Collins C.H.

et al, 2006
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Tcnicas Bsicas de
Cromatografia

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-2016- Metablitos Vegetais: origem,

Baseado em Fundamentos de Cromatografia Maria Luiza Faria Salatino diversidade e aplicaes
C. H. Collins, G. L. Braga, P. S. Bonato, 2006.
Cromatografia em Camada
Delgada

Cromatografia em Coluna
HISTRICO
Mikhael Semenovich Tswett filho de imigrantes russos
nascido em Asti, Itlia.
"Clorofilas no mundo vegetal e animal" (Chlorophylls in the
plant and animal world) doutorado em cincias.
Descreve sua inveno para a separao de substncias
coloridas presentes em vegetais.

Botnico russo Tswett ao lado de sua "unidade cromatogrfica" em 1910

O prprio termo foi criado por ele:

Das palavras gregas chroma (cor) e graph (grafia)

Cromatografia (grafia das cores)

DEFINIO
Cromatografia um mtodo fsico-
qumico de separao dos componentes
de uma mistura, realizada por meio da
distribuio desses componentes em duas
fases, que esto em ntimo contato.
 Fase estacionria
Fase mvel: move-se sobre a fase estacionria
TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Cromatografia em Camada Delgada (Planar) - a fase estacionria colocada sobre uma
placa.
Cromatografia em Coluna - a fase estacionria colocada em um tubo cilndrico.
Preparativas: 6->50 mm;
Analticas: 2-6 mm;
Microdimetro: 1-2 mm;
Capilares: < 1 mm.
Dependendo do estado fsico da fase mvel pode-se ter:
Cromatografia gasosa: fase mvel um gs inerte.
*Cromatografia lquida: fase mvel um lquido.
Cromatografia supercrtica: fase mvel um vapor pressurizado em
temperatura e presso acima do ponto crtico.

*Cromatografia lquida: Clssica feita em colunas de vidro, sob presso atmosfrica.

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) utiliza-se colunas
metlicas (normalmente) e presses de fase mvel elevadas,
obtidas com o auxlio de uma bomba de alta presso.
Processos Fsicos da Cromatografia:

adsoro: fase estacionria = slido (ex.: slica, alumina).

partio (absoro): fase estacionria

lquido que se espalha sobre a superfcie de um suporte slido
e inerte (ex.: cromatografia em papel)
adere s paredes de um tubo cromatogrfico (*cromatografia
gasosa, cromatografia lquida de alta eficincia).
*na cromatografia gasosa, a fase estacionria se torna lquida na
temperatura de trabalho
Baseados principalmente em atraes bipolares (foras de Van
der Waals).
 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
(CCD - TLC)
Definio:
Consiste na separao dos componentes de uma
mistura por meio da migrao diferencial sobre uma
camada delgada de adsorvente retido sobre uma
superfcie plana.
Teve incio em 1938, mas somente na dcada de 1960 comeou a
ser largamente utilizada.
Vantagens:
Fcil compreenso e execuo;
Separaes rpidas;
Fcil repetio;
Baixo custo.
 Cromatografia em camada delgada (CCD ou TLC)
Cuba
cromatogrfica

Solvente (fase mvel) Solvente (fase mvel)

Waters Co.
Tempo Zero Depois de dez minutos

FATOR DE RETARDAMENTO ou FATOR DE RETENO RF

PARA CROMATOGRAFIA PLANAR

definido pela razo entre as distncias percorridas pela

dr
dm substncia e pela fase mvel.

... RF =dm/dr
Solvente
 A cromatografia em camada delgada uma
cromatografia de adsoro

Adsorvente polar (ex.: slica ou alumina): ter afinidade por

substncias polares.
Portanto:
Substncias apolares (ex.: hidrocarbonetos possuem
apenas C e H): no tero afinidade pelo adsorvente. Nessa
maneira, no sero retidas, deslocando-se com a fase mvel.

Substncias polares (ex.: substncias aromticas possuem

oxignio na molcula) : sero retidas pela fase estacionria
(adsorvente) polar, no se deslocando.
 Aplicaes:
Analtica ou Preparativa: dependendo da espessura da camada de adsorvente e
da quantidade de amostra a ser analisada.

