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EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE

Expressão e purificação de uma proteína de fusão com a
Glutationa S-transferase

A Glutationa S-Transferase (GST) é uma proteína de 26 kDa que, quando expressa

em E.coli, apresenta actividade enzimática. Proteínas de fusão com a GST apresentam
também actividade enzimática da GST. Essas proteínas de fusão são normalmente
produzidas em quantidade apreciável por E. coli e são facilmente purificáveis, por
cromatografia de afinidade com Glutationa-Sepharose.

A figura 1 mostra o mapa do vector pGEX a utilizar para expressão de uma

proteína de fusão com a GST. O vector pGEX tem o promotor tac, um promotor forte,
indutível com IPTG, que produz níveis elevados de expressão da proteína de fusão
(ver figura 1). O cDNA codificante de várias proteínas foi clonado no vector pGEX
com a mesma pauta de leitura da GST, e células de E. coli foram transformadas com
este plasmídeo recombinante. Neste trabalho pretende-se produzir a proteína de fusão
recombinante, purificá-la por cromatografia de afinidade e analisá-la por electroforese
em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes e por “Western Blot”, utilizando
um anticorpo específico contra a proteína purificada.

Figura 1. Mapa do vector pGEX.

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Na electroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE), as

proteínas migram através dos poros do gel de poliacrilamida em resposta a um campo
eléctrico. O tratamento com SDS confere a todas as proteínas carga negativa, e igual
densidade de carga. Assim, as proteínas aplicadas no gel migram através da matriz do
gel na direcção do ânodo (polo positivo). Proteínas de menor massa molecular
migram mais facilmente através da rede formada pela poliacrilamida, e, por essa
razão, têm maior mobilidade do que proteínas de maior massa molecular. A separação
de proteínas num gel de poliacrilamida em condições desnaturantes acontece com
base na massa molecular das proteínas. O tamanho dos poros do gel diminui para
concentrações crescentes de acrilamida. Geis de 15% de acrilamida utilizam-se para
separar proteínas de massa molecular baixa, geis de menor concentração de
acrilamida, até 7.5%, utilizam-se para separar proteínas de alta massa molecular.
Depois de separadas num gel de poliacrilamida, as proteínas podem ser visualizadas
por coloração do gel com uma solução de Coomassie azul. A coloração das proteínas
separadas por SDS-PAGE permite obter informação sobre o tamanho da proteína
recombinante produzida e purificada, e saber se essa proteína está pura.

A. Indução da expressão da proteína de fusão com a GST

1. Repicar uma colónia de E. coli (estirpe BL21, deficiente em proteases),
transformada com o plamídeo pGEX recombinante e crescer durante a noite em
2ml de meio 2× YTA, a 37ºC;
2. Diluir a cultura 1:100 com meio 2× YTA novo, e crescer a 30ºC até a A600nm=0.5-
2 (~4h);
3. Adicionar à cultura 100 mM IPTG, de modo a obter uma concentração final de 0.5
mM IPTG, e incubar a 30ºC durante 30’;
4. Centrifugar as culturas, durante 10 minutos a 7 000×g, a 4ºC; descartar os
sobrenadantes e guardar os sedimentos a –80ºC até à purificação da proteína
recombinante.

Meio 2× YTA:
16 g/l Triptona
10 g/l Extracto de leveduras
5 g/l NaCl

Dissolver em 900 ml H2O, ajustar o pH para 7.0 e ajustar o volume para 1 l.

Esterilizar por autoclavagem.
Adicionar ampicilina na concentração final de 50 µg/ml.

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B. Purificação da proteína de fusão com a GST

B.1. Preparação do extracto de E. coli

1. Adicionar ao sedimento de 50 ml da cultura de bactérias 2.5 ml de PBS + 1%

Triton X-100 + inibidores de proteases;

2. Lisar as células bacterianas por sonicação no gelo (6×5 seg); agitar durante 30 min
a 4ºC;

3. Centrifugar o lisado de células bacterianas a 12 000×g, durante 10 min, a 4ºC, de

modo a eliminar a fracção celular insolúvel; recolher aliquota do sobrenadante da
centrifugação (20 µl; desnaturar proteína por diluição 1:1 com 2× solução
desnaturante e fervura).

B.2. Purificação da proteína de fusão

1. Preparar a resina Glutationa-Sepharose: usar 175 µl da mistura 75% de

Glutationa-Sepharose; lavar a resina com 10 ml de PBS; centrifugar, decantar o
sobrenadante e adicionar 130 µl de PBS, de modo a obter uma mistura de resina a
50%;

2. Adicionar o lisado celular à resina e agitar durante 30 min a 4ºC;

3. Sedimentar a resina por centrifugação e descartar o sobrenadante; lavar a resina

três vezes com 5 ml de PBS cada vez;

4. Incubar a resina com 130 µl (volume da resina) de 10 mM glutationa reduzida em

50 mM Tris-HCl, pH 8.0, durante 10 min; sedimentar a resina e recolher
sobrenadante (fracção eluída); realizar mais duas eluições como esta (opcional).

