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DGE-InDRE–RNLSP
2015
ENFERMEDAD DE CHAGAS–RNLSP
ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE
CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL DE
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE).
DGE-InDRE–RNLSP
2015
DEFINICIONES OPERATIVAS1
Caso sospechoso: Toda persona que refiera antecedentes de residencia o visita a
zona endémica de Tripanosomiasis Americana y que presente alguna o varias de las
siguientes características: que haya recibido sangre de donador seropositivo o
componentes sanguíneos; con antecedente de trasplante de órganos; que sea hijo
de madre seropositiva a T. cruzi o que presente algún síntoma inespecífico de la
enfermedad. El caso sospechoso de Tripanosomiasis es totalmente inespecífico, por
lo que su utilización debe abocarse para estudios de brotes y situaciones especiales.
Caso probable: Persona que resida o provenga de zona endémica y que presente
uno o varios de los siguientes signos o síntomas:
Caso probable agudo: Chagoma de inoculación, fiebre intermitente
prolongada, Signo de Romaña, cardiopatía y/o seropositividad a
inmunoglobulina IgM en una de las siguientes pruebas: HAI, IFI o ELISA.
Caso probable congénito: Hijo de madre seropositiva, prematurez,
fiebre, hepatoesplenomegalia y/o linfadenopatías.
1 Fuente: Lineamientos para la vigilancia epidemiológica de las Enfermedades Transmitidas por Vector. Grupo
Técnico Interinstitucional del Comité Nacional para la Vigilancia Epidemiológica (CONAVE). Marzo 2012.
OBJETIVOS
Objetivo General
Generar información básica para apoyar las actividades del programa de
Enfermedades Transmitidas por Vector (ETV) y promover la creación de sinergias
de actuación para realizar el diagnóstico de la tripanosomiasis americana.
Objetivos Específicos
Generar información oportuna y valida mediante la utilización de algoritmos
de diagnóstico validados.
Generar servicios de diagnóstico confiables mediante la participación en el
programa de evaluación externa del desempeño.
Incrementar el desempeño técnico de los recursos humanos de la RNLSP
mediante la capacitación continua y específica a las necesidades
particulares.
Demostrar nuestra competencia técnica, fomentando la cultura de calidad y
mejora continua de nuestros procesos.
En color rojo se presentan los estados que realizan una prueba, amarillo dos
pruebas y verde al menos tres pruebas. En color negro se indica los estados que no
realizan el diagnóstico o están en proceso de implementación.
http://www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html
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El sistema básico de triple embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está
contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia,
suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermético para
evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o número de
muestra del paciente. El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel
absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan
varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material
absorbente para evitar algún derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera)
tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 °C. Los recipientes
secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico y señal de orientación del recipiente, a su vez el
recipiente secundario deberá ir contenido en un paquete externo de envío (caja de cartón o hielera) que proteja
el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente,
destinatario y señal de orientación. La documentación que se integre al triple embalaje deberá colocarse en la
parte interior del paquete.
Durante la fase
Por venopunción
Sangre 2.0 mL, enviar con aguda de la Microhematocrito
en tubos con
total refrigerantes de 4 a 8 °C enfermedad fluorescente
heparina/EDTA
Durante la fase
Por venopunción
Sangre 3.0-5.0 mL, enviar con aguda de la
en tubos con Hemocultivo
total refrigerantes de 4 a 8 °C. enfermedad
heparina
Durante la fase
Por venopunción
Sangre 2.0 mL, enviar con aguda de la Inoculación en
en tubos con
total refrigerantes de 4 a 8 °C enfermedad ratón
heparina
B. Técnicas inmunoserológicas
Tipo de Medio/contenedor/fo
Método Tiempo Técnica
muestra rma de envío]
ELISA Ag
Durante la totales
Por
fase aguda ELISA Ag
venopunción en 1.0 mL, enviar con
Suero tardía y recombinantes
tubos sin refrigerantes de 4 a 8 °C
crónica de la IFI Parásito
anticoagulantes
enfermedad integro
Western Blot
1. Inmunodiagnóstico
El inmunodiagnóstico se basa en la detección de anticuerpos específicos contra T.
cruzi sin embargo, se debe entender que lo que se busca no es el parásito y por
tanto sus resultados nunca proporcionarán certeza diagnóstica y deben evaluarse
en términos de probabilidad. Para que la probabilidad se acerque a la certeza, es
importante seleccionar adecuadamente el método a emplear, el momento de la
toma de muestra y la interpretación apropiada de los resultados.
