchas.

3.3.2.2.1. Categorías de CCOs

 Categoría 1: Se considera los complejo cúmulos-
ovocito(CCOs) con capas múltiples, compacto,
claro, transparente y con citoplasma de
granulación fina y homogéneas.

Figura 15. Clasificación de ovocitos categoría 1.

16
  Categoría 2: Son los del CCOs cúmulos algo
más oscuros y menos transparentes que los de la
categoría 1, con citoplasma de granulación más
gruesa y más oscura que los de la categoría 1.

Figura 16. Clasificación de ovocitos categoría 2.

 Categoría 3: Poseen cúmulos menos compactos

y más oscuro que los de la categoría 1 y 2, el
citoplasma tiene manchas oscuras.

Figura 17. Clasificación de ovocitos categoría 3.

 Categoría 4: Incluye a los ovocitos con COCs

expandido parcial o totalmente desnudos.

Figura 18. Clasificación de ovocitos categoría 4.

17
 3.3.3. Evaluaciones

Ovocitos de mala calidad serian aquellos de tamaño muy grande o muy

pequeños, los que presentan menos de 3 capas de células del cúmulos o
aquellos donde el cúmulos no están compactos o son de coloración
muy oscura. Ovocitos de mala calidad derivan de folículos en atresia.

3.4. Maduración in vitro de ovocitos de alpaca y llama

3.4.1. Objetivo del proceso

 Lograr maduración citoplasmática para que ocurra una fertilización
exitosa que conlleve a un desarrollo embrionario normal.

3.4.2. Descripción del proceso

En forma natural en el folículo, la maduración del ovocito responde a
los mensajes endocrinos y otros mecanismos de regulación. Durante el
estro la secreción del pico ovulatorio de LH induce la rápida
luteinización de las células de la granulosa. A las 6 horas después del
máximo nivel del pico de LH, la concentración de estradiol en el líquido
folicular declina rápidamente debido a la inhibición en la síntesis de
androstenediona por las células de la teca como respuesta a la LH. La
androstenediona es el precursor para la síntesis del estradiol en las
células de la granulosa. Sin embargo, las células de la granulosa son
capaces de sintetizar estradiol hasta 14 horas después del pico de LH
pero la falta de precursor (androstenediona) determina que la
producción de estradiol decaiga.
El curso de la maduración in vitro es similar al proceso in vivo
observado luego del pico de LH. En el caso in vitro, durante las
primeras 6 horas de cultivo los ovocitos permanecen al estadio de
vesícula germinal (VG). La ruptura de la vesícula germinal (RVG)

18
ocurre durante las 6 y 8 horas de iniciado el cultivo. Estadios M-I son
observados predominantemente alrededor de 12 a 14 horas de iniciado
el cultivo. A partir de las 20 horas después de haber sacado los ovocitos
del folículo ovárico y haberlos puesto en condiciones de maduración in
vitro la mayoría de los ovocitos están en el estadio M-II de la meiosis.
Estudios hechos a diferentes intervalos desde el inicio de la maduración
in vitro muestran que luego de la RVG hay alteraciones significativas en
las proteínas del ovocito lo que indica alteraciones a nivel
citoplasmático durante la maduración in vitro.
Los COCs seleccionados fueron lavados 4 veces en medio de
maduración TCM-199 modificado con HEPES compuesto
suplementado con piruvato de sodio en una concentración de 0.2 mM,
sulfato gentamicina (sigma) 50 ug/ml, FSH (Sigma) 0.02 unidades /ml,
estradiol 17-β un ug/ml (Sigma) y suero fetal bovino al 10%.

Figura 19. Clasificación de ovocitos categoría 4, de alpaca para su

maduración mediante estereoscopio.

Posteriormente fueron transferidos a una placa petri (falcon 1008) que

contenía gotas de 50 ul de solución TCM-199 de maduración recubierta
de aceite mineral (Sigma). En dichas gotas los COCs fueron
nuevamente lavados. Los COCs logrados de esta forma fueron

19
cultivados a 37.5°C por un lapso de 24 horas en estufa de cultivo con
atmosfera húmeda de 5% CO2 al aire.
Después del periodo maduración los COCs fueron sometidos a vortex
por 3 minutos en tubo eppendorf que contenía solución PBS adicionada
de hialurodinasa al 0.1% luego los ovocitos fueron lavados 4 veces en
solución TCM – 199 de lavado los Ovocitos fueron observados bajo
una lupa estereoscópica con aumento de 40x para separar a los que
tenían corpúsculo polar, considerado ovocitos maduros.

