Traducción no oficial
Método Oficial AOAC 990.26 (e) Soluciones patrón de Hidroxiprolina.- (1) Solución de stock.-600 µg / ml.
Hidroxiprolina en Carnes y Productos Cárnicos
Método colorimétrico
Primera acción 1990
Acción final 1993
Método NMKL-AOAC
(No se aplica al análisis de material liofilizado).
Rendimiento del método:
Salchicha
Sr = 0,008; SR = 0,010; RSDr = 3,3%; RSDR = 4,0%
Solomillo
Sr = 0,006; SR = 0,009; RSDr = 5,6%; RSDR = 8,8%
Morcilla
Sr = 0,009; SR = 0,015; RSDr = 2,4%; RSDR = 3,8%
A. Principio
La Hidroxiprolina se determina cuantitativamente como medida del material
colágeno en la carne y los productos cárnicos. (El tejido conectivo colágenoso
(tendón) contiene 12,5% de Hidroxiprolina [cuando se utiliza el factor de nitrógeno
a proteína de 6,25] o 14% [cuando el factor es de 5,55]. La muestra se hidroliza
en H2SO4 a 105 °C, se filtra y se diluye. La Hidroxiprolina se oxida con Cloramina-
T a pirrol. El color rojo-morado que se desarrolla después de la adición de 4-
dimetilaminobenzaldehído se mide fotométricamente a 560 nm.
B. Aparatos
(a) Cortador de carne mecánico.-Con aberturas de placa de 2 y 3 mm.
(b) Procesador de alimentos.-Para operar a aproximadamente 1500-3000 rpm.
(c) Frascos Erlenmeyer.-100 mL, cuello ancho.
(d) Vidrio de reloj.-5-6 cm de diámetro.
(e) Horno de secado.-105 ± 1 °.
(f) Papel de filtro.-Lavado con ácido, 12.5 cm de diámetro. Velocidad de flujo 700
mL/min.
(g) Tubos de ensayo. - 10mL. Utilice tubos idénticos para cada serie de análisis.
(h) Baño de agua.-Con temperatura controlada a 60 ± 0,5°.
(i) Espectrofotómetro.-Para medir A a 558 ± 2nm. Con celdas de vidrio de 10mm
de longitud de trayectoria óptica. Se puede utilizar un colorímetro fotoeléctrico
con filtro de interferencia.
C. Reactivos
Utilizar reactivos de calidad analítica. El agua debe ser destilada o de pureza
equivalente.
(a) Ácido sulfúrico.-Aproximadamente 7N. Añadir 750 ml de H2O a un matraz
aforado de 2L. Añadir lentamente, con agitación, 375 ml de H2SO4 (1,84 g/ml).
Se enfría a temperatura ambiente y se diluye al volumen con agua.
(b) Solución tampón - pH 6,0. Disolver 30 g de ácido cítrico monohidratado
(C6H8O7 ∙ H2O), 15g de NaOH y 90g de acetato sódico trihidratado (CH3COONa
∙ 3H2O) en aproximadamente 500mL de H2O. Transferir la solución a un matraz
aforado de 1 litro. Añadir 290mL de 1-propanol. Compruebe el pH con el medidor
de pH y ajústelo, si es necesario, con ácido o base. Diluir al volumen con agua.
La solución es estable durante 2 meses a 4°C en botella oscura.
(c) Solución oxidante. - Disolver 1,41g de reactivo Cloramina-T en 100mL de
solución tampón, (b). La solución es estable 1 semana a 4°C en botella oscura.
(d) Reactivo de color. - Disolver 10g de 4-dimetilaminobenzaldehído en 35 mL de
ácido perclórico (60%m/m). Añadir lentamente, con agitación, 65mL de 2-
propanol. Preparar la solución el día de uso.
Disolver 60mg de Hidroxiprolina en agua en matraz volumétrico de 100mL. Diluir
al volumen con agua. La solución es estable durante 2 meses a 4°.
(2) Solución intermedia: 6µg/mL. Pipetear 5 mL de solución madre en un matraz
aforado de 500 mL. Diluir al volumen con agua. Preparar la solución el día de
uso.
(3) Soluciones de trabajo.-Se pipetean porciones de 10, 20, 30 y 40mL de La
solución intermedia 2 en matraces volumétricos de 100 mL. Diluir cada uno con
agua. Las soluciones patrón de trabajo contienen 0,6; 1,2; 1,8 y 2,4mg de
Hidroxiprolina/mL, respectivamente. Preparar soluciones en el día de uso.
E. Preparación de la muestra
Retirar cuantitativamente la muestra de la bolsa. Incluya la salsa, la jalea, la
grasa, y cualquier cosa que se ha separado del producto en paquete.
(Descongelar el material congelado en el refrigerador. Cortar la muestra
inmediatamente después de retirarla del refrigerador.) Cortar la muestra en trozos
pequeños. Pase las piezas a través del cortador, B (a). Utilice aperturas de placa
de 3mm para muestras muy grasas para evitar que la muestra se engrase en el
triturador. Mezclar bien después de cada trituración. Alternativamente,
homogeneizar la muestra en el procesador de alimentos, B (b). Las muestras con
una consistencia muy floja se pueden triturar y mezclar bien con un tenedor. La
homogeneidad de la muestra picada puede ser controlada añadiendo una
cucharada de carbón en polvo al cortador o al procesador de alimentos antes de
comenzar a homogeneizar y luego revisar el color del material, que debe tener
un aspecto uniforme y gris. Si la muestra preparada debe almacenarse durante
un tiempo mayor a 3 días, guárdela en un recipiente hermético a un máximo de -
18 °C.
F. Hidrólisis
Pesar, a 0.001g, muestras duplicadas de aproximadamente 4g en matraces
Erlenmeyer, B (c). La muestra no debe adherirse a la pared lateral del matraz.
Añadir 30 ml de H2SO4, C (a), a cada matraz. Cubrir con vidrio de reloj, B (d) y
colocar los frascos en un horno de secado de 105 ± 1 ° durante 16 h
(convenientemente, durante la noche). Transferir cuantitativamente el hidrolizado
caliente a un matraz aforado de 500 mL con ayuda de agua. Diluir al volumen con
agua y mezclar. Filtrar parte de la solución a través de papel, B (f), en un matraz
Erlenmeyer de 100mL. El filtrado es estable al menos 2 semanas a 4 °C. Diluya
el filtrado con agua en un matraz volumétrico para que la concentración de
Hidroxiprolina de la dilución final esté en el intervalo de 0.5-2.4 µg/mL. La dilución
de 5mL de filtrado a 100mL es usualmente la más adecuada.
G. Desarrollo y medición del color
Pipetear 2,00 mL de dilución final en el tubo de ensayo, B (g). Pipetear en cada
uno de los otros 2 tubos de ensayo, 2,00 mL de H2O en lugar de la dilución final
(blancos). A cada tubo de ensayo, añadir 1,00 ml de solución oxidante, C (c).
Agitar los tubos y dejar reposar 20±2 min a temperatura ambiente. A cada tubo
de ensayo, añadir 1,00 mL de reactivo de color, C (d) y mezclar bien. Cubra cada
tubo con una lámina de aluminio o de plástico o una tapa roscada. Coloque
inmediatamente los tubos en baño de agua de 60 ± 0,5°C durante exactamente
15 min. Enfriar los tubos con agua corriente durante al menos 3 min. Tubos secos.
Medir la absorbancia de soluciones vs blancos en células de vidrio de 10 mm a
558 ± 2 nm con fotómetro.
H. Curva de calibración
Prepare la curva de calibración para cada serie de mediciones. Transferir 2,00
mL de cada solución patrón de trabajo C (e)(3), a los tubos de ensayo y continuar
como en G. Calcular la curva de calibración con A en el eje y e Hidroxiprolina
(1.2, 2.4, 3.6 y 4.8 µg) en el eje x.
Traducción no oficial

