Controle de Qualidade

Microbiológico de Cosméticos

Faculdades Oswaldo Cruz

2011

São Paulo
 BIOSSEGURANÇA

1. Os acidentes típicos do laboratório microbiológico são as infecções

causadas por microrganismos patogênicos, que podem ser graves, se os
devidos cuidados não forem tomados;

2. As infecções podem ocorrer através da pele, olhos e ouvidos pela

projeção de culturas de microrganismos sobre a pele escoriada,
picadas de agulhas ou alças contaminadas;

3. Outra forma de contaminação é pela via digestiva e mucosa bucal,

quando alimentos e bebidas são ingeridos durante o trabalho, quando
não há suficiente desinfecção das mãos antes de comer ou fumar ou
quando se faz maquiagem.

4. Aprenda a manter os dedos, papéis, lápis, canetas, etc. longe da boca,

olhos e narinas.

Medidas de prevenção de acidentes em laboratório microbiológico

1. A desinfecção do local de trabalho é geralmente efetuada com o uso de

agentes químicos (desinfetantes), como álcool 70% (v/v) ou álcool
iodado.

2. Antes da utilização, todo o material deverá ser esterilizado. Os agentes

esterilizantes utilizados podem ser físicos (calor seco ou úmido, radiação
UV ou gama, filtrações) ou químicos (óxido de etileno).

3. Quando flambar a alça bacteriológica, a chama do bico de Bunsen deve

estar entre a pessoa e alça, a fim de proteger o operador contra
aerossóis que poderão ser projetados pelas extremidades da alça.

4. Os materiais contaminados em hipótese alguma devem ser escoados

nas pias ou nos ralos, mas sim, serem descontaminado por
autoclavação.

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 Para que se adquiram hábitos profissionais sadios e correta condição de
desempenho de seu trabalho observe rigorosamente as normas a seguir:

1. Todas as aulas práticas serão iniciadas pelo professor com

uma breve apresentação e detalhadas instruções. Não comece
a trabalhar antes de receber as instruções. Pergunte quando
houver dúvidas. A boa aula prática depende basicamente de
um bom entendimento do que se está realizando.
2. Desligar aparelhos telefônicos, evitando o desvio de atenção.
3. Materiais de alunos tais como bolsas, sacolas, pacotes,
mochilas, cadernos, etc., devem permanecer na parte superior
da bancada, e nunca sobre a superfície de trabalho.
4. Antes de entrar no laboratório o estudante deverá se
paramentar com touca, avental de manga comprida, óculos de
segurança e máscara, quando houver necessidade.
5. Não comer no laboratório, não beber água das torneiras e não
utilizar qualquer utensílio para bebê-la.
6. Não fumar no laboratório.
7. Nunca umedecer rótulos ou etiquetas com a língua.
8. No início e ao término dos trabalhos práticos, sanitizar a
superfície das bancadas, pois com este procedimento estará
destruindo os micro-organismos que poderiam contaminar suas
culturas e aqueles que possam a vir contaminar a área de
trabalho. Sanitizar o local com solução desinfetante (ex. álcool
70% (v/v).
9. O material de laboratório deve ser mantido em ordem e
escrupulosamente limpo. Ex. limpeza da balança semi-
analítica.
10. Antes de iniciar a prática, leia atentamente todos os
procedimentos descritos, sanando as dúvidas e separe todo o
material necessário.

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 11. Descartar as pipetas utilizadas em recipiente apropriado e
identificado que estará sobre as bancadas. Nunca coloque
material contaminado diretamente nas pias ou sobre a
bancada.
12. Anote cuidadosamente tudo o que for relevante, completando
com desenhos e esquemas quando necessário.
13. Na mesa de trabalho não deve existir acúmulo de material,
deixando-se apenas o necessário para cada etapa do
experimento.
14. Qualquer acidente deve ser comunicado imediatamente aos
colegas e aos professores (ex. queimaduras, cortes,
derramamento do meio de cultura, etc.).
15. Trabalhe em local ao abrigo de correntes de ar.
16. Efetue as operações próximas ao bico de Bunsen.
17. Frascos e tubos não devem ser abertos na posição vertical, e
sim mantidos na posição mais horizontal possível.
18. Trabalhe rapidamente, mas sem precipitação, evitando ações
não produtivas.
19. Ao terminar o período de trabalho, recoloque no lugar todo o
material e equipamento, não esquecendo da sanitização das
bancadas com álcool 70% (v/v).
20. Lave cuidadosamente as mãos com bastante água e sabão,
desinfetando-as com álcool iodado antes de utilizar o papel
toalha.
21. Mantenha seus EPIs em um saco plástico, separado do resto
dos materiais.