Corpúsculo polar

Figura 20. Se observa corpúsculo polar en ovocito maduro.

Fibroblastos

Figura 21. Ovocito maduro con fibroblastos visto en microscopio

invertido.

20
3.4.2.1. Factores importantes para la maduración in vitro de
ovocitos

Para que la maduración in vitro sea exitosa, el medio en el cual

se realizara debe proveer condiciones optimas para los
complejos cúmulos. Entre estos factores se cuentan con pH,
atmosfera gaseosa en la estufa de cultivo, osmolaridad, uso de
suplementos proteicos y hormonas.

pH y ambiente gaseoso.

El PH del medio debe mantenerse cercano al del plasma

sanguíneo (PH 7,4), de ahí la importancia del bicarbonato que
actúa como sustancia buffer y además como nutriente esencial,
otro buffer suplementado al medio de cultivo es el 4-(2-
hidroxietil)-1-piperazinaetansulfonico (HEPES). Se utiliza en
concentraciones entre 10 y 50 mM, en un rango de pH entre el
7,2 – 7,8 es un buffer más fuerte que el bicarbonato y no
requiere de co2 por lo que su función es regulador de pH es
más efectiva fuera de la estufa de cultivo.

La osmolaridad:

Debe variar entre 275 y 285 mosm, niveles que son

ligeramente inferiores a los del plasma (290mosm
aproximadamente). Sin embrago esta condición hipotónica del
medio es para compensar la evaporación durante la incubación.

Proteínas:

El suero junto con la albúmina bovina, es el complemento

orgánico más importante de los medios. En su preparación se
utiliza albúmina de suero bovino o suero fetal. La albúmina
sérica bovina fracción V es la más utilizada por la ventaja de
su presentación en polvo. El suero mas empleado para su

21
 preparación de medios de maduración es el suero fetal bovino
en concentraciones de 2% al 10%.

Hormonas.

La suplementación de los medios de maduración con

hormonas, se basa en el importante rol de las gonadotropinas
luteinizantes (LH) y folículo estimulante (FSH), en el
desarrollo folicular y del ovocito in vivo. Las gonadotropinas
aumentan la capacidad de desarrollo de ovocitos maduros en
medios libres de suero.

3.4.3. Evaluaciones

La maduración ocurre in vivo al interior del folículo y es el proceso

durante el cual se produce la reactivación de la división meiotica hasta
alcanzar la metafase de la segunda división meiotica, momento en el
que el ovocito retorna al arresto miótico hasta que sea fecundado.

3.5. Fertilización in vitro de ovocitos de alpaca

3.5.1. Objetivos del proceso

 Unir a un ovocito maduro con un espermatozoide capacitado, que
conlleve a un desarrollo embrionario normal.

22
3.5.2. Descripción del proceso

3.5.2.1. Método de recuperación de espermatozoide epididimarios

Existe una relación directa entre el tamaño testicular y la

producción espermática. Las diferencias en el tamaño testicular
están influenciadas por las concentraciones hormonales de
testosterona (T), estradiol (E2) y LH (hormona luteinizante).
Las concentraciones séricas de LH durante el período pre-
puberal son parcialmente responsables del crecimiento
testicular y del aumento de las concentraciones de T.
Se utilizaron testículos de alpacas (superiores a 4cm de largo)
obtenidos en el camal municipal de Huancavelica los que
fueron transportados en un termo al laboratorio. La
recuperación de espermatozoides se realizó aislando la cola del
epidídimo, previa limpieza aislando las arterias y el exceso de
grasa con la ayuda de una pinza y tijera en NaCl 9%.

Figura 22. Selección de testículos de alpaca mayor a 4cm.

23
 Figura 23. Extracción de semen desde la cola del epidídimo
en medio Sperm-talp.

Seguidamente se lavó y capacitó en 1.5ml de medio SPERM

TALP (SP-TALP), realizando 2 centrifugaciones a 1800 rpm
por 5 minutos cada una. Se elimina el liquido sobrenadante y
nos quedamos con el pellets (acumulo de espermatozoides que
queda en el fondo del tubo), al pellet se le añade 2ml de FERT
TALP, y se coloca en la cámara de CO2 durante 30 minutos,
con una inclinación de 45º.

Figura 24. Tubo cónico Falcon con pellets en medio FERT

TALP.

