BIO 275c

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA CLÍNICAS

Prof. Encargado:
Dr. Alexis Kalergis
(akalergis@bio.puc.cl)
 Bio275c
Organización
Docentes
Dra. Katia Abarca • Clases expositivas
Dra. Marcela Ferrés
Dra. Patrica García • Pasos prácticos y talleres
Dra. Ana María Guzmán
Dr. Alexis Kalergis • Conferencias invitadas
(responsable)
Dr. Marcelo López-Lastra • Seminarios de los alumnos
Dr. Guido Mora
Dra. Marisa Torres
Dr. Bruno Tesser
(instructor) Evaluación:
• 4 pruebas teóricas, 80% (clases,
Conferencistas
Dra. Ximena Aguilera
conferencias, prácticos y seminarios).
Dra. Susan Bueno • Tests de entrada a los pasos prácticos,
Dr. Jorge Jiménez 10%
Dr. Carlos Pérez
Dra. Sandra Solari • Presentación de seminario, 10%
 ¿Qué es la Microbiología?

“Ciencia que estudia la biología

de los microorganismos”

Microbiología deriva de 3 palabras griegas:

mikros (pequeño), bios (vida) y logos (ciencia)

Tipos de microorganismos:

Bacterias
Virus (*)
Hongos
Parásitos
 Ramas principales de la microbiología
Bacteriología Virología

Salmonella typhimurium HIV VRS

Micología Parasitología

Cryptococcus neoformans Plasmodium falciparum

Micro-organismos pueden colonizar una
enorme variedad de espacios-nichos.
 Las causas y terapias para enfermedades antes de
1880 (Köch y Pasteur) :

CAUSA TERAPIA

• Ira de Dios • Arrepentimiento

• Mal Aire • Sol, altitud, sequedad

• Vampiros • Estaca en el corazón

Louis Pasteur, 1880:

• propone la teoría de que las enfermedades son causadas por gérmenes.
• Primeros Experimentos modernos de vacunación usando microbios atenuados:
protección de pollos contra el cólera y perros contra la rabia.

Robert Koch, 1882:

• Descubre el bacilo de la tuberculosis, Premio Nobel 1905.
• Postulados de Koch para probar la Etiología de una enfermedad infecciosa.
 Plaga y tuberculosis
antes de Koch

Mercy Brown
Mercy Brown is sometimes known as the last traditional North American vampire. Mercy died on January 17, 1892 at age 19. Her death followed those
of her mother, Mary Brown, and older sister, Mary Olive. At the time of her death, her brother, Edwin, was gravely ill. Mercy's Father, George Brown was
desperate to save him. In an attempt to rid the family of a perceived curse, George Brown, decided to dig up the bodies of the women, including Mercy,
who had only been buried for about one month. During the exhumation, observers noted that Mercy's body appeared to have turned over inside the
coffin and that blood was present in her heart. Fearing Mercy was a vampire, the Exeter townspeople removed her heart and burned it on a nearby rock
before reburying her. Folklore at the time said that destroying the heart of a vampire would kill it, and by consuming the remains of the vampire's heart,
the curse would be broken and the victim would get well. George Brown fed the ashes to his son, Edwin, who died two months later. It is now known that
Tuberculosis caused the mysterious deaths once attributed to Rhode Island vampires, including the case of Mercy Brown.
 Fines del siglo XIX.
Conceptos requeridos para una teoría moderna
de infección e inmunidad.

• Concepto de un agente causante de la

enfermedad (Etiología).

• Concepto de transmisión de este agente

(Contagio)

• Concepto de inmunidad y resistencia a la

enfermedad.
 Edward Jenner, Louis Pasteur,
first successful vaccination (1790s) Anti-rabies vaccination trial (1880s)

Trudeau, Robert Köch

Discovery of first treatment for Identification of the causative
tuberculosis (1880s) agent for tuberculosis (1880s)
 Fines del siglo XIX.
Conceptos requeridos para una teoría moderna
de infección e inmunidad.

• Concepto de un agente causante de la enfermedad (Etiología).

• Concepto de transmisión de este agente (Contagio)
• Concepto de especificidad y reproducibilidad de una enfermedad.
• Concepto de interacción entre hospedero y agente patógeno.