Em caso de acidentes:

Cortes ou ferimentos, mesmo leves, devem ser desinfetados e cobertos;

Queimadura produzida por fogo ou material quente deve ser tratada com
pomadas apropriada ou vaselina;

Incêndio nas roupas ou na mesa deve usar extintores ou chuveiro.

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 Abreviaturas e Legendas
Agar Cetrimida = meio de cultura seletivo empregado na pesquisa de
Pseudomonas aeruginosa
Agar Mac Conkey = meio de cultura seletivo empregado na pesquisa de
coliformes totais e fecais
Agar Vogel – Johnson = meio de cultura seletivo empregado na pesquisa
Staphylococcus aureus
ATCC = American Type Culture Collection
D/E = Dey Engley – diluente contendo inativantes empregado no teste de limite
microbiano
mL = mililitro
“Pour Plate” = semeadura em profundidade
SDA = Ágar Sabouraud Dextrose – meio de cultura para fungos
TSA = Ágar Caseína Soja – meio de cultura para bactérias
UFC = Unidades Formadoras de Colônias

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 Aula Prática n1
CONTROLE DE SUPERFÍCIES, MANIPULADORES E EQUIPAMENTOS

Objetivo: determinar a carga de sobreviventes em superfícies, regulares e

irregulares, utilizando sanitizantes, treinar manipuladores e realizar o controle
de partículas viáveis do ambiente.

Material (cada grupo)

- 1 erlenmeyer com 100 mL de TSA + inativante
- 2 tubos de ensaio com 9 mL de solução salina
- 2 pipetas de 1-2 mL
- 4 placas de Petri estéreis
- 2 placas Rodac ou placa de contato
- 2 Swab ou zaragatoa
- álcool 70% (v/v)
- solução sanitizante
- algodão
- 4 placas de petri com TSA
- 2 placas de petri com SDA

Procedimento
Superfície:Placa de Contato
Selecionar uma área na bancada, aplicar a placa Rodac, sutilmente e
identificá-la com denominação área suja. Proceder a sanitização com o
sanitizante eleito, embebido em algodão, limpando sempre em um único
sentido. Aguardar 5 minutos, para que o excesso de sanitizante evapore e
aplicar um novo Rodac, identificando-o como área limpa. Incubar por 24 - 48
horas a 30-35C.

Superfície:Swab
Selecionar uma superfície irregular, umedecer o Swab na solução
salina do tubo de ensaio e amostrar. Retornar o Swab para o tubo, contendo 9
mL de solução salina. Identificar como área suja. Plaquear 1 mL da solução da
área suja, em duplicata, acrescentando 20 mL de TSA + inativante. Aguardar
solidificar e incubar invertido por 24 a 48 horas a 30-35C.

Sanitizar a superfície irregular com o ativo escolhido, aguardar 5 minutos

e amostrar com um novo Swab. Proceder da mesma forma anteriormente
mencionada. Identificar como área limpa. Plaquear 1 mL da solução da área
limpa, em duplicata, acrescentando 20 mL de TSA + inativante. Esperar
solidificar e incubar invertido por 24 a 48 horas a 30-35C.

Ambiente:
Expor duas placas de petri, uma contendo TSA e a outra contendo SDA
durante o período do experimento. Incubar invertido por 24 a 48 horas a 30-
35ºC. Registrar o horário de início e o horário de término.

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Colaborador:
Empregar placas de Petri contendo TSA para avaliar cabelo, toque de
dedos (TSA e SDA), tosse e papel. Incubar por 48 horas a 30-35C.

Leitura

Superfície
Área suja Área limpa

Swab
Rodac

Ambiente
Bactérias
Fungos

Colaborador
Pontos Analisados Bactérias Fungos

Cálculos

Interpretação dos resultados

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 Aula Prática n2
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DA ÁGUA

Objetivo: determinar a quantidade de UFC/mL da água.

