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ANÁLISE DE ADITIVOS EM REFRIGERANTES POR HPLC

Bernardo Vieira-80850 | Patrícia Ribeiro-80634 | P1-G2

Curso de Bioquímica Universidade de Aveiro, 3810-193 Aveiro, Portugal

Data de realização experimental do trabalho: 31/05/2017

Palavras Chave:

Resumo
Neste trabalho experimetal foram analisados aditivos em refrigerantes por HPLC, mais concretamente a cafeína
e o ácido benzoico. Para isso, foram preparadas soluções padrão mistas e amostras de duas coca-colas
diferentes (coca-cola zero e da marca auchan) para a análise quantitativa destes compostos. Através do tempo
de retenção caraterístico de cada composto (análise qualitativa), identificou-se o pico/área correspondente a
cada um deles e calculou-se a concentração de cafeína e ácido benzoico em cada uma das amostras através do
gráfico da área do cromatograma obtido por HPLC em função da concentração de cafeína e ácido benzoico dos
padrões.

2. Introdução
Os refrigerantes são bebidas consumidas em todo o mundo e são vários os ingredientes utilizados na
sua produção. Para além de conterem água, concentrados (que conferem o sabor caraterístico), sulfatos e
cloretos (auxiliam na definição do sabor), destacam-se os ácidos que são utilizados como conservantes (evitam
a deterioração causada por bactérias e fungos), antioxidantes e acidulantes (regulam o pH, realçam o sabor e
regulam a doçura do açúcar).

O ácido benzoico foi o primeiro conservante a receber aprovação por parte da FDA para utilização na
indústria alimentar. Caraterísticas como o baixo custo de produção, fácil incorporação nos alimentos, baixa
toxicidade e o facto de ser incolor tornaram este composto num dos conservantes mais utilizados em todo o
mundo. Igualmente, os seus respetivos sais de sódio, potássio e cálcio, designados por benzoatos são, também,
usados com frequência nos alimentos. Este conservante demonstrou ter propriedades antibacterianas e
antifúngicas, sendo capaz de inibir o crescimento de bactérias, fungos e leveduras, a valores baixos de pH o que
torna adequada a sua utilização e dos seus sais, em alimentos ácidos. Contudo, foi descoberto que num dado
refrigerante que contenha ácido benzoico e ácido ascórbico, mais conhecido como vitamina C, sob certas
condições de exposição à luz e ao calor, elas podem reagir e formar o benzeno, substância cancerígena. Daí
que alguns dos produtores tenham vindo a reduzir as quantidades de ácido benzoico nos refrigerantes, ou até
mesmo retirando o ácido benzoico por completo.

O presente trabalho teve como objetivo a validação de um método analítico de cromatografia líquida
de alta eficiência (HPLC) para a determinação de aditivos como a cafeína e o ácido benzoico.

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) é atualmente uma das técnicas de separação mais
utilizadas em química analítica. É composta por um sistema de distribuição de fase móvel, um injetor que pode
ser automático ou não, a coluna onde se dá a separação dos analitos e que pode ser de aço ou plástico, um
detetor e um sistema de aquisição e tratamento de dados. Adicionalmente, os sistemas mais recentes de HPLC
contêm também um sistema de desgaseificação para remover gases dissolvidos nos solventes e que podem
afetar o desempenho do detetor.

O sistema de bombagem de um aparelho de HPLC deve ser capaz de bombear a fase móvel com um
caudal específico e a pressões elevadas de forma a poder atravessar a coluna. Deste sistema, também fazem
parte dispositivos que permitem controlar o fluxo e programar a proporção de cada um dos solventes usados
na fase móvel, no caso de uma eluição em gradiente. Após injetar a amostra no injetor, esta dissolve-se na fase
móvel e segue para a coluna cromatográfica, onde os vários analitos de interesse são separados com base em
mecanismos de interação com a fase móvel e com a fase estacionária. Os analitos consoante a afinidade para
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com a fase estacionária vão sendo eluídos da coluna e passam por um detetor, que emite um sinal (ex:
absorvência do analito) para um software de computador, este processa o sinal e gera um gráfico de unidades
de absorvência em função do tempo de retenção, designado por cromatograma. A identificação dos analitos é
feita com base nos tempos de retenção e, através da área dos respetivos picos é possível quantificá-los.