Postulados de Koch
(Prueba de la Etiología de una
enfermedad infecciosa) :

• El organismo patogénico sospechoso debe estar presente en TODOS los de

caso enfermedad, y ausente de tejidos sanos.
• El organismo patogénico sospechoso debe ser cultivado en condiciones
aisladas
• Celulas del cultivo aislado deben causar la enfermedad en un animal sano.
• El organismo debe ser aislado nuevamente y demostrar ser el original.
 Causa de las enfermedades
infecciosas

• Gran impacto sociológico

– La enfermedad no es un castigo
– La enfermedad es prevenible (higiene,
contagio, etc.)
– Desarrollo de vacunas (profilaxis)
– Desarrollo de antibióticos (terapia)
 Algunas definiciones
Patógeno: Cualquier microbio que es capaz de causar una enfermedad
(daño en el hospedero).

Patogenicidad: La capacidad de un microbio de producir una enfermedad

o daño en los tejidos del hospedero.

Virulencia: La capacidad relativa de un microbio de causar daño en los

tejidos del hospedero.

Factor de virulencia (o determinante de virulencia): Cualquier

componente molecular del patógeno que cuando es removido disminuye la
virulencia pero no la viabilidad del patógeno.

Isla de patogenicidad: Genes de virulencia que se encuentran

agrupados en un locus dentro de alguno de los cromosomas del patógeno.

Patogenicidad depende del microbio y del hospedero!!

 Enfermedad:

El daño es el resultado del balance entre la virulencia del patógeno y la

respuesta del hospedero contra la infección

Clasificación de patógenos
de acuerdo a la causa del daño

Daño
Patogenesis mediada por
Patogenesis mediada por
componentes del hospedero
la bacteria

IgG1
IgE

Respuesta inmune
del hospedero

Toxinas

Respuesta inmune
del hospedero
Destrucción
de tejidos
 Robert Hooke (1664).

The microscope used by Robert Hooke. The
objective lens was fitted at the end of an
adjustable bellows (G), with illumination
focused on the specimen by a single lens
A drawing by Robert Hooke, which represents
one of the first microscopic descriptions of
microorganisms: a blue mold growing on the
surface of leather; the round structures contain
spores of the mold.
 Antoni van Leeuwenhoek (1684)
Photograph of a replica of
Leeuwenhoek’s microscope. The lens is
mounted in the brass plate adjacent to
the tip of the adjustable focusing screw
Leeuwenhoek’s drawings of bacteria,
published in 1684. Even from these crude
drawings we can recognize several
morphological types of common bacteria. A,
C, F, and G, rod-shaped; E, spherical or
coccus-shaped; H, cocci packets.
 Louis Pasteur, 1864

• Destruyó la teoría de la generación espontánea en 1864 (Experimentos con

matraces "cuello de cisne”).

• Propuso a los microorganismos como agentes causales de enfermedad.

• Trabajó en la fermentación del vino.

• Generó la vacuna para la rabia

 Fin de la teoría de la generación espontánea

Experimentos
de Louis Pasteur con
matraces cuello de cisne

2 3
 Robert Koch (1876)

Definió los postulados sobre la identificación de microorganismos patógenos

(Actualmente vigentes).

Identificó a los microorganismos como agentes causales de enfermedad

Trabajos sobre la etiología del carbunco (Bacillus anthracis)

 Fines del siglo XIX.
Conceptos requeridos para una teoría moderna
de inmunidad.

• Concepto de un agente causante de la enfermedad (Etiología).

• Concepto de transmisión de este agente (Contagio)
• Concepto de especificidad y reproducibilidad de una enfermedad.
• Concepto de interacción entre hospedero y agente patógeno.

Postulados de Koch (Prueba de la

Etiología de una enfermedad infecciosa) :
• El organismo patogénico sospechoso debe estar presente en TODOS
los de caso enfermedad, y ausente de tejidos sanos.
• El organismo patogénico sospechoso debe ser cultivado en condiciones
aisladas
• Celulas del cultivo aislado deben causar la enfermedad en un animal
sano.
• El organismo debe ser aislado nuevamente y demostrar ser el original.
Los postulados de Koch
 Cumplimiento de los postulados
de Koch en humanos??
VIH + Peter Duesberg Marshall y Warren + Helicobacter pylori
Atributos de un patógeno exitoso
(factores de virulencia):

• Colonización (invasión: adherencia y

entrada)
• Evasión de los mecanismos de
defensa del hospedero
• Persistencia
• Replicación o multiplicación
• Diseminación
 Postulados Moleculares de Köch 1980
(estándares para las evidencias de que un gen codifica para
un factor de virulencia).

