ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Una vacuna VLP inducir ADN diseñada para el VIH y inmice

probado
Alexandre Calazans 1,2 *, Cesar Boggiano 1, Ross Lindsay 1

1 Diseño y Desarrollo de laboratorio, International AIDS Vaccine Initiative, Brooklyn, Nueva York, Estados Unidos de América, 2 Centro para el
Desarrollo Tecnológico en Salud, Oswaldo Cruz, Fundación, Río de Janeiro, Brasil

* acalazans@cdts.fiocruz.br

Abstracto
a1111111111
Hemos desarrollado una vacuna de ADN que induce la formación de una VLP en vivo. Esta VLP fue diseñado para
a1111111111
provocar anticuerpos neutralizantes, para inducir mejores respuestas de células T y para activar el sistema inmune
a1111111111
a1111111111 innato. En general, 5 grupos de 10 ratones se sometieron a electroporación con las siguientes construcciones:
a1111111111 pVLP-LTR-GagPro [completo], pVLP-GagPro [VLP wihout ARN], pVLP-LTR-Gag [VLP inmaduro], pVLP-Gag y
pVLP-EnvBG505 [ vacuna de ADN normal] y un grupo simulado. Se realizó ICS en los bazos de ratones y se realizó
ELISA para anticuerpos env y un ensayo de Luminex para citoquinas inflamatorias. La VLP mostró una buena unión a
los anticuerpos neutralizantes. El porcentaje de células CD4 productoras de citoquinas fue del 0,1% [IFNg], 0,15%

ACCESO ABIERTO [IL-2] y 0,2% [TNFa] para el constructo pVLP-LTR-GagPro. El porcentaje de células CD8 productoras de citoquinas
fue del 0,3% [IFNg], 0,2% [IL-2] y 0,25% [TNFa]. Todas las construcciones pVLP indujeron más anticuerpos para
Citación: Calazans A, Boggiano C, Lindsay R (2017) Una vacuna

VLP inducir ADN diseñada para el VIH y probado en ratones. EnvBG505 que la normal vacuna de ADN Env.
PLoS ONE 12 (8): e0183803. https://doi.org/10.1371/journal.

pone.0183803

Editor: ShixiaWang, Universidad de Massachusetts Escuela de

Medicina, ESTADOS UNIDOS

Recibido: 17 de de abril de, 2017

Aceptado: 13 de agosto de, 2017

Publicado: 24 de de agosto de, 2017

Introducción
Derechos de autor: Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los
Ha sido más de 25 años desde que se identificó el VIH-1 como el agente causal del SIDA [ 1 ] [ 2 ]. Más de 60 millones de personas en
derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuido, transmitido,
todo el mundo han sido infectadas con el VIH-1, sobre todo en el mundo en desarrollo, y casi la mitad de estas personas han muerto.
modificado, construido sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona
El desarrollo de una vacuna segura y eficaz contra el VIH-1 sin duda, sería la mejor solución para el control final de la pandemia
para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la Creative

Commons A0 dedicación de dominio público. mundial del SIDA. Desafortunadamente, los esfuerzos de desarrollo de la vacuna del VIH-1 aún no han tenido éxito. La extraordinaria

diversidad de VIH-1, la capacidad del virus para evadir la respuesta inmune adaptativa, la incapacidad para inducir respuestas de

anticuerpos ampliamente reactivos, la pronta creación de reservorios virales latentes, y la falta de claras correlaciones inmunitarias de
Disponibilidad de datos Declaración: Todos los datos relevantes se

encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información de papel y. protección representan desafíos sin precedentes para la vacuna el desarrollo [ 3 ]. El principal objetivo de una vacuna contra el VIH-1

sería o bien para prevenir la infección o para reducir la carga viral después de la infección. Una vacuna ideal sería detener la infección

y proporcionar inmunidad esterilizante. Por el contrario, un gran número de vacunas virales licencia funciona mediante el control de la
Fondos: Este trabajo fue apoyado por una beca de la

Fundación Gilead subvención a Alexandre Calazans. replicación viral subclínica y mediante la prevención de la enfermedad clínica. Tal control parcial, como se ejemplifica por una

disminución en el pico y la consigna viral

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen

conflictos de intereses.

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 Una vacuna VLP inducir ADN para el VIH

cargas después de la infección, se ha demostrado en algunos estudios preclínicos de vacunas que provocan respuestas de células T [ 4 ].

Como se mencionó anteriormente, se desean respuestas de células T a ser provocada por una eficaz contra el VIH de la vacuna [ 5 ]. Es

bien conocido que las respuestas de células T CD8 Gag están asociados con la reducción de la viremia, mientras que las células T CD8 Env

están relacionadas con mayor viremia [ 6 ]. Los anticuerpos que neutralizan diversas cepas de VIH-1 se desarrollan en aproximadamente el

