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Seminario 7

Análisis de macronutrientes: proteínas, lípidos e hidratos de carbono

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ANÁLISIS DE MACRONUTRIENTES: PROTEÍNAS, LÍPIDOS E HIDRATOS DE CARBONO

ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

Las proteínas son el constituyente principal de las células y resultan imprescindibles para el crecimiento, la reparación y la continua renovación de los tejidos corporales. Además tienen también funciones reguladoras vitales y pueden ser utilizadas con fines energéticos. El contenido en proteínas (y de otros macro y micronutrientes) debe reflejarse en la etiqueta en la sección referente al etiquetado de propiedades nutritivas. Para llevar a cabo este fin, se deben realizar las determinaciones analíticas de dicho nutriente.

La determinación de proteínas puede realizarse mediante diferentes métodos analíticos. Entre los más frecuentemente empleados podemos encontrarnos a los que implican reacciones de unión de tintes a proteínas para su posterior determinación mediante espectrofotometría, como el método de Bradford (azul brillante de Coomassie como tinte, medida a 595 nm) o método de Lorry (reacción del reactivo de Folin y Denis con tirosina, único aminoácido fenólico de las proteínas), métodos de combustión (método de Dumas, determinación del NO 2 generado en la combustión) o métodos que emplean la interacción de radiación infrarroja cercana con el alimento para la determinación directa de la proteína (métodos de infrarrojo cercano (NIRS)). Sin duda alguna, uno de los métodos más empleados y conocidos es el método Kjeldahl que describiremos en más profundidad.

El método tiene tres etapas: digestión, destilación y valoración. La digestión (1) consiste en realizar una mineralización de la muestra, con el objeto de transformar el nitrógeno orgánico en nitrógeno amoniacal en medio ácido (NH 4 + utilizando ácido sulfúrico). Posteriormente, se separa por destilación (2) en medio alcalino como NH 3 . Finalmente, este NH 3 se determina volumétricamente mediante una valoración ácido-base (3). El amoniaco se puede recoger en HCl en exceso y valorar en HCl no consumido con NaOH hasta el viraje del rojo de metilo. También se puede recoger el amoniaco en una disolución de ácido bórico (H 3 BO 3 ) y posteriormente valorar el borato (H 2 BO 3 - ) generado hasta el viraje del verde de bromocresol utilizando HCl.

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macronutrientes: proteínas, lípidos e hidratos de carbono El contenido de proteína del alimento es el resultado

El contenido de proteína del alimento es el resultado de multiplicar el contenido de nitrógeno calculado del modo anterior, por un factor de transformación de nitrógeno en proteína. El factor general es 6.25, este dato está basado en la suposición de un contenido medio de nitrógeno de 16% en las proteínas (16 g de nitrógeno en 100 g de proteínas). Además, en alimentos concretos, cuya proteína es conocida, se utilizan factores específicos:

Harina de trigo refinada

5.70

Trigo completo, centeno, cebada, avena

5.83

Arroz

5.95

Almendras

5.18

Cacahuetes

5.46

Soja

5.71

Leche

6.37

Gelatina

5.55

Carne

6.25

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ANÁLISIS DE LÍPIDOS

Los lípidos son un grupo de compuestos de estructura heterogénea que tienen en común su liposolubilidad en disolventes orgánicos apolares. Los lípidos en el organismo cumplen una función energética (aportan 9 kcal/g), función plástica (forman parte de las membranas celulares, protegen la integridad de la piel, y son indispensables para el crecimiento y regeneración de los tejidos) y función reguladora (aportan ácidos grasos esenciales, actúan como vehículos de vitaminas liposolubles y ayudan a mantener la temperatura corporal).

La fracción lipídica de los alimentos es la parte del alimento que se puede extraer mediante un disolvente orgánico apolar (hexano, éter etílico, cloroformo, etc). La extracción se puede hacer de forma directa, con un disolvente orgánico apolar cuando hay cantidades notables de lípidos, o previa hidrólisis, cuando la fracción lipídica está asociada a otras moléculas como proteínas y glúcidos.

a) Métodos directos

Se extrae la fracción lipídica con disolventes orgánicos apolares. El disolvente orgánico se evapora posteriormente y se determina la cantidad de lípidos por gravimetría, expresando el resultado en tanto por ciento de grasa (peso/peso), es decir, gramos de grasa en 100 g de alimento. Dentro de los métodos directos, se puede distinguir la extracción de alimentos sólidos o líquidos.