Para probar que un fenotipo de virulencia es causado por la

expresión de un gen específico es necesario:

• Aislar una bacteria mutante con un fenotipo que difiere del fenotipo
silvestre (virulencia)

• Clonar el gen silvestre, y

• Al introducir el gen silvestre en la bacteria mutante se debe reproducir

el fenotipo silvestre (virulencia)
Invasión de células epiteliales por
Salmonella y Shigella
• Bacterias gram negativas, son patógenos
intracelulares.

• Invaden células epiteliales que no son fagocíticas

• Utilizan un sistema de secreción de tipo III para

inyectar proteínas bacterianas que inducen la
formación de pliegues en la superficie de la
célula epitelial.

• De esta manera estas bacterias evaden la

fagocitosis por células del sistema inmune
Colas de actina en Shigella
 Colas de actina como factor de
virulencia (diseminación bacteriana)
 Evaluando los postulados moleculares de Koch
para la generación de colas de actina en Shigella

• Generar mutantes de Shigella

• Evaluar fenotipo de las mutantes (pérdida de las colas de actina)

• Clonar el gen silvestre que fue mutado

• Introducir el gen silvestre en la cepa de shigella mutante y

recuperar el factor de virulencia (colas de actina)

• Introducir el gen en otra especie de bacteria (E. coli) e inducir la

generación de colas de actina.
 Shigella silvestre Shigella mutante
(virulenta) (atenuada)

¿Por qué estudiar los factores de virulencia?

• Incrementar el conocimiento de la biología del hospedero:

– Mecanismos de acción de las toxinas
– Mecanismos de internalización del patógeno

• Permitiría combatir de una mejor manera las enfermedades:

– Nuevos tratamientos (blancos para drogas y antibióticos).
– Mejores vacunas
– Mejores diagnósticos
Bacteria-mediated
Adhesion pedestals

• Movie part 1
• Movie part 2
• Movie part 3

BACK
 Subordinacion de la maquinaria de polimerizacion
de actina por patogenos entericos

Enteropathogenic E. coli (EPEC) causes the localized destruction of microvilli and the formation of actin-rich pedestals, a
process known as attaching and effacing. It requires translocation of the intimin receptor (Tir) by the TTSS. Tir is inserted
into the host
Shigella also membrane.
recruits WASP by the activity of IcsA on the surface of the bacteria.
IcsAbacterial
The increasesouter-membrane
the affinity of WASP
adhesinforintimin
the Arp2/3 complex
contacts Tir. and the ability to assemble actin filaments.
WASP works as a molecular ratchet, binding actin filaments at the bacterial surface and, in association with the Arp2/3
EPEC
complex,recruits
addingWASP
actin to areas of attachment.
monomers to one end of WASP is normally activated by the small GTPase Cdc42, but EPEC does not
the filaments
require Cdc42 to form actin pedestals, suggesting that they activate WASP in an alternative manner.
WASP recruits and activates the Arp2/3 complex, which nucleates actin and stimulates the formation of actin filaments.
Patógenos entéricos intracelulares utilizan los sistemas de
secreción para inyectar moléculas que controlan el
citoesqueleto de la células blanco para promover la
invasión.
 Mecanismos de patogenicidad bacteriana: Invasividad
Invasinas...

Algunas bacterias tienen evolucionados mecanismos para ingresar a las

células del hospedero que no son naturalmente fagocíticas (Ej.: Células del
epitelio intestinal)

Las proteínas secretadas o de la superficie bacteriana que inducen la

fagocitosis de la bacteria por células no-fagocíticas son llamadas invasinas

Mecanismo de invasión:

• Adhesión bacteriana a la superficie de

la célula hospedera
• Inducción de reordenamientos en el
citoesqueleto celular (polimerización y
depolimerización de filamentos de
actina)
• Se produce la fagocitosis de la
bacteria, que ahora habita dentro de
una vacuola especializada

Invasión de Salmonella en células epiteliales humanas

Mecanismos de patogenicidad bacteriana: Invasividad
Invasinas...