20% de los individuos infectados por el VIH-1 [ 7 ]. El ensayo RV144 demostró una eficacia de la vacuna 31% en la prevención de la infección

por VIH-1. Los anticuerpos contra la variable de la cubierta del VIH-1 los bucles 1 y 2 [Env V1 y V2] correlacionó inversamente con el riesgo

de la infección [ 8 ]. Nuevos adyuvantes y sistemas de suministro también son necesarias en nuevas vacunas para el VIH. Han sido diseñados

en base a su capacidad para estimular la inmunidad innata y sensores antígenos diana a las células dendríticas, las células responsables de

la iniciación de la respuesta inmune adaptativa. La inclusión de estos adyuvantes y sistemas de entrega en vacunas puede alterar

positivamente la naturaleza de la respuesta inmune adaptativa, lo que resulta en la protección aumentada [ 9 ]. Por ejemplo, las respuestas

inmunes innatas modular la diferenciación de células T y controlan la respuesta de anticuerpos en puestos de control críticos de la

diferenciación de células B antígeno impulsado. Los virus se detectaron principalmente por el sistema inmune innato a través del

reconocimiento de los ácidos nucleicos virales. Genomic ARN VIH-1 induce respuestas innatas a través de Toll-like receptor 7 (TLR-7) y por

medio de ácido retinoico gen inducible de detección receptor RIG-I-como de ARN-secundaria estructurada [ 10 ].

Tradicionalmente, el desarrollo de vacunas implica compensaciones entre la inmunogenicidad y la

seguridad. Las vacunas vivas atenuadas se caracterizan por ofrecer inmunidad rápida y duradera, pero han
reducido la seguridad en comparación con las vacunas inactivadas. Por el contrario, la incapacidad de las
vacunas inactivadas para replicar mejora la seguridad a expensas de la inmunogenicidad, a menudo,
requiere dosis múltiples y de los refuerzos. A medida que la VLP formado por la vacunación de ADN es
similar a la del propio virus VIH, creemos que esta vacuna puede funcionar como una vacuna viva, pero
inactivado. En otras palabras, la vacuna será no replicativo. En realidad, tendrá un ciclo de replicación. Una
vez formada la VLP, se infectar una célula y su ARN se traducirá a nuevas proteínas que formarán un nuevo
VLP que no contendrá ARN. Esto dará lugar a la expresión aumentada de antígenos de la vacuna in vivo. 11 ].

Sobre la base de los hechos anteriores, se propone el desarrollo de un candidato de vacuna de ADN newHIV-1, que está

diseñado para provocar anticuerpos neutralizantes respuestas [NAb] y de células T concomitantes con el VIH-1 respuestas innatas

específicas. Nuestro enfoque es el desarrollo de un vector de vacuna de ADN promotor dual. La razón fundamental es tener la

conducción vacuna de ADN en vivo el montaje y la gemación de una VLP Gag madura que contiene BG505 Env y también llevar a

una porción del genoma del VIH-1. La idea es no utilizar VLP, sino más bien el propio ADN, como vacuna para accionar el conjunto y

gemación de la VLP in vivo. Un promotor impulsa la expresión de VIH-1 LTR-GagPro compuesta de secuencias de ácido nucleico del

VIH, que puede codificar proteínas Gag maduras, mientras que el LTR-GapPro ARN será encapsulado en las partículas debido a la

presencia de la secuencia Psi en la LTR. Este ARN viral en la VLP puede accionar el sistema inmune innato a través de la ligación a

TLR-7 y RIG-1. El otro promotor expresa Rev y Env BG505. proteína Rev permite el procesamiento correcto del ARN del VIH y

embalaje, y Env se incorporará a la VLP en ciernes. La membrana de un virus, aquí una VLP, es el lugar ideal para la conformación

correcta de la envoltura del VIH. Es el lugar donde envolvente expone sus sitios de unión de CD4, esencial para la neutralización de

anticuerpos para unirse. Hemos probado este nuevo enfoque de la vacuna de ADN en ratones y producido buenos resultados de

inmunogenicidad. La vacuna indujo altos niveles de respuestas de células T, buenos títulos de anticuerpos específicos de Env y fue

capaz de inducir IL-1 β 24 horas después de la vacunación, lo que sugiere la activación del sistema inmune innato.

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métodos

Las secuencias y la síntesis de genes

Todas las órdenes de genes se hicieron a GeneArt 1 y fueron optimizados humano. El LTRGagPro se sintetiza como los
primeros 1925 nucleótidos del prototipo VIH-1 del genoma HXB2. El Rev2AEnvBG505 se ordenó como el gen Rev seguido
de un sitio de furina (RKRR), la secuencia 2A de virus del tomate aspermia (TAV) y el gen Env BG505 [ 12 ]. La secuencia de
señal nativa de la envoltura del VIH-1 fue sustituida por una secuencia señal de CD5.

clonación

Hemos construido el vector pCMV-dualpromoter como un vector de expresión eucariótico bicistrónico con 2 promotores CMV
y resistencia a la kanamicina, para ser un vector de vacuna de ADN. Hemos clonado la secuencia LTRG Agpro en los sitios
BamH1 y EcoRV del MCS1 y clonado el Rev2AEnvBG505 en los sitios EcoRI y XbaI del MCS2. Llamamos al plásmido
formado pVLP-LTRGagPro. Los otros construyen, pVLP-GagPro, pVLP-LTRGag, pCMV-Gag y pCMV-Env, se construyeron
mediante amplificación por PCR de la región diana y la clonación de la MCS1 ( Figura 1 ). Rev2aEnvBG505 retuvo el mismo
GagPro y LTRGag. pCMV-Gag y Env sólo contenían estos genes. Todos los plásmidos se prepararon de la vacunación previa
con HiSpeed ​Plasmid Kit EF Mega [Qiagen, Alemania] un kit de purificación de plásmido Endo-libre.