Esta técnica denominada swim up, tiene como fin la de separar

los espermatozoides de mejor calidad del resto y la eliminación
del líquido seminal.
La capacitación espermática es un complejo fenómeno que
resulta en la adquisición de la habilidad de secretar enzimas
por el espermatozoide, enzimas que son necesarias para la
penetración de la zona pelucida. Ocurren también otros

24
 cambios moleculares en el espermatozoide que lo habilitan
para realizar la fecundación.

Figura 25. Metodo Swim-up (método de separación de

espermatozoides).

3.5.2.2. Fertilización de ovocitos

Para asegurar una normal fertilización, se requiere que los

ovocitos estén al estado adecuado de maduración (categoría 1
o 2), que se disponga de espermatozoides recién
“capacitados” y que el micro ambiente de fertilización sea
optimizado.
La vida fecundante de los gametos es relativamente corta una
vez que han sido madurados (la capacitación es la
maduración del espermatozoide) el envejecimiento de los
gametos es la causa principal de anormalidades embrionarias
y muerte embrionaria temprana.

25
 Figura 26. Fertilización de un ovocito maduro.

La placa petri que contiene a los ovocitos maduros es retirada

de la cámara de CO2 y puesta sobre una platina caliente a
37.5ºC, mientras ya se ha preparado una nueva placa petri
con 7 gotas de FERT TALP, cubiertas con aceite mineral y
puestas en la cámara de CO2. Se extraen los ovocitos
maduros y se realizan dos lavados, uno con SOF HEPES y
otro con el medio FERT TALP, terminado los lavados se
coloca en la nueva placa que contiene FERT TALP.

Figura 27. Cambio de ovocitos maduros de medio TCM

suplementado, a medio FERT TALP.

26
 Figura 28. Evaluación de motilidad espermática para
fertilización in vitro (motilidad 4).

Teniendo los espermatozoides listos para inseminar,

utilizamos 5ul de muestra de semen en cada gota de cultivo
conteniendo 8-10 ovocitos maduros que fueron llevados a la
estufa de CO2 al 5% por un periodo de 18 horas, para luego
ser cambiado a medio de cultivo.

3.5.3. Evaluaciones
A las 48 horas de evaluación 42.3% de ovocitos inseminados dividieron
(embriones de dos células)

Figura 29. Embrión de 2 células.

27
3.6. Cultivo de embriones

3.6.1. Objetivos del proceso

Darle el medio adecuado a los ovocitos fecundados, para su normal
desarrollo.

3.6.2. Descripción del proceso

Pasada las 18 horas post inseminación, se retiraron las células de la
granulosa y los detritos celulares mediante agitación mecánica (vortex)
en medio TALP-HEPES. Los ovocitos libres de cumulus se lavaron en
medio TALP-HEPES y en SOF-IVC 2 veces en cada uno y se
cultivaron en gotas de 50 ul de SOF-IVC durante 8 días a 37.5ºC en
atmosfera con 5% de CO2.

Figura 30. Partes de un embrión 8-16 células.

Figura 31. Cultivo de embriones en cámara de CO2 por 18

días.

28
3.6.2.1. Evaluación de tasa de desarrollo

Se evaluó la tasa de segmentación a las 48 horas post –

inseminación in vitro y la tasa de mórulas y blastocistos a los
8 días post-inseminación.

Figura 32. Desarrollo embrionario normal (de izquierda a

derecha).

F
i
g
u
r
a

3
3
.

Figura 33. Cronología del desarrollo embrionario in vitro.

29
 Figura 34. Desarrollo embrionario anormal (células asimétricas).

3.6.3. Evaluaciones
De los 504 ovocitos fertilizados (126 X4 replicas) se obtuvieron 6% de
blastocistos tempranos y un 4.7% de blastocistos eclosionados.

3.7. Vitrificación de blastocistos de alpaca

3.7.1. Objetivo del proceso

 Disminuir el daño post descongelación con un método practico de
preservación.

3.7.2. Descripción del proceso

La vitrificación es una técnica de congelación ultrarrápida basada en el

contacto directo entre la solución de vitrificación que contiene los
agentes crioprotectores con las células y el nitrógeno líquido. La
definición física de la vitrificación es la solidificación de una solución a
baja temperatura sin que ésta llegue a cristalizar debido a un enorme
incremento de la viscosidad, manteniendo así la distribución molecular
e iónica que existía antes de la congelación.
La solución vitrificante utilizada posee crioprotectores en alta
concentración que al ser enfriados no cristalizan, sino que se torna

30
viscosa y pasa del estado líquido al sólido no estructurado similar al
vidrio, tomando de allí su nombre.
Se ubica el estadio de blastocisto en las placas de cultivo con SOF IVC.

