Zeña Silva, Laura Janett

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
Efecto del almidón comercial de Zea IC
ÁT
RM
mays sobre la cinética de producción de

FO
amilasas por Bacillus licheniformis

IN
DE
TESIS
AS
EM
PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL

ST
BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO
SI
DE
Autor: Br. Laura Janett Zeña Silva

N
IO
Asesor: Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

CC
TRUJILLO --PERU
RE
DI
2015
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO
N
IÓ
AC
Dr. Orlando Gonzáles Nieves
IC
UN
RECTOR
M
CO
Y
A
IC
Dr. Rubén Vera VélizÁT
RM
VICERECTOR ACADÉMICO
FO
IN
DE
AS
EM
Dr.Weyder Portocarrero Cárdenas

ST
SI
VICERECTOR DE INVESTIGACIÓN
DE
N
IO
CC
RE
DI
Dr. Esteban Ilich Zerpa
SECRETARIO GENERAL
ii
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS
N
BIOLÓGICAS
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
Dr. José Mostacero León
A
DECANO
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
Dr. William Zelada Estraver

EM
SECRETARIO
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
Dra. Bertha Soriano Bernilla

DI
DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.
iii
PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado:
N
IÓ
AC
IC
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos
UN
de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la Facultad de
M
CO
Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración
Y
y criterio el presente trabajo de tesis titulado:
A
“Efecto del almidón comercial de Zea mays sobre la cinética de producción de
IC
ÁT
amilasas por Bacillus licheniformis” con el cual pretendo obtener el Título Profesional de
RM
Biólogo Microbiólogo.
FO
IN
DE
AS
Trujillo, Diciembre de 2015

EM
ST
SI
DE
N
IO
Br. Laura Janett Zeña Silva

CC
RE
DI
iv
MIEMBROS DEL JURADO
Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en
concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y
N
IÓ
Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.
AC
IC
UN
M
CO
Y
_________________________________
A
IC
Ms. C. Anibal Quintana Diaz
ÁT
PRESIDENTE
RM
FO
IN
DE
AS
_________________________________
EM
Dr. Luis Llenque Díaz

ST
SECRETARIO
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
_________________________________
Ms. C. Miguel Muñoz Rios
VOCAL
APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el presente
Informe de Tesis titulado: “Efecto del almidón comercial de Zea mays sobre la
N
IÓ
cinética de producción de amilasas por Bacillus licheniformis”, ha cumplido con los
AC
IC
requisitos formales y fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.
UN
M
CO
Y
_________________________________
A
IC
Ms. C. Anibal Quintana Diaz
ÁT
PRESIDENTE
RM
FO
IN
DE
AS
_________________________________
EM
Dr. Luis Llenque Díaz

ST
SECRETARIO
SI
DE
N
IO
CC
_________________________________
RE
DI
Ms. C. Miguel Muñoz Rios
VOCAL
vi
CERTIFICACION DEL ASESOR
El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada:
N
IÓ
AC
“Efecto del almidón comercial de Zea mays sobre la cinética de producción de
IC
UN
amilasas por Bacillus licheniformis”
M
CO
Y
Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de Ciencias
A
IC
Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con su
ÁT
correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las observaciones
RM
y sugerencias alcanzadas.
FO
IN
DE
Por lo tanto, autorizo a Laura Janett Zeña Silva continuar con el trámite del
AS
reglamento correspondiente.
EM
ST
Trujillo, Diciembre de 2015

SI
DE
N
IO
CC
_________________________________
RE
Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

DI
ASESOR
vii
DEDICATORIAS
A Dios
N
IÓ
Por estar conmigo en cada paso que doy, cuidándome y dándome fuerzas para
AC
seguir adelante y no desalentarme en el intento, por haberme dado salud para lograr
IC
UN
mis objetivos y permitido llegar a este momento tan importante de mi vida profesional.
M
CO
Y
A
IC
ÁT
A mi madre Laura
RM
Por ser el pilar más fundamental en mi vida, por sus consejos, comprensión,
FO
amor, valores, apoyo incondicional en todo momento y por la confianza puesta en mí

IN
DE
para hacer posible la culminación de mi carrera profesional. ¡Gracias por estar

AS
siempre conmigo!
EM
ST
SI
DE
N
A mis hermanos: Abraham y Karen

IO
CC
Por estar a mi lado y compartir momentos, sus risas, ocurrencias y cada reto que
RE
se me presenta.
DI
viii
A mi abuelito Humberto
A quien admiro porque es un ejemplo de esfuerzo y sacrificio, a no darse por
N
IÓ
vencido ante cualquier dificultad, gracias por tus consejos y apoyo incondicional.
AC
IC
UN
M
CO
A mis Tías: Carmen y Lucinda
Y
A
IC
Por estar a mi lado, que con su apoyo y consejos me orientan a seguir adelante
ÁT
con optimismo y confianza en mí.
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
ix
AGRADECIMIENTO
A mi asesor, Dr. Luis Alberto Llenque Díaz, por brindarme su tiempo, apoyo y
N
IÓ
dedicación, así como las sugerencias constructivas durante el desarrollo de la presente
AC
investigación, además por brindarme su amistad y conocimientos académicos durante mi
IC
UN
formación profesional.
M
CO
A mis amigos, por estar conmigo todo este tiempo y compartir experiencias,
Y
A
conocimientos, momentos alegres y tristes. Gracias por ser mis amigos y recuerden que
IC
ÁT
siempre los llevare en mi corazón.
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
INDICE
Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo………………………….……….ii
N
IÓ
Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas……………………….………….. iii
AC
IC
Presentación…………………………………………………….………….………......iv
UN
M
Miembros del jurado………………………………………………………..……….…v
CO
Y
Aprobación………………………………………………...……………….………..…vi
A
Certificación del Asesor…………………………………...…….………….…...……..vii
IC
ÁT
RM
Dedicatoria………………………………………………………...……….…………..viii
FO
IN
Agradecimiento………………..………………………….….………………………...x
DE
Índice…..…………………………………………………….…………………….…...xi
AS
EM
Resumen…………………………………………………………………………......... xiii
ST
INTRODUCCIÓN…………………….……………………………………………......1
SI
DE
Objetivos…………………………………………………………………………....…..9
N
MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………….10
IO
CC
1. Material biológico……………………………………………………..………........10
RE
2. Procedimiento……………………………………………….……….……………..10
DI
2.1. Reactivacion del cultivo de Bacillus licheniformis FGM-A15……….……….10
2.1.1 Determinación de la pureza de las colonias…………………………...10
xi
2.1.2 Verificación de la capacidad degradativa de almidón por
Bacillus licheniformis FGM-A15………………………………….10
2.2. Construcción de biorreactores……………………………………………....11
N
IÓ
2.3. Preparación del inóculo…………..….…………………..……..…….....…11
AC
2.4. Sistemas de ensayo para la evaluación de la producción de…………………11
IC
UN
amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15
M
2.4.1 Sistema de ensayo Problema: ………………………………………11
CO
Y
2.4.2 Sistema de ensayo Control: …………………………………………12
A
IC
ÁT
2.4.3 Monitoreo: …………………………………………………………..12
RM
2.5.Determinación de la actividad catalítica……..........…………...…….……...12