I. Cálculos
(a) Hidroxiprolina.-Calcular el contenido de Hidroxiprolina de la muestra, H, como
sigue:

𝑔 ℎ ∙ 2.5
𝐻, =
100𝑔 𝑚∙𝑉

Donde h = Hidroxiprolina, mg/2mL de filtrado, leído de la curva de calibración; m

= peso de la muestra, en g; y V = volumen, en ml, de filtrado tomado para dilución
a 100 mL para la etapa de hidrólisis. El resultado es la media aritmética de 2
valores calculados para cada muestra, satisfaciendo el requisito de repetibilidad
en J (Fiabilidad del Método). Exprese el resultado al 0,01% más cercano.
(b) Tejido conjuntivo colágeno.-Calcular el contenido de tejido conjuntivo
colágeno de la muestra, B, como sigue:

𝑔
𝐵, = 𝐻∙8
100𝑔
(Nota: El tejido conectivo colágenoso contiene 12,5% de Hidroxiprolina si el factor
de nitrógeno a proteína es de 6.25).
(c) Tejido conjuntivo colágenoso por proteína cruda. - Calcular el tejido conectivo
colágeno por proteína bruta, BR, como sigue:

𝑔 𝐵 ∙ 100
𝐵𝑅, =
100𝑔 %𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 𝑐𝑟𝑢𝑑𝑎

Donde % de proteína cruda = contenido de nitrógeno de la muestra, g/100 g, x

6.25.
(Nota: El cálculo es diferente en algunos países, basado en diferentes factores
de nitrógeno e Hidroxiprolina).

J. Fiabilidad del método

La fiabilidad del método se da como la ecuación para la relación entre el
contenido de Hidroxiprolina (H) y la repetibilidad (r) y la reproducibilidad (R)
calculada como sigue:

𝑟 = 0.0131 + 0.0322 ∙ 𝐻
𝑅 = 0.0195 + 0.0529 ∙ 𝐻

La diferencia entre 2 valores calculados obtenidos simultáneamente o en

sucesión rápida de las porciones de ensayo duplicadas por el mismo analista no
debe exceder la diferencia calculada de acuerdo con r calculado.
Por ejemplo: Si se obtiene un valor medio aritmético de 0,50g de Hidroxiprolina
/100g para las determinaciones por duplicado de la muestra, la repetibilidad se
calcula como sigue:

𝑟 = 0.0131 + 0.0323 ∙ 0.50 = 0.029

En esta muestra, los resultados de dos determinaciones deben diferir no más de

± 0,029% del valor medio de 0.50.

Referencia: JAOAC 73, 54 (1990).

CAS-51-35-4 (4-hidroxi-L-prolina)