RT-PCR

1. Definicin:
En la RT-PCR, se retrotranscribe una hebra de ARN en ADN
complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa
inversa o transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica mediante
una PCR tradicional. El trmino PCR en transcripcin reversa no debe confundirse
con la PCR en tiempo real, tambin denominada PCR cuantitativa (Q-PCR), que en
ocasiones, por una mala traduccin del ingls, se abrevia de la misma manera (RT-
PCR, por Real Time-PCR).
2. Componentes de la RT-PCR:

Componentes para la reaccin RT-PCR

1. ARN molde.
2. Cebador (pueden ser Oligo dT, aleatorios o especficos a una
secuencia).
3. dNTPs.
4. Agua DEPC.
5. Enzima transcriptasa ( AMV o MMVL)
6. Buffer + DTT + Inhibidor de ARN asa
7. MgCl2
Componentes para la PCR:
1. Cebador
2. dNTPs
3. Buffer Tris-HCl
4. MgCl2
5. Taq polimerasa.
6. ADNc
Equipos y materiales:

1. Termociclador
2. Camara de bioseguridad
3. Guantes
4. Micropipetas
5. Microtubos

3. Etapas

a) Hibridacin del cebador.

b) Polimerizacin del ADN.
c) Inactivacin de la enzima.
 4. Protocolo de la RT-PCR
RT-PCR puede ser llevado a cabo por el protocolo de RT-PCR de un paso o el
protocolo de RT-PCR de dos pasos.

A. RT-PCR de un solo paso

1. Seleccione un kit de RT-PCR de un paso, que debe incluir una mezcla de la

transcriptasa reversa y el sistema PCR como una relectura de la polimerasa
Taq ADN polimerasa.
2. Obtener todos los materiales necesarios, equipos e instrumentos (kits deben
incluir una lista detallada de artculos necesarios).
3. Preparar una mezcla de reaccin, que incluir dNTPs, cebadores, RNA
molde, enzimas necesarias y un tampn.
4. Aadir la mezcla a un tubo PCR para cada reaccin. A continuacin aadir el
RNA molde
5. Colocar los tubos de PCR en el termociclador para comenzar el ciclo. El
primer ciclo es transcripcin reversa para sintetizar el cDNA. El segundo
ciclo es la desnaturalizacin inicial. Durante este ciclo de la transcriptasa
reversa es inactivada. Los ciclos siguientes (40 a 50) son el programa de
amplificacin, que consiste en tres pasos: (1) desnaturalizacin, (2)
recocido, (3) alargamiento.
6. Los productos de RT-PCR pueden analizarse entonces con electroforesis en
gel

B. RT-PCR de dos pasos

Paso uno

1. Combinan la plantilla de RNA, cartilla, mezcla de dNTP y agua libre de

nucleasas en un tubo de PCR.
2. Agregar inhibidor de RNasa y transcriptasa reversa al tubo de PCR.
3. Colocar los tubos en el termociclador para un ciclo que incluye hibridacin,
elongacin y luego inactivar la transcriptasa reversa.
4. Proceder directamente a la PCR o almacenar en hielo hasta que se puede
realizar PCR.
Paso dos

1. Aadir una mezcla maestra (que contiene tampn, mezcla de dNTP,

MgCl2Taq polimerasa y agua libre de nucleasas) a cada tubo PCR.
2. Aadir el primer apropiado.
3. Colocar los tubos en el termociclador durante 30 ciclos del programa de
amplificacin, que incluye tres pasos: (1) desnaturalizacin, (2) hibridacin,
(3) alargamiento.
4. Los productos de RT-PCR pueden analizarse entonces con electroforesis en
gel.