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fármacos marinos
ISSN 1660-3397
www.mdpi.com/journal/marinedrugs
Artículo
Relaciones peligrosas en la web Marino Ártico Alimentos: Las interacciones entre las
productoras de toxina Pseudo-nitzschia Las diatomeas y calanus copepoditos
Sara Harðardóttir 1,2, *, Marina Pančić 1,2, Anna Tammilehto 1, Bernd Krock 3,
Eva Friis Møller 4, Torkel Gissel Nielsen 2 y Nina Lundholm 1
1 Museo de Historia Natural de Dinamarca, Universidad de Copenhague, Sølvgade 83S, 1307 Copenhague,
Recibido: February 5 2015 / Aceptado: 28 May 2015 / Publicado: 16 Junio el año 2015
Abstracto: Las diatomeas del género Pseudo-nitzschia producir ácido domoico (DA), una toxina que se guía vectorial en la
cadena alimentaria marina, lo que causa graves problemas para los organismos marinos y seres humanos. A pesar de
esto, el conocimiento de las interacciones entre zooplancton pastoreo y diatomeas está restringido. En este estudio se
analizaron las interacciones entre calanus copepoditos y la producción de toxina Pseudo-nitzschia. Los copepoditos fueron
alimentados con diferentes concentraciones de tóxico P. seriata y una cepa de P. obtusa que fue previamente probado para
ser no tóxico. Las tasas de ingestión no difirieron entre las dietas ( P. seriata, P. obtusa, una mezcla de ambas especies), y
se acumula 6% -16% de DA ingerido (hasta 420 g por copepoditos peso seco). Cuando P. seriata fue expuesto a los
copepoditos, ya sea a través del contacto físico con los herbívoros o separados por una membrana, la toxicidad de P.
seriata aumentado (hasta 3,300%) lo que sugiere que la respuesta sea mediada químicamente. La respuesta inducida
también se activa cuando copepoditos pastan en otra diatomea, apoyando la hipótesis
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que las señales se originan Del copepoditos. Ni las concentraciones de pH ni de nutrientes explican la producción de DA
inducida. Inesperadamente, P. obtusa también producido DA cuando se expone a copepoditos de pastoreo, lo que
palabras clave: calanus copepoditos; seriata Pseudo-nitzschia; P. obtusa; pasto; inducción; ecología química; la producción
1. Introducción
El ácido domoico biotoxinas marinas (DA) causa la intoxicación amnésica mariscos (ASP) en los seres humanos [1,2], y la exposición a DA se
sabe que tiene efectos perjudiciales sobre los animales en la cadena alimentaria marina, por ejemplo, aves marinas y mamíferos [3, 4]. DA es
Pseudo-nitzschia como un metabolito secundario [5,6]. DA se acumula en los organismos marinos que se alimentan de fitoplancton, por ejemplo,
peces planctívoros (como sardinas), bivalvos y copépodos [7-9], que puede entonces servir como vectores para la DA en la red alimentaria. A pesar
de los efectos sombrías que las diatomeas DA-productoras tienen sobre los niveles tróficos superiores, sólo unos pocos estudios han explorado las
Pseudo-nitzschia es un género de diatomeas distribuida a nivel mundial, de las cuales muchas especies forman extensos floraciones.
Catorce de las 39 especies descritas son conocidos por ser toxigénica [11]. El incidente ASP registró por primera vez en 1987 en la Isla del
Príncipe Eduardo, Canadá [1], produjo un aumento de interés en la investigación y los programas de vigilancia ahora monitorear las
concentraciones de Pseudo-nitzschia y / o niveles de DA en moluscos. Estos esfuerzos de investigación y vigilancia se han ampliado nuestro
conocimiento particular de la ecología, distribución, taxonomía, y la toxina-producción de Pseudo-nitzschia en zonas templadas, subtropicales
y tropicales. Las regiones polares, sin embargo, han recibido mucha menos atención. No hay registros de una toxigénica Pseudo-nitzschia Existen
especies de la Antártida y el primer, y hasta ahora único, registro de una diatomea productora de la toxina en el Ártico es P. seriata [ 12,13].
Varias especies de copépodos son conocidos a pastar en tóxico Pseudo-nitzschia. La mayoría de los estudios no han detectado ninguna
reducción en el pastoreo en tóxicos versus no tóxico Pseudo-nitzschia [ 9,14-17]. El único estudio realizado en copépodos árticas, calanus spp.,
no encontraron diferencias significativas en la ingesta global específica del peso de las especies tóxicas y no tóxicas en tres calanus especies.
Sin embargo, se detectaron tasas de pastoreo discontinuos, lo que indica que dos de las especies, C. finmarchicus y
C. hyperboreus, fueron afectados temporalmente cuando se alimenta con tóxico P. seriata. Esto sugiere que la DA puede actuar como elemento
disuasorio contra el pastoreo copépodos [18]. Un impacto similar se observó en el patrón de pastoreo en el krill Euphausia pacifica, cuando el
P. pungens [ 19].
seriata pseudo-nitzchia aumento de la producción de DA cuando se expone a un adulto de pastoreo calanus
se encontró que era mediada químicamente copépodos [20], un efecto que puede estar relacionado con la defensa contra el pastoreo, y la
respuesta. Los cambios en los nutrientes (silicato, nitrato, amonio y fosfato), y los cambios en los niveles de pH son conocidos
desencadenantes para la producción de DA en Pseudo-nitzschia especies [21-23]. Sin embargo, los pocos estudios que han medido los
respuestas en el fitoplancton por el zooplancton, no se han encontrado los nutrientes a ser el factor inductor [24-27].
En el Ártico, copépodos del género calanus dominar el mesozooplancton. Antes de la floración del resorte fitoplancton, los copépodos
ascienden desde la profundidad para alimentar, reproducir y desovar [28]. Después del desove, el adulto calanus copépodos descienden al
agua cerca de la parte inferior para la hibernación [29]. Después de ello, las etapas más jóvenes se encuentran entre los mesozooplancton
más abundante y con frecuencia son herbívoros clave durante el período posterior a la floración [30,31]. Los estudios mencionados
anteriormente pastoreo fueron realizados en mujeres adultas. No se sabe si las etapas más jóvenes pastan en Pseudo-nitzschia y si lo
hacen, si son más vulnerables a las toxinas. Hasta donde sabemos, no hay otros estudios han explorado el efecto de la DA en las etapas
más jóvenes de copépodos y si se conservan DA, ni tienen su efecto sobre la producción de toxinas en el fitoplancton sido exploradas.
Los objetivos del presente estudio fueron investigar la interacción entre calanus copepoditos y
Pseudo-nitzschia, es decir, ( 1) si copepoditos seleccionar entre Pseudo-nitzschia especies de diferente toxicidad o tamaño; (2) si el
pastoreo en tóxico Pseudo-nitzschia afecta a las tasas de pastoreo y / o la mortalidad de los copepoditos; (3) si copepoditos conservan
DA; (4) si la presión de pastoreo de los copepoditos induce la producción de DA en un tóxico ( P. seriata) y un no tóxico ( P. obtusa)
Pseudo-nitzschia especies; y (5) si la producción DA inducida está mediada por cambios en los principales nutrientes inorgánicos o pH,
o debido a señales químicas a base de agua de los copepoditos.