Para la extracción de la grasa de un alimento líquido, se puede usar un método en continuo (método Palkin) o en discontinuo utilizando embudos de decantación y realizando la extracción por etapas. Tras la extracción se evapora el disolvente utilizado y se determina la cantidad de lípidos por gravimetría.

En el caso de la extracción sólido-líquido, el método más empleado es el Soxhlet, sistema de extracción de grasa con un disolvente orgánico en continuo de muestras previamente desecadas. El método de extracción se realiza en un aparato que consta de un matraz (A), un cuerpo extractor (B) y un refrigerante (C). La muestra desecada se coloca en el cuerpo extractor junto con el disolvente orgánico. En el matraz se coloca el disolvente orgánico y se calienta, los vapores ascienden por el tubo lateral (D) y llegan al refrigerante (C), donde se condensan y caen en el cuerpo intermedio (B).

(C), donde se condensan y caen en el cuerpo intermedio (B). Cuando el cuerpo extractor se

Cuando el cuerpo extractor se llena del líquido extractivo, éste se vacía por el sifón lateral interno (E) y desemboca en el matraz inferior (A). El disolvente orgánico se va reciclando durante el proceso, mientras los lípidos se van concentrando en el matraz inferior. Una vez finalizado el proceso, se evapora el disolvente al vacío y se determina la cantidad de lípidos por gravimetría. El método Soxhlet no es un método adecuado si posteriormente se desea analizar la calidad de los lípidos, ya que al hacer la extracción en caliente, la fracción lipídica se modifica principalmente por oxidación.

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b) Métodos indirectos o con hidrólisis previa

Se aplican a alimentos que tienen la fracción lipídica asociada a otras moléculas como proteínas o glúcidos (leche, carne, cereales, piensos, …).

Hidrólisis ácida. Rompe las uniones entre los lípidos y las proteínas, pero no hidroliza los triglicéridos. Se utiliza el método de Werner-Schmid, que realiza la hidrólisis ácida con HCl en caliente y posteriormente la extracción con éter etílico. También se usa el método de Gerber (en leche y derivados lácteos), consistente en una hidrólisis ácida con H 2 SO 4 concentrado, y posterior extracción con alcohol isoamílico (lectura en tubo graduado, butirómetro).

Hidrólisis básica. Rompe las uniones lípido-proteína y también los triglicéridos. El método más utilizado es el de Röse-Gottlieb, que realiza la hidrólisis con una solución de amoniaco en alcohol en frío y la extracción con éter de petróleo. Posteriormente, se pueden analizar los ácidos grasos que se liberan.

ANÁLISIS DE HIDRATOS DE CARBONO

El contenido en hidratos de carbono también debe reflejarse en la etiqueta en la sección referente al etiquetado de propiedades nutritivas. En el caso de los glúcidos (o hidratos de carbono), debido a que no poseen ninguna propiedad diferencial en relación al resto de grupos de compuestos, la determinación de glúcidos se hace muy complicada. Por ello, para determinar de manera fácil y rápida los hidratos de carbono totales, se realiza mediante diferencia de pesada (método NIFEXT) y los hidratos de carbono asimilables:

NIFEXT = 100 (% agua + % proteínas + % lípidos + % cenizas)

Hidratos Hidratos asimilables asimilables de de carbono carbono

= 100 (% agua + % proteínas + % lípidos + % cenizas + % fibra)

= 100 (% agua + % proteínas + % lípidos + % cenizas + % fibra)

De manera más particular, y en función del tipo de azúcar a determinar, existen diversos métodos para su determinación:

- Determinación de azúcares directamente reductores

- Determinación de azúcares no directamente reductores pero hidrolizables

- Determinación de azúcares no reductores y no hidrolizables

Determinación de azúcares reductores

Hay diferentes tipos de métodos para la determinación de azúcares reductores: físicos, químicos y biológicos. A pesar de que los métodos biológicos son más precisos, son los métodos químicos los más ampliamente utilizados (concretamente, el método de Fehling).

Físicos y fisicoquímicos

Químicos

Biológicos

Densitometría

Fehling

Fermentación

Refractometría

Luft-Schoorl

Enzimáticos

Polarimetría

Bertrand

 

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Este método se basa en una reacción redox entre el azúcar reductor (con función aldehído) y una solución de Cu 2+ , en medio básico y con tartrato. El medio básico enoliza los azúcares y el tartrato impide la precipitación del Cu 2+ . El Cu 2+ se reduce a Cu + , que precipita en forma de Cu 2 O, de color rojo ladrillo. La reacción no tiene estequiometría definida, por lo que hay que calcular el factor de Fehling (estandarización del reactivo), es decir, los gramos de glucosa necesarios para reducir un determinado volumen de Fehling, realizando para ello la valoración de una solución patrón de azúcar (glucosa).