Western blot
Para evaluar el procesamiento de proteínas Gag en el VLP, la LTR-GagPro [procesada Gag] y LTR-Gag [no procesados ​de la

mordaza] plásmidos se transfectaron a 293-T células con 1,0 g de ADN en 12 una placa de pocillos, utilizando el Lipofectamine

reactivo 1 2000 [Invitrogen, EE.UU.]. 48 horas después del inicio de la transfección, se eliminaron las células y se lisaron en

presencia de un tampón de baja salinidad

construcciones Fig 1. El VIH utilizados en este trabajo. 1- pVLP-LTRGagPro, 2- pVLPGagPro, 3- pVLP-LTRGag; asociado con Rev2AEnvBG505, la construcción que lleva el VIH-1 subtipo A Envelope BG505 y la
Rev de genes, necesaria para el empaquetamiento del ARN. Se muestran los promotores CMV [CMV pro] ubicación.

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[10 mMTris-Cl pH 7.5, 5 mMEDTA pH 8.0, 150 mMNaCl, 0.1%NP- 40] at 4˚C for 30 minutes. The lysate was clarified
by centrifugation at 13,000 g. The supernatant was collected, filtered (0.22μMmembrane, Millipore) and concentrated
in a 20% sucrose buffer in an ultracentrifuge (44000 g / 45 minutes / 4˚C). Then the supernatant was discarded and
the VLP was resuspended in 100 μL of PBS.

Las proteínas se separaron por 12,5% de SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-ECL, GE

Healthcares, EE.UU.), utilizando la transferencia mini-recipiente BIORAD. La transferencia se llevó a cabo en tampón de transferencia

(20% Tris-glicina 5X, 20% de metanol absoluto) durante 16 horas a 20 voltios. Después de la transferencia, las membranas se

incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas en tampón de bloqueo (1% PBS, 5% leche desnatada, 0,2% de Tween-20, 0,5%

BSA). Después, se añadió el anticuerpo primario (policlonal anti-p24GagHIV anticuerpo) y se incubó durante 2 horas a temperatura

ambiente. Al final de este período, las membranas se lavaron 3 veces con 1X PBS que contenía 0,2% de Tween-20. El anticuerpo

secundario se añadió en el mismo tampón (inmunoglobulinas anti-ratón) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.

Por último, las membranas se lavaron 5 veces con PBS-Tween y desarrollados por quimioluminiscencia utilizando el kit de

reactivos para la detección de proteína ECL (GE Healthcare, EE.UU.) de acuerdo con las directrices del fabricante.

Desplegable, ELISA y PCR: Estamos transfectadas la pVLP-LTRGagPro en 293-T células y recogió el

sobrenadante. Entonces hemos denominado la VLP en el sobrenadante con biotina (kit OneStep biotinilación,
Miltenyi, Alemania) anticuerpos neutralizantes (b12, PG9, PG16, PGT126, PGT145 y PGV04). Luego se bajó la VLP
marcada con anti-biotina (microperlas Miltenyi).

Se realizó un VIH-1 p24 ELISA (Zeptometrix, EE.UU.) con la VLP purificada. Además, se extrajo el ARN viral de
la VLP purificado con el kit QIAamp Viral RNAMini (Qiagen, Alemania) y hicimos cDNA con el kit de ADNc de alta
capacidad (ThermoFisher Scientific, EE.UU.). A continuación realizó PCR para la región de la mordaza.

La vacunación en ratones

Hemos probado esta vacuna en ratones, y 10 animales se utilizaron para cada grupo de vacuna ensayada. se utilizaron animales

Balb / c. Los grupos fueron pVLP-LTRGagPro, pVLP-GagPro, pVLPLTRGag, pCMV-Gag + pCMV-Env, y un vector vacío. Los

animales se vacunaron por electroporación (Sistema TriGrid, EE.UU.) con 20 g de ADN, dos veces, cada 3 semanas. Serumwas

recogió 24 horas después de la segunda exposición y durante la semana 5. En la semana 9, los animales se sangraron para el

suero luego sacrificados, y se extirparon los bazos para el análisis de células T. Los ratones se sacrificaron a través de CO 2 se llevó

a cabo la inhalación o Euthasol (100 mg / kg) administrado IP y una recogida de sangre terminal a través de punción cardiaca. La

condición de los animales se controló diariamente. Ningún animal mostró signos de enfermedad post-tratamiento. Y ningún animal

murió (sin la eutanasia), debido a los procedimientos experimentales. Un protocolo de IACUC (IBC-13-012) fue emitida, para este

estudio en la Universidad Estatal de Nueva York Downstate Medical Center, donde IAVI alberga las incubadoras animales. Atención

Institucional y el empleo Comisión (IACUC) aprobados específicamente este estudio.