A separação dos vários analitos pode ocorrer de diferentes formas sendo a cromatografia por partição
a mais utilizada. Este modo de separação pressupõe a partilha dos analitos pela fase móvel e estacionária com
base na sua polaridade. Deste modo, consoante a polaridade das fases móvel e estacionária é possível
distinguir dois tipos de cromatografia por partição: cromatografia em fase normal e cromatografia em fase
reversa. A primeira consiste na utilização de uma fase estacionária com elevada polaridade e um solvente não
polar como fase móvel resultando que os analitos de menor polaridade são os primeiros a serem eluídos. Na
separação por HPLC em fase reversa a fase estacionária possui um caráter não polar e uma fase móvel polar. A
fase estacionária, geralmente, consiste num suporte à base de sílica quimicamente modificada para promover a
ligação de cadeias de hidrocarbonetos (ex: C8 e C18), hidrofóbicas, resultando num enchimento altamente
estável e insolúvel na fase móvel.

Figura 1 - Esquema representativo de um sistema de Cromatografia Líquida de Alta Resolução

3.Metodologia
3.1. Preparação da coluna cromatográfica

A fase móvel foi preparada da seguinte forma: mistura de 60% de metanol com 40% de uma solução aquosa de
ácido acético 1 mol dm-3 (pH=4.2). A coluna foi equilibrada com a fase móvel com um caudal de 0,8 mL/min.

3.2. Análise qualitativa

Para determinar o tempo de retenção dos compostos a analisar (análise qualitativa) procedeu-se à preparação
de duas soluções com 10mg de cafeína e 20 mg de ácido benzoico em balões volumétricos de 50ml. Para
ajudar na solubilização dos compostos foi adicionado metanol antes de perfazer as soluções.

Posteriormente, injetou-se no cromatógrafo HPLC 20 µL de cada solução padrão e registou-se o tempo de


retenção de cada aditivo a analisar. Sendo o tempo de retenção específico para cada composto, isto é, sendo
independente da solução onde se encontra o aditivo, basta comparar o tempo de retenção registado com o dos
próximos cromatogramas de padrões e amostras para localizar a saída da cafeína e do ácido benzoico.

3.3. Análise quantitativa

Para a análise quantitativa foram preparadas soluções padrões mistas, isto é, que continham na mesma solução
cafeína e acido benzoico e amostras de refrigerantes.

Preparação das soluções padrão mistas

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Preparou-se 50 mL de uma solução padrão A, contendo aproximadamente 2000 ppm (m/V) em cafeína e 4000
ppm (m/V) em ácido benzóico, adicionando algum metanol para ajudar a solubilização, caso fosse necessário.
Preparam-se, em balões de 50 ml, uma série de padrões contendo 1, 2, 3, 4 e 5 mL, respetivamente, da solução
A.

Preparação das amostras

As amostras, antes de serem analisadas, foram desgaseificadas num banho de ultra-sons durante 10 minutos, e
depois filtradas através de um filtro de 0.8 µm, garantindo a maximização do tempo de vida da coluna. Um
volume de 5 ml de cada amostra foi o suficiente, pois a seringa usada na HPLC media volumes muito pequenos,
na zona dos µL.

Injetou-se 20 µL (loop) de cada uma das soluções padrão e da amostra e registou-se o respetivo cromatograma,
bem como áreas, alturas e larguras dos picos e cada injeção foi repetida três vezes.

4. Resultados e discussão
4.1. Análise dos cromatogramas

Para identificarmos qual o composto que sairia primeiro e se seria necessário alterar a composição do
eluente, fomos determinar o tempo de retenção da cafeína, através de uma solução preparada previamente.

O tempo de retenção da cafeína foi 6,48. Não procedemos ao cálculo do fator de capacidade, pois não foi
necessário para admitir que não era preciso alterar a composição da fase móvel. Também daqui podemos
retirar que, existindo apenas 2 compostos a analisar, a cafeína e o ácido benzoico, o composto que sair com o
tempo de retenção perto de 6,48 será a cafeína, enquanto que o outro pico observado no cromatograma será o
do ácido benzóico.

Por análise do padrão 5, com uma velocidade de registo do cromatograma de 10mm/min, obtivemos
os seguintes dados:

Tabela 1
Tempos de retenção e fatores de capacidade da cafeína e do ácido benzoico e tempo morto retirados do
cromatograma do padrão 5
Componente Tempo de retenção Fator de
(min) capacidade
(k’)
Cafeína 6,55 1,30
Ácido
13,06 3,58
benzoico
Tempo morto (min)
2.85

T r −T m
      k=
Tm

Analisando os fatores de capacidade de ambos os compostos, verifica-se que de facto não foi preciso
alterar a composição do eluente, pois os K’ estão afastados e dentro do intervalo de 1 a 5.

