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RT-PCR

1. Definicin:
En la RT-PCR, se retrotranscribe una hebra de ARN en ADN
complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa
inversa o transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica mediante
una PCR tradicional. El trmino PCR en transcripcin reversa no debe confundirse
con la PCR en tiempo real, tambin denominada PCR cuantitativa (Q-PCR), que en
ocasiones, por una mala traduccin del ingls, se abrevia de la misma manera (RT-
PCR, por Real Time-PCR).
Una de las caractersticas ms importantes es que en el proceso de RT-PCR, el
ADNc generado ya no lleva los intrones que s tendra el ADN original. De este
modo, al expresar el ADNc producto de la RT-PCR, se generar un ARNm formado
exclusivamente por exones. Esto ha permitido darle a esta tcnica uno de sus usos
ms importantes: insertar genes eucariota en organismos procariota.
2. Componentes de la RT-PCR:

a) ADN molde: El ARN sirve como plantilla en la transcripcin inversa.

b) Cebadores: Para iniciar la transcripcin inversa, las transcriptasas


inversas requieren un oligonucletido de ADN corto llamado cebador
para unirse a sus secuencias complementarias en la plantilla de ARN y
servir como punto de partida para la sntesis de una nueva cadena.
Dependiendo de la plantilla de ARN y las aplicaciones posteriores, hay
cebadores de tres tipos bsicos disponibles: cebadores de oligo (dT),
cebadores aleatorios y cebadores especficos de genes.

Oligo dT:
Los cebadores Oligo (dT) consisten en un tramo de 12-18 desoxitimidinas
que se hibridan con colas poli (A) de ARNm eucariotas, que constituyen solo
1-5% del ARN total. Estos cebadores son la eleccin ptima para construir
bibliotecas de ADNc a partir de ARNm eucariotas, clonacin de ADNc de
longitud completa y amplificacin rpida 3 'de extremos de ADNc (RACE 3').

Cebadores Aleatorios:
Los cebadores aleatorios son oligonucletidos con secuencias de bases
aleatorias. A menudo tienen una longitud de seis nucletidos y suelen
denominarse hexmeros aleatorios, N6 o dN6. Debido a su unin aleatoria
(es decir, sin especificidad de plantilla), los cebadores aleatorios pueden
reasociarse potencialmente con cualquier especie de ARN en la muestra. Por
lo tanto, estos cebadores pueden considerarse para la transcripcin inversa
de ARN sin colas poli (A). Si bien los cebadores aleatorios ayudan a mejorar
la sntesis de ADNc para la deteccin, no son adecuados para la
transcripcin inversa de longitud completa del ARN largo.
Los cebadores especficos de genes :
Ofrecen el cebado ms especfico en la transcripcin inversa. Estos
cebadores estn diseados en base a secuencias conocidas del ARN diana.
Los cebadores especficos de gen se usan comnmente en aplicaciones de
RT-PCR de un paso

c) dNTPs:
Los dNTP generalmente deben estar a 0,5-1 mM cada uno, preferiblemente
a concentraciones equimolares.

d) Agua DEPC:

El agua utilizada en las reacciones de transcripcin inversa debe estar libre


de nucleasas.

e) Enzima transcriptasa ( AMV o MMVL)


La mayora de las transcriptasas inversas utilizadas en biologa molecular se
derivan del gen pol del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) o del virus de la
leucemia murina de Moloney (MMLV). La transcriptasa inversa de AMV posee una
fuerte actividad de RNasa H que degrada el ARN en el ARN: hbridos de ADNc,
dando como resultado fragmentos de ADNc ms cortos (<5 kb).La transcriptasa
inversa MMLV es una enzima de 75 kDa con una temperatura de reaccin ptima
alrededor de 37 C. Aunque es menos termoestable que la transcriptasa inversa
AMV, la transcriptasa inversa MMLV es capaz de sintetizar un ADNc ms largo (<7
kb) con una mayor eficacia, debido a su menor actividad de RNasa H.