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4.

Assimilazione dell’azoto

* assorbimento dell’azoto
*organicazione dell’azoto assimilato
* fissazione biologica dell’azoto
* azoto e produttività di piante coltivate

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Hopkins, N. Huner G.F. 1
Macronutrienti essenziali per la
crescita delle piante

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Azoto
Costituente di tutti gli aminoacidi, proteine
(enzimi compresi), coenzimi, clorofilla,
nucleotidi, acidi nucleici, ormoni, ecc.
Mediamente rappresenta l’1-4% della
sostanza secca.

Assorbito come NH4+ , NO3- , NO2-

Carenza: clorosi, a cominciare dalle foglie


vecchie, crescita limitata, pigmentazione con
antociani

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Assorbimento di N organico

Le piante “carnivore” Sarracenia

sono in grado di
utilizzare
direttamente proteine
di origine animale
come fonte di azoto.
Digeriscono piccoli
animali ed assorbono
composti azotati e
sali minerali.

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Dionaea muscipula
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Nitrificazione

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Ammonizzazione, nitrificazione,
denitrificazione
Ammonizzazione: conversione di azoto organico in
ammoniaca da parte di microrganismi nel processo di
decomposizione di residui animali e vegetali;
– Necessita di ossigeno perché i microrganismi utilizzano per la
respirazione gli amminoacidi presenti nei residui, producendo
CO2, H2S e NH3;
Nitrificazione: ossidazione dello ione ammonio
dapprima a ione nitrito poi a nitrato da parte di batteri
chemioautotrofi (autotrofi che ricavano energia
dall’ossidazione di sostanze inorganiche semplici);
Denitrificazione: riduzione dello ione nitrato ad azoto,
nel terreno, ad opera di batteri denitrificanti (eterotrofi
anaerobi) che utilizzano il nitrato come accettore finale
di elettroni nella respirazione (al posto dell’ossigeno).
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Eutrofizzazione delle acque
Un eccesso di presenza di fertilizzanti azotati nel
terreno può portare alla eutrofizzazione delle acque:
nitrati e sali di ammonio sono molto solubili e, se non
assorbiti dalle radici, raggiungono le acque sotterranee
e da qui i corsi d’acqua, laghi e mari;
l’eutrofizzazione e una sovrabbondante produzione di
biomassa algale causata da un eccesso di nutrienti,
soprattutto azotati.
La proliferazione di alghe, non compensata dalla
capacità degli erbivori a consumarla, porta ad un
accumulo, successiva morte e decomposizione ad
opera di batteri,
con consumo di grandi quantità di ossigeno portando
ad anossia i corsi d’acqua e quindi morte di altri viventi.
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Assorbimento di azoto dal terreno
L’assorbimento del nitrato da parte della radice
avviene tramite un meccanismo di simporto con
l’ingresso contemporaneo di protoni, generalmente
2H+ / NO3-
L’assorbimento di nitrato è regolato dall’espressione
dei trasportatori e dalla presenza di ammonio.

I nitriti sono assorbiti dagli stessi carrier del nitrato


che quindi competono tra loro.

L’ammonio nel terreno è rapidamente convertito in


nitrato quindi è generalmente meno abbondante
salvo in condizioni anaerobiche (i nitritificanti non
vivono) o terreni molto acidi.
L’assorbimento di ammonio è accompagnato,
invece, dal rilascio di un protone o dall’assorbimento
di un anione; è di solito passivo attraverso canali.
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Organicazione del N
L’assimilazione dell’azoto inorganico in
composti organici è uno dei più importanti
processi della biosfera, al pari della fotosintesi
e della respirazione.

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Prime tappe dell’organicazione dell’azoto

GS-Ligasi con GOGAT-Liasi con


idrolisi di ATP condensazione

L’azoto ammidico della glutamina è trasferito al Aminoacidi


e altri
2-chetoglutarato (che deriva dal ciclo di Krebs) con composti
formazione di azoto amminico sull’acido glutamico. azotati
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Assimilazione dello ione ammonio
In sistemi che non fissano azoto, sia la
glutammina sintetasi (GS) che la glutammato
sintasi (GOGAT) sono presenti nelle cellule
delle radici e delle foglie;
La glutammina sintetasi (GS) si trova nel
citosol delle cellule radicali e nel citosol e
plastidi delle foglie;
La glutammato sintasi (GOGAT) è invece un
enzima plastidiale che si trova nei cloroplasti
delle foglie e negli amiloplasti della radice.