ADSORVENTES
O mercado dispe de uma grande variedade de adsorventes que
podem ser adquiridos para a confeco de placas nos laboratrios, ou
sob a forma de placas prontas, nas quais os adsorventes so
espalhados em vrias espessuras (para cromatografia analtica ou
preparativa).

Dentre os mais usados esto a slica (SiO2), a alumina (Al2O3), a

celulose e a poliamida.
SLICA um dos adsorventes mais usados.
apresenta carter fracamente cido.
utilizada na separao de compostos lipoflicos como
cidos graxos, terpenoides, esteroides, alcaloides etc.
ALUMINA o mais usado depois da slica.
tem carter alcalino, mas existe no comrcio na forma
neutra ou cida.
utilizada na separao de compostos lipoflicos
ex.: alcaloides, hidrocarbonetos policclicos, aminas e
vitaminas lipossolveis.
CELULOSE tem sido empregada como suporte da fase estacionria
lquida em cromatografia de partio.
pode ser impregnada com alguns materiais
ex.: polietilimina, carboximetil, dietilaminoetil
empregada para separar nucleotdeos, protenas e
cidos nucleicos, substncias fenlicas.

POLIAMIDA sua utilizao vem crescendo, apesar de ser pouco

aderente ao vidro.
empregada com maior frequncia na separao de
fenis e cidos carboxlicos.
PONTOS IMPORTANTES A SEREM OBSERVADOS :
1. Placas pr-fabricadas: so mais uniformes e homogneas do que
as feitas no laboratrio, melhorando a separao e tornando os valores
de RF mais reprodutveis.
2. Colocao da amostra: exatamente na linha de partida, para no
ocorrem variaes nos valores de RF.
3. Seleo da fase mvel: o solvente ou mistura de solventes
usados como fase mvel devem ser escolhidos cuidadosamente, pois
vai haver uma competio entre as molculas da fase mvel e da
amostra pela superfcie do adsorvente. Assim, deve-se considerar a
natureza qumica das substncias a serem separadas e a polaridade da
fase mvel.
4. Dissoluo das amostras: as amostras devem ser dissolvidas em
solventes bastante volteis, que possam ser rapidamente eliminados
aps a aplicao, numa concentrao que varie de 0,1 a 1%. A aplicao
pode ser feita com pipeta automtica ou tubos capilares de vidro.
 5. Formas de desenvolvimento:
Cromatografia ascendente o mtodo mais utilizado a placa
colocada na cuba, quase na posio vertical, apoiada no seu fundo. A
fase mvel sobe por capilaridade. A cuba deve estar perfeitamente
vedada para evitar a evaporao do solvente para o meio, e dessa
maneira permitir que a cuba fique saturada com a fase mvel, o que
se consegue colocando papel de filtro molhado com a fase mvel nas
paredes da cuba, antes do desenvolvimento do cromatograma.
Cromatografia descendente o mtodo utilizado para cromatografia
em papel. Coloca-se a fase mvel num depsito existente na parte
superior da cuba cromatogrfica. No fundo da cuba coloca-se um
pouco do solvente para assegurar sua saturao. A parte superior do
papel submersa na fase mvel e a cuba fechada. A mancha
colocada na parte superior do papel.
 Desenvolvimento circular a placa (ou papel cromatogrfico)
fica na posio horizontal. A amostra depositada em um crculo ao
redor do centro, no qual aplica-se a fase mvel. As manchas
aparecem em crculos concntricos.