Figura 35. Blastocisto eclosionando.

Los blastocistos se suspendieron en un medio de equilibrio (SV-I)

consistente de 4% etilenglicol (EG, Sigma) diluido en una solución base
(SB) compuesta por TCM-199 con 25 mM de Hepes (Sigma)
suplementado con 20% de suero fetal bovino (Sigma) y 50 μg/ml de
sulfato de gentamicina (Sigma) por 12-15 minutos sobre una platina
temperada a 39 ºC. Luego, los ovocitos se colocaron en una solución de
vitrificación (SV-II) consistente de 35% EG, 5% de polivinilpirrolidona
(PVP, Sigma) y 0,4 M trehalosa (TRE, Sigma) en SB por 30 segundos.

Figura 36. Platina caliente con placa petri que contiene las soluciones
SB, SV-I Y SV-II de izquierda a derecha respectivamente.

31
Inmediatamente, microgotas de 3,5 μl de SV-II conteniendo 4-6
ovocitos se dejaron caer sobre una superficie de papel de aluminio
preenfriado flotando en nitrógeno líquido.

Figura 37. Vitrificación de la gota de 3,5 μl SV-II con blastocisto que

cae sobre papel aluminio flotante en nitrógeno liquido.

Con ayuda de una pinza preenfriada las microgotas vitrificadas fueron

transferidas hacia un vial criogénico de plástico de 2 ml preenfriado y
fueron almacenadas en nitrógeno líquido.

Figura 38. Blastocisto vitrificado con SV-II, se encuentra sobre papel

aluminio flotando en nitrógeno líquido contenido en una caja tecnopor.

32
 Figura 39. Conservación de blastocistos en viales criogénicos a -196ºC.

3.7.3. Conclusiones sobre la vitrificación

 La vitrificación afecta la sobrevivencia y el desarrollo embrionario de

ovocitos de alpaca vitrificados/descongelados.

 Total eliminación de la formación de hielo.

 Disminución del daño causado por el enfriamiento.

 No requiere equipos de congelación caros o sofisticados.

IV. EVALUACIÓN DE LA INSTITUCIÓN

4.1. Indicadores de la producción

4.1.1. Congelamiento de espermatozoides epididimarios de alpaca

Tabla 5. Resultados de evaluaciones de espermatozoides epididimarios

de alpaca

Prueba Respuesta
Motilidad individual 24%
Viabilidad (%vivos) 60%
pH 7.5

33
4.1.2. Aspiración y selección de ovocitos de alpaca y llama

Tabla 6. Promedio de COCs por ovario, recuperados y el nivel

porcentual de calidad, recuperados de ovarios de llamas y
alpacas.

Ovarios COCs/ ovario COCs aptos para

(promedio) maduración in vitro
Llama 2.2 66%
Alpaca 3.5 69%

4.1.3. Maduración in vitro de ovocitos de alpaca y llama

Tabla 7. Porcentajes y tiempo de Maduración in vitro en alpacas y
llamas.
Especie Tiempo de maduración (horas) % maduración

Alpaca 25 95
llama 25 75

4.1.4. Fertilización in vitro de ovocitos de alpaca

Tabla 8. Fertilización in vitro de alpacas.
Numero de Numero de
Método % División
ovocitos replicas
SWIN UP 126 4 42.3

34
 4.1.5. Cultivo de embriones

Tabla 09. Porcentajes de División celular y desarrollo embrionario de

alpaca
División de 2 a Mórula Blastocisto (%)
Especie
32 células (%) (%) Temprano Eclosionado
Alpaca 32 5.6 6 4.7

4.2. Fortalezas y debilidades

4.2.1. Fortalezas

Se cuenta con un laboratorio ampliamente equipado para el desarrollo

de biotecnología reproductiva.

Se cuenta con el financiamiento económico del Fondo de Desarrollo

Socioeconómico de Camisea – FOCAM.

Convenios que mantiene la escuela de zootecnia de la Universidad

Nacional de Huancavelica, con los ganaderos de la localidad, quienes
dejan a disposición los animales con fines de investigación, recibiendo
a cambio asistencia por parte de los docentes y alumnos.

4.2.2. Debilidades

Inadecuada división de los ambientes de trabajo, dificultando los

trabajos de investigación por los agentes contaminantes.

