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Apunte Teórico:
MICROSCOPÍA
2007
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MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO
Un microscopio óptico es un instrumento que consiste básicamente en un tubo
con lentes de aumento en ambos extremos.
El objeto a observar es atravesado con luz visible, que es refractada por las
lentes del microscopio y así se amplifica la imagen.
Permite visualizar estructuras pequeñas, cuyas dimensiones son inferiores al
límite del poder de resolución del ojo humano.
1) Parte mecánica:
Consta del pie, la columna o brazo, la platina, el tubo y los tornillos macrométrico y
micrométrico.
− El pie se encuentra en la base, suele tener forma de herradura y en él descansa el
resto del microscopio.
− La columna o brazo, ubicada sobre el pie, sirve de soporte a los demás accesorios y
debe tomarse de la misma cuando se desea trasladar el microscopio.
− La platina, ubicada en la parte media, de forma cuadrada o rectangular, soporta la
preparación y presenta un orificio en el centro que permite el paso de la luz; una
pinza de sujeción para el preparado y sobrepuesta a ella una platina mecánica que
permite mover la preparación a voluntad en dos direcciones (llamadas Norte-Sur y
Este-Oeste), mediante el movimiento de tornillos ortogonales ubicados sobre la
platina o pendientes de ella. Estos tornillos pueden funcionar independientemente o
ser de comando coaxial (estar sobre el mismo eje). La mayor parte de las platinas
presentan una escala y un nonio que facilitan la señalización de posiciones
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determinadas en la preparación. La escala presenta líneas marcadas a un milímetro
de distancia. El nonio es una escala corta que presenta 10 líneas divisorias que se
corresponden con 9 divisiones de la escala principal.
− El tubo sostiene al sistema óptico. En su parte superior se ubican las lentes oculares
que pueden ser una (en los microscopios monoculares) o dos (en los microscopios
binoculares). En su extremo inferior se ubica el revólver, que es una placa giratoria
que sostiene las lentes objetivos de distintos aumentos que pueden cambiarse al
girar el revólver.
− Los tornillos macrométrico y micrométrico se utilizan para efectuar el enfoque
movilizando el tubo o la platina según el tipo de microscopio. El primero efectúa un
ajuste rápido y grosero, y el segundo realiza un ajuste lento y preciso. Ambos
tornillos pueden estar separados o bien ser coaxiales (dispuestos sobre un mismo
eje).
2) Parte óptica:
- Objetivos:
Cada objetivo consiste en un conjunto de lentes que en realidad cumplen la
función de una sola. Este sistema sirve para corregir errores de observación que
derivarían del uso de una sola lente.
En los microscopios modernos es común que los objetivos sean parafocales, es
decir, que si se encuentra enfocado uno de ellos, al girar el revólver y cambiar por otro
objetivo, éste resulta prácticamente enfocado, siendo suficiente sólo una ligera
corrección con el micrométrico para lograr el enfoque perfecto.
En cada objetivo se pueden observar una serie de numeraciones grabadas que
indican:
a. Aumento
b. Abertura numérica
c. Espesor del cubreobjetos a utilizar,
en mm.
a. Aumento: puede ser variable (4X, 16X, 20X, 25X, 40X, 45X, 60X, 95X, 100X,
éstos dos últimos se utilizan como objetivos de inmersión). Respecto del aumento
hay que diferenciar:
1) Aumento primario: es el dado por el objetivo en sí.
2) Aumento total: es el que se obtiene multiplicando el aumento del ocular por el
del objetivo. Nos dice cuántas veces está amplificada la imagen que obtenemos
del material examinado.
3) Aumento útil: es el aumento total del microscopio cuando no excede de cierta
cantidad condicionada por la abertura numérica del objetivo. Significa que si el
aumento total supera el aumento útil la imagen obtenida es muy grande, pero
borrosa, sin definición. En los objetivos de tipo acromático el mayor aumento
útil posible es de mil veces la abertura numérica (A.N. * 1.000), mientras que en
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los objetivos más perfeccionados, como los apocromáticos o los de fluorita, el
límite de aumento útil es de 1. 500 veces la abertura numérica (A.N. * 1.500).
b. Abertura Numérica (AN): cada objetivo tiene un determinado poder de resolución
que se mide en términos de abertura numérica del objetivo. Cuando un objeto es
iluminado, la luz emerge de él formando un cono que penetra en la lente frontal de
un objetivo. Se lo denomina ángulo de abertura; y a la mitad de este ángulo de
abertura se lo llama ángulo x. El medio en el que el objetivo trabaja (aire, aceite o
agua) tiene un índice de refracción determinado al que designamos como N. La
abertura numérica se determina entonces del siguiente modo:
0.61 * λ
L (límite de resolución):
A.N .
0.61 = constante
λ = longitud de onda de la luz incidente
A.N. = abertura numérica
- Oculares:
Es un sistema de lentes que aumenta la imagen producida en el objetivo,
aumento que está grabado en la parte superior (4X, 5X, 6X, 8X, 10X, 15X y 20X,
siendo los más comúnmente usados los de 6X y 10X).