Bacteria invadiendo una célula

epitelial humana (in vitro)

Luego de invadir, la bacteria se

localiza dentro de una vacuola
especializada en la célula epitelial
Bacterias utilizan el sistema de secreción de tipo III
para inyectar otros factores de virulencia en las
células del hospedero.
Sistema de secreción tipo III
Factores de virulencia de bacterias gram negativas (Salmonella, Shigella),
Sistemas macromoléculares de secreción de tipo pilus IV, tipo II y tipo III.

• Las proteínas requeridas para la fimbria de tipo IV y para los

otros sistemas de secreción son similares y residen en la membrana
interna.
• Los 3 sistemas usan una proteína multimérica (secretina) que se
ubica en la membrana externa y que tiene un poro central que
forma el canal para la secreción.
 Mecanismos de patogenicidad bacteriana: Invasividad
Colonización (Adhesión, adaptación y multiplicación)...

Factores de adherencia
(adhesinas)
•Fimbrias
•Pili
•Lipopolisacárido (LPS)
•Acidos teicoicos y lipoteicoicos
•Otros componentes de la pared
celular
•Glicocalix
Escherichia coli enteropatogénica (EPEC) adherida a la •Cápsula
superficie de células epiteliales de intestino humano
(Formación de microcolonias)

Luego de la adhesión bacteriana a un tejido específico, ocurre una

adaptación al nuevo hábitat (acondicionamiento del metabolismo,
etc), lo que le permite comenzar a multiplicarse lentamente para
lograr su asentamiento en el hospedero (Colonización inicial)
Patogenicidad bacteriana: evasión de las defensas del hospedero.

Células dendríticas controlan la activación de la respuesta inmune

contra patógenos.

Las células dendríticas

se localizan en lugares
estratégicos e inician la
inmunidad adaptativa

Células dendríticas interactúan

con linfocitos T para inducir su
activación (inmunidad)
Dendritic cells capture pathogens
and activate T cells

Dr. Jaime Dra. Susan

Tobar Bueno

Gewirtz et al
Rescigno et al

It would be advantageous for pathogens to interfere

with DC function
 Búsqueda de factores de virulencia en Salmonella

SPI-1

E M

DC

SPI-2
?

DC
DC Bueno et al, Crit. Rev. Immunol., 2005
 Features of Pathogenicity islands
• PIs are defined as DNA sequences that:
– (i) encode (often many) virulence genes;
– (ii) are present in pathogenic strains and absent in less-pathogenic
strains of one species or a related species;
– (iii) differ in G+C content in comparison to the DNA of the host
bacteria;
– (iv) are often more than 30 kb;
– (v) represent compact, distinct genetic units, often flanked by
direct repeats;
– (vi) are associated with tRNA genes and/or insertion sequences (IS
elements) at their boundaries;
– vii) contain (often cryptic) "mobility" genes (IS elements, integrase
genes, transposons, origins of plasmid replication);
– (viii) which are often unstable
Pathogenicity Islands: Pathogen Evolution
through Horizontal Gene Transfer
Virulence genes often cluster in localized regions of the
chromosome, termed pathogenicity islands.

Three observations suggest that pathogens have acquired

these gene clusters through horizontal gene transfer:

(a) pathogenicity islands often have a GC content that differs

significantly from the rest of the bacterial chromosome;
(b) pathogenicity islands are often flanked by genes that are
contiguous in closely related but nonpathogenic bacteria;
(c) remnants of bacteriophage or transposon insertion
sequences often lie near the borders of pathogenicity islands,
suggesting a possible mechanism for acquisition of these
genes.

Pathogenicity islands often contain multiple functionally

related genes necessary for a specific virulence phenotype,
suggesting that acquisition of a pathogenicity island during
evolution may in one "quantum leap" open up new host
niches or lifestyles for the pathogen.

For example, Salmonella pathogenicity island 1 (SPI-1)

encodes genes necessary for invasion of intestinal epithelial
cells and induction of intestinal secretory and inflammatory
responses. In contrast, Salmonella pathogenicity island 2
(SPI-2) encodes genes essential for intracellular replication,
and, in the mouse enteric fever model, is necessary for
establishment of systemic infection beyond the intestinal
epithelium. Many pathogenicity islands, including SPI-1 and
SPI-2, encode specialized devices for the delivery of
virulence proteins into host cells, termed type III secretion
systems (TTSSs).
Good bacteria and bad viruses

Acquisition of virulence factors by V.

cholerae.