Posteriormente, calculámos a largura das bases dos picos da cafeína e do ácido benzóico:

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Tabela 2
Largura da base dos picos da cafeína e do ácido benzóico retirados do cromatograma do padrão 5

Componente Altura ½ Largura Largura Largura


(mm) altura (mm) a ½ base base
(mm) altura (mm) (min)
Cafeína 9,6 4,8 2,5 4,25 0,425
Ácido 5,95 0,595
4,0 2,0 3,5
benzoico

1
W =1,7 * W
2

A fórmula acima escrita só é valida para picos perfeitos, isto é, completamente simétricos. Aplicando a
fórmula a seguir, calculou-se a resolução cromatográfica:

2(T R a−T R b )
                  R S=
W a−W b

Rs
12,76

A resolução entre dois picos cromatográficos, obtida com uma dada coluna usando determinadas
condições de eluição, mede a capacidade da coluna para, nessas condições, separar dois analitos e deverá ter
um valor superior a 1,5 para que se possam considerar dois analitos consecutivos bem separados. No nosso
caso, obtivémos um valor de 12,76, o que é bastante alto, e assim sendo podemos confirmer que nas
condições em que foi elaborado o trabalho, é possível obter uma boa separação da cafeína do ácido benzóico.

4.2. Determinação do conteúdo de ácido benzóico e de cafeína nas amostras

Foi-nos fornecida uma solução já preparada num balão de 200mL, com 0,4056g=405,6mg de cafeína e
0,8114g=811,4mg de ácido benzóico. Ou seja:

cafeína= 405,6mg|mác.benzoico=0811,4mg|Vsolução=200,0mL
[cafeína]=405,6/0,2000= 2028 ppm | [ác.benzoico]=811,4/0,2000=4057ppm

A partir desta solução mãe, preparámos os diferentes padrões, pipetando diferentes volumes para
balões de 50mL:

Tabela 3
Padrões e respetivos volumes adicionados da solução mãe e concentrações de cafeína e de ácido benzóico nos
padrões

Padrão Vsolução mãe V final (mL) [cafeína] (ppm) [ác.benzoico]


(mL) (ppm)
1 1,00 50,0 40,56 81,14
2 2,00 81,12 162,28
4
3 3,00 121,68 243,42
4 4,00 162,24 324,56
5 5,00 202,8 405,56

Para cada analito, estabeleceu-se uma regressão linear como reta de calibração:

Cafeína

Tabela 4
Concentração de cafeína nos padrões e área dos picos de cada padrão

Ccaf (ppm) Área


40.56 175544
81.12 279411
121.68 447766
162.24 516030
202.8 690163

A partir destes dados construímos a reta de calibração:

b 3120,9 800000 Cafeína


a 42026 700000

600000

500000

400000
Área

300000
LOD LOD (ppm)
(sinal) 200000

124174 26,32 100000


0
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
Ccafeína / ppm

Gráfico 1
Concentração de cafeína nos padrões em função da área dos picos dos padrões

Como podemos verificar pelo coeficiente de correlação apenas com um 9, a reta não era a mais
indicada para se usar no cálculo da concentração de cafeína nas amostras, no entanto, por falta de tempo, só
pudemos efetuar apenas 1 leitura por padrão. Procedendo então ao cálculo da concentração de cafeínas nas 2
amostras:

5
Tabela 5
Concentração de cafeína nas amostras
C caf
Área Caf (ppm)
Coca-cola
zero 315923 87,8
Auchan 367192 104,2

*Concentração na Coca-cola: 315923=3120,9 x +42026 ↔ x=87,8   p p m  

*Concentração na Cola Auchan: 367192=3120,9 x+ 42026 ↔ x=104,2   p p m  

Tabela 6
Concentração de cafeína nas amostras e respetivo intervalo de confiança

Amostra Sy/x Sx0 IC 95%


Coca-cola 27383 9,9 (87,8 ± 31,4) ppm
Cola Auchan 9,7 (104,2 ± 30,8) ppm

Como podemos verificar pelo S y/x e o Sx0, sendo a reta inadequada, a incerteza retirada desta vai é
muito grande e, como tal o intervalo de confiança obtido também o vai ser ( isto deve-se principalmente ao
valor de Sy/x, pois quando se substitui os valores da concentração na reta, o sinal obtido e o retirado da reta vão
ser bastante diferentes, resultando num erro muito grande). Podemos ver também que o limite de deteção deu
um valor elevado exatamente por causa do Sy/x.