35
 No hay un sistema de emergencia de electricidad, cuando los sistemas
regulares fallen para los equipos en funcionamiento, el trabajo en curso
se estropeara.

Deficiente integración con todas las unidades campesinas ganaderas

para un desarrollo integral.

Abandono de los estudiantes universitarios, a su institución por falta de

recursos económicos.

V. ANALISIS DE IMPACTO AMBIENTAL

Los compuestos orgánicos volátiles, a veces llamados VOC (por sus siglas en
inglés), se convierten fácilmente en vapores o gases.
Es muy importante evitar la entrada de estos compuestos perjudiciales para la salud
en los laboratorios de FIV ya que pueden contener compuestos embriotóxicos que
perjudiquen a los embriones. Sin embargo, estos compuestos presentan la dificultad
de que no pueden ser eliminados mediante los filtros normales. Para la eliminación
de estos COV en los laboratorios de FIV se emplean filtros de carbón activo con
distintas concentraciones de permanganato potásico. Por eso es importante manejar
cualquier tipo de elaboración de medios, dentro de una cámara de flujo laminar que
contenga estos filtros de carbón activo, como la que se emplea en laboratorio de
biotecnología reproductiva de la Universidad Nacional de Huancavelica.
Muchos compuestos orgánicos volátiles son peligrosos contaminantes del aire. La
importancia de los COV reside en su capacidad como precursores del ozono
troposférico y su papel como destructores del ozono estratosférico.

36
VI. CONCLUSIONES

El éxito de todos los protocolos relacionados a la biotecnología reproductiva, radica

en la correcta elaboración y empleo de los medios específicos de cada prueba.

El método de capacitación espermática Swin up, es altamente eficiente tanto en

resultados, como en ahorro de recursos.

Para tener éxito en la fertilización in vitro, es muy importante que los ovocitos sean
de las categorías I, II, III ya que los de categoría IV se degeneran en el transcurso
del desarrollo y no segmentan.

La atmósfera de trabajo con mezcla de gases de 90%N. 5%O2 y 5%CO2 es

indispensable en la producción in vitro, por mantener las concentraciones más
similares a las que se encuentran en el oviducto.

La vitrificación de ovocitos presenta mayores índices de fecundación y desarrollo

que la congelación tradicional, porque evita lesiones celulares al pasar rápidamente
por el rango de temperatura de mayor peligro, que es entre +15 a -5 ºC.

37
VII. RECOMENDACIONES

El manejo de equipos, instrumentos y reactivos deben realizarse con la mayor

asepsia posible para evitar contaminación de las muestras, teniendo en cuenta que
todo medio de cultivo debe prepararse en la cámara de flujo laminar.

Emplear el método de Swin Up resulta ideal por ser un método de capacitación

espermática sencillo y de bajo costo, y que además no genera toxicidad.

Trabajar con ovocitos de categoría superior a la IV, pues muchas veces llegan a ser
madurados y fertilizados correctamente, pero al momento del desarrollo
embrionario, son los primeros en degenerarse.

Llevar a campo todos los resultados obtenidos en el laboratorio para el desarrollo

de la ganadería, cómo realizar transferencia de embriones en alpacas obtenidos de
ovocitos producidos in vitro.

En la vitrificación hay que fijar bien el objetivo con la micropipeta y aspirar. Esta
técnica es muy conveniente porque evita lesiones celulares al pasar rápidamente
por el rango de temperatura de mayor peligro, que es entre +15 a -5 ºC.

38
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Atabay, C., M. Martinez, O. Dochi, y Takahashi. 2001. Factors affecting

enucleation rates of bovine and porcine oocytes alter renoval of cumulus cells by
vortexing. J. Reprod. Dev. 47: 365-371.

Chaves, M.G; M.H. Miragaya; E.F. Capdevielle; B.Rutter, S.Guliano; A. Aguero.

2003. Maduración in vitro de ovocitos de vicuña obtenidos por aspiración
quirúrgica de folículos de ovarios superestimulados. III Congreso de la
Asociación Latinoamericana de Especialistas de Pequeños Rumiantes y Camélidos
Sudamericanos. ALEPRYCS. Viña del Mar – Chile.

Del Campo, M.R.; M.X. Donoso; C.H. Del Campo; R. Rojo; C. Barros; R.
Mapletoft.1992. In vitro maturation of Llama (lama glama) oocytes. Proc 12th Int
Cong Anim Reprod,1992; vol I, p 324.

Hoshi, H. 2003. In vitro producction of bovine embryos and their application for
embryo transfer. Theriogenology 50: 675-685.