2. resultados
2.1.1. Toxicidad
Al comienzo del experimento, los copepoditos y la P. obtusa células no contenían DA, mientras
P. seriata células contenían bajas cantidades de DA, ~ célula 0,1 pg -1 ( nivel de Detectio n = de células DA 0.003 pg -1)
(Tabla 1). cuotas de células ácido domoico aumentaron significativamente en ambos P. seriata y P. obtusa cuando se expone a los
herbívoros, pero no en el control sin copepoditos (Tabla 1). Este es el primer reporte de producción de DA por P. obtusa. P. seriata producido
más DA de P. obtusa por célula ( t- prueba, P < 0,001) (Tabla 1), y también por volumen, es decir, teniendo en cuenta el mayor de
biovolumen P. seriata (~ 2,2 × 10 -3 y ~ 0,5 × 10 -3 DA pg por m 3, para P. seriata y P. obtusa, respectivamente) ( t- prueba, P = 0,003).
Disuelto DA no se midió. Al final del experimento, los copepoditos retenidos 0,1 ± 0,0 ng DA g C -1
después de pastar en P. obtusa, el P. obtusa células producidas 0,4 ± 0,1 × 10 -4 ng DA g C -1. Después de pastoreo en P. seriata durante 39 h,
1,9 ± 4,4 × 10 -4 ng DA g C -1. DA medido en los copepoditos varió desde 8,2 hasta 69,7 DA ng por individuo, con la cantidad más baja
después del pastoreo en P. obtusa y el más alto después del pastoreo en
P. seriata ( Rango de Mann-Whitney ensayo de la suma, P = 0,03) (Tabla 1). De la DA ingerido después de pastar en
P. obtusa, los copepoditos retenidos 6%, y 13% -16% cuando el pastoreo en P. seriata y mezcla de ambos, respectivamente.
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Tabla 1. Pastoreo experimento. Pseudo-nitzschia densidad celular (células ml -1) y ácido domoico cuota célula (célula DA
calanus ingerido (ng poli total de DA -1) y retenido DA por copepoditos, dada en medido DA (ng DA poli -1), en peso
seco (g DA g DW poli -1) y como porcentaje de DA ingerido. Los resultados se dan como * = diferencia significativa
de principio a fin, y ** para una diferencia significativa entre el control y el tratamiento. LOD = nivel de detección.
(LOD para P. obtusa
era de células DA 0.001 pg -1).
Pseudo-nitzschia calanus
(Cop ng (Cop ng (G DA g % De
(células ml -1) (Pg DA Cell -1)
DA -1) DA -1) DW poli -1) ingerido DA
controles
P. seriata + P. obtusa 7144 ± 103 8617 ± 122 0,1 ± 0,0 0,2 ± 0,0
Tratos
P. seriata + copepoditos 3951 ± 52 1901 ± 187 0,1 ± 0,0 2,6 ± 0,6 *, ** 530 ± 21 70 ± 18 410 ± 112 13 ± 4
P. obtusa + copepoditos 5951 ± 285 4988 ± 570 <LOD 0,2 ± 0,1 *, ** 137 ± 37 8±2 48 ± 10 6±2
P. seriata + P. obtusa +
7033 ± 97 4262 ± 249 0,1 ± 0,0 3,7 ± 0,6 *, ** 275 ± 70 42 ± 8 246 ± 51 16 ± 4
copepoditos
Los copepoditos producen sedimentos fecales en todas las dietas (Figura 1A) que demuestran que los copepoditos pastan en el algas
tóxicas. De los 146 copepoditos utilizados en el experimento, 138 estaban vivos y vitales al final del experimento, y no hay copepoditos muertos
fueron encontrados en las muestras al final. Dos de los copepoditos desaparecidos fueron descubiertos en las muestras de enumeración
celular, seis están desaparecidas. La tasa de aclaramiento medio para el 39 h era el mismo (2,8 ± 0,7 a 3,3 ± 0,6 ml poli -1 marido -1) para los tres
tratamientos (ANOVA de una vía, F 2,9 = 0,3, P = 0.8) (figura 2a); y no había diferencia entre las tasas de ingestión signifcant, ya sea cuando el
pastoreo en P. seriata, P. obtusa o una mezcla de ambas especies (ANOVA de una vía,
F 2,9 = 0,3, P = 0.7). No se encontraron cambios significativos en las tasas de ingestión específica de peso entre la luz y los períodos
oscuros en cualquiera de las dietas (RM ANOVA, PAG > 0,05) (Figura S1), y la tasa de ingestión promedio durante los 39 h (0,56% ±
0,1% -0,77% ± 0,2% h -1) no fue diferente entre las dietas (ANOVA de una vía, F 2,9 = 0,3, P = 0.8) (Figura 2B).
partir de la producción de pellets fecales y de despeje se representaron frente a la otra para las tres dietas. La tasa de inge
producción específica pellet fecal (SPP) (% h -1
)
cuando
el pastoreo en P. seriata, P. obtusa o una mezcla de ambas especies. No se encontraron diferencias significativas ent
),
calculado
y ( segundo)
marido -1
);
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± DE) para el pastoreo en P. seriata, P. obtusa o una mezcla de ambas especies. No se encontraron diferencias estadísticas e
, ± DE) para el pastoreo en P. seriata, P. obtusa o una mezcla de ambas especies; ( segundo) tasas de ingestión-peso es
media
policía -1
marido -1
,
media
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producción de pellets fecales fue más alto cuando el pastoreo en P. seriata, y la producción específica pellet fecal (SPP) fue más alto cuando el
pastoreo en P. obtusa ( Figura 1b). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el número de partículas fecales producidas
(ANOVA de una vía, F 2,9 = 1.3, P = 0.4) ni en SPP entre las dietas (ANOVA de una vía, F 2,9 = 1,0, P = 0.4). La comparación de las tasas de ingestión
específica de peso en base al aclaramiento de carbono o a base de egestion pellet fecal, mostró una tasa de ingestión más alta cuando se basa en
el aclaramiento, que egestion cuando el pastoreo en las tres dietas ( t- las pruebas; P. seriata y la combinación de ambas especies P < 0.001, y P.
obtusa Rango de Mann-Whitney ensayo de la suma, P = 0,03). Para ambos métodos de cálculo, una comparación de la tasa de ingestión entre las
La densidad celular inicial en cada uno de los tratamientos de dieta fue la misma que en los controles ( t- prueba; para
P. seriata P = 0,7; P. obtusa P = 0.1 y en el tratamiento con cultivos mixtos: P. seriata P = 0.9 y
P. obtusa P = 0.1). En general, no hubo cambios significativos o tendencias en los cambios de las concentraciones de fosfato (PO 43-), de amonio
(NH 4+) y nitrato (NO 3-) se observó, aunque las muestras individuales diferían, ya sea de principio a fin o entre el control y el tratamiento (ver
detalles en el cuadro complementario S1). Silicato (Si (OH) 4) concentraciones disminuyeron significativamente en todos los controles de
principio a final del experimento, mientras que en los tratamientos con copepoditos no hubo ningún cambio significativo. Los niveles de pH
fueron
8,1 ± 0,1 en los controles y los tratamientos en el inicio del experimento y 8,1 ± 0,03 al final del experimento, y no hay cambios
significativos en general se observaron entre los tratamientos que contienen copepoditos y los controles (ver detalles en el cuadro
complementario S1).
