SELECCIÓN DE MICROBIOS MUTADOS

Implica la búsqueda del mutante.

Existen básicamente dos formas de búsqueda: 1)Búsqueda al
azar o SELECCIONANDO AL AZAR de los sobrevivientes de una
población mutagenizada la cepa mutante, y 2)Búsqueda
dirigida EXAMINANDO LA PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICO U OTRA
PROPIEDAD en un proceso de fermentación que recuerde de
cerca el proceso a gran escala:

1.BÚSQUEDA AL AZAR:
Implica que después del tratamiento con el mutágeno y
de la expresión de la mutaciones inducidas se
inspecciona la habilidad de producir el producto de
interés por selección al azar entre los
sobrevivientes en fermentaciones modelo que están
cuidadosamente adaptadas al medio y a los parámetros
de fermentación del procedimiento a gran escala, a
fin de maximizar la similitud para que las cepas sean
adecuadas para la producción industrial. Las mejores
cepas del ciclo de mutación son repetidamente mutadas
 y seleccionadas. Los mutantes con altos rendimientos
son mucho más raros que aquellos con un ligero
aumento. Normalmente deben ser probados de varios
cientos a varios miles de aislados por ciclo de
mutación.

2.BÚSQUEDA DIRIGIDA:
2.1. AISLAMIENTO SELECTIVO DE MUTANTES:

AISLAMIENTO DE MUTANTES RESISTENTES:

Se hace a través de un medio selectivo que
contiene la sustancia tóxica que impide el
crecimiento de la cepa silvestre. La sustancia
tóxica puede ser un antibiótico o un
antimetabolito (presentan similitud estructural
con los metabolitos, pueden causar
retroinhibición pero no substituyen a los
metabolitos normales, causan la muerte de las
células normales pero no a las mutantes que
pueden formar un exceso de metabolitos).

AISLAMIENTO DE AUXÓTROFOS:
Se hace sembrando la población mutagenizada
sobre un medio completo con agar, en el que los
mutantes bioquímicamente deficientes pueden
también crecer. Se puede realizar por diferentes
técnicas:

a.TÉCNICA DE LEDERBERG (réplica en placa): Los

clones son transferidos a medio mínimo en el
 que las colonias auxótrofas no pueden crecer,
para que después estos mutantes sean
recuperados de las placas maestras y sean
caracterizados su defecto.

b.TÉCNICA DE ENRRIQUECIMIENTO POR FILTRACIÓN:

De una suspensión de esporas fúngicas, después
de que han sido expuestos al agente mutágeno,
una porción de ellas no afectadas por la
mutación originan microcolonias fúngicas
protótrofas en medio mínimo; las cuales son
separadas por filtración; dejando en el
filtrado las esporas de los auxotrofos que son
incapaces de crecer en el medio mínimo por
efecto de la mutación. El filtrado con las
esporas de los auxotrofos es entonces sembrado
en un medio enrriquecido para comprobación de
las características de auxotrofia de las
colonias que resultan.

c.TÉCNICA DE SELECCIÓN POR PENICILINA: sobre

todo para organismos unicelulares en el cual
basándose en que la penicilina mata a las
células en crecimiento pero no a las células
que no crecen , las células que crecen son
matadas selectivamente por tratamiento con el
antibiótico , enrriqueciendo de esta forma a
los auxotrofos que no pueden crecer en medio
mínimo.
 Similar a la técnica de selección por
penicilina se emplean en lugar de la
penicilina otras sustancias dependiendo del
microorganismo a aislar para aislar mutantes.

2.2. OTROS PROCEDIMIENTOS: incluyen:

 La incorporación de reactivos o colorantes

indicadores en la placa para ver la actividad
de enzimas de la cepa mutante.
 El método del taco de agar en el que cilindros
con colonias aisladas se transfieren a placas
de ensayo después de una incubación en una
cámara húmeda a partir del cual el diámetro de
las zonas de inhibición que se producen sirve
como medida de la producción de antibiótico de
cada cepa (esta producción de antibiótico que
es sobre medio sólido guarda una correlación
muy ligera con la que se lleva a cabo en
fermentación sumergida por lo que es
problema).