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Riduzione e organicazione di azoto nella
foglia

Le piante sono in grado di sintetizzare tutti i 20


aminoacidi presenti nelle proteine.
L’uomo, e molti animali, non sono in grado di
sintetizzare certi aminoacidi “essenziali” come:
istidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
fenilalanina, treonina, triptofano, valina (e arginina)
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Hopkins, N. Huner che devono
G.F. essere acquisiti con la dieta 14
Biosintesi degli amminoacidi
Gli amminogruppi derivano da transaminazioni
con la glutammina o glutammato;
Lo scheletro carbonioso degli amminoacidi può
derivare da:
– 3-fosfoglicerato o fosfoenolpiruvato o piruvato, che si
formano con la glicolisi;
– α-chetoglutarrato o ossalacetato, che si formano nel
ciclo di Krebs.
Parti di queste vie sono il bersaglio di erbicidi.

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Glicolisi

Ciclo di
Krebs
Fissazione di azoto molecolare
(circa 200-250 milioni t/anno)

Fissazione “elettrica”: circa il 10%, reagisce


con ossigeno con formazione di ossidi di N
sfrutttando l’energia di fulmini, radiazioni UV;
– Altre fonti sono dovute a combustioni industriali e
scarico auto, incendi, centrali elettriche;
Fissazione “industriale” (concimi) (riduzione):
rappresenta circa il 30% (300-400°C, 35-100
MPa);
Fissazione “biologica” (riduzione): circa il 60%
deriva dalla riduzione di N2 ad ammoniaca da
parte di organismi viventi procarioti.
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Esempi di organismi azotofissatori o
diazotrofi che possiedono “nitrogenasi”

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Associazioni batteri diazotrofici-pianta
I batteri che vivono liberi possono entrare
in associazione con le radici, pur non
stabilendo un rapporto simbiontico:
i batteri assorbono nutrienti essudati
dalle radici e liberano nel terreno
modeste quantità di azoto fissato.
I batteri endofitici colonizzano tessuti
interni con un sistema “opportunistico”.
Nella canna da zucchero (e riso), questi
batteri entrano nella radice, si spostano
via xilema rimanendo negli spazi
intercellulari:
arrivano a fornire dal 30 al 80% della
richiesta
Fisiologia vegetale - di
W. azoto del cereale.
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Foglie: Nitrogen Fixation
– Gluconacetobacter
– Herbaspirillum
in Sugarcane
Fusti: Ohyama et al., 2014
– Gluconacetobacter http://dx.doi.org/10.5772/56993
Agricultural and Biological Sciences
– Herbaspirillum
– Azospirillum
Radici:
– Gluconacetobacter
– Herbaspirillum
– Azospirillum
Rizosfera
– Azotobacter
– Beijierinckia
– Herbaspirillum
– Azospirillum
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Associazione simbiotica di un cianobatterio
(Anabaena azollae) con una piccola felce acquatica
(Azolla), a volte usata come significativa sorgente
di azoto in agricoltura, come in campi di riso.

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Licheni: simbiosi tra cianobatteri (o alghe)
con funghi

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Simbiosi tra batteri azoto-fissatori e
piante superiori
Actinomiceti (Frankia) (batteri gram-positivi,
filamentosi), con alcuni alberi, tra cui Alnus,
Myrica, Eleagnus, Hippophae, Casuarina,
appartenenti a 8 famiglie.

Rizobi (genere Rizobium o affini), con circa il


90% delle leguminose.

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Simbiosi rizobi-
leguminose

Tubercoli radicali in piante di


soia.
I noduli sono il risultato
dell’infezione con Rizobium
japonicum.

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Alcuni esempi di specificità nelle simbiosi
dei rizobi con le leguminose

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Processo di inoculo e infezione

1. riconoscimento pianta-batterio
attraverso scambio di segnali
molecolari,
2. diffusione dell’infezione nella radice,
3. formazione del nodulo radicale (sede
dell’associazione),
4. azoto fissazione e inizio della
simbiosi.
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Formazione del tubercolo radicale
I rizobi si moltiplicano, colonizzano la rizosfera e aderiscono al
rizoderma e soprattutto ai peli radicali;
avvenuto il riconoscimento,
i peli radicali si incurvano,
i batteri liberano poligalatturonasi che ammorbidiscono la parete
del pelo radicale e
i batteri entrano nei tessuti della pianta delimitati da una membrana,
proliferazione della membrana plasmatica.

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L’attrazione iniziale coinvolge processi di
chemiotassi positiva
Le radici liberano nel terreno varie molecole organiche
come amminoacidi, zuccheri e acidi organici che servono
come nutrienti per i microrganismi presenti nel terreno;
alcuni flavonoidi e betaine, nonché lectine, sono implicati
nell’attrazione verso le radici dei rizobi:
i flavonoidi interagiscono con il prodotto del gene
batterico nodD con induzione di altri geni di nodulazione
con sintesi, da parte del batterio, di fattori Nod (lipo-chito-
polisaccaridi) che, agendo come ormoni, stimolano la
risposta radicale.