El diagnóstico de laboratorio se realiza en una muestra de sangre o suero del
paciente, el tipo de muestra y la técnica a realizar se determina en base a la fase en
la que se encuentra la enfermedad. Se debe obtener una muestra de sangre
completa por venopunción, aproximadamente 5 mL en un tubo con o sin
anticoagulante.
Para inmunodiagnóstico se utiliza suero en fase crónica, para técnicas de cultivo o
inoculación en modelo animal es sangre completa o laminillas con extendido y gota
gruesa para técnicas parasitoscópicas, será enviado al LESP para el ensayo. La
muestra de suero debe mantenerse siempre en refrigeración (2-8 °C) desde la toma
hasta la llegada al LESP. La muestra deberá venir acompañada con el Formato de
envío debidamente completado, sin datos alterados o sobre escritos y en caso de
considerarlo conveniente, por favor indique la gravedad del paciente; las muestras
que no cumplan con los requisitos establecidos, serán rechazadas.
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010. Para la vigilancia
epidemiológica, prevención y control de las enfermedades transmitidas por vector,
el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana se basa
en el cuadro clínico del paciente, asociado a las fases aguda y crónica sintomática
del padecimiento; antecedentes de residencia en áreas endémicas de la
enfermedad, transfusional, madre chagásica y/o trasplante de órganos. “Se
confirma el diagnóstico en fase aguda, al demostrar la presencia del T. cruzi o
serología positiva en la sangre, por estudio directo o por la técnica de concentración
de Strout, cultivo o xenodiagnóstico, serología positiva (HAI, IFI, ELISA y
Decisión en el laboratorio:
Repetir la prueba con la misma muestra.
Referir a referencia, LESP o InDRE.
Solicitar una nueva muestra, en aproximadamente mes y medio.
Los valores de densidad óptica se sitúan muy cerca del punto de corte (±10%), el
resultado no debe considerares positivo o negativo, se debe reportar como
indeterminado.
Decisión en el laboratorio:
Repetir la prueba con la misma muestra.
Referir a referencia, LESP o InDRE.
Solicitar nueva muestra, en aproximadamente tres semanas.
2. Diagnóstico parasitológico
a. Material y equipo
alcohol metílico grado reactivo
colorante de Giemsa
lancetas
microscopio
portaobjetos
solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2
b. Procedimiento
1. Realizar la punción digital.
3. Obtener una segunda gota de sangre y colocarla sobre la mitad de una de las
caras de un portaobjetos desengrasado.
Punto crítico
Realizar el extendido de manera uniforme. Evitar que se moje la gota gruesa con el
alcohol metílico. Usar portaobjetos limpios y desengrasados.
b. Procedimiento
1. Obtener otra gota de sangre de la misma punción de donde se obtuvo la
anterior, para el frote sanguíneo (punto anterior).
2. Obtener la muestra del dedo apretándolo suavemente por sus bordes laterales
hacia su extremo.
3. Sobre la misma cara del portaobjetos donde se hizo el extendido sólo que en la
parte media libre, colocar otra gota de sangre más grande que la anterior.
4. Con el ángulo de un portaobjeto auxiliar y con movimientos circulares se
extiende la gota en un cuadro de más o menos 2 cm por lado.
5. Dejar la preparación sobre una superficie horizontal hasta que se seque,
abanicar con la mano para obtener un secado más rápido (protegerla del
polvo, moscas y otros insectos).
Punto crítico
La gota gruesa no se debe poner en contacto con alcohol metílico por lo que se debe
cuidar de no introducir la porción del portaobjetos con la gota gruesa en el alcohol,
ni dejar que escurra el fijador sobre de ella.
Tinción
Preparar la solución de trabajo del colorante Giemsa con solución amortiguadora
de fosfatos realizando una dilución 1:10 de la solución madre.
1. Cubrir las láminas con la solución de trabajo y dejar teñir durante 30 minutos.
Punto crítico
El tiempo de tinción debe de estandarizarse cada vez que se prepara colorante.
Lectura
1. Enfocar primero la gota gruesa, utilizando los objetivos de menor a mayor
aumento.
2. Cubrir con aceite de inmersión ambas muestra teñidas, hasta conseguir una
imagen nítida con el objetivo de inmersión.