Ácido Benzóico

Fazendo o mesmo para o ácido benzóico:

Tabela 7
Concentração de ácido benzóico nos padrões e área dos picos de cada padrão

Cac.benz.
(ppm) Área
81.14 106889
162.28 166297
243.42 268548
324.56 304366
405.7 405687

A partir destes dados construímos a reta de calibração:

Ácido Benzóico
450000

b 906,66
400000
350000
29658
a
300000
250000
Área

200000
150000
100000
6
50000
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450
Cácido benzóico / ppm
LOD
(sinal) LOD (ppm)
81738,9 57,44

Gráfico 2
Concentração de ácido benzóico nos padrões em função da área dos picos dos padrões

Como podemos verificar pelo coeficiente de correlação apenas com um 9, a reta não era a mais
indicada para se usar no cálculo da concentração de cafeína nas amostras, no entanto, por falta de tempo, só
pudemos efetuar apenas 1 leitura por padrão. Procedendo então ao cálculo da concentração de ácido benzóico
nas 2 amostras:

Tabela 8
Concentração de ácido benzóico nas amostras

C ác. Benz.
Área ác. Benz. (ppm)
Coca-cola
zero
Auchan 162077 146,1

*Concentração na Cola Auchan: 162077=906,66 x +29658 ↔ x =146,1   p p m  

Devido à polémica dos aditivos nos refrigerantes, como o ácido benzóico, a coca-cola não
apresenta uma concentração significativa de ácido benzóico que se consiga distinguir do ruído e,
como tal só calculámos a concentração deste na coca-cola Auchan.

Tabela 9
Concentração de ácido benzóico nas amostras e respetivo intervalo de confiança

Amostra Sy/x Sx0 IC 95%


Cola Auchan 17360 6,1 (146,1 ± 19,4) ppm

Como podemos verificar pelo S y/x e o Sx0, sendo a reta inadequada, a incerteza retirada desta vai é
muito grande e, como tal o intervalo de confiança obtido também o vai ser (isto deve-se principalmente ao

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valor de Sy/x, pois quando se substitui os valores da concentração na reta, o sinal obtido e o retirado da reta vão
ser bastante diferentes, resultando num erro muito grande). Podemos ver também que o limite de deteção deu
um valor elevado exatamente por causa do Sy/x.
Em ambas as amostras, tanto para a cafeína como para o ácido benzóico, o intervalo de confiança
obtido não traduz nenhuma confiança no valor obtido e, como tal, o mais indicado seria repetir a leitura dos
padrões para minimizar o erro obtido da reta de calibração, melhorando o coeficiente de correlação.
Em nenhuma reta de calibração o padrão com concentração menor se encontrava abaixo do limite de
deteção, confirmando-se que se pode distinguir todos os sinais obtidos, tanto dos padrões como da amostra.
Após pesquisa da concentração de cafeína na Coca-cola zero, encontrámos o valor 125mg/L (ppm),
que nem mesmo com um IC 95% tão grande, este valor se encontra inserido no intervalo. O que podemos
confirmar que a nosso método de trabalho teve algumas falhas que impossibilitaram a obtenção de bons
resultados. Sobre a coca-cola Auchan, nenhuma informação obtive e, como tal nada posso dizer, como forma
de comparação dos nossos resultados obtidos.

5. Conclusão
A resolução entre dois picos cromatográficos, obtida com uma dada coluna usando determinadas
condições de eluição, mede a capacidade da coluna para, nessas condições, separar dois analitos e deverá ter
um valor superior a 1,5 para que se possam considerar dois analitos consecutivos bem separados. No nosso
caso, obtivémos um valor de 12,76, o que é bastante alto, e assim sendo podemos confirmer que nas
condições em que foi elaborado o trabalho, é possível obter uma boa separação da cafeína do ácido benzóico e
que não foi preciso alterar a composição da fase móvel para melhorar a separação.
No entanto como podemos verificar pelos S y/x e o Sx0, retirados de ambas as retas, a incerteza é muito
grande, o que revela falhas no nosso método de trabalho, que se devem principalmente às leituras únicas de
cada padrão, mas que por falta de tempo não poderia ter sido de outra maneira. Isto verifica-se quando
comparamos o valor tabelado de cafeína na coca-cola zero com o nosso valor obtido, que mesmo tendo um
intervalo de confiança grande, o valor tabelado não se insere neste intervalo.
Podemos então concluir que as condições em que foi feito este trabalho foram ideias para se obter
uma boa resolução cromatográfica, ou seja, uma boa separação da cafeína do ácido benzóico, mas não foram
ideias para se calcular a concentração de ambos os analitos nas amostras.
Aspetos a melhorar seria repetir as leituras dos padrões de modo a obter uma reta de calibração mais
fidedigna e com um coeficiente de correlação maior (mais perto de 1), para que a incerteza associada à
concentração da amostra não fosse tão grande.

Bibliografia
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6http://repositorio.ipl.pt/bitstream/10400.21/4673/1/Disserta%C3%A7%C3%A3o.pdf