Material (cada grupo)

 1 tubo de ensaio com 10mL de água estéril
 tiossulfato de sódio 10% (p/v)
 50 mL de TSA(PCA)
 50 mL de SDA
 2 pipeta de 5 mL
 4 placas estéreis

Procedimento

Transferir 3mL para uma placa de Petri e 2 mL para outra placas de

Petri. Verter meio de cultura TSA, homogeneizar em forma de 8, aguardar
solidificar e incubar de forma invertida a 30-35C por 48 horas.
Transferir 3mL para uma placa de Petri e 2 mL para outra placas de
Petri. Verter meiode cultura SDA, homogeneizar em forma de 8, aguardar
solidificar e incubar de forma invertida a 30-35C por 48 horas.

Leitura
Análise Quantitativa

Bactérias:
Placa 2 mL Placa 3 ml
Resultado UFC/mL

Fungos:
Placa 2 mL Placa 3 ml
Resultado UFC/mL

Interpretação dos resultados

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 Aula Prática n3
TESTE LIMITE MICROBIANO

Objetivo: determinar o número de UFC/g ou mL em produtos cosméticos e

comprovar a ausência de micro-organismos específicos.

1º Parte - INATIVAÇÃO DO SISTEMA CONSERVANTE

Objetivo: determinar qual a diluição e os inativantes químicos necessários para

a eliminação da atividade bacteriostática do sistema conservante.

Preparação do material (cada grupo)

 2 erlenmeyer com 90 mL de diluente contendo os inativantes
adequados.
 1 tubo de ensaio com 5 mL do mesmo diluente.
 160 mL de Agar Caseína Soja – TSA.
 8 placas de Petri estéreis.
 4 pipetas de 1 ou 2 mL – embrulhadas em papel craft e estéreis.
 1 pipeta de 10 mL embrulhada em papel craft e estéril.
 1 pipeta de 5 mL embrulhada em papel craft e estéril
 1 espátula ou bagueta embrulhada em papel craft e estéril.
 Suspensão de Escherichia coli ATCC 10536 padronizada em
aproximadamente 100 UFC.

Procedimento
Transferir 10 g/mL do produto para o primeiro erlenmeyer com 90 mL
(10-1) de diluente + inativante. Deste erlenmeyer transferir 10 mL para o
segundo erlenmeyer (10-2) com diluente + inativante.
Plaquear 1 mL em duplicata de cada diluição, utilizando técnica de
semeadura em profundidade ou “pour plate”.
Transferir  100 UFC da suspensão microbiana padronizada, de forma
que as duas alíquotas não se misturem.
Colocar 15-20 mL de TSA e homogeneizar em oito. Aguardar solidificar
e incubar de forma invertida, a 30-35ºC por 48h.

- Controle I – plaquear  100 UFC suspensão microbiana padronizada em

duplicata +15-20 mL de meio de cultura.
- Controle II – plaquear 1 mL do diluente + inativante (sem amostra) em
duplicata com  100UFC da suspensão bacteriana padronizada + 15-20 mL de
meio de cultura.

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Esquema
10g
10mL
Suspensão
microbiana
Controle I
Amostra

- -

1mL

Controle II

- - -

diluente
-1 -2
Diluição 10 Diluição 10

Leitura e interpretação

Nome do produto:
Sistema conservante declarado:
Diluição
10-1 10-2 Controle I Controle II

Média: Média: Média: Média:

Conclusão

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 Aula Prática n3.1
TESTE LIMITE MICROBIANO

2º Parte - CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS

VIÁVEIS (PARTE QUANTITATIVA)

Objetivo: determinar o número de micro-organismos viáveis em produtos

cosméticos e medicamentos.

Material (cada grupo)

 2 erlenmeyer com 90 mL de diluente contendo os inativantes
adequados, já preparados anteriormente.
 80 mL de Agar Caseína Soja – TSA.
 80 mL de Ágar Sabouraud Dextrose - SDA.
 8 placas de Petri estéreis.
 3 pipetas de 1 ou 2 mL – embrulhadas em papel craft e estéreis.
 1 pipeta de 10mL embrulhada em papel craft e estéril.
 1 espátula ou bagueta embrulhada em papel craft e estéril.

Procedimento

Transferir 10 g/mL do produto para o primeiro erlenmeyer com 90 mL

-1
(10 ) de diluente + inativante. Deste erlenmeyer transferir 10 mL para o
segundo erlenmeyer (10-2) com diluente + inativante.
Plaquear 1 mL em quadruplicata cada diluição, utilizando a técnica “Pour
Plate”.
Colocar 15-20 mL de TSA em duas placas de cada diluição e 15-20mL
de SDA nas outras duas placas.
Homogeneizar em oito, aguardar solidificar e incubar invertido, a 30-
35ºC por 48h as placas contendo TSA e 20-25ºC por 5 -7 dias as placas
contendo SDA.