3. Emplear filtro azul.
4. Buscar sistemáticamente la presencia del parásito en todo el portaobjeto hasta
asegurarse de dar un resultado final correcto.
5. Observar todos los campos microscópicos de ambas muestras antes de emitir
un resultado negativo.
a. Equipo
Equipo de Microhematocrito fluorescente (QBC) de Becton Dickinson
Punto crítico
La lectura debe ser inmediatamente después de la centrifugación, de lo contrario se
puede producir lisis del tripomastigote.
b. Procedimiento
1. Utilizar medio de cultivo de Warren en condiciones de esterilidad.
2. Extraer 10-20 mL de sangre por punción venosa en un tubo con heparina.
3. Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos.
4. Separar el plasma en otro tubo y por separado tomar el paquete de
leucocitos.
5. Mezclar el paquete de leucocitos con 10 mL de caldo infusión cerebro
corazón (BHI).
6. Sembrar 2.0 mL de la suspensión celular anterior en medio de cultivo de
Warren en cinco tubos diferentes.
7. Cerrar perfectamente los tubos sembrados e identificar con claridad cada
uno de ellos.
8. Agitar suavemente cada tubo inclinándolo 90º (no provocar burbujas).
9. Incubar los tubos sembrados a 28 °C durante 8 días.
10. Para la revisión de los cultivos, extraer con ayuda de una pipeta Pasteur
estéril una gota del medio de cultivo que se coloca entre portaobjetos y
cubreobjetos para observar al microscopio con objetivo de 40x.
11. Revisar al microscopio cada tubo de cultivo y hacer resiembra por duplicado,
se continúa cultivando y se revisan los tubos cada 15 días por un periodo de
3 meses.
12. Descartar los tubos que continúen negativos después de este tiempo.
Esterilizar y lavar.
Interpretación
Se da como positivo el hemocultivo cuando se detectan las formas móviles
características del flagelado en su fase de epimastigote en las preparaciones de los
medios de cultivo sembrados.
Preparación
1. Esterilizar los medios de cultivo, agar nutritivo y BHI, a 15 libras de presión
durante 15 minutos en autoclave.
2. Mantenga la temperatura del agar nutritivo a 45 °C y agregue sangre de
conejo, 5% v/v.
3. Envasar 3.0 mL de medio en tubos de ensaye para cultivo con tapón de rosca
de 16x150, estériles.
4. Colocar los tubos a una inclinación de 10° hasta que se solidifique el agar.
5. Hacer pruebas de esterilidad a 28 °C por 24 horas.
6. Complementar el caldo de infusión cerebro corazón, al 1%, con suero fetal de
ternera al momento de hacer la siembra del medio de cultivo. Adicionar
gentamicina a una concentración final de 5 µg/mL de BHI.
b. Procedimiento
1. Obtener una muestra de sangre del paciente por punción venosa previa
asepsia del área de la toma de muestra, con alcohol yodado. No retirar el
capuchón de protección de la aguja hasta el momento de realizar la punción.
2. Cerca de un mechero o lámpara de alcohol depositar la sangre en un tubo o
frasco estéril que contenga anticoagulante (heparina, es el producto de
elección).
3. Inocular a los animales inmediatamente después de tomar la muestra, con
0.2 mL a 0.3 mL de sangre por vía intraperitoneal a cada animal. Si la
muestra no se puede procesar de inmediato, conservar la muestra de sangre
en refrigeración hasta su procesamiento. El tiempo de almacenaje puede ser
hasta de 48 horas.
4. Mantener los animales inoculados con agua y alimento a libre demanda en
condiciones de bioterio, es decir temperatura y humedad controladas entre
otras.
5. Ocho días después de la inoculación, practicar un corte en la porción distal
de la cola del ratón.
6. Realizar un examen directo, que consiste en la observación al microscopio
entre porta y cubre buscando al parásito por el movimiento de este y en otro
portaobjetos hacer un frotis y gota gruesa.
7. A los 15 días después de la inoculación practicar un nuevo corte en la porción
distal de la cola del mismo ratón.
Punto crítico
Asegurarse de inocular en cavidad peritoneal. Es requisito indispensable el saber
manejar animales de laboratorio.
TITULO DE Ac 100
10
1
0 3 6 9 12
TIEMPO (meses)
Hijo Madre