FO
2.6. Medición del Almidón Residual.…………...………….…..…………….....13

IN
DE
2.7 Elaboración de la curva estándar de almidón...………………..………......13

AS
2.8 Determinación de la producción de amilasas

EM
(Unidades de actividad amilólítica)……………..………….….…………….14

ST
SI
2.9 Analisis de resultados……………………………………………………………...14

DE
RESULTADOS………………………………………………………………………..15
N
IO
DISCUSIÓN…………………………………………………………………..….......17
CC
CONCLUSIONES…………………………………………………….………...……..22
RE
DI
RECOMENDACIONES……………………………………………………….……....23
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………….....……...24
ANEXOS………………………………………………………………………...……..30
xii
RESUMEN
El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo de establecer el efecto del almidón
N
IÓ
comercial de Zea mays sobre la cinética de producción de amilasas por B. licheniformis en
AC
un biorreactor agitado hasta las 72 horas de incubación, utilizando como control el almidón
IC
UN
químicamente puro (q.p.). El cultivo bacteriano fue reactivado mediante siembra en placas
M
con agar almidón 0.5% e incubadas a 37°C por 24h; al mismo tiempo se verificó la
CO
capacidad hidrolítica mediante la prueba de lugol, y pureza con coloración Gram. A partir
Y
A
del cultivo reactivado se preparó una suspensión bacteriana (inóculo) equivalente al tubo
IC
ÁT
N° 3 del nefelómetro de Mc Farland (9.0 x 108 UFC/mL) con SSFE. Luego, se agregó
RM
20mL del inóculo estandarizado a cada biorreactor (Problema y Control) conteniendo

FO
180mL de caldo almidón 0.5% - buffer fosfato 0.2 M, pH 6.0, suplementado con sales:
IN
(NH4)2SO4, CaCl2 y CuSO4. Seguidamente, se puso en funcionamiento e incubó a 40°C. Se

DE
determinó la producción de amilasas a las 0, 12, 24, 36, 48, 60 y 72h, extrayendo 10 mL de
AS
EM
muestra del biorreactor, que fue centrifugado a 2500 rpm por 10 min. En cada
ST
sobrenadante (extracto enzimático) se determinó la cantidad de amilasas producidas en

SI
relación al tiempo de incubación, midiendo la actividad amilásica (unidades

DE
enzimáticas/mL) sobre almidón q.p. a 50 °C, pH 6.0, por 1h a través de la dosificación del
N
IO
almidón residual en el espectrofotómetro a 580nm, relacionando con la curva patrón de

CC
almidón. El almidón comercial de Zea mays permitió obtener una producción de amilasas
RE
por Bacillus licheniformis FGM-A15 en forma creciente desde las 0h hasta las 72h con una
DI
tendencia logarítmica y una producción máxima de 0.0426 UA/mL a las 72h, pero que
estadísticamente dichas producciones son similares en comparación con el sistema control.
xiii
INTRODUCCIÓN
El almidón es sintetizado y almacenado como fuente de energía en plantas
N
superiores, constituyendo un polisacárido de reserva que está distribuido tanto en las
IÓ
AC
raíces, tallos y hojas, encontrándose más abundantemente en las semillas de los cereales y
IC
en los tubérculos como las patatas, camote, yuca, etc. en forma de gránulos intracelulares
UN
compactos. Dicha estructura puede ser explicado en términos de la fuerza de atracción
M
CO
entre las largas moléculas de carbohidratos, y dentro de los gránulos se dispone
Y
radialmente en capas concéntricas, una mezcla de moléculas lineales y ramificadas y
A
IC
cuando hay asociaciones paralelas entre estas, se juntan por puente de hidrogeno lo que
ÁT
resultan en regiones cristalinas o micelas, lo cual causa que el granulo sea birrefringente y
RM
FO
evita su disolución en agua fría por la formación de una malla molecular que mantiene
IN
juntos los gránulos. Estas fuerzas asociadas entre las moléculas pueden ser vencidas si se
DE
1
aplica una energía suficiente .
AS
EM
El almidón, después de la celulosa, es el segundo hidrato de carbono más abundante

ST
en la biosfera. Aunque el contenido de almidón en los vegetales varía según la fuente de

SI
obtención, la más importante son los cereales (maíz, arroz, trigo) con un contenido
DE
aproximado de 30-80%, en leguminosas (frijol, arveja, haba) un 25-50% y en tubérculos

N
IO
(papa, yuca) representa un 60-90% de la materia seca. De la producción mundial de

CC
almidón aproximadamente el 83% es obtenido del maíz; después, la fuente más importante
RE
es el trigo con un 7%, y papa con un 6%2. La producción industrial ha desarrollado

DI
técnicas de aprovechamiento de recursos o residuos de producción de diversas industrias
con el objeto de adquirir enzimas utilizando sustratos de bajo costo, así como los desechos
agrícolas3.
El uso de las enzimas convierten a los procesos en eficientes y menos costosos; en
muchos casos, tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad (suaves condiciones de
trabajo); mientras que en otros, se logra más material procesado con el mismo equipo y
menos consumo de energía. En la industria alimentaria, las enzimas hidrolíticas nos ofrece
N
IÓ
la ventaja de reducir viscosidad (hidrólisis), mejorar las extracciones (degradación de
AC
IC
pectina), hacer bioconversiones (glucosa a fructosa), causar separaciones (separación del
UN
suero en queso), sustituir ingredientes y coadyuvantes en procesos, ahorrar con procesos
M
CO
más eficientes obteniendo menos subproductos indeseados y mayor capacidad de planta
Y
con un incremento de rendimiento de producto, ganancia y mejorar propiedades deseables
A
obteniendo un producto único, jarabe de alta concentración de fructosa4.
IC
ÁT
RM
Una de las propiedades características de las enzimas es su capacidad de catalizar

FO
ciertas reacciones químicas bien definidas y su presencia se detecta, en general, por la

IN
reacción que cataliza; y la cantidad de la misma se estima a partir de la velocidad de la

DE
reacción; en este sentido, las amilasas son enzimas que degradan el almidón dando como
AS
productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa4,

EM
que tienen numerosas aplicaciones biotecnológicas, un ejemplo de ello es la producción de

ST
SI
jarabes, que contienen oligosacáridos como maltosa y glucosa. Las otras propiedades y los
DE
mecanismos de acción de las amilasas dependen del origen de las mismas, generalmente
N
las α- amilasas son estables entre pH 5.5 y 8.0 en presencia de un componente de calcio
IO
CC
con un óptimo entre 4.8 y 6.51.

RE
Las amilasas están incluidas en una familia de enzimas hidrolíticas compuesta por:
DI
α-amilasa, β-amilasa, glucoamilasa e isoamilasa, que se encuentran ampliamente
distribuidas en tejidos vegetales, donde juegan un rol muy importante en la degradación
del almidón en la germinación de las semillas; en tejidos animales, cumpliendo una misión
digestiva; y en diversas especies de microorganismos como hongos y bacterias5. Las α-
amilasas provenientes de hongos y bacterias son las más utilizadas en el sector industrial
por sus múltiples ventajas: fácil disponibilidad, volumen de producción, estabilidad de
operación, modificación y optimización del proceso6. La termoestabilidad de esta enzima,
N
IÓ
industrialmente, ha hecho que las amilasas tengan gran aplicabilidad en diversos procesos4.
AC
IC
El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el almidón es
UN
glucosa, lo que la diferencia claramente de la α y β amilasas. La enzima también produce
M
CO
pequeñas cantidades de oligosacáridos. La sacarificación del almidón puede alcanzar hasta
Y
96% de dextrosa. La acción de la enzima causa inversión de la configuración, produciendo
A
IC
β-glucosa. Las glucoamilasas son inactivas sobre almidón nativo y su actividad es máxima
ÁT
RM
entre pH 4.0 y 5.5, y temperatura alrededor de 55-65 °C. La tasa de reacción cae
FO
rápidamente a medida que disminuye el tamaño de la molécula de sustrato, siendo máxima

IN
sobre almidones previamente sometidos a licuefacción7.