Palma, G. 2001. Producción in vitro de embriones bovinos. En: biotecnología de la

reproducción. Primera Edición, Ediciones Instituto Nacional de Tecnología
Agropecuaria (INTA), Balcarse. Argentina.

Rath, D. 2001. Producción in vitro de embriones porcinos, en: biotecnología de la

reproducción. Primera edición, Ediciones Instituto Nacional de Tecnología
Agropecuaria (INTA), Balcarse. Argentina.

Ruiz, J.A., J.E. Correa. Maduración in vitro de ovocitos de alpaca y llama

recuperados vía Laparoscópica Universidad Austral de Chile.

39
IX. ANEXOS

Anexo 01. Plano de laboratorio de ciencias e investigación.

65m

82.15m

17.15m

23. 5m

Anexo 02. Plano de laboratorio de biotecnología reproductiva.

40
Anexo 03. Equipos

 Baño maría:
Confiere temperatura uniforme a una sustancia líquida o sólida o
para calentarla lentamente, sumergiendo el recipiente que la
contiene en otro mayor con agua que se lleva a o está en ebullición.

 Microscopio invertido
El microscopio invertido es una variante del microscopio
convencional que, tal y como indica su nombre, tiene invertida la
posición normal de los objetivos, que están, en el revólver, por
debajo de la platina, mientras que la luz de la fuente de iluminación,
a través del condensador y del diafragma, llega desde encima de la
platina, lo que facilita cierto tipo de trabajos como el control del
estado de las monocapas celulares cuando se trabaja con botellas o
tubos de cultivo.

41
 Balanza analítica:
Indispensable para el pesado exacto de los reactivos de distintos
medios a preparar en laboratorio.

 Cámara de CO2:
Cámara que brinda niveles de CO2 o alguna mezcla de gases para
medios de cultivo o capacitación, presentando niveles controlados
de presión y humedad.

42
 Estufa:
La estufa de secado se emplea para esterilizar o secar el material de
vidrio y metal utilizado en los exámenes o pruebas, que realiza el
laboratorio y que proviene de la sección de lavado, donde se envía
luego de ser usado en algún procedimiento. La esterilización que se
efectúa en la estufa se denomina de calor seco y se realiza a 180 °C
durante 2 horas.

 Platina caliente:
La platina caliente (termoplatina) puede calentarse hasta 50°C. Si la
temperatura de la muestra colocada en una cápsula de Petri o sobre
un portaobjeto es inferior al valor de proceso indicado, debe
modificarse el valor ajustado para que la temperatura de la muestra
sea adecuada. En caso contrario la muestra podría resultar dañada.

43
 Centrifuga:
Este aparato somete la muestra a fuerzas de aceleración que obligan
a las moléculas a concentrarse en el fondo del envase utilizado,
separándolas del medio en que se encuentran. Incluso, bajo ciertos
métodos se puede generar un gradiente de concentraciones dentro
del mismo tubo, separando distintas moléculas a distintos niveles o
fases dentro del tubo.

 Tanque de nitrógeno:
Los tanques de nitrógeno líquido son en realidad grandes botellas de
vacío con un sistema de aislamiento muy eficiente. Un tanque
interno que contiene el nitrógeno líquido se encuentra suspendido
del tanque externo por el cuello (a temperatura interna de -196ºC).

44
 Cámara de flujo laminar:
La cámara de flujo laminar tiene la función de proteger de
contaminación al operador, producto y medio ambiente, por medio
del aire filtrado estéril (HEPA) y régimen de aire laminar (Los
filtros HEPA retienen un 99% de eficiencia las partículas de hasta
0.3 micrones).

 Micropipetas:
Las micropipetas son extremadamente útiles en los laboratorios de
biotecnología. Estas permiten medir con precisión volúmenes tan
pequeños como 0.1 μl hasta 1 ml. Las puntas de micropipetas vienen
con distintas características de acuerdo al uso que se les dé.

45
Anexo 04. Materiales

Materiales para pruebas de mortalidad y concentración espermática (de

izquierda a derecha: regla de metal, eppendorf con eosina negrosina, dos
cámaras de neubauer).

Equipos para selección de ovocitos (de izquierda a derecha: estereoscopio y

placas petri cuadriculadas).

46
Materiales para vitrificar (de izquierda a derecha: caja de tecnopor, hilo
para sujetar viales, dos viales criogénicos rotulados, tubo cónico de
centrifuga falcon, balsa de papel aluminio, guantes aislantes, pinzas).