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Formazione del tubercolo radicale
Si forma un filo di infezione che cresce fino a raggiungere gli strati più
profondi della corteccia;
I batteri secernendo molecole morfogenetiche, i fattori nod, inducono
cambiamenti nella crescita e metabolismo della radice;
Inoltre i batteri rilasciano segnali “mitogenetici” che stimolano le
divisioni delle cellule della corteccia;
Inizia lo sviluppo di un nodulo a livello corticale;

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Formazione del tubercolo radicale
Il filo di infezione (canale) si ramifica per penetrare in numerose cellule
In prossimità dell’endodermide, i batteri sono rilasciati nelle cellule
dell’ospite (fino a 20.000 batteri/cellula);
Da cellule meristematiche si ha la formazione del nodulo; si formano
altri canali con formazione di nuovi noduli;
Trasformazione somatica di batteri in “batteroidi” (fino a 30 volte il
volume iniziale) con formazione del vero e proprio nodulo;
I batteroidi iniziano a fissare N grazie al complesso enzimatico della
nitrogenasi.

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Formazione del tubercolo radicale
Il tubercolo radicale
deriva dalla
proliferazione dei batteri
e delle cellule radicali;
I batteri si trasformano in
“batteroidi”, forma in
grado di fissare azoto
molecolare.
In questa fase, l’NO
gioca un importante
ruolo di segnale
molecolare.
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Fissazione di azoto:
N2 + 8H+ + 8e- + 16 ATP= 2NH3 + H2 +16 ADP + 16 Pi
Nitrogenasi: complesso proteico multimerico formato da due proteine di grandezza diversa

Fe-S proteina
è ridotta da un
donatore di tetramero con
dimero con
elettroni 2 unità identiche 2 coppie subunità

Principale
donatore di
elettroni

e- La proteina MoFe
catalizza la riduzione
sia di N2 che di H+

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Interazioni tra respirazione, fotosintesi e
fissazione dell’azoto nei batteroidi
La riduzione del N è costosa in termini di energia;
Almeno 25 ATP per ogni N ridotto, compreso il costo per la
ferredossina ridotta (16 per ogni molecola di N, cioè 2 per ogni –e
trasferito, + 9 per il potenziale riducente sotto forma di ferredossina
ridotta) .

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Fissazione di azoto
Tramite floema, substrati organici sono inviati al
tubercolo radicale per la respirazione;
all’interno del batteroide avviene la fissazione di
azoto con intervento della nitrogenasi e consumo di
ferredossina ridotta (con consumo di NADH);
l’ammoniaca, o meglio lo ione ammonio, una volta
formato nel batteroide, è subito escreto nel citosol
delle cellule infette del nodulo, dove è presente la
glutammina sintetasi (GS) (la glutammato sintasi
GOGAT è plastidiale); qui lo ione ammonio è
organicato con formazione di aminoacidi, ammidi,
ureidi;
questi prodotti sono utilizzati dalla radice o, via
xilema, inviati al resto della pianta;
la nitrogenasi è inibita da: ossigeno, ammoniaca,
aminoacidi.
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Sensibilità della nitrogenasi all’ossigeno
Sia la Fe-S proteina che la Mo-Fe sono inattivate da
ossigeno molecolare; rimedi:
1. Alcuni batteri azoto-fissatori liberi vivono in
anaerobiosi, ma sono poco produttivi per carenza di
ATP (3-7 mg di N fissato con 1 g di carboidrati rispetto
ai 10-12 di batteri aerobi).
2. Alcuni cianobatteri isolano la struttura che fissa
azoto (eterocisti) limitando la presenza di ossigeno in
quanto, anche se fotosintetica, non ha il PSII né la
Rubisco, ma solo il PSI così da formare ATP con la
fosforilazione ciclica;
3. Nei noduli delle leguminose, la presenza di ossigeno
è regolata da una proteina, leghemoglobina, che fissa
ossigeno e lo mantiene su valori tali da permettere la
respirazione, ma non limitare l’attività della nitrogenasi.
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Eterocisti in Cianobatteri che fissano azoto
molecolare

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Produzione di H gassoso: uno spreco di energia
Durante la fissazione di N, si sviluppa H2 gassoso, almeno 1 molecola per
ogni molecola di N ridotto;
Il costo è del 25-30% di tutto l’ATP consumato nel ciclo;
Alcuni azotofissatori non rilasciano H2 in atmosfera, perché contengono
un enzima ossigeno-dipendente, idrogenasi uptake (o idrogenasi
irreversibile, NAD-dipendente) che recupera parte di questa energia:
accoppiano l’ossidazione di H2 a 2H+ con formazione di NADH che,
riossidato nella catena respiratoria, produce + 3 ATP e gli elettroni sono
riportati al pool riducente per la nitrogenasi.
Importante sarebbe che “tutti” i rizobii potessero riciclare l’H molecolare
prodotto per aumentare l’efficienza della fissazione di N in piante
coltivate. Quindi, aumento dell’espressione dei geni hup.