DE
La α -amilasa o α -1,4-glucohidrolasa catalizan la etapa de hidrólisis de los enlaces

AS
α-1-4 del almidón y los oligosacáridos, liberando moléculas de glucosa a partir del extremo
EM
ST
no reductor de la cadena. Los enlaces ramificados α-1-4 también se hidrolizan, pero mucho
SI
más lentamente, formándose un jarabe de glucosa cuyo contenido de glucosa es 95 a 97 %

DE
en peso y de un 30 a 5 % de oligosacáridos grandes. La glucosa formada se utiliza como

N
IO
jarabe o se cristaliza para obtener glucosa pura sólida. Se usa a gran escala en la industria
CC
de procesado del almidón en tanques discontinuos a 55-60 °C y pH de 4.5 y con períodos

RE
de incubación de 48-92 horas. El calcio la estabiliza frente a la desnaturalización por el

DI
calor o los álcalis, y la hidrólisis puede llevarse a cabo fácilmente añadiendo el enzima
soluble al almidón una vez que la α-amilasa ha realizado del 15 al 30 % de la hidrólisis
posible. La α-amilasa bacteriana hidroliza el enlace glucosídico interno dando lugar a
productos de bajo peso molecular, solubles y menos viscosos, cuya ruptura está limitada
por la presencia de los enlaces glucosídicos a-1-6 en los puntos de ramificación de la
molécula del almidón nativo (amilopectina). Los productos de hidrólisis tienen
configuración a en la glucosa del extremo reductor. Se piensa que la enzima actúa por la
N
IÓ
acción combinada de los grupos carboxilo e histidina del centro activo. Las α-amilasas
AC
IC
obtenidas de Bacillus subtilis var amyloquefaciens tienen un ion calcio fuertemente ligado
UN
por molécula, que es necesario para la actividad del enzima y que lo estabiliza en gran
M
CO
medida frente al calentamiento. Se utiliza como enzima soluble en tratamientos de dos
Y
horas a 85 °C y pH 5,5-7 como una alternativa a la utilización de ácido clorhídrico que
A
IC
produce excesivos compuestos coloreados y la formación de productos de reversión.
ÁT
Debido a que los almidones de patata y de cereales cerosos no pueden tratarse por
RM
gelatinización, se les somete a un proceso en dos etapas, en el que se añade una segunda
FO
dosis de enzima y se continúa el tratamiento hasta lograr el contenido deseado de glucosa8.

IN
DE
El principal género bacteriano productor de amilasas es Bacillus y dentro de las

AS
especies registradas tenemos a Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, B.

EM
subtilis y Bacillus amyloliquefacien, quienes son aplicados en procesos industriales para

ST
alimentos, textiles, fermentación, papelería entre otros9 por sus amplios rangos de
SI
DE
operación de temperatura (25-90°C), resistencia a pH extremos (1.0-11.5) y altos niveles

N
de expresión6. Por su parte, la amilasa de Bacilllus licheniformis tiene un pH óptimo de 5.0

IO
CC
a 8.0, temperatura optima de 76°C y un peso molecular de 2.25 x 104 Kd1, producen
RE
complejos amilolíticos para hidrólizar almidón con el fin de mejorar el desarrollo de este
DI
proceso industriales10. La inducción de amilasa tipo α requiere un sustrato que contenga
enlaces α-1,4 glucosídicos, además de maltosa, dextrina y almidón, y la glucosa, producto
final de la hidrólisis tiene la posibilidad de reprimir la síntesis de enzima como un
mecanismo conocido como represión catabólica11 e inactivada a un pH en el rango de 4.8 -
5.0 y estable entre 6.0 y 7.0 12.
La enzima β-amilasa actúa en la reacción de hidrólisis de los enlaces β-1,4-
N
glucosidicos del almidón con inversión en la configuración del carbono 1 pasándolo de la
IÓ
AC
configuración α- a la β; así como de remover las unidades de maltosa continuas presentes
IC
en los terminales no-reductores de la cadena polisacárido. Los grupos sulfihidrilos son
UN
esenciales para la actividad, por lo que la enzima se inactiva por oxidación, por los metales
M
CO
pesados y sus sales. Su producto es beta-maltosa. Ha sido descrita como una proteína
Y
abundante la cual se puede encontrar en grandes cantidades tanto en tejidos de
A
IC
almacenamiento de almidón y órganos de plantas. Muchos cereales contienen también la
ÁT
enzima β-amilasa y α-amilasa aunque esta última en concentraciones menores, tan solo
RM
FO
ocupa aproximadamente 30% de contenido total de proteínas sintetizadas durante la

IN
germinación. Estas dos amilasas pueden ser distinguidas una de otra, mediante el punto de
DE
inactivación que presentan a un pH determinado. Es estable en un rango de pH entre 4.8 -

AS
5.0 e inactivada alrededor de 6.0-7.013.

EM
ST
Mediante un estudio de bioprospección microbiana en Colombia, se ha tratado de

SI
identificar las potencialidades de la flora microbiana presente en los diversos nichos

DE
ecológicos del mundo, que posibiliten la formación de industrias productoras de enzimas y

N
IO
las industrias derivadas de su aplicación; para lo cual se estudió el efecto que presentan
CC
diferentes fuentes de carbono en la expresión de dicha enzima, de los cultivos estudiados

RE
se seleccionó a Bacillus sp como la que presentó mayor halo de hidrolisis en la prueba de

DI
lugol estableciéndose que presentaba mayor actividad amilolítica. Las modificaciones de la
fuente de carbono del medio estándar seleccionado utilizando almidón, glucosa y dextrina
en una cantidad de 1 g/L permitieron establecer que el comportamiento de las cepas
seleccionadas cuando se utiliza un medio de cultivo con almidón o dextrina como fuente de
carbono es similar; es decir, al realizar la electroforesis de las respectivas muestras de las
fermentaciones realizadas, se observó que las proteínas presentes en el medio de cultivo
modificado con almidón son exactamente las mismas que se expresan en el medio de
N
IÓ
cultivo modificado con dextrina14.
AC
IC
En un estudio de investigación se dio a conocer la cinética de crecimiento del
UN
Bacillus subtilis ATCC 6633 como microorganismo productor de α-amilasa utilizando
M
CO
como medio de cultivo cáscaras de Solanum tuberosum (papa). El experimento se realizó
Y
por triplicado a las mismas condiciones de temperatura y pH. A cada muestra se le
A
IC
determinó el pH, biomasa por el método turbidimétrico, azucares totales por el método del
ÁT
fenol-sulfúrico y la actividad enzimática de la α-amilasa por el método del lugol. Al
RM
FO
realizar la cinética de crecimiento, se determinó el rendimiento máximo de la α-amilasa el

IN
cual se lleva a cabo en un tiempo de 48 horas después de haber iniciado el proceso de

DE
fermentación, hidrolizando así 1.0531 mg/mL de almidón proveniente de cascaras de

AS
papa15.
EM
ST
El crecimiento bacteriano se considera como el aumento ordenado de todos los

SI
constituyentes químicos que conduce a un aumento en el número de individuos en una

DE
población, dicho crecimiento se puede subdividir en sistemas cerrados, como el cultivo

N
IO
intermitente, y en sistemas abiertos, como el cultivo alimentado por lotes y el cultivo

CC
continuo; entonces, cuando en un medio de cultivo las bacterias viables tienen los
RE
nutrientes necesarios (por ejemplo almidón) y adecuadas condiciones ambientales