2.2.1. Toxicidad
cuota celular ácido domoico (toxicidad) en P. seriata aumentado significativamente en ambos tratamientos de densidad copepodito, tanto en el
matraz A con células en contacto directo con los herbívoros (figura 3A), y en el matraz B con las células separadas de los herbívoros (Figura 3b)
(RM ANOVA, Valores de p < 0.05, excepto por el matraz A día 2 a 5, donde se añadieron las células no inducidas en el día 3). En general, la cuota
de células DA aumenta gradualmente en el matraz A del día 0 al día 8, mientras que la respuesta se retrasó en el matraz B (Figura 3). En el
control, la cuota de células DA no cambió durante el experimento, era consistentemente en el rango de 0.3 ± 0.1 para
de células DA 0,4 ± 0,0 pg -1 ( RM ANOVA, F 2,6 = 38,8, P = 0,08). Desde el día 0 a 2, toxicidad de P. seriata
aumentó significativamente sólo en matraz A ( t- pruebas, con 12 copepoditos P < 0.001 y con 20 P = 0,003). En el día 2, la cuota de células DA
P < 0,001 para 12 y 20 copepoditos, respectivamente). Después de días 2, el contenido de toxina fue la misma en matraz de A y B en ambas
concentraciones de copepoditos ( t- pruebas, PAG > 0,05). El nivel más alto de la DA fue
de células DA 13,3 ± 4,9 pg -1 en el matraz A con 12 copepoditos en día 8 (Figura 3 y el cuadro complementario S2). En el experimento donde
las células de P. seriata fueron cultivadas en agua filtrado, donde los copepoditos habían sido previamente pastando en Thalassiosira sp., el
,
media
± SD) cuando se cultivan en el agua filtrado donde copepoditos habían sido pastando en otras especies de diatomeas ( Thalassiosir
± SD) de P.
seriata cuando rozado por dos concentraciones diferentes de copepoditos y en el control. ( un) Un frasco con copepodi
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Las concentraciones celulares iniciales fueron los mismos en todos los tratamientos y en los controles en el inicio del experimento (ANOVA de una vía, F
2,11 = 3.7, P = 0,05). La media de las tasas de crecimiento (ocho días) en todas las incubadoras que contienen sólo P. seriata Células, es decir, matraces B y
P = 0.7), que indica las condiciones de crecimiento similares (Figura 4). Las tasas de crecimiento fueron ligeramente más bajos durante los dos
primeros días, 0,1 ± 0,9 d -1 y estabilizado a partir de entonces alrededor de 0,3 ± 0,1 días -1. La densidad celular fue significativamente menor en el
matraz A que en el matraz B en el día 2 en ambos tratamientos (12 y 20 copepoditos) (Figura 5b) ( t- prueba, P < 0.001 y Mann Whitney-rank test
suma, P = 0.029) que ilustra que las copepoditos pastan en las células tóxicos. A pesar de la adición de células en matraz de A en el día 3, los
números de células fueron significativamente inferiores en matraz A que en el matraz B en el día 8 en ambos tratamientos (Figura 5) ( t- prueba, P = 0,018,
Figura 4. tasa de crecimiento (día -1) en el matraz B que contiene sólo P. seriata células, y los controles. El día 3, los
matraces se diluyeron con 1/10 medio L (flecha) para compensar la adición de células al otro sitio de la cámara donde los
copepoditos habían reducido la concentración de células drásticamente. No se encontraron diferencias estadísticas entre
los tratamientos.
,
media
± SD) en el experimento de inducción. ( un) Los dos controles (tanto n = 3); ( segundo) Las concentraciones
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En general, las mediciones de nutrientes mostraron una disminución significativamente mayor en la concentración de silicato en el
control que en los tratamientos, las concentraciones relativamente estables de fosfato y de amonio durante todo el experimento (aunque las
muestras individuales diferían, ya sea de principio a fin o entre el control y el tratamiento (ver detalles en Tabla 2)), y una concentración final
significativamente mayor de nitrato en los tratamientos que en el control (Tabla 2). Debido a que sólo dos mediciones estaban disponibles
para la concentración inicial de nitrato, que no estaba incluido en las pruebas estadísticas. El NO inicial 3: Si (OH) 4: correos 43-
relaciones fueron de ~ 23: 1: 1. Los niveles de pH fueron 8,1 al comienzo del experimento y varió entre 8,1 y
8,2 al final del experimento (Tabla 2), sin diferencia estadística entre los tratamientos y los controles.
Tabla 2. experimentos de inducción. Las concentraciones de nutrientes y niveles de pH en el inicio y el final de los experimentos de
inducción. norte es el número de copepoditesr. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Los resultados se dan
Tiempo
Tratamiento Si (OH) 4 ( mol L -1) correos 43- ( mol L -1) NUEVA HAMPSHIRE 4+ ( mol L -1) NO 3- ( mol L -1) pH
(días) / (h)
0 Inicial 5,7 ± 0,6 5,6 ± 0,6 38,3 ± 1,6 131,6 ± 5,6 8.10
8 Controlar 0.0 * 3,5 ± 0,3 * 25,6 ± 1,0 * 99,3 ± 6,3 8,12 ± 0,02
8 Un frasco, n = 12 1,3 ± 1,0 * 6,6 ± 1,2 ** 28,8 ± 2,3 182,6 ± 20,7 ** 8,16 ± 0,02
8 Un frasco, n = 20 3,6 ± 0,7 *, ** 7,1 ± 0,5 *, ** 33,9 ± 0,7 ** 191,2 ± 4,2 ** 8,12 ± 0,02
8 Matraz B, n = 12 0,4 ± 0,7 * 5.5 ± 1.1 25,9 ± 1,4 164,2 ± 17,7 ** 8.18 ± 0.00
8 Matraz B, n = 20 0,4 ± 0,3 * 5,1 ± 0,1 27,9 ± 1,5 161,4 ± 10,5 ** 8,11 ± 0,01
0 Inicial 6,7 ± 0,6 7,0 ± 0,2 38,8 ± 1,7 164,8 ± 12,5 8,06 ± 0,00
39 h Controlar 3,6 ± 0,3 * 7,4 ± 0,1 * 39,9 ± 1,0 177,7 ± 1,0 8,09 ± 0,01
39 h Fin 3,7 ± 0,31 * 8,0 ± 0,4 * 43,3 ± 0,7 *, ** 197,7 ± 1,1 *, ** 8,10 ± 0,01
La tasa de depuración promedio fue de 0,7 ± 0,1 ml poli -1 marido -1 en el matraz A con 12 copepoditos y
1,1 ± 0,2 ml poli -1 marido -1 con 20 copepoditos. La tasa de ingestión específica peso medio (0-8 días) era el mismo en ambos
tratamientos (0,4% ± 0,0% h -1). La tasa de ingestión más bajo se midió entre los días 0-2 y más alto entre los días 3-5 después de las
células adicionales se habían añadido (Figura 6). Al final del experimento, 106 de los 128 copepoditos iniciales estaban vivos y
vitales. En el tratamiento con 12 copepoditos, uno era muerto, y en el tratamiento con 20 copepoditos, seis copepoditos estaban
muertos, no se encontraron los copepoditos restantes. Después de ocho días de pastoreo en P. seriata, los copepoditos retenidos 250
± 77 y 171 ± 29 ng de poli DA -1, en los tratamientos con 12 y 20 copepoditos, respectivamente, correspondientes a 2,3 ± 0,7 y 1,6 ±
0,3 ng DA g C -1. los P. seriata células producidas en promedio
La Figura 6. Peso tasa de ingestión específica de las dos concentraciones de herbívoros (% h -1,
media ± SD). Las flechas indican el momento en que se añadieron células para asegurar los copepoditos tenían suficiente comida.
