Tesis102 PDF

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLTICAS Y DETERMINACIN DE PATGENOS

HUMANO Escherichia coli y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGNICOS
DOMICILIARIOS EN COMPOSTAJE
LEIDY ANDREA CEPEDA PATIO

SANDRA PATRICIA VALENCIA CRDENAS
Directora:
ADRIANA MATIZ VILLAMIL
BACTERIOLOGA M. Sc.
Codirectora:
MARA MERCEDES MARTNEZ
MICROBILOGA M. Sc.

CARRERA MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOT D.C.
DICIEMBRE DE 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la resolucin No. 13 de julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada contrario al dogma y la
moral catlica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo por buscar verdad y justicia.

HUMANOS Escherichia coli y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGNICOS

Aprobado:
___________________________ _______________________
Dra. Adriana Matiz Villamil Dra. Mara Mercedes Martnez

Directora Coodirectora
__________________________ _______________________
Dra. Andrea Aguirre Dr. David Gmez

Jurado Jurado

HUMANOS Escherichia coli y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGNICOS

Aprobado:
_________________________________ ____________________________
Dra. ANGELA UMAA MUOZ.,M.Phil Dra. Janeth Arias

Decano Acadmico Facultad de Ciencias Directora Carrera de Microbiologa
A Dios por brindarme apoyo para alcanzar todas mis metas.
A mi mama por ser compaera y amiga por su apoyo y compaa durante
la elaboracin de este trabajo de grado
A mi papa por ser la inspiracin de todo lo que hago
A mis tios por la confianza y apoyo constante a pesar de la distancia
A mis amigas por su amistad y por compartir conmigo esta gran
experiencia
Leidy Andrea Cepeda Patio
A Dios por haberme acompaado en el transcurso de mi carrera. A mi

mami por darme apoyo en los momentos mas difciles y por infundirme
paciencia cuando cre que esto no sera posible. A mi papi por darme
ejemplo de no desfallecer y luchar por lo que se quiere. A mis amigos que
me brindaron una sonrisa y sus palabras en el momento justo. Por ltimo
a mis compaeros de laboratorio por su ayuda incondicional en los
momentos de desesperacin.
Sandra Patricia Valencia Crdenas.

AGRADECIMIENTOS
A Bioagrcola del Llano S.A. E.S.P., empresa de aseo de Villavicencio por la colaboracin
prestada durante el desarrollo de este proyecto.
A la Dra. Adriana Matiz directora del presente proyecto, por su dedicacin e infinita
paciencia, aportando sus conocimientos para el desarrollo de este trabajo.
A la Dra. Maria Mercedes Martnez codirectora del presente proyecto, por el aporte de sus
conocimientos y su paciencia para concluir con xito este trabajo.
A todos aquellos que de una u otra forma colaboraron con nuestro trabajo e hicieron
posible que este se llevara a cabo.
DICIEMBRE DE 2007
TABLA DE CONTENIDO
Pg.
1.-INTRODUCCIN 1
2.- MARCO TERICO 2