1×PBS (Tampão fosfato salino):

140 mM NaCl
2.7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
1.8 mM KH2PO4

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C. Quantificação da proteína recombinante purificada

C.1. Quantificação da concentração de proteína usando a absorvância a 280 nm

Fazer uma diluição de 1:50 de cada uma das amostra eluídas da coluna de Glutationa-
Sepharose; ler a absorvância dessas amostras a 280 nm; calcular a concentração de
proteína de fusão nas amostras, tendo em conta que, para a proteína GST:

A280nm=1 ⇒ [GST]=0.5 mg/ml

C.2. Determinação da concentração de proteína usando o método do ácido

bicinconínico (BCA)

O método do ácido bicinconínico permite a detecção colorimétrica e a quantificação

de proteína. Este método combina a redução de Cu2+ a Cu+ por proteínas em meio
alcalino (reacção do biureto) com a detecção colorimétrica, muito sensível e selectiva,
do ião Cu+ usando um reagente contendo ácido bicinconínico (Pierce). Nesta reacção
forma-se um produto de cor roxa, solúvel em água, com forte absorvância a 562 nm,
que é linear com concentrações crescentes de proteína, ao longo de uma gama extensa
de concentrações de proteína (20 µg/ml – 2000 µg/ml).

1. Preparação das soluções para a curva padrão

Solução Stock: 2 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA)

Volume de BSA Volume de Diluente Concentração final de BSA

100 µl 0 µl 2000 µg/ml
75 µl 25 µl 1500 µg/ml (A)
50 µl 50 µl 1000 µg/ml (B)
50 µl (A) 50 µl 750 µg/ml (C)
50 µl (B) 50 µl 500 µg/ml (D)
50 µl (D) 50 µl 250 µg/ml (E)
50 µl (E) 50 µl 125 µg/ml (F)
20 µl (F) 80 µl 25 µg/ml(G)

2. Preparação do Reagente BCA

Misturar 50 partes do Reagente A com 1 parte do Reagente B.

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3. Protocolo em “microwell”

a) Pipetar 25 µl de cada uma das soluções padrão de BSA para uma placa
“multiwell” de 96 poços. Usar 25 µl de diluente para fazer o ponto zero da
curva padrão.
b) Pipetar o volume apropriado (≤ 25 µl) das amostras a quantificar, e adicionar o
volume necessário de diluente para prefazer 25 µl.
c) Adicionar 200 µl do reagente BCA; agitar a placa num agitador orbital durante
30 segundos.
d) Cobrir a placa e incubar a 37 C durante 30 minutos.
e) Deixar arrefecer a placa.
f) Medir a absorvância a 562 nm.
g) Construir a curva padrão, representando num gráfico a A(562nm) de cada uma
das soluções padrão vs. a sua concentração de proteína em µg/ml. Usando a
curva padrão, determinar a concentração de proteína para cada uma das
amostras.

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D. Visualização num gel de poliacrilamida, em condições desnaturantes (SDS-

PAGE), das amostras recolhidas ao longo da expressão e purificação da
proteína de fusão

D.1. Preparação do gel de poliacrilamida

Soluções:
1.5 M Tris, pH 8.8
0.625 M Tris, pH 6.8
30% acrilamida (29 acrilamida: 1 bisacrilamida) ATENÇÃO! NEUROTÓXICO!
20% (p/v) SDS
10% (p/v) persulfato de amónio (AMPS)
TEMED (Tetra-metil-etilenodiamina)

Tampão de electroforese: 100 mM Tris: 100 mM Glicina, 0.1% SDS

Tampão de desnaturação das amostras (2×, 100 ml, pH 6.8): 1×

10 ml β-mercaptoetanol 5%
4 g SDS 2%
25 ml 1M Tris, pH 7.4 125 mM
20 ml glicerol 10%
H2O até 100 ml

Gel de separação (12% de acrilamida, 5 ml): concentração final

1.325 ml H2O
1.7 ml 1.5 M Tris, pH 8.8 0.5 M
2 ml 30% acrilamida 12%
50 µl 20% SDS 0.2%
50 µl 10% AMPS
agitar
12.5 µl TEMED
agitar e verter imediatamente no sistema de montagem do gel, até cerca de 2cm do
topo do vidro mais pequeno; adicionar uma camada de isopropanol 50%.

Gel de concentração (4% de acrilamida, 5 ml): concentração final

3.1 ml H2O
1.25 ml 0.625M Tris, pH 6.8 0.16 M
0.65 ml 30% acrilamida 4%
50 µl 20% SDS
50 µl 10% AMPS
agitar
12.5 µl TEMED
agitar e verter sobre o gel de separação, até ao topo do vidro mais pequeno; aplicar o
pente.

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Solução corante (Coomassie):

0.25% Coomassie azul
50% metanol
10% ácido acético

Solução descorante:
25% metanol
5% ácido acético

D.2. Preparação das amostras e electroforese

1. Diluir as amostras com solução desnaturante 2×, na proporção 1 solução

desnaturante (2×): 1 de amostra; ferver as amostras durante cerca de 5 min
Amostras para corar com Coomassie azul: Usar 10 µl amostra + 10 µl solução
desnaturante (2×)
2. Aplicar as amostras no gel (ver secção D.3.); aplicar também padrão de massas
moleculares contento proteínas de massa molecular conhecida. Encher a tina de
electroforese com tampão de electroforese e correr a electroforese a 200 V durante
cerca de 45 min.
3. Corar o gel por agitação durante cerca de 15 min em solução corante e lavagem
por diversas vezes em solução descorante.

D.3. Aplicação das amostras no gel de poliacrilamida em condições desnaturantes

Gel para corar com Coomassie azul:

1. Padrão de massas moleculares (10 µl)
2. Lisado celular (fracção solúvel em PBS + 1% Triton X-100) (10 µl)
3. Amostra purificada (~2 µg/10 µl)
4. Controlo positivo (GST purificada anteriormente) (2 µg/10 µl)

Bibliografia:
Gene Cloning and DNA Analysis, T.A. Brown. Capítulo 13.

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