Tampa Tampa
Pina Cuba Cuba
para Fase mvel
sustentar
o papel Papel Papel

Solvente
para
Fase mvel manter a
saturao

Cromatografia ascendente Cromatografia descendente

Cromatografia circular
 6. Revelao: aps o desenvolvimento dos cromatogramas, evapora-
se o(s) solvente(s) e as placas so reveladas, a fim de tornar visvel as
substncias incolores presentes na amostra.
Visualizao pode ser feita por meio de:
mtodos fsicos - ex.: luz UV substncias fluorescentes .
Esse mtodo no destrutvel.
mtodos qumicos substncias so borrifadas sobre as
placas e depois aquecidas a 100-120oC
(ex.: vanilina-sulfrica). Esse mtodo
destrutvel.
mtodos biolgicos reaes enzimticas ou bacterianas
ex. teste de substncias antifngicas.
7. Documentao:
Fotografar as placas reveladas quimicamente.
Desenhar em folha de papel de seda ou papel vegetal.
 CROMATOGRAFIA EM COLUNA
(CC)
Cromatografia lquida clssica
Reproduo do experimento de
Tswett - separao de um extrato
de folhas de espinafre por
uma tcnica de adsoro
cromatografia em coluna aberta.

Iniciada nos primeiros anos do sculo XX

Fase estacionria (slida): colocada numa
coluna de vidro de dimetro variado;
Amostra: colocada no topo da coluna;
Fase mvel (eluente): passa atravs dela.
Pode ser usada para fins preparativos,
dependendo do tamanho da coluna.
Carregando a amostra 1o Passo 2o Passo
(Negra)
3o Passo

Fase mvel

Fase estacionria

Fase estacionria

Apenas uma coluna separou os trs pigmentos

Adsorventes: exs: slica gel, xido de alumnio, silicato de
magnsio, carvo ativo, celulose microcristalina.
O tamanho das partculas dos adsorventes para CC so
maiores que aquele para CCD (60-200 m).
Eluentes: so selecionados de acordo com o seu poder de
eluio.
Enchimento da coluna:
Por via mida: mistura-se a fase mvel ao adsorvente
at formar uma pasta. Preenche-se a coluna com essa pasta.
Coloca-se a amostra em soluo no topo da coluna (ex.:
separao de flavonoides em coluna de PVPP; eluente = metanol).
Por via seca: coloca-se o adsorvente na coluna. Coloca-
se a amostra no topo da coluna em mistura com um pouco
de adsorvente. Passa-se a fase mvel (eluente) (ex.: separao
de hidrocarbonetos de ceras epicuticulares em coluna de xido de
alumnio; eluente = hexano).
 CROMATOGRAFIA EM COLUNA
(CC)

Dependendo do estado fsico da fase mvel:

Cromatografia gasosa: fase mvel um gs inerte.
Cromatografia lquida: fase mvel um lquido.
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) utiliza-se
colunas metlicas (normalmente) e presses elevadas para a fase mvel,
obtidas com o auxlio de uma bomba de alta presso.
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)
Dcada de 1970 - avano considervel em CLAE.
ltimas dcadas - acoplamento com espectrmetro de massas .
Separa misturas de compostos semelhantes.
processada a temperaturas pouco acima da temperatura
ambiente: separa substncias termicamente instveis.
Utiliza colunas metlicas (normalmente) e presses elevadas
para a fase mvel, obtidas com o auxlio de uma bomba de
alta presso.

Caracterstica da amostra: ser solvel na fase mvel.

Mecanismo de separao: competio entre as molculas da
amostra e as da fase mvel pelos stios ativos da fase estacionria.
uma cromatografia de partio.
Eluio por gradiente: aumento da polaridade da fase mvel
devido a reteno da amostra pela fase estacionria.
 Coluna com fase estacionria
Cromatograma

Injetor
Injetor

Computador
(armazena os dados)

Solvente
(fase mvel) Amostra

Bomba de Detector
alta presso

Descarte

Esquema de um cromatgrafo lquido

 CLAE Analtico
CLAE Semi-preparativo
CLAE Preparativo
Solventes
(fase mvel)

Mdulo de
Cromatogramas dos extratos de acetato controle
de etila de duas amostras de prpolis
brasileiras, obtidos por CLAE com
deteco a 270 nm.

Computador Computador Bomba de

(armazena os dados) (armazena os dados) alta presso

Coluna com fase estacionria

Injetor

Detector

Cromatgrafo Lquido Analtico Agilent Technologies

 Cromatografia em Fase Gasosa
uma cromatografia de partio
Iniciou-se de forma acelerada na dcada de 1950.
Separa dezenas de substncias de uma mesma amostra.
Tcnica sensvel - Analisa pequenas quantidades de amostra.
Separa substncias volteis e termicamente estveis.