Env BG505 ELISA

Serial dilutions of heat inactivated sera fromweek 5 and 9 were incubated for 1 hr on 96-well plates which were
previously coated with Env BG505 protein [homemade produced], then blocked for 1 hour with 3% BSA/PBS. Plates
were washed in 0.05% PBS/Tween and incubated for 1 hr with the alkaline 236 phosphatase-conjugated secondary
antibodies. After washing, plates were incubated for 30 min with nitrophenylphosphate and optical density was
measured

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at 450 nm using SoftMAx Pro GxP v5 (Molecular Devices, US). All data shown have the ‘no sera’ background
signal subtracted.

Intracellular cytokine staining [ICS]

PBMC entre 600.000 y 1.000.000 se incubaron con la proteína gag y reservas de péptidos del VIH-1 Consenso B de la mordaza (Se

obtuvo el siguiente reactivo a través del Programa NIH SIDA Reactivo, División de SIDA, NIAID, NIH: VIH-1 Con B Gag péptido

piscina [cat # 12425]) o proteína gp 120 durante 9 horas con brefeldina a (Sigma, EE.UU.), CD49d, y CD28 (BD Biosciences,

EE.UU.) a 37ºC con 5% de CO 2. Las células se lavaron y se tiñeron con la tinción de células que se puede fijar / DEAD -Aqua

viabilidad LIVE (Invitrogen, EE.UU.), después se lavaron y se tiñeron para los marcadores extracelulares con CD3-Pacific Blue,

CD4-PerCP Cy5.5, y CD95-APC [BD Biosciences, EE.UU. ]. Las células se permeabilizaron con Perm Fix y se tiñeron para los

marcadores y citoquinas intracelulares con CD69-Texas Red, CD8-APC-H7, IL-2- PE, IFN γ- Alexa 700, y TNF α- PE-Cy7 (BD

Biosciences, EE.UU.). Las células se recogieron en un LSR-II (BD Biosciences, EE.UU.) y se analizaron utilizando un dispositivo

FlowJo (TreeStar, US). Todos los datos que se muestran tienen las respuestas estimuladas fondo '' Mock sustraídas.

Luminex
citoquinas inflamatorias se analizaron en el suero del animal, se recogió 24 horas después de la vacunación. Utilizamos el panel
magnético 4-Plex inflamatoria de citoquinas de ratón para el Luminex ™ (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.), que detecta
GM-CSF, IL-1 β, IL-6, y TNF α. El lecturas se realizaron usando un dispositivo 200 Bio-Plex (Bio-Rad, EE.UU.). Se llevaron a cabo
tres experimentos independientes.

análisis estadístico
Un utilizó un modelo lineal se utilizó para comparar los 5 grupos en los experimentos. Se utilizó una prueba de comparación múltiple

de Tukey-Kramer post-test. Gráficos se produjeron utilizando GraphPad Prism

6.0, y realizó el análisis estadístico GraphPad INSTAT en 3.10.

resultados

Hemos construido una vacuna de ADN que provocó una VLP in vitro. La razón era que el conductor vacuna de ADN en vivo montaje
y injerto de un VLP Gag maduras contienen BG505 Env, que también lleva una porción del genoma del VIH-1. Un promotor
impulsa la expresión de VIH-1 LTR-GagPro compuesta de secuencias nativas de ácido nucleico del VIH, que codifica para las
proteínas Gag maduras. El RNAm de LTR-GagPro, que se encapsula en la partícula a través de la secuencia Psi en la LTR,
puede formar estructuras secundarias que inducen el brazo innata del sistema inmunitario. El otro promotor expresa Rev y Env
BG505. proteína Rev permite correcto procesamiento del ARN del VIH y el embalaje [ 13 ], Y la proteína Env se incorporarán
correctamente en VLP en ciernes como una espiga. Se seleccionaron los contenidos de estos genes para hacer que las partículas
de la mordaza maduros que contienen Env BG505. BG505 fue seleccionado por el Design & Development Laboratory,
International AIDS Vaccine Initiative porque se une a una amplia gama de Nab [PG9 / 16, VRC01, PGT122, PGT 125 familias] [ 14 ].
moléculas de la mordaza maduro procesados ​por la proteasa del VIH son más inmunogénicas que poliproteína Gag no procesado
[Pr55Gag] [ 15 ]. Así, la presencia del VIH-1 RNA genómico en las VLP estimulará la inmunidad innata citosólica receptores TLR-7
y RIG-1, lo que puede dar forma positiva y modular las respuestas humorales y celulares [ dieciséis ].

En el experimento de transferencia de Western, se podía ver que los pVLP-LTRGagPro forma una partícula Gag maduras

debido a la presencia de una banda de p24 en la membrana. En el otro lado, LTR-Gag mostró sólo la banda Pr55Gag que indica un

Gag no procesada, como se esperaba ( Figura 2 ).

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Fig 2. Análisis de procesamiento de Gag en la VLP. pVLP-LTRGagPro y pVLP-LTRGag transfecciones tenían el sobrenadante [VLP] concentró y
se sometió toWestern secante, y se desarrolló con anticuerpo policlonal anti-p24. LTRGagPro mostró la presencia de la banda de p24, lo que indica el
procesamiento. LTRGag mostró sólo la banda Pr55gag, lo que indica la mordaza inmaduro.