DI
(oxígeno, pH, temperatura, etc.) activan su genética, para la síntesis de material enzimático
(amilasas) requerido, y el metabolismo mediante la rutas metabólicas que permiten
posteriormente su crecimiento y desarrollo, pero que la enzimas secretadas permanecen en
los sistemas de incubación16.
Las bacterias utilizadas en los procesos productivos requieren de un alto grado de
N
adaptabilidad para responder a cambios físicos y químicos, que repercute en su conjunto a
IÓ
AC
las diferentes actividades metabólicas; por lo que en la naturaleza son capaces de existir
IC
poblaciones con una variedad de estados fisiológicos, y pueden cambiar rápidamente de un
UN
estado a otro de acuerdo a la presencia o no de nutrientes. Por tanto, el conocimiento de la
M
CO
cinética de crecimiento y de producción de enzimas en un determinado sistema permiten la
Y
predicción del transcurso del proceso, medir las velocidades, rendimientos y
A
IC
productividades, al mismo tiempo que entrega información útil para establecer las
ÁT
estrategias de producción y optimización del proceso en general17.
RM
FO
El comportamiento cinético de una población está determinado por un conjunto de

IN
factores genéticos y ambientales. Entre estos últimos destacan las condiciones de operación
DE
(composición del medio, temperatura, pH y otras) y la modalidad de cultivo entre las que
AS
EM
distinguimos el cultivo por lotes y el cultivo por lotes alimentados o semicontinuo. El

ST
cultivo por lotes se define como aquel que se realiza sin intercambio de materia con los
SI
alrededores, salvo lo referente a los gases (aireación, producción de dióxido de carbono y

DE
otros) que se suministran y retiran del sistema en forma continua. En esta modalidad de
N
IO
cultivo se adicionan inicialmente los nutrientes y luego se inocula con una determinada
CC
cantidad de células viables, que produce una serie de eventos característicos denominada
RE
curva de crecimiento, la cual se representa por una gráfica del peso seco celular o biomasa
DI
o metabolito de interés (enzimas) contra el tiempo de incubación en horas1.
Al comparar la producción de α-amilasa termoestable a partir de almidón, empleando
una cepa autóctona de Thermus sp., en cultivo discontinuo, el mismo que se llevó a cabo
en medio PAP-2 modificado por la adición de almidón de maíz a 3.024g/L, los resultados
obtenidos en el fermentador, reportaron mayor eficiencia debido a concentración de la
fuente de carbono, oxigenación y temperatura; lo que permitió mejor aprovechamiento del
sustrato. La máxima producción de α-amilasa que se obtuvo con células inmovilizadas en
N
IÓ
un fermentador con 1L de caldo de cultivo (cultivo fluidizado), a las 24 horas de
AC
IC
fermentación fue de 360.97UA/min/L y 149.09 de actividad específica, mientras que, fue
UN
de 60.31UA/min/L y 18.40 de actividad específica, obtenida en fermentador con 10L de
M
CO
volumen de trabajo a las 14h18.
Y
El uso de las amilasas en la industria de biocombustibles constituye una alternativa
A
IC
para la obtención de jarabes de glucosa necesarios para la fermentación alcohólica
ÁT
RM
posterior; en forma paralela se sabe que las bacterias excretan amilasas al medio de cultivo
FO
con el afán de hidrolizar los sustratos amiláceos presentes, constituyendo comercialmente

IN
los extractos enzimáticos que pueden ser utilizados en la industria a gran escala. Por otro
DE
lado, la implementación de plantas de producción de alcohol carburante de primera

AS
generación a partir de sacarosa en nuestra región geográfica, nos alienta a proponer la

EM
transformación de los otros productos amiláceos como materia prima alternativa para los
ST
SI
procesos de hidrólisis mediante la acción de amilasas bacterianas capaces de hidrolizarlos

DE
hasta oligosacaridos, maltosa o glucosa. En este sentido, se pretendió evaluar la capacidad

N
hidrolítica de B. licheniformis FGM-A15, aislado de efluentes de curtiembres, en un

IO
CC
biorreactor agitado y proponerlo como alternativa para la degradación de residuos

RE
amiláceos a través de la producción de amilasa en cultivo sumergido. Así mismo permitirá

DI
identificar algunos parámetros cinéticos particulares de crecimiento para ser empleados en
la producción comercial de amilasas, que está directamente relacionado con la economía
del proceso industrial.
OBJETIVO(S)
General:
N
IÓ
AC
1. Establecer el efecto del almidón comercial de Zea mays sobre la cinética de
IC
producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado
UN
hasta las 72h de incubación.
M
CO
Y
A
Específicos:
IC
ÁT
1. Determinar la produccion de amilasas (unidades enzimáticas/mL) por B. licheniformis
RM
FGM- A15 a las 0, 12, 24, 36, 48, 60 y 72h en cada uno de los biorreactores agitados.
FO
IN
2. Describir la cinética de producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15

DE
hasta las 72h de incubación en un biorreactor agitado con el almidón comercial de Zea
AS
mays y el almidón químicamente puro.

EM
3. Comparar la producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 hasta las

ST
72h de incubación en un biorreactor agitado utilizando el almidón comercial de Zea

SI
DE
mays y el almidón químicamente puro en las condiciones de ensayo.

N
IO
CC
RE
DI
MATERIAL Y MÉTODOS
1. MATERIAL BIOLÓGICO
N
IÓ
Cultivo de Bacillus licheniformis FGM-A15, proporcionado por el Laboratorio de
AC
Fisiología y Genética Microbiana, con capacidad amilolítica aislado de residuos de
IC
UN
efluente de curtiembre19 (ANEXO 1).
M
CO
Almidón de féculas de Zea mays comercial “Maizena Duryea” (ANEXO 2).
Y
Almidón químicamente puro “Riedel-de Haën”
A
IC
ÁT
RM
2. PROCEDIMIENTO
FO
2.1. REACTIVACIÓN DEL CULTIVO DE Bacillus licheniformis FGM-A15

IN
El cultivo puro fue reactivado mediante siembra por estría en placas

DE
conteniendo agar almidón 0.5% (ANEXO 3), luego se procedió a incubar a

AS
37ºC por 24h.

EM
ST
2.1.1 DETERMINACIÓN DE LA PUREZA DE LAS COLONIAS

SI
A partir del cultivo reactivado se realizó una coloración Gram, y

DE
posterior observación microscópica. (ANEXO 4)

N
IO
CC
2.1.2 VERIFICACIÓN DE LA CAPACIDAD DEGRADATIVA DE

RE
ALMIDÓN POR Bacillus licheniformis FGM-A15

DI
Luego de haber reactivado el cultivo
Se verificó la capacidad degradativa del almidón por Bacillus
licheniformis FGM-A15, sembrando por puntura en placa conteniendo
10
agar almidón 0.5% y se incubó a 37ºC por 48h. Posteriormente se
agregó la solución de lugol (ANEXO 5), y se observó el halo neto de
hidrolisis del almidón alrededor de las colonias (ANEXO 6).
N
2.2 CONSTRUCCIÓN DE BIORREACTORES
IÓ
AC
Se construyeron 02 biorreactores con frascos de vidrio de 400 mL, se
IC
UN
acondicionó 04 “bafles”, un motor de 6V y un agitador tipo Roushton a cada
M
uno20 (ANEXO 7). Los biorreactores y accesorios fueron esterilizados,
CO
haciendo uso de hipoclorito de sodio (lejía comercial) al 2.5 % por 30
Y
A
minutos, y luego irradiados con luz ultravioleta de una lámpara de 300 Watt,
IC
ÁT
a una distancia de 30 cm por 60 minutos21.
RM
2.3 PREPARACIÓN DEL INÓCULO

FO
A partir del cultivo reactivado se sembró en agar almidón 0.5% y se incubó a

IN
DE
37°C por 12h. A partir de las colonias formadas (ANEXO 8), se preparó una
AS
suspensión bacteriana utilizando solución salina fisiológica estéril equivalente

EM
al tubo Nº3 (9.0x108 UFC/mL) del nefelómetro de Mc Farland22 (ANEXO 9).