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- Condensador:
Es el tercer elemento de la parte óptica, constituido por una lente que concentra
los rayos de luz iluminando la preparación en la parte enfocada por el objetivo, de modo
que el campo visual presente una iluminación uniforme. Además proporciona al
objetivo un cono de luz adecuado en tamaño y naturaleza, para obtener óptimos
resultados en la observación.
El condensador presenta hacia uno o ambos lados un tornillo para subirlo o
bajarlo según las necesidades. Además presenta un diafragma semejante al de una
cámara fotográfica que deja penetrar sólo los rayos útiles y elimina los laterales que
generalmente molestan.
Antes de enfocar, el diafragma debe estar completamente abierto, graduándose a
continuación su abertura según los aumentos del objetivo. Con altos aumentos el
diafragma debe estar más abierto que con los bajos aumentos.
3) Sistema de iluminación:
Tipos de observación:
Por otro lado, una observación también puede ser seca o por inmersión:
Observación seca: se realiza sin colocar líquido alguno entre el cubreobjetos del
preparado y el objetivo.
Observación por inmersión: en ella se coloca entre el cubreobjetos y el objetivo una
gota de aceite de inmersión (con índice de refracción de 1.5, que es el del vidrio)
que mejora la imagen por aumento de la abertura numérica. De este modo, todos los
medios atravesados por la luz tienen un mismo índice de refracción. La imagen
obtenida es más luminosa y más clara. Para hacer inmersión se utiliza el objetivo de
mayor aumento (95X o 100X).
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Técnica de la inmersión:
Procedimiento
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Recomendaciones para el uso del microscopio óptico
1. Comience siempre las observaciones con el objetivo de menor aumento. Esto le dará
una visión integral del preparado y le permitirá seleccionar las mejores áreas o las de
especial interés, que luego observará con mayores aumentos.
2. La iluminación debe ser homogénea y de buena intensidad, pero no excesiva y
deberá modificarla de acuerdo con el objetivo que está utilizando.
3. Nunca acerque el objetivo al preparado si no está mirando por el costado del
microscopio. Así evitará la destrucción de muestras y lentes.
4. Siempre que haga una observación, ajuste el enfoque con el tornillo micrométrico,
aun cuando ya haya sido enfocado por otra persona previamente (es usual que
existan diferencias de enfoque entre un observador y otro).
5. Recuerde que el microscopio óptico otorga imágenes invertidas del objeto, por lo
tanto el movimiento que realice de la platina será inverso al corrimiento de la
imagen.
6. Todo dibujo que realice de la observación debe ser esquemático, respetando las
proporciones de los elementos que observa. Evite sobrecargarlo de detalles de cuyo
origen no está seguro (burbujas de aire, granos de colorante u otras imperfecciones
del preparado). Evite sombrearlo.
7. No siempre es ideal el máximo aumento.
8. Los portaobjetos y cubreobjetos deben estar limpios y secos.
9. Debe ser prudente con la cantidad de líquido de montaje que utiliza.
10. Cuando deba realizar un corte hágalo siempre lo más fino posible, así evitará la
superposición de capas.
11. Luego de su uso, limpie los objetivos con un paño.
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Observación de células epiteliales de la mucosa interna de la mejilla humana con
distintos tipos de microscopios ópticos (*). En b) con campo brillante (luz
transmitida), en c) con campo oscuro, en d) con contraste de fases y en e) con
interferencia diferencial de Nomarski. Los microscopios de contraste de fases y de
interferencia diferencial intensifican las diferencias de densidad óptica en distintas
regiones de la célula.
*Extraído de Solomon et al. 2001.
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MICROSCOPIO SIMPLE, ESTEREOSCÓPICO O LUPA
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MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
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Microscopio Electrónico de Transmisión
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Por medio de una bobina electromagnética, que hace las funciones de
condensador, los electrones se concentran en el plano donde se coloca el objeto.
La segunda bobina funciona como una lente objetivo y da una imagen
agrandada del objeto.
Esta es recibida por una tercera lente electromagnética que actúa como ocular o
lente de proyección, que aumenta la imagen que proviene del objetivo.
La imagen final se ve sobre una pantalla fluorescente y eventualmente se registra
sobre una placa fotográfica. Una cámara de televisión acoplada puede recoger también
la imagen y transferirla a un monitor, a una impresora de video o a un analizador digital
de imágenes.
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Consiste en:
- Un filamento de tungsteno que emite electrones y un ánodo que los atrae y
acelera.
- Bobinas deflectoras que desplazan el haz de electrones de manera tal que
exploran la superficie de la muestra mediante un barrido horizontal y otro
vertical.
- Los electrones llegan a la superficie de la muestra, interaccionan con átomos de
la misma, emitiéndose electrones secundarios de baja energía.
- La cantidad de electrones secundarios emitidos por cada punto es proporcional
al tipo de superficie (las hendiduras emiten menos electrones que las
proyecciones).