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Hemos detectado la formación de la VLP a través de un desplegable experimento in vitro ELISA. Se utilizó anticuerpos
neutralizantes biotinilados (NAB) para capturar la VLP con perlas anti-biotina. Entonces se realizó un VIH-1 p24 ELISA. El
pVLP-LTRGagPro con Env BG505 indujo una VLP que se une bien a la mayoría NAb. Se no se unió bien a b12, una primera
generación de VIH-1 Nab, y la unión fue relativamente menor que la del anticuerpo a VSV-G. La mejor unión era PGT 145 (>
400 pg / ml p24), mientras que la unión a PG-9, PG-16, PGT-126 y PGV-04 era buena (~200pg / mL p2). El anticuerpo no
relacionado VSV-G tenía una unión de <100 pg / ml de p24 ( Fig 3A ). Podríamos amplificar Gag de la VLP purificada, por
PCR, lo que demuestra que la VLP lleva su ARN viral como verificada con la presencia de una banda Kb ~ 1,7 en el gel ( Fig
3B ). El cordón de VLP purificadas están suprimidos los plásmidos en el sobrenadante, por lo que esta amplificación por PCR
es del ARN genómico.

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 A DNA inducing VLP vaccine for HIV

Fig 3. Pull-down de la pVLP-LTRGagPro produce VLP por biotinylatedmagneticmicrobeads. A- after separation of the VLP with the neutralizing antibodies [Nab] [b12, PG9, PG16, PGT126, PGT145, PGV04, and
the non-related antibody VSV-G], the purified VLP were submitted to HIV p24 ELISA, proving the correct assembly of the particle. B–the purified VLP RNAwas extracted, cDNA was synthetized and PCR amplification
was performed for the Gag region [lane 1- 1kb ladder plus, lane 2 –pVLP-GagPro cDNA, lane 3 –negative control].

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En la semana 5, no hemos podido detectar la producción de anticuerpos por pVLP-LTRGagPro. Las otras construcciones

mostraron un nivel moderado de la producción de anticuerpos, con un título de dilución de suero 500. Ya, en la semana 9 la

pVLP-LTRGagPro era el constructo que produjo nivel más bajo de anticuerpos [alrededor de dilución 200]. pVLP-GagPro produjo

un título más alto, dilución de suero de aproximadamente 2.500. pVLP-LTRGag indujo una dilución de suero de aproximadamente

2000 y pCMV-Gag y Env, indujo una dilución de suero de aproximadamente 1000 ( Fig 4 ). En el experimento ICS hemos perdido

las muestras fromweek 5 por un accidente de laboratorio. Por lo tanto, sólo se podía analizar las muestras fromweek 9. A partir de

este experimento, pudimos ver que pVLPLTRGagPro indujo a los más altos niveles de producción de citoquinas cuando se

estimularon con péptidos de la piscina de la mordaza. Para las células T CD4, indujo 0.1, 0.2, y 0.35% de IFN γ, IL-2, y TNF α, respectivamente

(estadísticamente significativo). Para las células T CD8, produjo 0,5, 0,2 y 0,55% de IFN γ, IL-2, y TNF α, respectivamente

(estadísticamente significativo) ( Fig 5A y 5B ). Al comparar la pVLPLTRGagPRO con la vacuna regular de ADN del VIH, pCMVGag

+ pCMV-Env, se podría detectar niveles más altos de producción de citoquinas en la VLP formación de vacuna que en la vacuna

de ADN regular. Para las células T CD4, indujo 8,3, 7,0, y 2,2 veces para las citoquinas IFN γ, IL-2, y TNF α,

respectivamente. Además, se indujo 2,5, 12,8, y 2,2 veces para IFN γ, IL-2, y TNF α, respectivamente, en las células T CD8.
Cuando se estimula con la proteína gag, se podría detectar resultados estadísticamente significativos para las células CD4 que
segregan IFN γ. Cuando las células T se estimularon con gp120, se observó otro patrón de respuesta. Estas células no expresan
niveles significativos de citoquinas. El pVLP-LTRGag fue la única respuesta. Se indujo 0,25% de IFN γ para las células CD8 ( Fig
5F ).

Se midió la respuesta inmune innata 24 horas después de la última toma de la vacuna. Se analizó la producción
de las citocinas GM-CSF, IL-1 β, IL-6, y TNF α. Para GM-CSF, IL-6, y

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Fig 4. La medición de los anticuerpos producidos después de la vacunación mediante ELISA. Los sueros de los animales recogidos en la semana 5 y 9, se
sometieron a ELISA, con la Env BG505 recubrimiento de las placas. se muestran de punto final títulos de anticuerpos anti-env. Resultados estadísticamente
significativos se indican en la figura.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0183803.g004

TNF- α we did not observe differences [data not shown]. We did observe an increase in the production of IL-1 β for
pVLP-LTRGagPro that was statistically significant, with p<0.001 ( Fig 6 ).

Discussion
Hemos observado que pVLP-LTRGagPro construyó una partícula maduro, con las proteínas Gag procesados, como se muestra en el

experimento de transferencia de Western. pVLP-LTRGag no mostró una proteína Gag maduras, como se esperaba.