Fase estacionria slida coluna capilar com dimetro < 1 mm

e comprimentos de 25-30 m.
Fase mvel gs inerte (hlio, nitrognio, hidrognio, argnio).
Temperatura da coluna: constante -isotrmica
com variao (linear ou no) temperatura
programada
 Controlador da vaso
Regulador da presso

Sistema de injeo da amostra

Injetor
Sistema programao,
registro e tratamento
dos dados
Forno Sistema de
Coluna
deteco
Fonte do cromatogrfica
gs de
arraste Detector

Esquema de um cromatgrafo de fase gasosa

(retirado de Collins C.H. et al, 2006)
 Injetor automtico

Detector de Ionizao
de Chamas

Cromatogramas das fraes de clorofrmio de quatro amostras de prpolis

brasileiras, obtidos por cromatografia gasosa.

Sistema de
programao,
registro e tratamento
de dados Impressora

Forno para coluna

Detector de Massas

Interface do detector
de massas

Cromatgrafo a gs Agilent Technologies

Prtica 2 Anlise de pigmentos foliares por cromatografia em camada delgada
A. Extrao
1. Pegue folhas frescas de Tradescantia pallida var. purpurea (Commelinaceae) ou
Tradescantia zebrina (Commelinaceae) ou Cordyline terminalis (Asparagaceae) ou
Acalypha wilkesiana (Euphorbiaceae) e corte-as em tiras finas;
2. Transfira-as para um gral, adicione 15 mL de acetato de etila e 20 gotas de cido actico
glacial. Triture o material com pistilo;
3. Filtre o extrato para um tubo Falcon (de 50 mL), usando funil e algodo, tomando o
cuidado para que o resduo permanea no gral;
4. Trate o resduo com mais 10 mL do solvente anterior e filtre o extrato para o mesmo tubo.
Acrescente ao resduo, 2 vezes 10 mL de gua, triture, e filtre os extratos aquosos para o
mesmo tubo.

B. Separao e caracterizao dos pigmentos hidrossolveis e lipossolveis

1. Agite levemente o tubo. Separam-se duas fases: a inferior, aquosa, de cor rsea (A) e a
superior, de cor verde (B);
2. Transfira por meio de uma pipeta Pasteur, cuidadosamente, 4 mL da fase aquosa (A) para
um novo tubo Falcon (de 15 mL);
3. Acrescente ao tubo 30 - 40 gotas de uma soluo de NaOH 10% e agite;
4. Adicione agora, soluo anterior, 20 gotas de cido actico e agite.
C. Cromatografia
1. Com auxlio de uma pipeta automtica, deposite cuidadosamente 20 L (10 x 2 L) da
soluo B no ponto central de uma placa cromatogrfica a cerca de 1 cm da extremidade
inferior. Tome cuidado para que o dimetro do extrato na placa no exceda 0,5 cm;
2. Coloque cerca de 1 cm de uma mistura de hexano:acetato de etila (8:2) em um bquer;
3. Coloque a placa no bquer, e cubra com um vidro de relgio;
4. Acompanhe a ascenso do solvente, at chegar a 2/3 da placa. Retire a placa do bquer e
deixe evaporar o solvente;

Obtm-se uma zona amarela, superior, correspondente aos carotenoides, e duas verdes,
inferiores, correspondentes s clorofilas.

Responda:
a) As folhas no verdes fazem fotossntese?
b) Qual substncia responsvel pela colorao rsea da fase aquosa (A)?
c) O que aconteceu com a colorao da soluo A aps as misturas indicadas no item 3? Qual
a explicao para as reaes vistas acima?
d) Quais substncias so responsveis pela fase (B)?
Tradescantia zebrina - Commelinaceae Tradescantia pallida var. purpurea - Commelinaceae

Cordyline terminalis - Asparagaceae

Acalypha wilkesiana - Euphorbiaceae