- Un detector colecta los electrones secundarios. Luego se produce una
amplificación y los electrones envían su impulso eléctrico a un monitor dando
distintos tonos (gris cuando llega regular cantidad de electrones, blanco cuando
llegan muchos y negro cuando llegan pocos), pudiéndose obtener luego
fotomicrografías.
Cabe recalcar que los electrones no atraviesan la muestra sino que interaccionan
con ella para que emita otros electrones. Por ello la muestra no presenta limitaciones de
tamaño ni de espesor. Además, toda la trayectoria de los electrones se cumple en un
tubo de alto vacío.
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MO
MET
MEB
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ESCALA LOGARITMICA DE LAS DIMENSIONES MICROSCÓPICAS
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Los fijadores más comúnmente utilizados son:
− FAA: es una mezcla de formol, alcohol etílico, ácido acético y agua.
− Farmer: es una mezcla de alcohol etílico absoluto y ácido acético glacial.
− Carnoy: es una mezcla de alcohol etílico 96º, ácido acético glacial y cloroformo.
CORTES DE MUESTRAS
Orientación:
Los cortes de muestras cilíndricas (tallo, raíz) pueden realizarse en los siguientes
sentidos:
Tipos de corte:
1. Corte a mano libre o a mano alzada: se realizan con hoja de afeitar o navaja. Se
utilizan para observaciones rápidas y sin mucho detalle pues su espesor
generalmente es mayor de 20 µm. Se puede efectuar directamente sobre el material
o bien utilizando médula de saúco o hinojo, o trozos de raíz como la zanahoria, que
actúan como soporte del material acortar.
2. Cortes con micrótomo de mano: poco usado actualmente pues con él se logran
cortes semejantes en espesor a los cortes a mano libre. Consta de una platina circular
en cuyo interior existe una pinza de sujeción que actúa mediante un tornillo exterior
y en la que se ubica el elemento a cortar. Mediante otro tornillo se coloca a nivel de
platina el objeto a cortar y luego se lo hace sobresalir de acuerdo al espesor que se
desea obtener, mediante la escala ubicada en el pie del micrótomo. El corte se
efectúa con navaja bien afilada, realizando primeramente un corte de limpieza y
luego los definitivos.
3. Cortes con micrótomo de cuchilla metálica: se obtienen cortes de entre 5 y 20 µm
de espesor según el tipo de micrótomo, pudiéndose obtener cortes en serie con
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espesor controlado. El material a cortar puede ser fresco o fijado, blando o duro
(madera), incluido o no en parafina, según las características del micrótomo.
Entre ellos se encuentran:
a. Micrótomo de deslizamiento.
b. Micrótomo de congelación.
c. Micrótomo rotario o Minot.
4. Cortes con ultramicrótomo: emplea cuchillas de vidrio o diamante y permite
obtener cortes de 750 Å a 1µm de espesor. Se utilizan para efectuar observaciones
con Microscopio Electrónico de Transmisión.
PREPARADOS
COLORACION
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− Verde Jano: tiñe mitocondrias de verde brillante y las paredes celulares de verde.
− Azul de anilina: tiñe la calosa.
− Floroglucinol: tiñe la lignina.
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colorantes histológicos, al combinarse selectivamente con determinadas regiones del
espécimen
Para la preparación del material a observar con MEB, los pasos son:
- Fijación
- Deshidratación: también es necesaria para evitar que el alto contenido de agua de los
materiales biológicos entre en ebullición al colocarlos en el alto vacío.
- Secado
- Adhesión a un soporte.
- Metalización de la superficie de la muestra, con una delgada capa de oro-paladio o
de oro, efectuado en alto vacío en aparatos de evaporación. Este paso es necesario
ya que el material biológico no emite electrones al ser irradiado y mediante la
metalización se logra que la superficie de la muestra quede eléctricamente
conductora.
Bibliografía:
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Características MO LUPA MET MEB
Lámpara de Lámpara de Filamento de Filamento de
Fuente de
incandescencia incandescencia tungsteno tungsteno
iluminación
(fotones) (fotones) (electrones) (electrones)
Directas,
Invertidas,
tridimensionales Directas,
planas y Directas, planas
Proporciona y tridimensionales
policromáticas y
imágenes (dependiendo de la policromáticas y
(dependiendo de la monocromáticas
muestra y/o
muestra y/o coloración
monocromáticas
coloración empleada)
empleada)
Refracción de
Imagen dada Reflexión de Dispersión de Dispersión de
rayos
por rayos luminosos electrones electrones
luminosos
Límite de
0,25 µm 3 µm 1,4 a 3 Å 60 Å
resolución
Longitud de
550 nm 550 nm 0,005 nm 0,005 nm
onda empleada
Material
Vivo o muerto Vivo o muerto Muerto Muerto
biológico
FAA Tetróxido de
Fijadores Faramey - osmio y -
Carnoy aldehídos
Gelatina-
Medios de glicerina
- Resinas Epoxi -
inclusión Bálsamo de
Canadá
Ultramicrótomo
Aparatos para
con cuchilla de
efectuar los Micrótomo - -
cristal o de
cortes
diamante
Espesor de los 50 – 100 nm
5 – 20 µm - -
cortes (hasta 1000 nm)
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