En el experimento desplegable, podíamos ver que la VLP (pVLP-LTRGagPro) se une bien a todos los anticuerpos
neutralizantes usados ​(VRC-1, PG-9, PG-16, PGT-145, etc). Esto demostró que la VLP era bien montado. Debido a que
hemos detectado la cápside (p24) por ELISA, se determinó que el sobre BG505 se expresa en la conformación derecha,
exponiendo así la unión CD4

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 Una vacuna VLP inducir ADN para el VIH

Fig 5. intracelular de citoquinas tinción [ICS] resultados. células T CD4 y CD8 se estimularon con piscina gag péptido, proteína gag, o proteína gp120 Env y la producción de las citoquinas IFN γ, IL-2, y TNF α fue
medido. Los resultados estadísticamente significativos tienen el valor p indica en los gráficos. Las muestras que no tienen valor de p se muestra no mostraron resultados estadísticamente significativos.

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Fig Análisis 6. de la producción de citoquinas pro-inflamatorias, 24 horas después de la vacunación. La producción de las citocinas GM-CSF, IL-1 β, IL-6, y TNF α weremeasured por Luminex. Las citocinas
GM-CSF, IL-6, y TNF α no tuvo resultados significativos [datos no mostrados]. Con respecto a IL-1 β, la pVLPLTRGagPro constructo induce más la liberación de esta citoquina que los otros grupos [p <0,001], para
3 experimentos independientes.

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dominios, permitiendo que se unen a los NAb. Cale et al, también se utiliza VLP para estabilizar el trímero env e identificar

VIH-1-neutralizar linaje-un anticuerpo neutralizante buena N90-VRC38 Ab [ 17 ]. Estos resultados confirman la eficacia de las VLP

como presentación y sistema de administración para proteínas conformacionales [ 18 ]. La amplificación por PCR de la mordaza de

la VLP purificada demuestra que la partícula se encapsula el RNA viral.

Entre los tipos de células analizadas [CD4 e CD8], el pVLP-LTRGagPro mostró los niveles más altos de todas las citoquinas
producidas [IFN γ, IL-2 y TNF α] cuando se pulsaron con péptidos gag. Esta construcción indujo más citocinas de la vacuna de
ADN normal pCMV-Gag + pCMV-Env. Parece que la respuesta fue trasladada a un patrón más Th1. Creemos que este efecto
fue causado debido a la presencia de ARN viral de que actuó como un adyuvante, se activara el sistema inmune innato. Las
respuestas de células T contra gp120 Env fue baja. Esto es deseable en una vacuna contra el VIH, como la respuesta de
células T a Env se asocia con el aumento de la viremia VIH [ 6 ]. Los constructos que no llevan ARN fueron menos eficaces en la
producción de citoquinas que la que lleva el ARN.

De alta magnitud, polifuncionales CD8 respuestas de células T a la mordaza se ha demostrado que ser un componente importante del

control de la viremia en el VIH a largo plazo no progresores positivas y controladores de élite. Por lo tanto, la mordaza se considera que es

un componente importante de las vacunas contra el VIH debido a una respuesta de células T fuerte podría dar lugar a la temprana

eliminación de las células infectadas por el VIH a través de las células T CD8 en el sitio de la infección, el control de la propagación de la

puerta de entrada, y el control de la viremia [ 19 ].

Chapman et al [ 20 ] También hizo una vacuna de ADN para el VIH que forma una VLP. Sin embargo, esta VLP era una Gag inmaduro

sin ARN dentro. Ellos tenían altos niveles de Gag respuestas de células T, similar a la nuestra. Sin embargo, es difícil comparar estos

estudios porque utilizaron ELISPOT para evaluar la respuesta de células T y también se utilizan sólo tres péptidos Gag-específicos para la

estimulación de las células. En contraste, se utilizó un conjunto de péptidos Gag para la estimulación. Otro grupo [ 21 ] Produjo una vacuna

de ADN lentivirus no replicativo para el VIH. Tenía un solo ciclo de replicación, tales como nuestra vacuna de ADN. Produjeron robusta

respuesta de células T de la mordaza. De nuevo, es difícil comparar porque usaron ELISPOT y un ensayo de proliferación (CFSE) para

evaluar las respuestas de células T. Batán et al [ 22 ] Hecho una vacuna de ADN gp120 y probado en ratones. En contraste con Estados

Unidos, que mostraron altos niveles de Env respuesta de las células T y la respuesta de anticuerpos de moderada a Env. Encontramos

una respuesta más robusta que los anticuerpos de Env.

El pVLP-LTRGagPro mostró títulos de anticuerpos más bajos que los otros constructo. Esto puede ser debido la presencia del

ARN en la VLP actuar como adyuvante. Los adyuvantes pueden desencadenar diferentes respuestas de anticuerpos, y pueden

sesgar selectivamente un anticuerpo [ 23 ] [ 24 ]. A medida que la respuesta inmune se cambió a un patrón Th1, la respuesta Th2 fue

menor, lo que disminuyó la producción de anticuerpos en el pVLP-LTRGagPro construir [ 21 ].

Hemos probado las respuestas inmunes innatas 24 horas después de la vacunación. Esto no era ideal, y que debería haber

sido probado 4-6 horas después de la vacunación. Sin embargo, hemos sido capaces de ver un alto nivel de IL-1 β tras la

vacunación pVLP-LTRGagPro, que indica la activación del sistema inmune innato.