Infection with TCP was a critical step in

the evolution of virulence by non-
pathogenic strains of V. cholerae.
This bacteriophage/type IV fimbria
serves not only as a colonization factor,
but also as a receptor for the
CTX encoding cholera toxin. Both
bacteriophages can integrate into the
bacterial genome and form episomal
replication intermediates. The production
of cholera toxin and the biogenesis of
CTX both depend on a secretin
encoded within the bacterial genome.
 Los genes que codifican para factores de virulencia se
agrupan en islas de patogenicidad que son transmitidas de
bacteria a bacteria o de fagos a bacterias
Salmonella typhimurium as a pathogen model

Gram (-) Bacilli

Causative agent of typhoid
fever in mice
Virulent strains do not
efficiently prime T cells
Attenuated strains prime T
cells

Hypothesis
Salmonella interferes with DC
ability to activate bacteria-
specific T cells
 Experimental system: processing and location of
bacterial antigens
S. typhimurium S. typhimurium
14028s pOVA 14028s pGFP
kDa pUC 1 2 3

47.5-
OVA
32.5-

CD8+

Dendritic cells
Activation
+
DC
Salmonella pOVA
CD4+

Salmonella-GFP
 Potentiation
Salmonella of antigen
By targetingkeeps DCstopresentation
bacteria FcγRs
from by antigen
on DCs
presenting directing
bacterial
presentation
bacteria to T
antigens cells
FcγRs is restored
on
to T cellsDCs

CD8+ ++ CD4+ +
CD8
CD8 CD4
100 Salmonella OVA 150 Salmonella OVA
100
100 Salmonella OVA 150 Salmonella OVA
Salmonella Salmonella OVA-IgG Salmonella OVA-IgG
OVA Purificada OVA Purificada
75
75

IL-2 (U/ml)
75
IL-2 (U/ml)

100
(U/ml)

(U/ml)
IL-2 (U/ml)

IL-2 (U/ml)
100
Presentación
50
50
50 en MHC-I y II
IL-2

IL-2
Receptores Fcγ 50
Salmonella-IgG
25 50
25
25

0 0
+
00 3
10 10 4 4 10 5 5 10 6 6 10 3 0 10 4 10 CD8
5
10 6
1033 10
+ 10 105 106
4 33 44 55 6
10 10 10 10 10 10 10 6
DC Number
DC Number
Number
DC Number
DC Number Activation
DC

DC Salmonella OVA-IgG CD4+

Tobar et al, J. Immunol. 173: 4058-65, 2004
 Possible evasion mechanism
Inhibition of fagosome-lysosome fusion?

T CELL
Escape from antigen
presentation

FcγR
Lysosomes

Bacterial degradation
Æ Antigen presentation
A Salmonella spiC mutant (SPI-2) is
defective for intramacrophage survival
(Groisman and collegues).
Fulfilling Koch molecular postulates by defining the
role for a SPI-2 secreted protein in Salmonella
pathogenesis.

Intramacrophage survival properties of wild-type, spiA and

spiC mutant strains of S.enterica in J774 macrophages.
Macrophage survival can be restored to the spiC mutant by
the spiC+-containing single copy plasmid pEG9127 but not
by the plasmid vector (pBAC108L).

Salmonella spiC and spiA mutants exhibit wild-type levels of

invasion into Henle-407 cells. The invasion-defective mutant
pho-24 was evaluated in the same experiments and is shown
here for comparative purposes.
 A Salmonella virulence protein that inhibits
cellular trafficking (Groisman and colleagues.)

wild-type mice
IFN-γ knockout
Regulator of SPI2 expression
Translocon component
control
Secretory apparatus
wild-type mice
+ iNOS inhibitor
Abrogation of the NADPH
phagocyte oxidase restores
virulence to SPI2-deficient S.
typhimurium mutants (Fang and
colleagues).
Survival curves are shown for:
A. wild-type C57BL/6 mice
B. wild-type mice fed drinking water
containing the iNOS inhibitor
aminoguanidine
gp91phox
C. congenic immunodeficient IFN-γ
knockout
knockout mice
D. gp91phox knockout mice
Intraperitoneal challenge with wild-
type S. typhimurium or isogenic
strains with mutations at ssaJ::Tn5,
ssaV::Tn5, ssrA::Tn5, or sseB::aphT.
An isogenic aroA-mutant S.
typhimurium strain with attenuated
Secretory apparatus
virulence in mice was included as an
additional control.
Abrogation of the NADPH phagocyte oxidase
restores the ability of SPI2-deficient S.
typhimurium mutants to survive in macrophages.