ST
SI
DE
2.4 SISTEMAS DE ENSAYO PARA LA EVALUACION DE LA
PRODUCCIÓN DE AMILASAS POR Bacillus licheniformis FGM-A15

N
IO
CC
2.4.1 Sistema de ensayo Problema:

RE
En el biorreactor se colocó 180 mL de una solución de caldo

DI
almidón comercial 0.5% - buffer fosfato 0.2 M a pH 6.0,
suplementado con (NH4)2SO4, CaCl2 y CuSO4 (ANEXO 10), luego
se agregó 20 mL de inóculo estandarizado de 9.0x108UFC/mL
11
(ANEXO 11), seguidamente, se puso en funcionamiento, con una
agitación de 200 rpm aproximadamente, y se incubó a 40°C
(ANEXO 12).
N
2.4.2 Sistema de ensayo Control:
IÓ
AC
En el biorreactor se colocó 180 mL de una solución de caldo
IC
almidón soluble químicamente puro 0.5 % - buffer fosfato 0.2 M a
UN
pH 6.0, suplementado con (NH4)2SO4, CaCl2 y CuSO4 (ANEXO 10),
M
CO
luego se agregó 20 mL de inóculo estandarizado (9.0x108UFC/mL)
Y
(ANEXO 11), seguidamente, se puso en funcionamiento, con una
A
IC
agitación de 200 rpm aproximadamente, y se incubó a 40°C
ÁT
RM
(ANEXO 12).
FO
2.4.3 Monitoreo
IN
DE
A los tiempos 0, 12, 24, 36, 48, 60 y 72h, se extrajo 10 mL de

AS
muestra del biorreactor (ANEXO 13), y se centrifugó a 2500 rpm

EM
por 10 minutos (ANEXO 14). El sobrenadante (extracto enzimático)

ST
se conservó en refrigeración hasta la medición de las amilasas

SI
producidas en relación al tiempo de incubación (ANEXO 15).

DE
N
Este procedimiento se repitió para cada sistema de ensayo.

IO
CC
RE
2.5 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CATALITICA

DI
En un tubo de ensayo, se colocó 1.0 mL de disolución de almidón 0.1% -
buffer fosfato 0.2 M pH 6.0 y 1.0 mL de extracto de enzimas, se
12
homogeneizó manualmente, e incubó a 50 °C por 1h (ANEXO 16).
Posteriormente se calentó a 80°C por 5 min.
Se trabajó con un tubo Control, colocando 1 ml de buffer fosfato y 1.0 mL de
N
extracto de enzima, calentado a 80 °C, y se incubó en las mismas
IÓ
AC
condiciones, para cuantificar la cantidad de almidón residual presente en el
IC
extracto de enzimas.
UN
M
2.6 MEDICIÓN DEL ALMIDÓN RESIDUAL
CO
Y
En otro tubo de ensayo, se colocó 0.5mL del inactivado con 0.1mL de
A
IC
solución yodada (ANEXO 17), y 0.4 mL de agua destilada. Las lecturas de
ÁT
las absorbancias (Problema), se realizaron en el espectrofotómetro
RM
(Spectronic 20) a una longitud de onda de 580nm (ANEXO 18).

FO
IN
Para determinar los miligramos (mg) de almidón residual, se multiplicó la

DE
absorbancia problema corregida por el factor de conversión, y por la dilución

AS
realizada, antes de realizar la lectura de la absorbancia en el

EM
espectrofotómetro.
ST
SI
2.7 ELABORACIÓN DE LA CURVA ESTANDAR DE ALMIDÓN

DE
N
Se trabajó con solución de almidón a una concentración de 0.1mg/mL. Se

IO
CC
colocó 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 y 0.6mL, en tubos de ensayo,
RE
respectivamente; se aforó a 1.0 mL con agua destilada; luego se agregó a cada

DI
tubo, 0.5mL de HCl 0.01M y 0.1mL de solución yodada (I2/KI). Para el
blanco de reactivo, se trabajó con 1.0 mL de agua destilada. Por último se
procedió a realizar las lecturas en el espectrofotómetro (ANEXO 19).
13
Finalmente, se determinó el factor de conversión para determinar almidón por
espectrofotometría.
N
IÓ
2.8 DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE AMILASAS
AC
(UNIDADES DE ACTIVIDAD AMILOLÍTICA)
IC
UN
Una unidad de actividad amilolítica (UA) se definió como la cantidad de
M
CO
amilasas necesarias para hidrolizar 10mg de almidón en 30 minutos, a 50 °C,
Y
a pH de ensayo, expresados como UA/mL (ANEXO 20-24).
A
IC
La cantidad de almidón hidrolizado, se calculó a partir de la diferencia entre
ÁT
el almidón inicial incubado y el almidón residual, después de la actividad
RM
catalítica.
FO
Para calcular las UA/mL, se dividió la cantidad de almidon hidrolizado

IN
DE
calculado entre 10.

AS
2.9 ANALISIS DE RESULTADOS

EM
ST
La producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15, en

SI
cada uno de los sistemas de ensayo (Control y Problema) fueron analizados

DE
mediante la comparación de medias, ANOVA y prueba T para muestras

N
IO
independientes y determinar si existe o no diferencia significativa entre los

CC
resultados obtenidos en cada sistema de ensayo.

RE
DI
14
RESULTADOS
En la Figura 1, se observa la producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15
N
IÓ
con relación al tiempo, a partir de las 0 h hasta las 72 h de incubación en cada uno de los
AC
sistemas de ensayo (Problema y Control), donde se visualiza que a las primeras 12h existe
IC
UN
una mayor producción de amilasas en el sistema con almidón químicamente puro y menor
M
en el sistema con el almidon comercial de Zea mays, pero que a las 72 h se registra una
CO
tendencia a igual dichas producciones.
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
15
0.0500
0.0450
0.0400
N
IÓ
0.0350
AC
UA/mL promedio
0.0300
IC
UN
0.0250
Control
M
Problema
CO
0.0200
Y
0.0150
A
IC
0.0100 ÁT
RM
0.0050
FO
0.0000
0 12 24 36 48 60 72
IN
horas
DE
AS
Figura 1. Concentración de amilasas (UA/mL) producidas por Bacillus licheniformis

EM
FGM-A15 en cada uno de los biorreactores agitados (sistemas de ensayo

ST
Control y Problema) hasta las 72h de incubación.

SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
16
DISCUSIÓN
Bacillus licheniformis FGM-A15 es una bacilo Gram positivo (ANEXO 4) que
N
IÓ
tiene la característica de producir amilasas cuando esta frente a almidón como fuente
AC
carbonada en el medio de cultivo, el mismo que fue corroborado cuando fue evaluado en
IC
UN
placa (ANEXO 6) y el biorreactor agitado en condiciones de laboratorio. Por su parte
M
Sánchez y colaboradores23, pudieron aislar hasta 103 cepas amilolíticas, de las cuales 9
CO
presentaron cualitativamente mayor actividad amilolítica y fueron identificadas
Y
A
bioquímicamente, éstas pertenecieron a los géneros Bacillus sp, Clostridium sp y Kurthia
IC
ÁT
sp, a partir de almidón de maíz.
RM
La producción de amilasas por bacterias sigue siendo una actividad importante a

FO
nivel de laboratorio, toda vez que su aplicación es de interés comercial a gran escala, ya
IN
DE
que los datos que se obtengan serán imprescindibles para estandarizar dichos procesos para
AS
la obtención de jarabes glucosados. En este sentido, la evaluación de dicha producción

EM
constituyó un factor crítico para verificar que B. licheniformis FGM-A15 produce amilasas
ST
y en un nivel competitivo. Al respeto, se pudo observar que hubo una producción

SI
logarítmica de amilasas hasta las 12h de incubación, alcanzando 0.035 UA/mL en el

DE
biorreactor agitado a pH 6.0, 40 °C y utilizando una concentración de almidón de Zea mays

N
IO
al 0.5 %. Por su parte, Ochoa24 logró la producción de alfa-amilasa con el género Bacillus
CC
RE
realizado generalmente dentro del rango de pH de 6.0 a 7.0, con una temperatura de 45°C,
DI
y una agitación de 125 rpm.
17
En las condiciones de ensayo se pudo comprobar que la producción de amilasas
utilizando el almidón comercial de Zea mays resultó ser menos eficiente (0.0070 UA/mL)
en comparación con lo obtenido con el almidón químicamente puro (0.035 UA/mL), hasta
las 12h lo que nos indicaría que el procesamiento realizado previamente para comercializar
N
IÓ
el producto (almidón comercial) afectaría la solubilidad del almidón y por consiguiente la
AC
IC
disponibilidad del almidón no sería un factor que estimule la secreción de la amilasa por
UN
parte de Bacillus licheniformis FGM-A15, lo que sí se puede observar en el sistema con el
M
CO
almidón químicamente puro.
Y
A
IC
Al transcurrir el tiempo de incubación (Fig. 1), se observó que en el sistema con
ÁT
RM
almidon comercial de Zea mays la producción de amilasas se incrementó desde el tiempo

FO
0h con una tendencia lineal hasta las 72h en el biorreactor agitado, lo que indicaría que B.
IN
licheniformis FGM-A15 produce la enzima para degradar el almidón soluble en las

DE
condiciones de ensayo (Temperatura y pH). La máxima producción de amilasas por la

AS
bacteria se mantiene estable durante todo el tiempo de incubación después de haber

EM
iniciado el proceso y se mantiene aproximadamente constante hasta las 72 horas. Sería

ST
SI
conveniente monitorear mayores tiempos de incubación para determinar el cese de dicho

DE
proceso, que indicaría el consumo del almidón y la reducción del crecimiento bacteriano
N
por consumo de sustrato15.

IO
CC
RE
B. licheniformis se caracteriza por tener una temperatura mínima de crecimiento de

DI
15 °C y la máxima de 50-55 °C, aunque se ha reportado una cepa aislada de un ambiente
geotérmico a una temperatura de 68 °C25. En este caso, la temperatura de incubación fue de
40°C, donde se puede observar que la bacteria ha excretado sus amilasas, indicando que
18
estuvo activa, toda vez que las amilasas servirían para hidrolizar las moléculas de almidón
(comercial o químicamente puro) que están en el medio de cultivo en azucares menos
complejos, para luego asimilar las moléculas más sencillas, como oligosacáridos, maltosa
y/o glucosa, a medida pasa el tiempo, que finalmente se traduciría en crecimiento, al hacer
N
IÓ
uso de su vías metabólicas para sintetizar sus metabolitos primarios y obtener la energía
AC
suficiente y necesaria26.
IC
UN
M
CO
El mecanismo anterior de producción de amilasas fue corroborado por Pedroza y
colaboradores27, cuando al ensayar la concentración de almidón, para la producción de a-
Y
A
IC
amilasa con células libres de Thermus sp., empleó 3.204 g/L de almidón de maíz, y obtuvo
ÁT
46.48 UA/min a las 22h de fermentación; mientras que al emplear 6.408 g/L, obtuvo 24.90
RM
U A/min a las 2h; mientras que, al utilizar 7.369 g/L se logró 43.16 UA/min, a las 22h,
FO
demostrando que la menor concentración de almidón de maíz genera 4.98 veces mayor la
IN
DE
actividad al comparar estos resultados con los obtenidos por Pedroza28, donde se
AS
produjeron 9.33 UA/min a las 27h en fermentador de 1 L a 150 r.p.m., y 1 v.v.m.,

EM
utilizando como fuente de carbono 1% p/v de almidón hidrosoluble. El aumento en la

ST
producción de enzima se debe probablemente a la mayor afinidad de la bacteria, por el

SI
almidón de maíz empleado como fuente de carbono; lo que sugiere que el almidón
DE
hidrosoluble 100% puro podría generar inhibición por sustrato; por otra parte el almidón de
N
IO
maíz en forma de “maicena” que fue empleado contiene CaCl2 y se conoce que algunas
CC
RE
enzimas como la alfa-amilasa de este género requiere como cofactor el CaCl2.

DI
El estudio de la cinética de producción de amilasas por B. licheniformis FGM-A15
a condiciones de concentración de almidón, temperatura y pH previamente establecidos
permitió observar que la producción de amilasas con el almidón comercial tuvo un
19
incremento constante desde las primeras de incubación hasta las 72 h de monitoreo, y con
tendencia a ir incrementando. Similares condiciones fue determinado para Bacillus
megaterium donde la temperatura óptima para la producción de la enzima por la esta
bacteria fue de 40 °C y que tuvo un mayor crecimiento a los 42 °C empleando un
N
IÓ
biorreactor agitado con control de temperatura y pH29. Otros resultados indican que la alfa
AC
IC
amilasa de BBM1 presentó una actividad significativa entre 30°C y 80°C, con un máximo
UN
a 60°C, que también corresponde al máximo de estabilidad; en tanto que la misma enzima
M
CO
trabajó con una eficiencia superior al 80% entre 45°C y 72 °C, pero que su actividad
decreció rápidamente por encima de 80ºC30.
Y
A
IC
ÁT
La mayoría de las amilasas que se conocen presentan mayor actividad a valores de
RM
pH neutro o ligeramente ácidos, también se sabe que la actividad disminuye rápidamente a

FO
pH alcalino31, 32, 33,34.En relación al pH del sistema de estudio con B. licheniformis FGM-
IN
DE
A15, este fue de 6.0 y que la producción de amilasas en el biorreactor agitado a 40 °C, tuvo
AS
un incremento hasta un máximo de 0.047 UA/mL a las 72h de evaluación en el biorreactor

EM
utilizando el almidón químicamente puro, en tanto que utilizando el almidón comercial se

ST
logró producir un tanto mayor cantidad de amilasas equivalente a 0.043 UA/mL. El pH

SI
trabajado también ha sido el adecuado para otras bacterias, así tenemos que el pH óptimo
DE
para las alfa amilasas de B. subtilis es variable, pero se encuentra generalmente en el rango
N
IO
6.0-7.035. La mayor actividad amilásica para B. amyloliquefaciens se registró a pH 6.0,

CC
aunque existen pocos reportes de alfa amilasas con un pH óptimo por debajo de 5.030.
RE
DI
Al evaluar estadísticamente la producción de amilasas por B. licheniformis FGM-
A15 en los dos sistemas de ensayo (Control y Problema) se observó que la producción
media en el sistema Control fue de 0,375 UA/mL; mientras que, en el sistema Problema
20
fue de 0,213 UA/mL (ANEXO 25) lo que significaría que con el almidón q.p. se produciría
mayor cantidad de enzima. Pero el ANOVA de la producción promedio, en relación al
tiempo desde las 0h hasta las 72h de incubación en las condiciones de ensayo, expresa que
no existe diferencia significativa en la producción en ambos sistemas, y que se corrobora al
N
IÓ
36
analizar estos valores mediante la prueba T . Entonces la cinética de producción de
AC
IC
amilasas varía en las primeras horas de incubación siendo exponencial en ambos sistemas
UN
pero mayor en el Control, pero que a medida que la bacteria se va a adaptando en el
M
CO
sistema Problema, y las condiciones ambientales van siendo las más adecuadas, se logra
Y
producir amilasas en la misma intensidad en dichos sistemas a las 72h. Por su parte,
A
IC
Portillo y Ramírez trabajando con Bacillus subtilis ATCC 6633 y utilizando como medio
ÁT
de cultivo cáscara de papa, logró determinar que la producción de amilasas se evidencia
RM
después de las primeras 48 h en donde se mantiene casi constante a las 72 h después de

FO
haber iniciado el proceso de producción de la amilasa15.

IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
21
CONCLUSIONES
1. El almidón comercial de Zea mays permitió obtener una producción de amilasas por
N
IÓ
Bacillus licheniformis FGM-A15 en forma creciente desde las 0h hasta las 72h.
AC
IC
UN
2. La producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 desde las 0h hasta
M
las 72h de incubación en un biorreactor agitado con el almidón comercial de Zea
CO
mays tuvo una tendencia de producción logarítmica hasta un valor de 0.0426 UA/mL
Y
A
a las 72h.
IC
ÁT
RM
FO
3. La producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 fue similar

IN
estadísticamente, utilizando el almidón comercial de Zea mays y el almidón

DE
químicamente puro a las 72h.

AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
22
RECOMENDACIONES
 Hacer una prueba preliminar de los biorreactores a utilizar para verificar su
N
IÓ
correcto funcionamiento.
AC
IC
 En cada toma de muestra monitorear y controlar el pH del Caldo Almidón.
UN
M
 Al momento de preparar la solución de Caldo Almidón, los reactivos deben
CO
ser esterilizados por separado, ya que algunas sales reaccionan al ser
Y
mezclados ocasionando un precipitado.
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
23
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IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
29
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
ANEXOS
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
30
ANEXO 1. Cultivos puros de Bacillus licheniformis FGM-A15.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
31
ANEXO 2. Almidón de féculas de Zea mayz comercial “Maizena Duryea” utilizado en el
ensayo.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
ANEXO 3. Composición química del Agar Almidón

EM
ST
SI
Composición g/L
DE
Almidón 2.0
N
IO
Peptona 5.0
CC
NaCl 3.0
RE
Agar 15.0
DI
pH: 7.0±0.2
32
ANEXO 4. Observación microscópica de Bacillus licheniformis FGM-A15con objetivo de
100X y coloreado mediante la tinción Gram.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ANEXO 5. Composición química de la solución de lugol

ST
SI
DE
Componentes Peso / Volumen

N
Yodo 1.0 g
IO
CC
Yoduro de potasio 2.0 g

RE
Agua destilada 300 mL

DI
33
ANEXO 6. Placa Petri con el cultivo de Bacillus licheniformis FGM-A15 donde se
observa el halo de hidrólisis del almidón revelado mediante la adición de la
solución yodada.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
ANEXO 7. Biorreactores de vidrio, con sistema de agitación utilizados en el ensayo

EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
34
ANEXO 8. Cultivo de Bacillus licheniformis FGM-A15 en placa Petri después de 18h de
incubación a 37°C.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
ANEXO 9. Gradilla con los tubos de ensayo conteniendo cada una de las suspensiones
bacterianas equivalente al tubo Nº3 (9.0x108 UFC/mL) del nefelómetro de

AS
EM
Mc Farland
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
35
ANEXO 10. Composición química del Caldo Almidón
Composición g/L
Almidón 2.00
N
IÓ
(NH4)2SO4 0.50
AC
CaCl2 0.50
IC
UN
KH2PO4 1.49
M
Na2HPO4.12H2O 3.22
CO
CuSO4 0.5
Y
A
NaCl 3.0
IC
ÁT
RM
FO
IN
ANEXO 11. Inoculación de los 20 mL de inóculo bacteriano al biorreactor conteniendo

DE
Caldo Almidón 0.5% - buffer fosfato 0.2 M, pH 6.

AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
36
ANEXO 12: Biorreactores (Sistemas Control y Problema) dentro de la estufa casera.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
37
ANEXO 13: Toma de muestra del biorreactor con la propipeta y gradilla con tubos de
ensayo con las muestras recolectadas de cada uno de los sistemas de ensayo
(Control y Problema).
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
38
ANEXO 14: Tubos de ensayo conteniendo los extractos enzimáticos obtenidos mediante
centrifugación, y la centrífuga utilizada.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
39
ANEXO 15: Frascos de penicilina conteniendo los extracto enzimático obtenido de cada
uno de los sistemas de ensayo en relación al tiempo de incubación.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
40
ANEXO 16: Baño maría utilizado para la incubación de los tubos de ensayo para medir
la actividad enzimáticas del extracto enzimático obtenido en cada uno de los
sistemas de ensayo (Control y Problema).
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
41
ANEXO 17: Gradilla con tubos de ensayo conteniendo las soluciones coloreadas y las
diluciones realizadas para la determinación de almidón residual a partir de
los sistemas de ensayo (Control y Problema).
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
42
ANEXO 18: Espectrofotómetro (Spectronic 20) utilizado para obtener las lectura de
absorbancias de las soluciones para determinar la cantidad de almidón
residual.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
43
ANEXO 19: Tubos de ensayo conteniendo las diferentes concentraciones de almidón
para determinar la curva de calibración de almidón.
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
Tubo B S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7
EM
Absorbancia(A) 0.05 0.14 0.24 0.31 0.45 0.64 0.75 0.9

ST
Leyenda: B = Blanco S = Estándar

SI
DE
Fórmula para calcular el factor de conversión de almidón

N
IO
CC
F=
RE
DI
F = 0.067 mg/mL
: Concentración del estándar F = Factor
44
ANEXO 20: Absorbancias de las muestras obtenidas en los sistemas Control y Problema
para la determinación de almidón residual en cada una de las tres
repeticiones realizadas.
N
IÓ
AC
SISTEMAS DE ENSAYO CONTROL
IC
UN
TIEMPO (h) C-1 C-2 C-3 PROMEDIO
M
0 0.85 0.75 0.80 0.80
CO
12 0.30 0.27 0.28 0.28
Y
24 0.21 0.20 0.22 0.21
A
IC
36 0.17 0.18 ÁT 0.19 0.18
48 0.16 0.15 0.17 0.16

RM
60 0.15 0.13 0.15 0.14

FO
72 0.14 0.12 0.13 0.13

IN
DE
AS
EM
SISTEMAS DE ENSAYO PROBLEMA

ST
TIEMPO (h) P-1 P-2 P-3 PROMEDIO

SI
0 0.80 0.75 0.85 0.80

DE
12 0.75 0.70 0.66 0.70

N
IO
24 0.58 0.62 0.60 0.60

CC
36 0.48 0.49 0.52 0.50

RE
48 0.42 0.40 0.39 0.40

DI
60 0.31 0.32 0.28 0.30
72 0.18 0.22 0.20 0.20
45
ANEXO 21: Absorbancias promedio de las muestras obtenida en cada uno de los
sistemas de ensayo Control y Problema para la determinación del almidón
residual.
N
IÓ
TIEMPO PROMEDIO
AC
(h)
CONTROL PROBLEMA
IC
0 0.80 0.80
UN
12 0.28 0.70
M
24 0.21 0.60
CO
36 0.18 0.50
Y
48 0.16 0.40
A
IC
60 0.14 ÁT 0.30
72 0.13 0.20
RM
FO
IN
ANEXO 22: Cantidad de almidón residual promedio hidrolizado (mg/mL) por Bacillus
DE
licheniformis FGM-A15 en cada uno de los sistemas (Control y Problema)

AS
desde las 0h hasta las 72 h de incubación según las condiciones de ensayo.

EM
ST
SI
TIEMPO PROMEDIO
DE
(h) CONTROL PROBLEMA

N
0 0.5682 0.5682
IO
12 0.1993 0.4971
CC
24 0.1495 0.4261
RE
36 0.1283 0.3551
DI
48 0.1134 0.2841
60 0.0996 0.2131
72 0.0922 0.1420
46
ANEXO 23: Cantidad de almidón promedio hidrolizado Bacillus licheniformis FGM-

A15 en cada uno de los sistemas (Control y Problema) desde las 0h hasta las
72 h de incubación según las condiciones de ensayo, teniendo en cuenta que
N
el almidon inicial fue de 0.5682 mg/mL.
IÓ
AC
IC
PROMEDIO
TIEMPO
UN
(h)
CONTROL PROBLEMA
M
0 0.0000 0.0000
CO
12 0.3689 0.0711
Y
A
24 0.4187 0.1421
36
IC
0.4399 0.2131
ÁT
48 0.4547 0.2841
RM
60 0.4685 0.3551
FO
72 0.4759 0.4262
IN
DE
AS
ANEXO 24: Unidad enzimática amilolítica (UA/mL) promedio producidas por Bacillus
EM
licheniformis FGM-A15 en cada uno de los sistemas (Control y Problema)

desde las 0h hasta las 72 h de incubación según las condiciones de ensayo.
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
47
TIEMPO PROMEDIO
(h) CONTROL PROBLEMA
0 0.0000 0.0000
12 0.0369 0.0071
N
24 0.0419 0.0142
IÓ
AC
36 0.0440 0.0213
IC
48 0.0455 0.0284
UN
60 0.0469 0.0355
M
72 0.0476 0.0426
CO
Y
A
IC
ANEXO 25: Análisis estadístico de la producción de amilasas (UA/mL) promedio por
ÁT
Bacillus licheniformis FGM-A15 en cada uno de los sistemas (Control y
RM
Problema) desde las 0h hasta las 72 h de incubación según las condiciones

FO
de ensayo.
IN
Estadísticos de grupo
DE
Sistemas N Media Desviación Porcentaje

AS
típ. Error típ. de la media

EM
Control 7 0,375 0,169 64,04197

Producción
ST
Producción 7 0,213 0,153 57,97126

Fuente: Anexo 24
SI
DE
N
ANOVA de un factor: Producción de enzimas

IO
CC
Suma de gl Media F Sig.

RE
cuadrados cuadrática
Inter-grupos 92340,643 1 92340,643 3,536 ,085
DI
Intra-grupos 313405,714 12 26117,143

Total 405746,357 13
Fuente: Anexo 24
48
Prueba T (Prueba de muestras independientes)
Prueba T para la igualdad de medias

Diferen- Porcenta- 95% Intervalo de
Producción Sig. cia de je. Error confianza para la
t gl
(bilateral) medias típ. de la diferencia
N
diferencia Inferior Superior
IÓ
Se han asumido
AC
1,88 12,00 0,085 0,162 86,38310 -25,784 350,641
varianzas iguales
IC
No se han
UN
asumido 1,88 11,88 0,085 0,162 86,38310 -25,989 350,847
M
varianzas iguales
CO
Fuente: Anexo 24
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
49

Zeña Silva, Laura Janett

Caricato da

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Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

mays sobre la cinética de producción de

amilasas por Bacillus licheniformis

PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL

Autor: Br. Laura Janett Zeña Silva

Asesor: Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

Dr.Weyder Portocarrero Cárdenas

Dr. Esteban Ilich Zerpa

AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS

Dr. William Zelada Estraver

Dra. Bertha Soriano Bernilla

DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

Señores Miembros del Jurado:

Trujillo, Diciembre de 2015

Br. Laura Janett Zeña Silva

MIEMBROS DEL JURADO

concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y

Dr. Luis Llenque Díaz

Ms. C. Miguel Muñoz Rios

Dr. Luis Llenque Díaz

Ms. C. Miguel Muñoz Rios

CERTIFICACION DEL ASESOR

El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada:

Trujillo, Diciembre de 2015

Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

amor, valores, apoyo incondicional en todo momento y por la confianza puesta en mí

para hacer posible la culminación de mi carrera profesional. ¡Gracias por estar

A mis hermanos: Abraham y Karen

A quien admiro porque es un ejemplo de esfuerzo y sacrificio, a no darse por

Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo………………………….……….ii

2.1. Reactivacion del cultivo de Bacillus licheniformis FGM-A15……….……….10

2.1.1 Determinación de la pureza de las colonias…………………………...10

2.1.2 Verificación de la capacidad degradativa de almidón por

Bacillus licheniformis FGM-A15………………………………….10

2.2. Construcción de biorreactores……………………………………………....11

2.5.Determinación de la actividad catalítica……..........…………...…….……...12

2.6. Medición del Almidón Residual.…………...………….…..…………….....13

2.7 Elaboración de la curva estándar de almidón...………………..………......13

2.8 Determinación de la producción de amilasas

(Unidades de actividad amilólítica)……………..………….….…………….14

2.9 Analisis de resultados……………………………………………………………...14

20mL del inóculo estandarizado a cada biorreactor (Problema y Control) conteniendo

(NH4)2SO4, CaCl2 y CuSO4. Seguidamente, se puso en funcionamiento e incubó a 40°C. Se

sobrenadante (extracto enzimático) se determinó la cantidad de amilasas producidas en

relación al tiempo de incubación, midiendo la actividad amilásica (unidades

almidón residual en el espectrofotómetro a 580nm, relacionando con la curva patrón de

estadísticamente dichas producciones son similares en comparación con el sistema control.

El almidón es sintetizado y almacenado como fuente de energía en plantas

El almidón, después de la celulosa, es el segundo hidrato de carbono más abundante

en la biosfera. Aunque el contenido de almidón en los vegetales varía según la fuente de

aproximado de 30-80%, en leguminosas (frijol, arveja, haba) un 25-50% y en tubérculos

(papa, yuca) representa un 60-90% de la materia seca. De la producción mundial de

es el trigo con un 7%, y papa con un 6%2. La producción industrial ha desarrollado

técnicas de aprovechamiento de recursos o residuos de producción de diversas industrias

El uso de las enzimas convierten a los procesos en eficientes y menos costosos; en

muchos casos, tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad (suaves condiciones de

Una de las propiedades características de las enzimas es su capacidad de catalizar

ciertas reacciones químicas bien definidas y su presencia se detecta, en general, por la

reacción que cataliza; y la cantidad de la misma se estima a partir de la velocidad de la

productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa4,

que tienen numerosas aplicaciones biotecnológicas, un ejemplo de ello es la producción de