3. Discusión y Conclusiones
3.1.1. Pasto
En este estudio se muestra por primera vez que calanus copepoditos etapas C3 y C4 pastan en tóxico
Pseudo-nitzschia y retener la toxina, lo que sugiere que copepoditos suponen un riesgo como vectores de DA en los alimentos marinos del Ártico.
Los resultados sugieren que DA no impidió el pastoreo, que puede parecer como una paradoja porque las algas inducen la producción de toxinas
en presencia de copepoditos de pastoreo. Pero DA puede afectar a otras capacidades físicas del herbívoro, por ejemplo, la competencia para
escapar de los depredadores. Esto se ha visto en los copépodos Oithona similis y C. helgolandicus, que se vieron afectados negativamente
(desorientado o muerto) después de la alimentación en una cepa tóxica de Alexandrium tamarense [ 32]. Otros efectos potenciales de la DA podría
ser una reducción de la fecundidad y la tasa de eclosión de los huevos, como se ha demostrado previamente para el rotíferos [Brachionus plicatilis 33].
Las tasas de ingestión y eliminación no difirieron significativamente entre los tratamientos o dentro de los tratamientos, es decir, entre los períodos
de luz y oscuridad, o como media de la 39 h. Las tasas de pastoreo fueron los mismos en los dos experimentos y estaban en el intervalo
encontrado en los otros estudios sobre C. finmarchicus copepoditos [34,35]. Nuestros resultados están de acuerdo con los resultados de la mayoría
de los estudios anteriores de pastoreo de copépodos adultos, los cuales no han mostrado DA para disuadir el pastoreo de copépodos, por ejemplo,
tóxico P. multiseries en comparación con el no tóxico P. delicatissima. Lo mismo se observó para C. finmarchicus
pastoreo en tóxico P. multiseries y no tóxico P. pungens [ 15]. Los resultados difieren en parte del único estudio de la misma ubicación,
donde las hembras adultas de C. finmarchicus y C. hyperboreus fueron afectados temporalmente cuando se alimenta con tóxico P. seriata [ 18],
similar a un efecto de pastoreo temporal visto en krill [24]. pastoreo y / o mortalidad de los copépodos disuadido se han observado en otros
por ejemplo, reducción de las tasas de pastoreo de C. pacificus fueron detectados cuando el pastoreo en dinoflagelados tóxicos [36,37].
tonsa Acartia ingerido menor proporción de tóxico Alexandrium minutum cuando se les ofrece una elección entre
A. minutum y presa alternativa no tóxica micans Prorocentrum [ 24], y grazer mortalidad varió de 36% a 47% para typicus
Centropages y Acartia Clausi, respectivamente, el pastoreo en tóxico
A. minutum [ 38]. En el presente estudio, tanto Pseudo-nitzschia especies fueron, para nuestra sorpresa, resultó ser tóxico, y los copepoditos
P. obtusa. Por lo tanto, debido a la falta de un control no tóxico, no podemos concluir que DA no tiene ningún efecto negativo en los copepoditos,
ya que, por ejemplo, tasas de ingestión podría ser mayor en una especie no tóxicas que en las especies tóxicas.
La selectividad para el tamaño (pastoreo diferente en P. seriata, que es mayor que P. obtusa) No se observó. Esto se esperaba ya que los
copepoditos estaban en el rango de tamaño de C. pacificus y C. finmarchicus, y ambos P. seriata y P. obtusa están dentro del rango de tamaño de la
presa de estas especies [18,39]. Cuando el cultivo de cepas clonales de diatomeas pinnadas, como Pseudo-nitzschia, que inevitablemente se hacen
más cortos con el tiempo debido a las restricciones de la envolvente de sílice durante la división celular en la regla de MacDonald-Pfitzer [40]. El
tamaño de celda grande se recuperó durante la reproducción sexual. La longitud de la célula de las cepas de P. seriata y
P. obtusa por lo tanto, eran pequeñas en comparación con las observaciones de la especie en el campo. Pero dado que la
Pseudo-nitzschia células aparecido en colonias escalonadas, que los copepoditos aparentemente no tienen dificultades de manejo, no esperamos
que un tamaño de celda más grande en el campo planteará cualquier diferencia en el pastoreo. Los copepoditos fueron similares al tamaño de un
adulto C. finmarchicus, que se ha informado para alimentar eficazmente en las células con considerables volúmenes más grandes que las células de
la presente estudio [41], por lo tanto, se puede esperar que la respuesta de alimentación que vemos es representativo para la alimentación en las
poblaciones naturales.
Vimos pocos (seis de cada 128) copepoditos muertos en el experimento de inducción de ocho días, y esto podría en un grado menor estar
relacionada con una hipótesis de DA no actúa como elemento disuasorio de pastoreo, sino como una toxina. Ya que no se encontró ningún efecto
en el pastoreo como una indicación de las copepoditos no ser así, no tenemos en cuenta que es probable que los seis muertos copepoditos habían
muerto a causa de la DA. DA disuelto (DDA) ha sido encontrado previamente para no afectar la tasa de pastoreo, pero que tiene efectos letales
sobre el copépodo Tigriopus californicus [ 42], y el DDA se ha encontrado que aumentar la mortalidad de krill [43]. DDA no se midió en el presente
estudio, debido a que la misma cepa previamente había sido encontrado a gotear DA sólo en cantidades muy bajas en fase de crecimiento
exponencial [18], y el DDA por lo tanto no se consideró pertinente. Debido a que la mayoría de copepoditos estaban vivos después de pastar en los
monocultivos de algas tóxicas, suponemos que ni DDA ni acumulada DA causaron mortalidad copepoditos.
Los organismos del estudio se utilizan aquí, Pseudo-nitzschia y calanus, proceder de la misma localidad, lo que significa que la calanus la
población puede tener un largo historial de exposición a la DA. Adaptación local de copépodos a toxinas ha sido estudiado en Acartia spp.
pastoreo en los dinoflagelados tóxicos y se ha demostrado que las poblaciones con una larga historia de exposición a toxinas muestran un mejor
rendimiento (tasa de ingestión y la producción de huevos) cuando se expone a las algas tóxicas, en comparación con las poblaciones ingenuas
sin previa
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la experiencia de las toxinas [44-48]. Si las poblaciones de zooplancton, por ejemplo, calanus copepoditos, están adaptados a las toxinas de algas, esto
puede hipotéticamente, dar lugar a una concentración de células de algas reducida o una duración más corta de una floración algal tóxico debido a
pastoreo, en comparación con presencia de zooplancton naïve ( es decir, menos reducción en pastoreo). Por otro lado, las poblaciones de zooplancton
adaptados para de algas toxinas pueden acumularse mayores cantidades de toxinas en sus cuerpos, y por lo tanto representan un riesgo mayor para la
acumulación de toxinas en la red de alimentos y el aumento aún más el riesgo de ASP en seres humanos. Algo similar se ha observado en la almeja Mya
arenaria donde una variación en la resistencia / sensibilidad a las toxinas paralizantes de moluscos producidos por
Alexandrium tamarense fue encontrado. Las almejas de áreas expuestas a las toxinas eran más resistentes a las toxinas y acumulan las
toxinas a tasas mayores que las almejas de áreas no expuestas, lo que indica una adaptación a la toxina [49].