The survival of wild-type S. typhimurium or

isogenic SPI2-deficient strains with mutations
at ssaJ::Tn5, ssrA::Tn5, sseA::aphT,
and sseB::aphT was measured in
macrophages from:

A) C57BL/6

B) congenic gp91phox knockout mice

Exclusion of the NADPH phagocyte oxidase
from Salmonella-containing vacuoles.

Immunofluorescence microscopy for p22 and p47

NADPH oxidase subunits (red).

Both NADPH oxidase p22phox (E) and p47phox

(F) subunits coalesced in the vicinity of GFP-
positive (green) sseB-deficient S. typhimurium.

This contrasts with the dispersed pattern of

vesicular distribution in the cytoplasm of
macrophages infected with GFP-expressing (green)
wild-type bacteria (G and H).

(I) and (J ) show p22phox and p47phox staining in

macrophages from gp91phox knockout (phox KO)
mice infected in vitro with sseB-mutant S.
typhimurium.
 Búsqueda de Determinantes Moleculares responsables de la
interferencia en la función de la DC: Isla de Patogenicidad 2

SPI-1

E M

DC

SPI-2
?

DC
DC Bueno et al, Crit. Rev. Immunol., 2005
Sistema Secretor de Tipo III codificado en la Isla de
Patogenicidad 2

Citoplasma
DC

Membrana
Vacuolar

Membranas
Bacterianas

SpiC SifA Efectores

Identificación de factores de virulencia de Salmonella
typhimurium en DCs: Rol de la SPI-2

ΔspiA ΔspiC ΔSPI-2

Sistema Secretor Ausencia de Efector Ausencia de Isla

no Funcional Implicado en Evasión Completa
Lisosomal
 Cepas mutantes de Salmonella presentan menor
sobrevivencia intracelular en DCs, desde las 4 horas

70
WT
60
CFU (x 10 células)

Δ spiA
50 Δ spiC
40 Δ SPI-2
3

30
20
10
0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0
Tiempo (h)
Tobar et al., 2005. Manuscrito Enviado
 Cepas mutantes de Salmonella son presentadas
eficientemente por DCs a linfocitos T CD8+ y CD4+

Presentación de antígenos derivados de Salmonella in vitro

CD8+ CD4+
1.00 1.00
SpiA

IL-2 (O.D. 450 nm)

IL-2 (OD 450 nm)

SpiC
0.75 0.75
SPI-2
WT
0.50 0.50

0.25 0.25

0.00 0.00
10 3 10 4
10 5
10 6
10 3 10 4 10 5 10 6
DC Number DC Number

Tobar et al., 2005. Manuscrito Enviado

 Mutantes SPI-2 de Salmonella colocalizan
con marcadores lisosomales dentro de DCs

WT ΔspiA

LAMP-2
Salmonella
ΔspiC ΔSPI-2

Tobar et al., 2005. Manuscrito Enviado

 Mutantes SPI-2 de Salmonella presentan
signos de degradación dentro de DCs

WT ΔspiC

ΔspiA ΔSPI- 2

Tobar et al., 2005. Manuscrito Enviado

 Experimentos in vivo con cepas de Salmonella
mutantes para SPI-2

Infección Oral
105 CFU

Suero
(ELISA IgG anti OVA)

Hígado, Bazo,
Nódulos Mesentéricos Linfáticos
Día 5 post inoculación (Colonización)
 Cepas mutantes en la SPI-2 presentan atenuación en virulencia in vivo

COLONIZACION Producción IgG anti-OVA

2000 0.6
Hígado Δ spiA pOVA

Absorbance (450 nm)

Δ spiC pOVA
Bazo 0.5
1500 Δ SPI-2 pOVA
C F U /10 5 c e lls

LNs
0.4 14028s pOVA
Preimmune
1000 0.3

0.2
500
0.1

0 0.0
1/40
1/5 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50
WT SpiA SpiC SPI-2
Sample Dilution

Tobar et al., 2005. Manuscrito Enviado

Proliferación in vivo de linfocitos T específicos para OVA

OT-I Bazo

CFSE

WT

Día 1

Día 2
Análisis Bazo
(Tinción con anti-CD8)
Día 5
Proliferación in vivo de linfocitos T transgénicos

Número de células

CFSE
A diferencia de Salmonella virulenta, mutantes de la SPI-2 inducen
proliferación de linfocitos T transgenicos in vivo

Proliferacion OT-I

Proliferacion OT-II

Proliferacion SM1

end Tobar et al., 2005. Manuscrito Enviado

 Salmonella Host Range: An
Immunological Point of View

Jaime Tobar, Susan Bueno, Francisco Perez and

Alexis Kalergis
 Salmonella Serovars

• Salmonella is a genus of enterobacteria that possess

two species. One of them, Salmonella enterica, has
more than 2.200 serovars.