COMPOSTAJE 2
2.1.1 Beneficios del Uso del Compost 2
2.1.2 Factores de Importancia 3
Equilibrio carbono/nitrgeno 3
Temperatura 4
Humedad 5
pH 6
Aireacin 6
Tamao de partcula 7
Ambiente 7
Porcentaje de lquido efectivo (% LE) 7
2.2 PROPIEDADES FSICO QUMICAS DE LOS RESIDUOS COMPOSTABLES 8
2.2.1 Propiedades Fsicas. 8
2.2.2 Propiedades Qumicas. 8
2.3 ESTRUCTURA DE LPIDOS Y GENERALIDADES DE LAS LIPASAS 8
Lpidos simples 9
Lpidos complejos 9
2.4 LIPASAS 10
2.4.1 Mtodos de Determinacin de Lipasas 12
2.4.2 Enzimas Termoestables 12
2.4.3 Enzimas en el Tratamiento de Residuos 14
2.4.4 Importancia Industrial de las Enzimas Lipolticas 14
2.4.5 Microorganismos reconocidos Biotecnolgicamente como Productores de
Lipasas 16
2.5 IMPORTANCIA DE LOS INOCULANTES BIOLGICOS. 17
2.6 MICROORGANISMOS PATGENOS
19
3.- JUSTIFICACIN 21
4.- OBJETIVOS 23
4.1 Objetivo General. 23
4.2 Objetivos Especficos. 23
5.- METODOLOGA 24
5.1 REACTIVACIN DE CEPAS 24
5.2 FASE DE LABORATORIO 24
5.2.1 MUESTREO 24
5.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 25
5.2.2.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipoltica 25
5.2.2.2 Identificacin microscpica y macroscpica de las colonias 26
5.3 BANCO DE CLULAS PRIMARIO (Conservacin de Cepas) 26
5.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO 26
5.5 CURVAS DE CRECIMIENTO 28
5.5.1 Produccin del inculo 28
5.5.2 Fermentacin Discontinua 28
5.6 TCNICA COLORIMTRICA P-NITROFENIL PALMITATO PARA ACTIVIDAD
LIPOLTICA 28
5.6.1 Curva Patrn de p-nitrofenol 28
5.6.1.1 Evaluacin y estandarizacin cuantitativa de actividad lipoltica 29
5.6.1.2 Prueba preliminar de actividad enzimtica 29
5.7 DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS PATGENOS Escherichia coli y
Salmonella sp 31
5.7.1 Determinacin de microorganismos patgenos Salmonella sp 32
5.7.2 Determinacin de Escherichia coli 33
5.8 FASE DE CAMPO
34
5.8.1 Determinacin de pH y Temperatura 34
5.8.2 Anlisis Fsico Qumico de las muestras 34
6. RESULTADOS Y DISCUSIN 36
6.1. Procesamiento de las muestras 36
6.1.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipoltica 36
6.1.2 Identificacin macroscpica y microscpica de las cepas 38
6.1.3 Criopreservacin de cepas 40
6.1.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO 40
6.2 CURVAS DE CRECIMIENTO 42
6.3 CURVA DE CALIBRACIN 45
6.3.1 Actividad Lipoltica 45
6.3.1.1 Estandarizacin del tiempo de contacto entre sustrato y extracto crudo 45
6.3.1.2 Estandarizacin de diferentes concentraciones de sustrato 46
6.3.1.3 Estandarizacin con diferentes volmenes de extracto crudo 20 ul, 500 ul y 700 ul
49
6.4 Toma de muestras 51
6.4.1 Determinacin de pH y temperatura 52
6.5 ANLISIS DE MICROORGANISMOS PATGENOS Escherichia coli y Salmonella sp
55
6.5.1 NMP de Salmonella sp con medio Rappaport Vassiliadis semislido modificado 56
6.5.2 NMP Escherichia coli 59
6.6 ANLISIS FSICO QUMICOS 61
7.- CONCLUSIONES 64
8.- RECOMENDACIONES 65
9.- REFERENCIAS 66
Anexos 75
LISTA DE TABLAS
Pg.
Tabla 1. Tiempo y temperatura de eliminacin de patgenos comunes en

materiales orgnicos. 5
Tabla 2. Microorganismos productores de lipasas 17
Tabla 3.Tabla gua para la lectura indicadores de Presencia de Salmonella sp 32
Tabla 4 Cepas presuntivas lipolticas 37
Tabla 5. Identificacin macroscpica y microscpica de las colonias 39
Tabla 6. Promedio de resultados de las pruebas antagnicas 41
Tabla 7 a,b,c Promedio de No de colonias caractersticas en medio XLT4 y BS 57
Tabla 8. Promedio de resultados de Escherichia coli materias primas 60
Tabla 9. Promedio de resultados de Escherichia coli muestras finales 60
LISTA DE FIGURAS
Pg.
Figura 1. Mecanismos de accin de las lipasas (Arpigny y Jaeger, 2000). 11

Figura 2 a. Cepa aislada L1 38
Figura 2 b. Cepa aislada L2 38
Figura 2 c. Cepa aislada L3 38
Figura 3 a. Cepa L1 Bacilos Gram negativos 39
Figura 3 b. Cepa L2 Bacilos Gram negativos filamentosos 39
Figura 3 c. Cepa L3 Bacilos Gram negativos 40
Figura 4. Enfrentamiento de cepas lipolticas sin halo de inhibicin 41
Figura 5. Enfrentamiento de cepas lipolticas con las cepas del inculo 42
Figura 6. Curva de produccin de biomasa en funcin del tiempo Cepa L3 43
Figura 7. Curva de crecimiento Cepa L2 44
Figura 8. Tiempo de Contacto 46
Figura 9. Evaluacin de las diferentes concentraciones de sustrato 47
Figura 10. Curva de UL al 1 y produccin de biomasa en funcin del tiempo 47
Figura 11. Segunda evaluacin de diferentes concentraciones de sustrato 48
Figura 12 Curva UL al 1.5 y produccin de biomasa en funcin del tiempo 48
Figura 13. Estandarizacin de los diferentes volumenes de extracto crudo 50
Figura 14. Estandarizacin de los diferentes volumenes de extracto crudo 50
Figura 15. Conformacin de las pilas 52
Figura 16. Medicin de temperatura 52
Figura 17. Resultados de pH y temperatura vs tiempo durante el proceso de compostaje
de residuos orgnicos 53
Figura 18. Medio semislido Rappaport V con halo de aclaramiento 56
Figura 19. Medio XLT4 con colonias presuntivas. 57
Figura 20. Medio BS con colonias presuntivas 57
Figura 21. Resultados de bioqumicas para identificacin de Salmonella sp 58
Figura 22. Turbidez e indol positivo 59
Figura 23. Fluorescencia positiva 60
LISTA DE ANEXOS
Pg.
Anexo 1. Medio Leche- Almidn al 1% 77