Anexo 05. Reactivos y preparación de medios

Pesado de reactivos para distintas concentraciones de medios

47
Conservación de medios a 4ºC

48
 MEDIOS EMPLEADOS EN LABORATORIO
MADURACION IN VITRO
TCM-199 de trabajo o stock para IVM

Componentes Cantidad/50 ml

TCM-199 polvo(M 5017) O,75 g

NaHCO3 0,11 g

HEPES 0,298g

Agua mili Q completar hasta 50 ml

Duración un mes a 4° C.

SUPLEMETAR CON:

Componentes Concentración final Volumen/10 ml

TCM-199 de trabajo 90% 9 ml

FCS 10% 1ml

FSH1 0,02 unid./ml 10 μl (stock)

Piruvato de sodio2 0,2 Mm 20 μl (stock)

Gentamicina3 50 μg/ml 10 μl (stock)

Estradiol 17-β4 1 μg/ml 10 μl (stock)

Usar dentro del día de preparación

1. FSH stock: 20 A.U. FSH/1000 μl de suero fisiológico.
2. Piruvato de sodio stock: 11 mg ácido pirúvico/1000 μl de suero fisiológico.
3. Gentamicina stock: Sulfato de gentamicina 50 mg/1000 μl de suero fisiológico.
4. Estradiol stock: Estradiol 17-β 5 mg/5000 μl de etanol absoluto.

49
ACTIVACION QUIMICA
mSOF- HEPES (SOFH): Fluido de Oviducto Sintético con HEPES

Componentes Concentración Volumen/100 ml Volumen/50

ml

Stock A -- 10,0 ml 50,0 ml

Stock B -- 1,33 ml 0,665ml

HEPES 25 mM 595,8 mg 297,9mg

Piruvato de Na 0,33 mM 3,6 mg 1,8mg

L-glutamina 1 mM 14,6 mg 7,3mg

Glucosa 1mM 18,0 mg 9,0mg

Glicina 5 mM 37,5 mg 18.75mg

Taurina 5 mM 62,5 mg 31,25mg

Lactato de Sodio 3,30 mM 47,0 μl

(60%) 23,5ul

BME 50 x 2 ml 1ml

MEM 100 x 1 ml 0,5ml

Insulina 10 μg/ml 100 μl (stock) 50ul

Sulfato de 50 μg/ml 100 μl (stock)

gentamicina 50ul

BSA 1 mg/ml

Ajustar pH, adicionar 900 μl NaOH 1N pH: 7,4

BSA: Adicionar antes de usar y filtrar.

50
m SOF – IVC
Fluido Sintético del Oviducto Modificado, mSOF (Takahashi et al., 1996)

Componentes Concentración Volumen /100 ml Volumen /50 ml

Stock A -- 10,0 ml 5,0ml

Stock B -- 16,2 ml 8,1ml

Piruvato de Sodio 0,33 mM 3,6 mg 1,8mg

L-glutamina 1 mM 14,6 mg 7,3mg

Glucosa 1 mM 18 mg 9,0mg

Glicina 5 mM 37,5 mg 18,75mg

Taurina 5 mM 62,5 mg 31,25mg

Lactato de sodio 3,3 mM 47 μl (stock)

60%1 23ul (stock)

BME2 50 x 2 ml 1ml

MEM3 100 x 1 ml 0,5ml

Insulina4 10 μg/ml 100 μl (stock) 50ml (stock)

Sulfato de 50 μg/ml 100 μl (stock)

gentamicina5 50ml (stock)

Agua mili Q Completar hasta completar hasta

100 ml 50ml

BSA Sigma A-6003 3 mg/ml --- --------------------

--

Duración una semana a 4 º C

1. Lactato de Sodio stock: 600 μl lactado de sodio/400 μl de agua Mili Q.
2. BME: 12 aminoácidos esenciales para medio base Tagle.
3. MEM: 7 aminoácidos no esenciales para medio esencial mínimo.
4. Insulina stock: insulina 1 mg/10 μl ácido acético/1000 μl de agua Mili Q.
5. Gentamicina stock: Sulfato de gentamicina 50 mg/1000 μl de suero fisiológico.