La producción de pellets fecales confirma que los copepoditos pastaban en las algas. La producción de pellets en este estudio fue de
0,3 a 0,4 gránulos copepodito -1 marido -1, que es menor que el encontrado para
C. finmarchicus etapas copepoditos C4 y C5 [35]. Esto puede explicarse en parte por la acumulación de lípidos, que puede ser mayor en las
etapas de C3 y C4 que en C5, como se sugiere en [50], ilustrando así que las etapas más jóvenes de copepoditos están explotando los
alimentos ingeridos a un mayor grado que el etapas de mayor edad. Los lípidos son esenciales para el mecanismo de hibernación y el
suministro temprano para alimentar la maduración, desarrollo de las gónadas y la reproducción en la primavera [51,52]. El alto grado de
explotación alimento puede explicar con más detalle las tasas de ingestión específica de peso inferiores que se encuentran cuando los cálculos
se basaron en los sedimentos fecales egestion que en el aclaramiento de carbono, ya que los cálculos se basan en suposiciones hechas de
El presente estudio es el primero realizado en copepoditos como vectores potenciales para la DA en la cadena alimentaria y los resultados
muestran claramente que los copepoditos conservan DA. La cantidad de DA retenido, en relación con el peso corporal, varió de 48 g poli DA g
DW -1 cuando el pastoreo en P. obtusa, a 410 g poli DA g DW -1
cuando el pastoreo en P. seriata, para 39 h. Esto está en rango con las cantidades en Tammilehto et al. [ 18], donde el adulto calanus pastado
peso corporal de los copepoditos fue similar al tamaño de un adulto C. finmarchicus (~ 0,11 mg C poli -1). La cantidad de DA retenido por
copépodos, 68 ng DA poli -1 cuando el pastoreo en P. seriata durante 39 h, está en el rango de lo que ha sido encontrado previamente
para mujeres adultas; es decir, C. finmarchicus fue encontrado para acumular 17 ± 5 ng DA poli -1 cuando se alimenta dieta mixta de
tóxico P. multiseries y no tóxico P. pungens, y 42 ± 4 ng DA poli -1 con una dieta de P. multiseries durante 12 h [15]. Los resultados
también son similares a los valores encontrados en [18], es decir, 55 ± 10 ng DA poli -1 para C. finmarchicus pastoreo en P. seriata durante
P. obtusa a 16% ± 4% cuando el pastoreo en una mezcla de ambas especies. Esta cifra es ligeramente inferior a la de los adultos
calanus spp. donde los valores variaron de 37% ± 32% a 48% ± 20% en C. hyperboreus y
C. finmarchicus [ 18], pero en el rango de los hallazgos en [15], 12% ± 5% a 34% ± 19%. Estos niveles relativamente altos de DA retenidos
en copepoditos ilustran claramente un riesgo potencial para la acumulación de DA en la red de alimentos ártico durante una floración
calanus copepoditos fue mayor en DA por g de carbono que en el Pseudo-nitzschia Células. Además,
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los niveles encontrados en los copepoditos fueron mayores que las cantidades que se han encontrado en el krill (<45 g g DW krill -1) [ 43].
En este estudio, hemos visto que la producción de DA se ve reforzada por 3300%, y alcanzó ~ 13 pg celular DA -1
el día 8, similar a los niveles fue reportado por Tammilehto et al. [ 20] que encontró que la toxicidad de P. seriata
(La misma cepa, como se usa en este experimento) aumentó significativamente en presencia de hembras adultas de pastoreo C. finmarchicus y C.
hyperboreus. En el presente estudio, la cuota de células DA era el mismo en el matraz B (donde se separaron las células de los copepoditos)
como en el matraz A (donde las células estaban en contacto directo con los herbívoros) después de días 2, pero con un aumento retardado en
cuota de células DA durante los dos primeros días, mientras que en [20] P. seriata fue notablemente más tóxico en el matraz A que en el matraz B.
Esto puede explicarse por las mayores densidades de herbívoros utilizados en el presente estudio en comparación con [20], o que las señales
producidas por los copepoditos pueden consistir en moléculas más pequeñas que se difunden más fácilmente sobre la membrana. Además
podemos confirmar que las señales no fueron producidos por P. seriata células, como también se observó la inducción cuando P. seriata Las
células crecieron en agua de mar filtrada, donde copepoditos habían sido pasto solamente en Thalassiosira sp. Por lo tanto, el origen de las
señales deben ser los copepoditos. Recientemente, ocho compuestos intercalar, copepodamides, se aislaron e identificaron a partir de typicus
Centropages, Pseudocalanus sp. y finmarchicus calanus, y comprobar que es responsable de la inducción de la toxina Alexandrium minutum [ 57].
Los copepodamides diferían entre copepoditos, y la producción de toxinas en A. minutum se demostró que era compuesto específico. elevación
específica de la especie de la producción de la toxina ha sido previamente informado de dinoflagelados [32,38] y para nuestra cepa de P. seriata.
Los disparadores para la producción de DA inducida previamente se han encontrado para ser factores ambientales, por ejemplo, los niveles
de nutrientes, revisado en [11], y pH [23,58]. Pseudo-nitzschia se ha encontrado que aumenta la producción de toxinas cuando está estresado por
el agotamiento de silicato o fosfato de [21], y cuando los niveles de amonio o nitrato están repletos [22,59]. El medio de crecimiento en este
estudio fue 1/10 de medio L con amonio adicional claveteado en agua de mar filtrada desde la localidad (ver en detalle en Materiales y Métodos)
con el fin de suministrar las células con suficientes nutrientes para el crecimiento y la producción de DA y para evitar artefactos de condiciones de
nutrientes extremas. Los niveles de nutrientes iniciales medidas fueron, sin embargo, la baja tanto para silicato y fosfato, debido a los bajos niveles
de nutrientes en el agua de mar utilizada. Los niveles de silicato disminuyeron significativamente en los tratamientos y en los controles, pero el
aumento de la toxicidad de P. seriata sólo se observó en los tratamientos con copepoditos (Tabla 2 y el cuadro complementario S1) y no en los
controles, con exclusión de agotamiento de silicato como disparador para la producción de DA. Al final del experimento, los niveles de silicato
estaba por debajo de 1? M en el control, que es el nivel considerado previamente como el ozono, y donde
Pseudo-nitzschia spp. han sido previamente informado de inducir la producción de DA [21], sin embargo, en este estudio, el agotamiento de
silicato de no aumentar la producción de DA. Silicato fue significativamente mayor en los tratamientos que en los controles al final del
experimento, pero a nuestro conocimiento, el agotamiento de silicato nunca se ha demostrado que inhiben la producción de DA en Pseudo-nitzschia.