Medio Lquido TSB 77
Medio Rappaport Vassiliadis Modificado 77
Medio Lecitina 78
Anexo 2. Promedios de Temperatura y pH de las 3 rplicas 79
Anexo 3. Preparacin de Buffer Fosfato Concentracin 1 M 83
Anexo 4. Curva Patrn p-nitrofenol 84
Anexo 5. Promedio de absorbancias de actividad enzimtica 85
Anexo 6. Recuentos de las cepas aisladas 89
Anexo 7. Resultados pruebas de antagonismo 90
Anexo 8. Pruebas Bioqumicas de las Colonias Positivas para Salmonellla sp 91
Anexo 9. Requisitos especficos de fertilizantes o abonos orgnicos minerales
Y enmiendas orgnicas segn NTC 5167 (Icontec 2004) 92
Anexo 10. Anlisis estadstico 97
Anexo 11. Metodologa 98
RESUMEN
La Empresa Bioagrcola del Llano S.A E.S.P ubicada en Villavicencio (Meta) ha venido
desarrollando desde el 2003 un plan integral en cuanto a la disposicin de residuos
slidos urbanos (RSU) generados en esta regin, como residuos de plaza, industria
pecuaria, cocinas, entre otros. Es por esto que, actualmente se llevan a cabo procesos de
transformacin de estos residuos mediante el compostaje aerbico, produciendo un
bioabono rico en nutrientes y de buenas condiciones segn la norma NTC 5167. Esta
empresa ha venido desarrollando un importante proyecto de aprovechamiento y
transformacin de residuos urbanos slidos mediante el proceso de compostaje
enriquecido con inoculantes microbianos termfilos, compuestos por 14 cepas amilolticas
y proteolticas.
Este proyecto de investigacin se fundamenta en el aislamiento de microorganismos

lipolticos, a partir de 3 replicas de pilas de compostaje de residuos orgnicos (plaza 55%,
poda, contenido ruminal y cascarilla de arroz). Igualmente se estandariz la tcnica que
permiti la evaluacin y determinacin de la actividad lipoltica generada por la cepa 3,
mediante el manejo de diferentes tiempos de contacto entre la enzima producida y el
sustrato (p-nitrofenil), como fueron 30 minutos y 60 minutos, as como tambin fueron
utilizados diferentes concentraciones de sustrato 0.08% (p/v), 0.5% (p/v), 1% (p/v), 1.5%
(p/v) y 2%(p/v).
Los resultados determinaron como tiempo ptimo de contacto 30 minutos pero en las
diferentes concentraciones de sustrato y volumen demuestra, no se presentaron
diferencias significativas. De la misma manera, la cepa 3 obtuvo UL del orden de 30.73UL
corroborando una actividad muy baja relacionada con su biomasa que fue de 30*10 9
UFC/ml. As mismo se llev a cabo un anlisis de microorganismos patgenos humanos
Escherichia coli y Salmonella sp al inicio y al final del proceso arrojando resultados
positivos al inicio y al final y un NMP de Salmonella sp < a 0.006473 NMP/4g.
Igualmente se hizo una caracterizacin fisicoqumica al producto obtenido (bioabono) en