Estos resultados ilustran que las VLP con GagPro proporcionan un medio seguro y eficaz de mejorar la neutralización de las

respuestas humorales a las partículas que contienen proteínas gp120. Por lo tanto, la antigenicidad de estos VLP representan un

enfoque atractivo para el diseño de vacunas para los cuales se desea la estimulación específica de anticuerpos neutralizantes y las

funciones efectoras citotóxicas a las glicoproteínas complejas [ 25 ].

Conclusión
La vacuna probada aquí, pVLP-LTRGagPro, mostró resultados mejor inmunogénicas que sus controles. Se demostró más altos

ICS resultados tanto para CD4 y las células-T CD8. La alta respuesta Gag de la

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 Una vacuna VLP inducir ADN para el VIH

De células T y la respuesta de células T bajo Env es deseable para una vacuna contra el VIH [ 6 ]. Esta vacuna produjeron más
IL-1 β 24 horas después de la vacunación que otros grupos, lo que indica que esta vacuna puede activar el sistema inmune
innato. Hemos demostrado que esta vacuna tiene su propio adyuvante natural. Esta construcción no sólo indujo anticuerpos pero
también causó la respuesta celular inmune a cambiar a un perfil más favorable Th1. Por lo tanto, esta vacuna indujo todos los
brazos del sistema inmune: respuestas humorales y celulares, así como la activación del sistema inmune innato.

El siguiente paso para esta vacuna debe ser probando en NHP [primates no humanos]. En la configuración de NHP,
pudimos evaluar la respuesta inmune innata y no determinar si esta vacuna es capaz de proteger a los animales de la infección
tras la exposición de un SHIVmodel.

Expresiones de gratitud

Nos gustaría agradecer a Michael Caulfield y Christopher Parques de discusión científica y apoyo.

Contribuciones de autor

conceptualización: Alexandre Calazans, Cesar Boggiano.

los datos de curación: Alexandre Calazans, Cesar Boggiano.

Análisis formal: Alexandre Calazans, Cesar Boggiano, Ross Lindsay.

Investigación: Alexandre Calazans, Cesar Boggiano, Ross Lindsay.

Metodología: Alexandre Calazans, Cesar Boggiano, Ross Lindsay.

Administración de proyecto: Alexandre Calazans, Cesar Boggiano.

recursos: Alexandre Calazans, Ross Lindsay.

Software: Alexandre Calazans, Cesar Boggiano.

Supervisión: Alexandre Calazans, Cesar Boggiano.

Validación: Alexandre Calazans, Cesar Boggiano, Ross Lindsay.

Visualización: Alexandre Calazans, Ross Lindsay.

Escribiendo - proyecto original: Alexandre Calazans, Cesar Boggiano, Ross Lindsay.

Redacción - revisión y edición: Alexandre Calazans, Cesar Boggiano, Ross Lindsay.

referencias
1. Barre'-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, NugeyreMT, Chamaret S, Gruest J, Dauguet et al. 1983. aisla-
ción de un retrovirus linfotrópico T de un paciente en riesgo de síndrome de inmunodeficiencia adquirida [SIDA]. Science [80-] 220:
868-871. PMID: 6189183

2. Kuscetti FW, Gallagher KE, Clarkson B, Kalyanaraman VS, Harbor CS, IM, Svoboda J et al. 1984. fre-
Detección quent y aislamiento de citopático Retrovirus [HTLV-III Fron pacientes con SIDA y en riesgo de SIDA. Ciencia [80-] 224: 500-503.
PMID: 6200936

3. Excler JL, RobbML, Kim JH. 2015. Las perspectivas de una vacuna a nivel mundial eficaz contra el VIH-1. Vacuna 33: D4-
D12. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.03.059 PMID: 26100921

4. Barouch DH. 2008. Desafíos en el desarrollo de una vacuna contra el VIH-1. Naturaleza 455: 613-619. https: //
doi.org/10.1038/nature07352 PMID: 18833271

5. McDermott AB, Koup RA. 2012. células CD8 [+] T en la prevención de la infección por VIH y la enfermedad. SIDA
26: 1281-1292. https://doi.org/10.1097/QAD.0b013e328353bcaf PMID: 22441256

PLoSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0183803 24 de de agosto de, 2017 11/12

 Una vacuna VLP inducir ADN para el VIH

6. Kiepiela P, Ngumbela K, Thobakgale C, Ramduth D, Honeyborne I, Moodley E et al. 2007. CD8 + T-cell
respuestas a diferentes proteínas del VIH tienen asociaciones discordantes con la carga viral. Nat Med 13: 46-53.
https://doi.org/10.1038/nm1520 PMID: 17173051

7. Liao HX, Lynch R, Zhou T, Gao F, AlamSM, Boyd SD et al. 2013. Co-evolución de un ampliamente neutralizantes
ing anticuerpo VIH-1 y el virus del fundador: suplemento. Naturaleza 496: 469-76. https://doi.org/10.1038/ nature12053 PMID: 23552890

8. RollandM, Edlefsen PT, Larsen BB, Tovanabutra S, Sanders-Buell E, Hertz T et al. 2012. Aumentó
VIH-1 eficacia de la vacuna contra el virus con firmas genéticas en Env V2. Naturaleza 490: 417-20. https: // doi.org/10.1038/nature11519 PMID:
22960785