concentraciones de fosfato disminuyeron en el control, pero sigue siendo el mismo en los tratamientos, excepto en matraz A con 20
copepoditos, donde fosfato aumentó significativamente. Además, fosfato nunca fue por debajo de los 1 M agotan [21], y por lo tanto podemos
excluir el agotamiento de fosfato como factor de DA-inductor. Los resultados muestran niveles más altos de silicato, fosfato y nitrato en los
y nuestra hipótesis es que en parte se derivan a partir del contenido intracelular de nutrientes inorgánicos liberados en el medio cuando los
herbívoros aplastar los frústulos de silicato durante el pastoreo. Los copépodos pueden tener fugas de amonio y niveles altos (> 200? M)
Pseudo-nitzschia [ 22]. concentraciones de amonio fueron los mismos en el control y el tratamiento, excepto para los niveles más
altos en un tratamiento (matraz B, 20 copepoditos) (Tabla 2), y los niveles de amonio no estaban en el rango demostrado que causa
el aumento de DA-producción [22 ]. Por lo tanto, los niveles de amonio no pueden explicar la producción de DA inducida. Los niveles
altos de nitrato también pueden desencadenar la producción de DA [22,59]. Las concentraciones de nitratos fueron
significativamente mayores en los tratamientos que en el control al final del experimento en los experimentos de inducción. La fuente
del nitrato más probable origina a partir de la adición de células a la A-matraces en el día 3. La entrada de las células puede haber
resultado en la adición de nutrientes a niveles más altos que el medio añadido a los controles 1/10, como la adición se basó en una
mezcla de un décimo medio de células de un medio de cultivo completo. Pseudo-nitzschia células cuando se aplastan durante el
pastoreo. Además, el nitrato podría proceder de los copepoditos a través de la nitrificación que se producen en el caparazón de los
animales, un fenómeno que no es poco común entre los invertebrados acuáticos [60]. Las excreciones de amonio de los copepoditos
serían una fuente de amonio para las bacterias oxidantes de amoníaco [61]. Para apoyar esta hipótesis un aumento en el nitrógeno
se ha detectado en la incubación de morir de hambre C. hyperboreus de la misma localidad (Peter Stief, comunicación personal) [62].
Cabe señalar que los niveles de nitrato en el inicio de tanto el experimento de inducción 39 h y el experimento de pastoreo estaban
en rango con la concentración final del experimento de inducción de ocho días, y como el último controla experimento y
concentraciones finales tratamiento hicieron no diferir a pesar de los diferentes niveles de DA, que por lo tanto excluimos nitrato
como un disparador.
Los estudios realizados sobre la población natural han demostrado que bajo silicato de Si (OH) 4: correos 4 y Si (OH) 4: NO 3 relaciones
correlacionados con alta DA-producción, lo que sugiere limitación silicato causando la producción de toxina [63]. Sin embargo, en la misma
localidad, [64] informaron de correlaciones entre bajas proporciones de Si (OH) 4: correos 4-3 y no 3- + NO 22-): correos 43- correlacionado con la mejora en
la producción de DA, pero baja Si (OH) 4 :( NO 3- + NO 22-) proporciones no lo hicieron. Estos estudios son en parte de acuerdo con los resultados de
los resultados de laboratorio que muestran que el estrés de sílice aumenta la producción de toxinas en Pseudo-nitzschia. Otros estudios han, sin
embargo, no se detecta ninguna correlación con las concentraciones ambientales de los nutrientes y la producción de DA [65,66]. Además, la
producción de DA en población natural de Pseudo-nitzschia se ha medido cuando los niveles de nutrientes donde repleta [67]. En el presente
estudio, los niveles de nutrientes del agua de mar local no estaban disponibles antes de los experimentos y no dentro de la relación de Redfield.
Tanto en el tratamiento y el control, los niveles de nutrientes estaban más cerca de la relación sugirió para provocar la producción de DA; no
obstante, DA no se indujo en los controles. Nuestros resultados, por tanto, no están de acuerdo con la anterior en experimentos de laboratorio,
y la divergencia entre los estudios de campo demuestra aún más claramente que hay una falta de una fuerte relación entre el nivel de los
niveles de nutrientes y la producción de DA en el campo. Se necesitan estudios sobre la interacción de los factores que inducen la producción
de DA para mejorar nuestra comprensión de los factores que inducen la producción de DA en el campo.
Los niveles de toxina celular en el presente estudio fueron más altos que visto anteriormente en algunos experimentos de laboratorio con P.
seriata, donde por ejemplo, fosfato como el factor ozono resultó en un máximo de
de células DA 2,9 pg -1, pero fueron comparables a los niveles menores de agotamiento de silicato se produjeron max las células
de células DA 14,7 pg -1 [ 22]. Los niveles de DA inducidos durante la fase de crecimiento exponencial están dentro del
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gama ve en P. seriata en el campo, por ejemplo, una concentración de células DA hasta 21 pg -1 se informó en [68] en aguas danesas.
concentraciones similares se han medido a partir danés, escocés y cepas de Canadá, que produjo las concentraciones de DA de
respectivamente [69,70]. Los niveles de DA son aún más en el intervalo encontrado en el campo para la otra
Pseudo-nitzschia especies por ejemplo, 0,1-78 pg celular -1 en P. australis [ 71], 7 - 75 células -1 en muestras de campo que comprende principalmente P.
experimento o entre los tratamientos y los controles. Por lo tanto, pH, así como las concentraciones de nutrientes pueden excluirse como
P. seriata y P. obtusa.
Nuestra intención inicial era usar P. obtusa como una cepa de control no tóxico para explorar el efecto de la dieta tóxica en el
copepoditos. P. obtusa ha sido previamente dado negativo para DA durante diferentes fases de crecimiento, así como a niveles de pH desde
8,0 hasta 9,1 [58,73]. Las pruebas iniciales mostraron que P. obtusa no produjo DA en la actualidad los niveles de detección, pero,
sorprendentemente, se reveló ser toxigénica cuando inducida por copepoditos. Si P. obtusa produce simplemente DA a niveles inferiores la
producción límite de detección y la toxina se ve reforzada por la inducción, o si la producción de toxina se cerró completamente antes de la
inducción y la producción se puso en marcha por la inducción, no se puede determinar en el presente estudio y necesita además atención,
así como la posibilidad de que otra Pseudo-nitzschia especies son productoras de toxinas cuando se expone a los herbívoros.
calanus etapas copepoditos C3 y C4 pastan en tóxico Pseudo-nitzschia y retenido altos niveles de la toxina, lo que sugiere que los copepoditos
son capaces de tolerar DA y actúan como vectores de DA niveles para tróficos más altos, lo que plantea una amenaza para la cadena alimentaria
marina ártico y los humanos explotarlo. La presencia de copepoditos pastoreo indujo la producción de DA en tanto Pseudo-nitzschia especies, lo
que sugiere que la producción de DA por Pseudo-nitzschia puede ser un mecanismo de defensa contra el pastoreo, sin embargo, en este estudio
se encontró ningún efecto sobre la tasa de pastoreo. Una respuesta inducida también se produce cuando la copepoditos previamente habían sido
pasto de otras especies de diatomeas, lo que demuestra que las señales no se originan a partir Pseudo-nitzschia Células. Los resultados de
ambos experimentos muestran que la respuesta inducida en la producción de DA no es causado por cambios en los niveles de nutrientes o pH,
pero sugieren que las señales transmitidas por el agua se originan a partir de los copepoditos. Por último, el presente estudio es el primer informe
de
P. obtusa ser un productor de toxina Pseudo-nitzschia especies, la 15a conocido productor DA de esta genus.Copepods, incluyendo copepoditos,
constituyen un enlace imperativo, la transferencia de energía desde los productores primarios a niveles tróficos superiores, en las redes
alimentarias marinas y las consecuencias de un aumento del aumento de 3.300% en la producción DA debido a pastoreo de copepoditos pueden
ser profundas de la cadena alimentaria marina, con mayores consecuencias para la salud humana y la economía.