Agrilab, el cual arrojo resultados de relacin C/N de 8 %, humedad de 42.03%, N 1.86%,
P 1.32%, K 2.53%; N orgnico 1.59% y metales pesados como Cobre 28.6 ppm y Zinc
118.3 ppm valores cercanos a lo exigido a la norma Icontec.
ABSTRACT
"Bioagrcola del Llano SA ESP" located in Villavicencio (Meta) has been developing since
2003 a comprehensive plan regarding the provision of municipal solid waste (MSW)
generated in this region, such as waste plaza, livestock industry, kitchens , among others.
That is why, now being carried out processing of this waste through aerobic composting,
producing a bioabono rich in nutrients and good conditions under the rule NTC 5176. The
company has been carrying out a major project for the use and conversion of municipal
solid waste through composting process enriched inoculators microbial thermophilic,
composed of 14 strains amilolityc and proteolityc.
This research project is based on the isolation of microorganisms lipollitycs, from the
assembly of 3 replicas of bacteria composting of organic waste (plaza 55%, pruning,
rumen contents and cascarilla). They also standardized technique that permitted the
evaluation and determination of the activity lipolityc generated by the strain 3, through
handling different times of contact between the enzyme and substrate produced (p-
nitrofenil), as were 30 minutes and 60 minutes, they were used as well as different
concentrations of substrate 0.08% (w / v), 0.5% (w / v), 1% (w / v), 1.5% (w / v) and 2% (w
/ v).
The results identified as optimum time to contact 30 minutes but in different concentrations
of substrate and volume shows there was no significant difference. In the same way, the
strain 3 obtained UL order 30.73 UL corroborating a very low related to biomass that was
30 * 109 CFU / ml. It also took out an analysis of human pathogens Escherichia coli and
Salmonella sp at the beginning and end of the process yielding positive results at the
beginning and end and an MPN Salmonella sp <a 0.006473 NMP/4g.
They also made a physicochemical characterization on the product (bioabono) Agrilab,

which results daring relationship C / N 8% moisture 42.03%, N 1.86%, P 1.32% K 2.53%,
organic N 1.59% heavy metals such as copper 28.6 ppm and zinc 118.3 ppm values near
what is required by Icontec.
1.-INTRODUCCIN
La generacin de residuos slidos municipales, vara en funcin de diferentes factores

asociados a los niveles de ingreso, hbitos de consumo, desarrollo tecnolgico y calidad
de vida de determinada poblacin, es por esto, que en la actualidad se busca una
eliminacin segura de dichos residuos para evitar problemas de salud pblica y ambiental.
La Empresa Bioagrcola del Llano S.A E.S.P. ubicada en Villavicencio (Meta) ha venido
desarrollando desde el 2003 un plan integral en cuanto a la disposicin de residuos
slidos urbanos (RSU) generados en esta regin, como residuos de plaza, industria
pecuaria, cocinas, entre otros. Es por esto que, actualmente se llevan a cabo procesos de
transformacin de estos residuos mediante el compostaje aerbico, produciendo un
bioabono rico en nutrientes y de buenas condiciones segn la norma NTC 5176 (Anexo
10). Este sistema ha sido optimizado, mediante el uso de un inoculante biolgico
acelerante, compuesto por 14 cepas nativas termoflicas con actividad proteoltica y
amiloltica (Galindo et al., 2005). Este inoculante ha sido evaluado con diferentes
porcentajes de materias primas utilizadas, en la bsqueda de la optimizacin del proceso
y por ende, en la calidad del producto obtenido (bioabono), gracias a la actividad
enzimtica proteoltica y amiloltica de los microorganismos del inoculante.
Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este proyecto de investigacin, fue aislar

microorganismos nativos con actividad lipoltica, con el fin de potencializar la eficiencia del
inoculante utilizado en la Empresa Bioagrcola del Llano, identificando as mismo
patgenos humanos, para que de esta manera se logre obtener un compost con mejores
caractersticas fisicoqumicas, libre de patgenos, que pueda ser utilizado en cultivos
propios de la regin, contribuyendo de esta manera al desarrollo agroindustrial.
2.- MARCO TERICO
2.1 COMPOSTAJE
El compostaje es la descomposicin biolgica y la estabilizacin de sustratos orgnicos,

bajo condiciones controladas que desarrollan temperaturas termfilas como un resultado
del calor producido biolgicamente, y genera un producto final que es estable, libre de
patgenos y semillas de plantas y puede ser aplicado benficamente al suelo (Stefan et
al., 2006). En el compostaje la fase slida del material orgnico sirve de soporte fsico,
matriz de intercambio de gases, fuente de nutrientes orgnicos e inorgnicos, vertederos
para los productos residuales metablicos y aislamiento trmico (Sylvia et al., 1998).
Los principales objetivos del proceso son estabilizar materia orgnica putrescible,
conservar la mayor cantidad de nutrientes y materia orgnica como sea posible, y generar
un producto uniforme y relativamente seco conveniente para usar como acondicionador
de suelo y suplemento para jardines o para disponer en tierra.
2.1.1 Beneficios del Uso del Compost
El compost se obtiene industrialmente por la transformacin biolgica de la materia