R-COH

R-COH

glucosa

glucosa

Cu 2+ (CuSO 4 ) Cu 2+ (CuSO ) 4 H H 2 2 O
Cu 2+ (CuSO 4 )
Cu
2+
(CuSO )
4
H H
2 2 O O
NaOH
NaOH

Cu(OH)

Cu(OH)

azul

azul

2

2

Calor Calor R R Cu Cu O O 2 2 rojo ladrillo rojo ladrillo
Calor
Calor
R
R
Cu
Cu
O
O
2
2
rojo ladrillo
rojo ladrillo

Si en el medio hubiera un compuesto reductor, el estado de oxidación del cobre cambiaría de 2 + a 1 + , evidenciándose por el cambio de coloración.

Debido a una serie de inconvenientes de dicho método, entre ellos la necesidad de estandarizar el reactivo de Fehling para calcular el factor, el resto de métodos químicos son modificaciones del método de Fehling.

Otros métodos ampliamente utilizados para la determinación de azúcares reductores son la densitometría (aerómetros) y la refractometría (refractómetro de Abbe), ambos mediante el uso de tablas de conversión para el cálculo del % de sacarosa.

Determinación de azúcares no directamente reductores pero hidrolizables

Debido a que estos azúcares (como la sacarosa) no son reductores (no tiene OH libre, sino enlazado), su determinación se realiza con los métodos descritos anteriormente, previa hidrólisis. Una vez calculada la cantidad de monosacáridos, es necesario realizar una conversión de sacarosa mediante la relación de pesos moleculares, teniendo en cuenta a su vez que la sacarosa produce 2 moles de monosacáridos:

F = (PM sacarosa) / (2 x PM monosacárido) = 342 / (2 x 180) = 0.95

Determinación de azúcares no directamente reductores y no hidrolizables

Dentro de este grupo de azúcares se encuentra la fibra. Hay varios métodos para su determinación, como son:

- Método colorimétrico de Southgate

- Método basado en el uso de detergentes, por valoraciones

- Método enzimático, que permiten determinar de manera separada tanto la fibra soluble como no soluble

- Método Weende, menos utilizado actualmente

- Métodos cromatográficos, menos utilizados actualmente

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OBJETO

El objeto de esta sesión práctica consiste en el conocimiento de los diversos métodos de análisis de proteínas, lípidos e hidratos de carbono, necesarios para el etiquetado de alimentos.

EJERCICIOS

1.

Calcular el factor de un licor de Fehling con los datos siguientes: 10 ml del licor son reducidos por 9.8 ml de una solución de glucosa del 0.4857% (p/v).

2.

Se

pesan 10 g de un polvo que sólo contiene un azúcar reductor (glucosa). Se lleva a 100

ml

con agua destilada. Se toma una alícuota de 20 ml y se diluye nuevamente a 100 ml. Se

realiza el método Fehling y para reducir 10 ml del licor (F=0.053) se gastan 8 ml de esta última dilución. Calcúlese la riqueza de glucosa del polvo.

3.

Se

analiza un producto cárnico partiendo de 0.8 g. El contenido de proteína se realiza

siguiendo el método Kjeldhal recogiéndose el NH 3 producido sobre una disolución de H 3 BO 3 y valorándose el H 2 BO 3 - producido con una disolución de HCl 0.05 M de la que se consumen 26.7 mL hasta el viraje del verde de bromocresol. Calcular el porcentaje de proteína en el preparado cárnico.

4.

2.6 g de una harina de arroz se someten al método Kjeldahl. El NH 3 producido se recoge sobre 35 ml de HCl 0.1 M, y el exceso de HCl necesita 15.6 mL de NaOH 0.1 M para su neutralización. ¿Cuál es el porcentaje de proteínas en dicha harina?

5.

10 g de galletas se someten al método Soxhlet utilizando hexano como disolvente. Después de añadir la cantidad de hexano tal para que se produzcan varios ciclos de extracción, finalmente el peso del matraz más su contenido fue de 110 g. Calcule el porcentaje de grasa de las galletas. Nota: peso del matraz 106.5 g.

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