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1. Definicin:
En la RT-PCR, se retrotranscribe una hebra de ARN en ADN
complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa
inversa o transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica mediante
una PCR tradicional. El trmino PCR en transcripcin reversa no debe confundirse
con la PCR en tiempo real, tambin denominada PCR cuantitativa (Q-PCR), que en
ocasiones, por una mala traduccin del ingls, se abrevia de la misma manera (RT-
PCR, por Real Time-PCR).
Una de las caractersticas ms importantes es que en el proceso de RT-PCR, el
ADNc generado ya no lleva los intrones que s tendra el ADN original. De este
modo, al expresar el ADNc producto de la RT-PCR, se generar un ARNm formado
exclusivamente por exones. Esto ha permitido darle a esta tcnica uno de sus usos
ms importantes: insertar genes eucariota en organismos procariota.
2. Componentes de la RT-PCR:
Oligo dT:
Los cebadores Oligo (dT) consisten en un tramo de 12-18 desoxitimidinas
que se hibridan con colas poli (A) de ARNm eucariotas, que constituyen solo
1-5% del ARN total. Estos cebadores son la eleccin ptima para construir
bibliotecas de ADNc a partir de ARNm eucariotas, clonacin de ADNc de
longitud completa y amplificacin rpida 3 'de extremos de ADNc (RACE 3').
Cebadores Aleatorios:
Los cebadores aleatorios son oligonucletidos con secuencias de bases
aleatorias. A menudo tienen una longitud de seis nucletidos y suelen
denominarse hexmeros aleatorios, N6 o dN6. Debido a su unin aleatoria
(es decir, sin especificidad de plantilla), los cebadores aleatorios pueden
reasociarse potencialmente con cualquier especie de ARN en la muestra. Por
lo tanto, estos cebadores pueden considerarse para la transcripcin inversa
de ARN sin colas poli (A). Si bien los cebadores aleatorios ayudan a mejorar
la sntesis de ADNc para la deteccin, no son adecuados para la
transcripcin inversa de longitud completa del ARN largo.
Los cebadores especficos de genes :
Ofrecen el cebado ms especfico en la transcripcin inversa. Estos
cebadores estn diseados en base a secuencias conocidas del ARN diana.
Los cebadores especficos de gen se usan comnmente en aplicaciones de
RT-PCR de un paso
c) dNTPs:
Los dNTP generalmente deben estar a 0,5-1 mM cada uno, preferiblemente
a concentraciones equimolares.
d) Agua DEPC: