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RESUMEN
INDICE DE CONTENIDOS
I. INTRODUCCION 5
OBJETIVOS 6
II. RESEÑA HISTORICA 7
III. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA PIV 10
2. CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES
BOVINOS 36
2.1 Congelación 37
2.2 Vitrificación 45
4. PROTOCOLO DE LA PIV 52
4.1 Metodología para la obtención y maduración de
ovocitos 53
4.2 Metodología de fecundación in vitro de
embriones bovinos 59
4.3 Metodología para el cultivo in vitro de
embriones bovinos 67
4.4 Descongelación 72
4.5 Transferencia 74
IV. CONCLUSIONES 76
V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 77
VI. ANEXOS 80
UNIVERSIDAD DE CUENCA
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Escuela de Medicina Veterinaria y Zootecnia
Monografía previa a la
obtención del título de Médico
Veterinario y Zootecnista.
CUENCA – ECUADOR
2011
I. INTRODUCCION.
La biotecnología de la reproducción ha
experimentado un gran avance en las últimas décadas
y ha dotado a la ciencia de nuevas herramientas
capaces de manipular y modificar el genoma de los
seres vivos más evolucionados: los mamíferos, el
desarrollo de nuevas biotecnologías para producir
animales transgénicos o para la multiplicación in vitro
de líneas de animales genéticamente superiores, se
basa en el avance de las técnicas de fertilización in
vitro (FIV) y en el cultivo de embriones.
OBJETIVOS.
1. Objetivo General.
2. Objetivos Específicos.
III.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA
PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES
BOVINOS.
• Ventajas.
- Maduración de ovocitos
- Fecundación de ovocitos maduros
- Cultivo de embriones.(grafico 4)
Fuente de energía.
“Las fuentes de energía más utilizadas en los
medios de cultivo de embriones son, en general, el
lactato, el piruvato y la glucosa.
Se ha demostrado que durante los primeros estadios,
antes de la activación del genoma embrionario, los
embriones utilizan preferentemente piruvato, lactato y
glutamina como fuente de energía, aumentando
considerablemente la utilización de glucosa en estadios
más avanzados de desarrollo.
Fuente de proteína.
2. CRIOPRESERVACION DE EMBRIONES
BOVINOS.
2.1. Congelación.
• polivinilpirrolidona (PVP)
• glucosa
• fructosa
• ficol
• dextrano sorbitol
• sucrosa
• lactosa
• trealosa
• rafinosa
• otros azucares
REACTIVOS UNIDADES
EG 1,68 ml
Sacarosa 0,684 g
BSA 80 mg
PBS 14,32 ml
Cuadro 1. Composición del medio de congelación (1).
EG 1,5 Molar + 0,1 Molar de sacarosa.
(Fuente. Mucci. N.)
REACTIVO UNIDADES
EG 2ml
Sacarosa 0,684g
BSA 80mg
PBS 14,32ml
Cuadro 2. Composición del medio de congelación (2).
Eg 1,78 Molar + 0,1 Molar de sacarosa.
(Fuente Mucci. N.)
2.2. Vitrificación
• Procedimiento:
COMPONENTES UNIDADES
Cloruro de 666ml
sodio
Bicarbonato de 210mg
sodio
Cloruro de 23,5mg
potasio
KH2PO4 4,7mg
Rojo fenol 1mg
Penicilina 6,5mg
Lactato de 186µl
sodio
Cloruro de 10mg
magnesio
Cloruro de 39,7mg
calcio
Agua ultrapura 100ml
Cuadro 8. Medio de fecundación (FIV)
(Fuente. Mucci. N.)
COMPONENTES UNIDADES
FIV stock 10ml
BSA 60mg
Piruvato stock 100µl
Cuadro 9. Formulación final del medio de fecundación.
(Fuente. Mucci. N.)
COMPONENTES UNIDADES
Heparina 1mg
Medio de 1ml
fecundación
Cuadro 10. Dilución de heparina para la fecundación.
(Fuente. Mucci. N.)
3. Independientemente de la forma de la
presentación del semen este deberá ser
acondicionado con el propósito de eliminar
diluyentes, células muertas, etc., mediante al
menos una de dos metodologías.
• Procedimiento detallado.
Fotografía 25.micropipeta.
(Fuente. Mucci. N.)
Mórula compacta.
Blastocisto protruyendo.
4.4. Descongelación.
• Embriones congelados con etilenglicol.
4.5. Transferencia.
TÉCNICA DE TRANSFERENCIA NO
QUIRURGICA TRANSCERVICAL.
1. “Las vacas receptoras deben ser seleccionadas
en el día 7 del ciclo estral (día 0= estro),
detectándolo con o sin sincronización.
2. Los embriones se cosechan al día 7-8 después
de la fertilización, se los identifica en un
microscopio y se transfieren los embriones de
calidad excelente y buena.
3. Una vez realizado el examen rectal de la
receptora y constatada la presencia de un CL
se inyecta una anestesia epidural baja (solución
de xilocaína al 2%).
4. La región perineal y vulva se lavan con jabón
desinfectante, agua y se secan.
5. El embrión es entonces colocado dentro de una
pajuela esterilizada (0.25–0.5 ml) a la que se le
ha cortado un extremo (aproximadamente 1,5
cm.), esto se realiza para que no se doble al ser
introducida en el cérvix con la consiguiente
pérdida del embrión.
IV. CONCLUSIONES.
V. BIBLIOGRAFIA.
1. CELESTINOS M. GATICA R, Vitrificación como
técnica de criopreservaciòn de embriones bovinos.
Arch. Med. Vet, 2002;34(2): pp.157-165.
&ct=result&resnum=5&ved=0CDwQ6AEwBA#v=onepa
ge&q&f=false
VI. ANEXOS.
REACTIVOS UNIDADES
MPM stock 9ml
Suero de vaca en celo SBC 1ml
hormona folículo estimulante
recombinante humana (FSH-rh) 100µl
Cisteamina 100µM
REACTIVOS UNIDADES
TCM-199 1ml
Carbonato de sodio 22mg
Glutamina 1mg
gentamicina stock 55µl
Estradiol 10µg
LH 10µg
rojo fenol 1mg
FSH-rh 100µl
Cisteamina 100µM
EGF 100µl
Agua ultrapura 9ml
REACTIVOS UNIDADES
FSH-rh 75UI
MPM 75ml
REACTIVOS UNIDADES
Sulfato de gentamicina 50mg
Solución fisiológica estéril 1ml
REACTIVOS UNIDADES
Cisteamina 5g
TCM-199 + bicarbonato de
sodio 33,33ml
REACTIVOS UNIDADES
EGF 0,01mg
SOF 2ml
REACTIVOS UNIDADES
Estradiol 1mg
medio de maduración 1ml
REACTIVOS UNIDADES
Cloruro de sodio 580mg
Bicarbonato de sodio 209mg
HEPES 238mg
NaH₂PO₄ 4mg
Rojo fenol 1mg
Lactato de sodio 0,4ml
Cloruro de magnesio 31mg
Cloruro de calcio 38,4mg
agua ultrapura 1ml
REACTIVOS UNIDADES
Cloruro de sodio 315mg
Cloruro de K 26,8mg
KH₂PO₄ 2mg
Bicarbonato de sodio 21mg
Penicilina 3,25mg
HEPES acid free 120mg
HEPES sodium sault 130mg
Piruvato de sodio 2,75mg
BSA FAF 150mg
Cloruro de calcio 12,6mg
Lactato de sodio 23,5µl
Agua ultrapura csp 50ml
REACTIVOS UNIDADES
Piruvato de sodio 11mg
Solución fisiológica estéril 5ml
UNIDADES UNIDADES
REACTIVOS POR 5L POR 1L
Cloruro de sodio 42,5g 8,5g
Estreptomicina sulfato 2,5g 0,5g
500.000 UI; 100.000UI;
Penicilina G 0,292 g 0,0584g