Leitura e interpretação

Nome do produto:
Sistema conservante declarado:
Diluição
Bactérias Fungos
-1 -2 -1
10 10 10 10-2

Média: Média: Média: Média:

Cálculo

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 Aula Prática n3.2
TESTE LIMITE MICROBIANO

3º Parte - PESQUISA DE PATOGÊNICOS (PARTE QUALITATIVA)

Objetivo: pesquisa de micro-organismos patogênicos específicos.

Material (cada grupo)

 2 erlenmeyer com 90 mL de diluente contendo os inativantes
adequados (anteriormente preparados).
 Alça bacteriológica
 1 placa com meio Mac Conkey
 1 placa com meio Cetrimida
 1 placa com meio Vogel Johnson

Procedimento
Flambar a alça de Henle na chama do Bico de Bunsen até rubor.
Esfriar a alça na parede do erlenmeyer anteriormente preparado (aula
TLM 2ºparte).
Retirar alíquota da amostra e semear em superfície empregando a
técnica de esgotamento em estrias.
Utilizar as placas e o tubo contendo os meios de cultura específicos para
pesquisa de patogênicos:
- Vogel Johnson (S. aureus)
- Cetrimida (P. aeruginosa)
- Mac Conkey (E. coli).

Em paralelo fazer o controle positivo para verificar o crescimento

característico dos micro-organismos que estão sendo pesquisados.

Leitura

Nome do produto:
Sistema conservante declarado:

Meios de Descrição do crescimento característico Resultados

cultura
específicos

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 Certificado Analítico Microbiológico

Produto: Lote:
Data de fabricação: Data de validade:
Sistema conservante declarado:
Inativantes empregados:
Material de acondicionamento:

Análises Especificação Resultado

Contagem de bactérias e
fungos
Pesquisa de S. aureus
Pesquisa de coliformes
totais
Pesquisa de E. coli
Pesquisa de P. aeruginosa

Resolução nº 481 de 23 de setembro de 1999.

Os resultados referem-se à amostra recebida.

___________________ _______________________
Analista Supervisor
CRX- XXXXXX CRX-XXXXXX

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 Componentes seletivos e de diferenciação de alguns meios de cultura
para isolamento de micro-organismos específicos

Staphylococcus aureus

1) Agar Manitol-vermelho de fenol

Cloreto de sódio 7,5%
Manitol
Vermelho de fenol
Características: colônias amareladas com halo amarelo

2) Agar Vogel-Johnson
manitol
glicina
vermelho de fenol
telurito de potássio
Características: colônia preta com halo amarelo

3) Agar Baird- Parker

cloreto de lítio
glicina
piruvato de sódio
telurito de potássio
gema de ovo
Características: colônias pretas com halo transparentes

Pseudomonas aeruginosa

1) Agar Cetrimida
cloreto de magnésio
sulfato de potássio
cetrimida
glicerol
Características: colônias de coloração variada, geralmente esverdeadas que
apresentam fluorescência sob luz ultravioleta.

Escherichia coli

1)Agar Mac Conkey

Lactose
Mistura de sais biliares
Vermelho neutro
Características: colônias de cor vermelha

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 Observação microscópica e reações bioquímicas

As colônias com características descritas, em cada meio de cultura, são

submetidos a coloração de Gram e observadas ao microscópio, quanto a
morfologia. Aqueles que possuem correspondência com o microrganismo
específico são submetidas a reações bioquímicas.

Staphylococcus aureus

- Coloração de Gram = cocos Gram positivo

- Coagulase positiva = a colônia inoculada em plasma de coelho ou
cavalo, após incubação a 30-37C provoca a formação de gel em até
24hs.
- Desoxirribonucleose positiva = o repique em ágar com ácido
desoxirribonucléico apresenta-se como colônias com halo transparentes.

Pseudomonas aeruginosa

- Coloração de Gram = bacilos Gram negativos

- Citrocomo oxidase-positiva = a colônia com solução de N-N-dimetil-p-
fenilenodiamina desenvolve coloração rosa a vermelho.

Escherichia coli

- Coloração de Gram = bacilos Gram negativos

- Indol positiva = reação com reativo de Kovac- halo vermelho intenso

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