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4. Materiales y Métodos
4.1.1. zooplancton
Mesozooplancton se recogió de Disko Bay (69 ° 14 'N, 53 ° 23' W), West Groenlandia, en junio
2013, desde el 100 m superior utilizando una red WP-2 (200 m). calanus en etapas C3 y C4 fueron identificados por el número de urosome
somitas y recogido individualmente en placas de Petri colocadas en bloques de hielo utilizando microscopios estéreo (Nikon SMZ-1B y Leica Wild
M3b). Los copepoditos se mantuvieron en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas en 0,22 micras agua de mar filtrada y se
alimentaron con Thalassiosira sp. Antes de los experimentos, los copepoditos se mueren de inanición durante 24 h. El contenido de carbono de los
copepoditos (C) se calculó a partir de una regresión longitud / peso usando la ecuación dada para el período de post floración; C = 0,0044 × PL 3,57,
donde PL es prosoma longitud (Tabla 3). El peso seco se calculó suponiendo que el peso relación de carbono a la masa seca para ser 0,60 [53].
Tabla 3. El tamaño y el contenido de carbono de los organismos de estudio. longitud de la célula y la anchura (m), el volumen celular
(micras 3), y el contenido de carbono (celular pg C -1) para obtusa pseudo-nitzschia y P. seriata.
promosome Longitud (mm) y peso de carbono de los copepoditos, n es el número de células / individuos
medidos y los valores se dan en media ± SD.
Pseudo-nitzschia Longitud de la célula (m) Cell Anchura (m) Volumen de la célula (micras 3) Contenido de Carbono (célula pg C -1)
P. obtusa n
33,5 ± 3,2 4,2 ± 0,5 489 ± 149 57.3
= 23
P. seriata n
49,0 ± 3,4 5,4 ± 0,8 1.163 ± 383 137,1
= 23
El contenido de carbono por
calanus Prosoma longitud (mm)
individuo (cop mg -1)
Para los cálculos, la tasa de crecimiento del fitoplancton en los controles se calculó usando un modelo exponencial y cambios en las
concentraciones de fitoplancton en el pastoreo fueron calculados a partir de [39]. tasa de ingestión se calculó como el número de artículos
alimenticios consumidos por cada grazer y el peso específico de la ingestión se estimó multiplicando el número de Pseudo-nitzschia células
ingeridos por el contenido de carbono celular y dividiéndolo por el peso corporal medio de carbono de copepoditos. Para las ecuaciones en
Al final del experimento, los pellets fecales se contaron y el tamaño estimado. La anchura de
> 20 bolitas fecales por tratamiento y se midieron la longitud> 30 bolitas fecales por réplica, y sólo gránulos que eran al menos 3 × más largo
que ancho fueron incluidos. volumen pellet fecal se calculó asumiendo una forma de cilindro y el contenido de carbono se estimó mediante la
aplicación de un volumen en un factor de conversión de carbono de 0,043 pg C micras -3 [ 54]. producción de pellets fecal específica (SPP) se
calculó de acuerdo con [54] utilizando el número de bolitas fecales, el volumen promedio de los pellets fecales y el volumen de pellets a factor
de conversión de carbono. ingestión-peso específico se calcula a partir de la producción de pellets fecal, es decir,
egestión y eficiencia de asimilación followin g [ 55], y la eficiencia de asimilación se asumió que era
0,65 después de [56]. Todos los cálculos se llevaron a cabo siguiendo las ecuaciones tal como aparecen en [18].
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4.1.2. fitoplancton
Las cepas de P. seriata ( P5G3 cepa) y P. obtusa ( L4B4 cepa) se aislaron en cultivos clonales de Disko Bay (69 ° 14 'N, 53 ° 23' W), en abril
de 2010 y en 2012 Abril, respectivamente, mediante el aislamiento de células individuales o cadenas en placas de micro pocillos, y después de
inocular la culturas en matraces de cultivo de tejidos. P5G3 Strain era conocido por ser una cepa tóxica de P. seriata, mientras P. obtusa fue
anteriormente sólo conocido como una especie no tóxicas [73]. P5G3 cepa es la misma cepa, como se usa en los experimentos anteriores en calanus
y Pseudo-nitzschia en la Bahía de Disko por Tammilehto et al. [ 18,20]. Antes de los experimentos, ambas especies se hicieron crecer en cultivos
de lotes a 4 ° C en L1-medio [74] bajo una intensidad de luz de 85! Mol fotones m -2 s -1, a un 18: 6 de luz: oscuridad ciclo utilizando lámparas
fluorescentes blancas frías. cuota de células de carbono se calculó utilizando el contenido de carbono medido de (P. multiseries 0,12 pg C micras -3)
siguientes [19] y relacionando esto con el volumen de la celda de P. seriata y P. obtusa. El volumen de la celda de Pseudo-nitzschia spp. se
calculó siguiente [23]: Volumen = (0,6 × L × W 2) + ( 0,4 × 0,5 × L × W 2), dónde L es la longitud de la célula y W es la anchura de la celda (Tabla 3).
Activamente natación copepoditos fueron ordenados a cabo en frascos de cultivo llenos de 0,22 micras agua de mar filtrada. se tomaron
submuestras triplicado de copepoditos para el análisis de DA, donde cada réplica contenía el mismo número de muestras, como se usa en los
matraces experimentales. Los copepoditos se enjuagaron y se filtraron sobre filtros GF / F usando vacío suave, y se congelaron a -20 ° C
concentraciones celulares de las diatomeas iniciales dirigidos se prepararon diluyendo las culturas de P. seriata y
P. obtusa con un volumen apropiado de 1/10 L1-medio. Las concentraciones de células inicial proporcionada copepoditos con saturar
suministro de carbono (> 400 mg CL -1) [ 75]. Para evitar artefactos de las concentraciones de nutrientes extremas, se usó 1/10 medio L1,
basado en 0,22 micras agua de mar filtrada con una salinidad de 36 cloruro de amonio adicional (0,1 ml de NH 500 mM 4 Cl L -1) se añadió al
medio para evitar grandes diferencias en las concentraciones de amonio entre tratamientos debido a amonio excretados por copépodos
[76]. agua de mar local se utilizó para los experimentos, y que eran por desgracia no es capaz de medir los niveles de nutrientes antes de
realizar el experimento, y por lo tanto los niveles iniciales de silicato y fosfato fueron menores de lo previsto. pH se midió utilizando un
WTW pH 3,110 pH-metro con un electrodo de SenTix 41 (un límite de detección del sensor de 0,01; dos calibración de punto) se tomaron
(WTW, Xylem), y por triplicado submuestras de 50 ml para la composición de nutrientes inorgánicos. Para la medición de la cuota de
células DA, por triplicado submuestras de 200 ml P. seriata y P. obtusa se tomaron de la final de cultivo para los experimentos, y se filtra
sobre filtros GF / F. muestras de nutrientes y muestras para análisis DA se almacenaron a -20 ° C hasta su análisis. Los nutrientes se
analizaron en el Instituto de Biociencia, Universidad de Aarhus en Dinamarca en una inyección de flujo auto-analizador, siguiendo [77].