9. Levitz SM, Golenbock DT. 2012. Más allá del empirismo: Informar el desarrollo de vacunas a través innata
investigación de la inmunidad. Cell 148: 1284-1292. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.02.012 PMID: 22424235

10. Pulendran B, Ahmed R. 2011. Immunological mechanisms of vaccination. Nat Immunol 12:509–17.
PMID: 21739679

11. Liu MA. 2010. Immunologic basis of vaccine vectors. Immunity 33:504–515. https://doi.org/10.1016/j.
immuni.2010.10.004 PMID: 21029961

12. Hoffenberg S, Powell R, Carpov A, Wagner D, Wilson A, Kosakovsky Pond S et al. 2013. Identification
of an HIV-1 clade A envelope that exhibits broad antigenicity and neutralization sensitivity and elicits antibodies targeting three distinct
epitopes. J Virol 87:5372–83. https://doi.org/10.1128/JVI.02827-12
PMID: 23468492

13. Lu K, Heng X, Garyu L, Monti S, Garcia EL, Kharytonchyk S et al. 2011. NMR detection of structures in
the HIV-1 5’-leader RNA that regulate genome packaging. Science 334:242–5. https://doi.org/10.1126/ science.1210460 PMID: 21998393

14. Julien JP, Lee JH, Cupo A, Murin CD, Derking R, Hoffenberg S et al. 2013. reconocimiento asimétrica del trímero VIH-1 mediante la
neutralización ampliamente PG9 anticuerpo. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 110: 4351-6. https: // doi.org/10.1073/pnas.1217537110 PMID: 23426631

15. Sacha JB, Reynolds MR, Buechler MB, Chung C, Jonas AK, Wallace LT et al. 2008. antígeno diferencial
la cinética de presentación de epítopos de células T CD8 + derivadas de la misma proteína viral. J Virol 82: 9293-8.
https://doi.org/10.1128/JVI.00749-08 PMID: 18596093

dieciséis. Heil F, Hemmi H, Hochrein H, Ampenberger F, Kirschning C, Akira S et al. REC- 2012. específico de la especie
nocimiento de ARN monocatenario a través de Toll-like receptor 7 y 8. Science [80-] 1526.

17. Cale Evan M., Jason Gorman, Radakovich Nathan A., Kwong Peter D., Mascola John R. et al.2017.
Partículas similares a virus identificar un anticuerpo neutralizante V1V2 VIH Apex-Binding que carece de un resalta Loop. Inmunidad 46,
777-791. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2017.04.011 PMID: 28514685

18. ViscianoML, Diomede L, Tagliamonte M, Tornesello ML, Asti V, Bomsel M et al. 2011. La generación de
VIH-1 Virus-Like partículas expresan diferentes del VIH-1 glicoproteínas. Vacuna. 2011 Jul 12; 29 [31]: 4903-
12. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2011.05.005 PMID: 21596074

19. Williamson AL, Rybicki EP. 2015. Justificación de la inclusión de la mordaza de candidatos a vacuna contra el VIH.
Expert Rev Vaccines 15: 1-14. https://doi.org/10.1586/14760584.2016.1112744

20. Chapman R, Jongwe TI, Douglass N, Chege G, Williamson AL. 2017. heteróloga vacci- primer impulso
nación con el ADN y vacunas MVA, expresando partículas similares al virus VIH-1 subtipo Cmosaic de la mordaza, es altamente inmunogénica
en ratones. PLoSONE 12: e0173352. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173352
PMID: 28278263

21. MoussaM, Arrode-Bruss G, Manoylov I, Malogolovkin A, Mompelat D, Ishimwe H et al. 2015. Una novela
vacuna no integradora de un solo ciclo quimérico VIH ADN lentivector. Vacuna 33: 2273-2282. https: // doi. org / 10.1016 /
j.vaccine.2015.03.021 PMID: 25825333

22. Fuller D, Haynes J. 1994. Una progresión cualitativo en el VIH tipo 1 glicoproteína citotóxico 120-específica CEL
lular y las respuestas inmunitarias humorales en ratones que recibieron una vacuna de glicoproteína de 120 basado en el ADN. AIDS Res
HumRetroviruses 10: 1433-41. https://doi.org/10.1089/aid.1994.10.1433 PMID: 7888198

23. Gunn BM, Alter G. 2016. moduladores anticuerpos funcionalidad de Enfermedades Infecciosas y de vacunación.
Trends Mol Med 22: 969-982. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2016.09.002 PMID: 27756530

24. Vaccari M, Gordon SN, Fourati S, Schifanella L, Liyanage NPM, CameronM et al. 2016. por adyuvantes
dependientes firmas inmune innata y adaptativa de riesgo de adquisición de SIVmac251. Nat Med 22.

25. Deml Ludwig, Schirmbeck Reinhold, Jörg Reimann, Wolf Hans, andWagner Ralf. 1997. recombinante
Inmunodeficiencia Humana Pr55gag partículas semejantes al virus quimérico Presentación de glicoproteínas de la envoltura Inducir citotóxicos
células T y los anticuerpos neutralizantes. Virología 235, 26-39. https://doi.org/10.1006/ viro.1997.8668 PMID: 9300034

PLoSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0183803 24 de de agosto de, 2017 12/12