• Only some of S. enterica serovars are pathogenic,

causing diseases such as gastroenteritis, bacteremia
and enteric fever.

• Some of the pathogenic S. enterica serovars have a

broad host range, while others are host restricted
 S. Paratyphi
S. Typhi

S. Choleraesuis
S. Gallinarum
S. Enteritidis

S. Dublin

S. Typhimurium
Salmonella enterica serovars

S. Typhi: Host-restricted serovar, only

causes disease in humans

S. Typhimurium: Broad Host range serovar,

causes a Typhoid-like disease in mice

S. Enteritidis: Broad Host range serovar,

causes a persistent infection in chickens and
a Typhoid-like disease in mice (it depends on
the S. Enteritidis strain…)
 Interacción entre la DC y distintos serovares de Salmonella
como determinante de la especificidad de hospedero

Enfermedad Sistémica Muerte (15-30 días)

S. typhimurium

Enfermedad Autocontenida Sobrevivencia

S. typhi

S. enteritidis Enfermedad Autocontenida Sobrevivencia

 Colonización de serovares en DCs in vivo después de
infección oral o intraperitoneal

CFU Oral CFU intraperitoneal

600
LN
500 Spleen

CFU/1000 cells
400
Liver

300

200

100

is
m

d
ph
is
m

ed

te
ph

id
iu
id
iu

Ty

ec
ct

rit
ur
Ty

rit
ur

nf
te
im
nf
te
m

ni
En
ph
ni
En
i
ph

U
U

Ty
Ty
14028/OVA STH2370/OVA PT1/OVA

1 1 1 Uninfected

2 2 2 1

SPLEEN

3 3 3
Niveles de presentación de antígenos es inversamente
proporcional a la sobrevivencia bacteriana

1.0×10 7
Typhimurium
Enteritidis
CFU/100000 cell

Typhi

1.0×10 6

1.0×10 5
5 12 24

hrs
Serovares que presentan enfermedad autolimitante presentan signos de
degradación y colocalizan con lisosomas al interior de DCs de ratón.

LAMP-1 Salmonella Merged

S. Typhimurium

S. Typhimurium
S. Enteritidis
S. Enteritidis

S. Typhi
S. Typhi

Bueno, Tobar, et al, enviado 2005

 Serovares que presentan enfermedad autolimitante son
eficientemente presentados por DCs de ratón

B3Z
OVA
0.75
Untreated
Peptide
Peptide
IL-2 (OD 450 nm)

0.50 Enteritidis Enteitidis

Typhi
Typhimurium Typhi
0.25
Typhimurium

No pulse
0.00
0 25000 50000 75000 100000 125000 0 10 20 30 40 50
DC Number % Kb-SIINFEKL (CD11c-Gated)

OT4H
0.7
Untreated
0.6
Peptide
IL-2 (OD 450 nm)

0.5 Entritidis
0.4 Typhimurium
Typhi
0.3
0.2
0.1
0.0
0 25000 50000 75000 100000 125000
DC Number
 Proliferación de linfocitos T in vivo
Proliferación OT-I

S. typhimurium S. typhi S. enteritidis

Proliferación OT-II

S. typhimurium S. typhi S. enteritidis

Lo opuesto ocurre en DCs humanas: Typhi vive,
Typhimurium no…

100 Typhimurium
Typhi
Enteritidis
CFU/10000 cells

75

50

25

0
0 2 4 6 8 10 12 14

Time (h)
Bueno, Tobar, et al, enviado 2005
 Bacteria-DC encounter
and
bacterial capture

iDC

Maturation

Migration to LNs and Spleen

Impaired presentation of
bacteria-derived antigens

mDC

Impaired T Cell
Activation

Bacterial
Dissemination

Bueno et al, Crit. Rev. Immunol., 2005