análisis DA se llevaron a cabo por cromatografía líquida acoplada con espectrometría de masas tándem como se describe en detalles en
[18]. límite de detección para DA era 1 muestra ng -1. Todos los experimentos se realizaron a una temperatura de 4 ° C, y una intensidad de
luz de 100! Mol fotones m -2 s -1 y 12:12 luz: oscuridad ciclo usando bombillas fluorescentes blancos fríos. Los matraces experimentales
Los copepoditos fueron alimentados con cultivos de tóxico P. seriata, no tóxico P. obtusa, y una mezcla de ambas especies. Cada uno
de los tres que pastan tratamientos experimentales se llevaron a cabo en 720 matraces ml de poliestireno (Sarstedt) en cuatro réplicas con
12 copepoditos por matraz y se ejecutan en paralelo con los controles en 3 repeticiones de 39 h. La concentración celular inicial nominal era
de 4000 células ml -1 de
P. seriata y 5000 células ml -1 de P. obtusa, y 2000 células ml -1 de P. seriata además de 5000 células ml -1 de
P. obtusa en el cultivo mixto para ambos tratamientos y controles (Tabla 3).
Al principio y al final del experimento, las muestras para los nutrientes y DA, así como mediciones de pH se realizaron como se
describe en la Sección 4.4. Las submuestras para enumerar las concentraciones de células fueron tomadas cada 3 h, y el volumen
retirado se reemplazó con 0,22 m de agua de mar filtrada. Al final del experimento (39 h), se recogieron los copepoditos y pellets fecales
experimento de inducción se llevó a cabo en incubadoras especialmente diseñado, hecho de dos 720 matraces de cultivo tisular de
poliestireno mL conectados a través de dos aberturas (4.5 cm de diámetro) con una membrana de policarbonato de 2 m, ver detalles en
Tammilehto et al. [ 20]. La transmisión de colorante de alimentos a través de la membrana se midió en un escáner de sinergia (Biotek), y el
equilibrio de difusión fue de ~ 30% después de dos días, que coincide con el de difusión sobre una membrana similar en un establecer
hecha por Tang et al. [ 78]. El cambio del agua de membrana permitido entre los matraces pero el plancton permaneció en sus matraces
iniciales, denominadas A y B para los dos lados. Las células de P. seriata y copepoditos en concentraciones de 12 o 20 individuos fueron
inoculadas en matraz A, y sólo P. seriata en matraz B. La concentración celular inicial de P. seriata era de 3000 células ml -1. El experimento se
realizó en 4 réplicas y un control en 3 repeticiones (usando matraces individuales, 720 ml) durante ocho días.
Las submuestras para los recuentos de células (2 ml; fijo con 2% (concentración final) solución ácida de Lugol) y análisis DA
(200 ml) se tomaron en los días 0, 2, 5 y 8. El volumen muestreado se sustituyó
0,22 m filtran el agua de mar. En el día 3, 168 ml de P. seriata cultura de aproximadamente 7.000 células mL -1
se añadió en un matraz de A a suplemento para una cantidad sustancial de células pastado por los copepoditos y para asegurar la
copepoditos una cantidad suficiente de células para el pastoreo. Del mismo modo, se añadió 168 ml de 1/10 medio L1 a los controles
y matraz B. Nuevos controles en tres repeticiones fueron establecidos posteriormente para la medición de la tasa de crecimiento de las
células que habían sido añadidos a los tratamientos. Las células se originaron de una cultura basada en una mezcla de 1/10 medio y
las células cultivadas en medio completo L1. Al final del experimento (día 8), se midió el pH y se tomaron submuestras para la
enumeración de células, los nutrientes y los análisis de DA como se describe anteriormente. Los copepoditos se recogieron por
tamizado el contenido total a través de un tamiz de 200 micras para eliminar el fitoplancton y partículas fecales. Los copepoditos se
agua filtrada se preparó colocando> 70 copepoditos nadan activamente en 0,22 m (~ 6 L), se filtró el agua de mar con una cultura
unialgales de Thalassiosira sp. durante 24 h. Los copepoditos y los pellets fecales se retiraron mediante el uso de un tamiz de 50
a través de un filtro de 0,22! m. matraces experimentales con una concentración de células inicial de 4.000 células ml -1 de
P. seriata, se preparó usando esta agua filtrada utilizando 720 ml frascos de poliestireno. El experimento se llevó a cabo en cuatro
repeticiones y tres controles y se ejecuta en la rueda de plancton simultáneamente durante 39 h con el experimento de pastoreo (Sección
4.3).
4.6. Microscopía
Para la enumeración de las células de algas, una cámara Sedgewick-Rafter y un microscopio de luz invertida (Olympus CKX31 a
una magnificación de 100 x). Un mínimo de 400 células fueron contadas. bolitas fecales se contaron usando un microscopio estéreo
(Reichter en 16 × aumentos) y longitud x anchura de los pellets fecales se midió utilizando 40 × magnificación. Para las mediciones de calanus
La distribución normal de los datos se ensayó utilizando una prueba de Shapiro-Wilk y homogeneidad de las varianzas aplicando el test
de Levene. Las diferencias en el tiempo dentro de cada tratamiento fueron probados por ANOVA de medidas repetidas (RM ANOVA) y post
hoc análisis probada usando ajustes Holms-Sidak. Las diferencias entre las medias se analizaron utilizando ANOVA de una vía, una t- prueba o
un emparejado t- prueba. Si el conjunto de datos no pasó el supuesto de distribución normal, se utilizó una prueba U de Mann-Whitney o una
prueba de Kruskall-Wallis. Para las mediciones de nutrientes en la Tabla 2 y el cuadro complementario S1, los análisis estadísticos se
realizaron con emparejado t- prueba entre el inicio y el final, y t- de prueba entre el extremo de control y el extremo tratamientos. Los resultados
** para diferencia significativa desde el extremo de control. El nivel de significación utilizado fue de 0,05.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a la estación del Ártico en Qeqertarsuaq, Groenlandia y el líder científico Ole Stecher para proporcionar excelentes
instalaciones de investigación y ayuda de muchas maneras. Agradecemos a Abel Marca y Johannes Mølgaard para obtener ayuda con la
recogida de muestras, Lis Munk Frederiksen para el trabajo de campo y la asistencia con los experimentos. Agradecemos a Wolfgang
Drebing para la extracción de muestras y mediciones de toxinas y Dorottya Sarolta Wágner por asistir con medidas espectrofotométricas. El
financiamiento fue proporcionado por la Fundación Carlsberg (2012_01_0556) y concede DFF-1323 hasta 00258 del Consejo de
Investigación de Dinamarca a NL y una subvención dada desde: Botanisk FÖRENING; Konto af 1988 para Botaniske
mikroorganismeforskning a SH.
Contribuciones de autor
Sara Harðardóttir: diseñó el estudio, llevado a cabo los experimentos, enumeró las muestras, se analizaron los datos y
escribió el manuscrito.
Marina Pančić: Se lleva a cabo los experimentos, enumeró las muestras, se analizaron los datos y revisó el manuscrito.
Anna Tammilehto: diseñó el estudio, analizó los resultados y revisó el manuscrito. Bernd Krock:
análisis de toxina realiza y revisó el manuscrito.
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Eva Friis Møller: a realizar los análisis de nutrientes y revisó el manuscrito. Torkel Gissel
Nielsen: discutió los resultados, revisó el manuscrito.
Nina Lundholm: diseñó el estudio, llevado a cabo los experimentos, analiza los resultados y revisó el manuscrito.
Conflictos de interés
referencias
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© 2015 por los autores; licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido bajo
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