51
Stock A

Componentes Concentración Cantidad/100 ml Cantidad/50 ml

NaCl 107,7 mM 6,294 g 3,147g

KCl 7,16 mM 0,534 g 0,267g

NaH2PO4 1,19 mM 0,162 g

(2H2O) 0,081g

CaCl2 (2H2O) 1,71 mM 0,2514 g 0,1257

MgCl2 (2H2O) 0,49 mM 0,0996 g 0,0498g

Rojo fenol -- 100 μl

(0,5%) 50ul

Agua mili Q -- Completar hasta 100 ml completar hasta

50ml

Duración un mes a 4° C

Stock B

Componentes Concentración Cantidad/100 ml Cantidad/50ml

NaHCO3 37 mM 1,3 g 0,65g

Rojo fenol -- 100 μl

(0,5%) 50 μl

Agua mili Q Completar hasta 100

ml Completar hasta 50ml

Duración un mes a 4° C

Solución de Hialuronidasa

Componentes Cantidad/10 ml

PBS(-) 10x 1 ml

Agua Mili Q 9 ml

Hialuronidasa 10 mg

Almacenar a – 20º C. Alícuotas de 0,5 ml.

52
 MEDIOS UTILIZADOS PARA FECUNDACIÓN IN VITRO DE OVOCITOS
BOVINOS Y CAMELIDOS

SP-TALP (medio de lavado y capacitación de espermios)

Componente (mM) 100 ml (mg) ul stock sales

- NaCl 100 584,4 mg 2500 ul 4M

- KCl 3,1 23,1 mg 310 ul 1 M

- NaHCO3 25 210 mg

- NaH2PO4 0,3 3,6 mg 300 ul 0,1 M

- Lactato de Na 21,6 368 ul

- Ca Cl2 x 2H2O 2 29,4 mg 200 ul 1M

- Mg Cl2 x 6H2O 0,4 8,1 mg 399 ul 0,1 M

- HEPES 10 238 mg

(1%) 100 ul; (0,5%) 200

- Rojo Fenol ul

Titular pH = 7,4, Mantener Refrigerado (15 a 30 días)

SUPLEMENTO : Para 10 ml de Medio

(agregar antes de filtrar para usar)

- Piruvato Na 1,0
mM 10 ul en 10 ml medio

50 ug/ml, 10 ul stock en 10 ml
- Gentamicina medio

- BSA F V (A-
8022) 6 mg/ml

Filtrar 0,22 um
Incubar al menos 2 horas antes de usar

53
TALP-HEPES (Medio de lavado de ovocitos)

Componente (mM) 100 ml (mg) ul stock sales

- NaCl 114 666 mg 2849 ul 4 M

- KCl 3,2 23,8 mg 319 ul 1 M

- NaHCO3 2 16,8 mg

- NaH2PO4 0,4 4,8 mg 400 ul 0,1 M

- Lactato de Na 10 187 ul

- Ca Cl2 x 2H2O 2 29,4 mg 200 ul 1M

- Mg Cl2 x 6H2O 0,5 10 mg 492 ul 0,1 M

- HEPES 10 238 mg

(1%) 100 ul; (0,5%)

- Rojo Fenol 200 ul

Titular pH = 7,4, Mantener Refrigerado (15 a 30 días)

SUPLEMENTO: Para 10 ml de medio

(agregar antes de filtrar para usar)

- Piruvato Na 0,2 mM 10 ul en 10 ml medio

50 ug/ml, 10 ul stock en 10 ml
- Gentamicina medio

- BSA F V (A-8022) 30 mg

Filtrar 0,22 um
Temperar antes de usar

54
 FERT-TALP (Medio de fecundación)

Componente (mM) 100 ml (mg) ul stock sales

- NaCl 114 666 mg 2849 ul 4M

- KCl 3,2 23,8 mg 319 ul 1 M

- NaHCO3 25 210 mg

- NaH2PO4 0,4 4,8 mg 400 ul 0,1 M

- Lactato de Na 10 187 ul

- Ca Cl2 x 2H2O 2 29,4 mg 200 ul 1M

- Mg Cl2 x 6H2O 0,5 10 mg 492 ul 0,1 M

- HEPES --------------

(1%) 100 ul; (0,5%)

- Rojo Fenol 200 ul

Titular pH = 7,8 Mantener Refrigerado (15 a 30 días)

SUPLEMENTO : Para 10 ml de Medio

(agregar antes de filtrar para usar)

- Piruvato Na 0,2 mM 10 ul en 10 ml medio

50 ug/ml, 10 ul stock en 10 ml
- Gentamicina medio

- BSA Faty Free (A-

6003) 6 mg/ml

Filtrar 0,22 um
Temperar antes de usar
- Al inseminar agregar: Heparina

55