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Genetica della fissazione di N: quali geni
sono coinvolti
In batteri “liberi”:
– geni nif : strutturali che codificano proteine della
nitrogenasi, oltre a geni regolatori
In batteri “simbionti”:
– sintesi di fattori Nod diretta da geni nod per la
nodulazione, la cui espressione è influenzata da
essudati radicali come i flavonoidi;
– geni nif per la sintesi e regolazione della nitrogenasi,
– geni fix che codificano per la ferredossina e
potrebbero essere coinvolti nel trasporto di elettroni
alla nitrogenasi;
– geni nod nel genoma della cellula ospite, per la sintesi
di proteine specifiche del nodulo sintetizzate dalle
cellule dell’ospite: le noduline (precoci: sintesi di
membrane del filo di infezione, formazione primordi
del nodulo, ecc.; tardive: leghemoglobina).
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L’NH3 prodotta è convertita in N organico
A pH fisiologico l’ammoniaca è protonata per
formare NH4+;
questo è generalmente tossico: inibisce la
nitrogenasi, interferisce con il metabolismo
energetico delle cellule, soprattutto nella
produzione di ATP;
per evitare ciò la pianta lo incorpora rapidamente
negli amminoacidi.
Glutammina, ma più spesso asparagina o derivati
dell’urea (ureidi), sono le forme organiche di N
esportate al resto della pianta.

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Di solito, con
basse Quantità relativa di composti azotati
concentrazioni presenti nella linfa xilematica di alcune
di nitrato nel piante coltivate
terreno, questo
è ridotto nelle
radici;
Con alte
concentrazioni
l’assimilazione
nelle radici è
limitata e
buona parte è
inviato alle
foglie dove è
assimilato;
Ma non tutte le
piante hanno la
stessa capacità
di
metabolizzare
il nitrato nelle
radici……..
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L’assorbimento di azoto
nella maggioranza delle piante Mobilità dell’azoto
è più alto nella fase iniziale di
La foglia giovane rappresenta
crescita e diminuisce con la
l’organo che maggiormente importa
crescita riproduttiva e
e accumula N;
invecchiamento
Con l’invecchiamento, la foglia
seguita ad importare N, ma anche ad
esportarne in grandi quantità,
soprattutto verso i semi e frutti
(circolo dell’azoto) che ne richiedono
più di quello assorbibile;
La Rubisco, in questa fase, funziona
anche come proteina di riserva e
quindi come sorgente di N, a scapito
della fotosintesi;
In piante perenni, prima della caduta
delle foglie, N viene mobilitato da
queste verso fusti e radici ed
accumulato come riserva fino alla
ripresa vegetativa l’anno successivo.
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Ruolo dell'azoto nella produzione di agrumi

La risposta ottimale
all'Azoto varia a
seconda dell'età della
pianta:
piante di un anno in
genere richiedono 50-
200g N/pianta; 400-
850g N/pianta si usano
negli anni cinque e sei.
Tuttavia, negli anni di
massima fruttificazione
si possono usare sino
a 1kg N/pianta in caso
di coltura intensiva.

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La crescita delle piante Produttività e
dipende molto dall’azoto
disponibile; disponibilità di azoto
In quelle coltivate si interviene
con concimazioni azotate;
La disponibilità può essere
limitata da:
– T°, O2, H2O, pH;
– Attività microrganismi del ciclo
dell’N;
– Impoverimento dovuto ai
raccolti.
Negli ecosistemi naturali,
circa 2/3 di N deriva dalla
fissazione e il resto da fonti
atmosferiche (pioggia,
depositi secchi); inoltre molto
è “riciclato”, riassorbito da
organi come foglie o frutti
prima della caduta.
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Efficienza d’utilizzo dell’azoto: capacità della pianta di
convertire N in prodotto utile: minore è l’efficienza
maggiore è il rischio che venga perso
Lo ione nitrico è la forma più assorbita
dalle radici, ma non è trattenuta,
è soggetta a lisciviazione in caso di
piogge o irrigazione,
in condizioni asfittiche si può
innescare la denitrificazione con
perdita in forme gassose.

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Negli ecosistemi naturali l’azoto Mineralizzazione
viene lentamente rimineralizzato:
dai residui N filtra lentamente nel dell’azoto
terreno ed è trasformato in
composti semplici da batteri,
funghi e altri organismi
decompositori.
La mineralizzazione è dovuta
essenzialmente a processi di
ammonizzazione:
parte del N è trattenuto dagli
organismi decompositori
(immobilizzazione),
parte è ceduto al terreno e quindi
alle piante (mineralizzazione
netta);
l’ossidazione successiva da
parte di batteri nitrificanti è
regolata da parametri ambientali
come pH, temperatura, umidità
del terreno, ossigeno.
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Medicago sativa

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