orgnica. De esta transformacin resulta un bioabono o acondicionador de suelos, apto
segn las caractersticas fisicoqumicas y microbiolgicas, para la fertilizacin, tanto por la
mejora del suelo como soporte fisicoqumico, como en relacin con la capacidad de
retencin de agua, y presencia de agregados y microorganismos (MacGregor et al.,
2001).
Los cidos resultantes de los procesos de degradacin de la materia orgnica disuelven

parte de los productos minerales del suelo y los hacen aprovechables para la nutricin de
las plantas. Los organismos actan como promotores de crecimiento, controladores
biolgicos y remediadores de suelo.
El nitrgeno contenido en el compost se encuentra en forma asimilable por las races y

puede ser retenido en el horizonte A - B (capa cultivable del suelo), evitando ser
arrastrado por las aguas de lluvia o de riego a capas ms profundas fuera del alcance del
sistema radicular (Macgregor et al., 2001).
Igualmente, la modificacin de las caractersticas fsico - qumicas del terreno hace que se
incremente el grado de disponibilidad del fsforo y potasio para la planta.
El compost incorpora al terreno micro y oligo elementos (cobre, magnesio, zinc,

manganeso, hierro, boro, etc.) que son muy necesarios para la actividad y desarrollo
vegetativo de las plantas. Otra caracterstica importante es que reduce la necesidad de
pesticidas qumicos al producir plantas saludables que son menos atacables por plagas
de insectos, enfermedades y heladas (Trautmann y Olynciw, 1999).
Fsicamente, la aplicacin de compost reduce la erosin y mejora la estructura del suelo,

la retencin de agua y el drenaje (Vsquez, 2003).
2.1.2 Factores de Importancia
Hay varias condiciones crticas para la elaboracin ptima de compost. Debe haber una
humedad adecuada (50-60% de contenido de agua), evitando el exceso (70% o superior),
puesto que interfiere con la aireacin y reduce el autocalentamiento. La relacin carbono-
nitrgeno no debera ser mayor de 40:1(Atlas y Bartha, 2001).
Equilibrio carbono/nitrgeno
En la composicin elemental del sustrato, se encuentra la cantidad relativa de carbono,

nitrgeno, fsforo, azufre y otros nutrientes. Adems de la composicin, es necesario
conocer la calidad de los sustratos para determinar el rango de descomposicin (Silvya,
et al 1998).
Conviene mezclar materiales de origen vegetal y animal para procurar un contenido

aceptable de todos los nutrientes esenciales. Es importante mantener un buen equilibrio
entre los materiales ricos en carbono y los ricos en nitrgeno, para que la relacin C/N se
mantenga entre 25 y 35. Una relacin elevada retrasa la velocidad de humificacin y un
exceso de N ocasiona fermentaciones no deseables. La mezcla debe ser rica en celulosa,
lignina (restos de poda, pajas y hojas muertas) y en azcares (hierba verde, restos de
hortalizas y orujos de frutas). El nitrgeno ser aportado por el estircol, el purn, las
leguminosas verdes y los restos de animales de mataderos. Todo se debe mezclar de
manera tan homognea como sea posible materiales pobres y ricos en nitrgeno, y
materiales secos y hmedos (Vsquez, 2003).
Un contenido menor de nitrgeno no permite la formacin de biomasa microbiana

suficiente. Una proporcin excesiva de nitrgeno (C:N= 25:1 o menos) causa la
volatilizacin del amonio, produce malos olores, y baja el valor fertilizante del compost
resultante (Atlas y Bartha, 2001).
Temperatura
Al inicio del proceso de desprende gran cantidad de calor, etapa termfila, la temperatura
en el material a compostar puede subir hasta los 60 70C, la actividad bacteriana
aumenta rpidamente. Debido al aumento de temperaturas, una gran cantidad de agua
del material se evapora. El oxgeno tiene que llegar a todo el material, por lo que el
material requiere de una buena ventilacin. En esta etapa los microorganismos atacan la
materia ms fcilmente biodegradable (Roder, 1998).
La actividad metablica de los microorganismos, al actuar sobre los sustratos orgnicos,

libera energa. Parte de la energa generada al interior de la pila de compostaje es
utilizada por los microorganismos, y otra parte es liberada al ambiente en forma de calor,
es por esto que el incremento de la temperatura es reflejo de la actividad microbiana
sobre la materia orgnica. Uno de los efectos de la temperatura sobre la pila de
compostaje es la eliminacin de microorganismos patgenos (Fundases, 2006).
Es importante tener en cuenta que para determinado grupo de microorganismos existen

rangos de temperatura y tiempos de exposicin (tabla 1).
Tabla 1. Tiempo y temperatura de eliminacin de patgenos comunes en materiales

orgnicos.
Microorganismo Tiempo Temperatura

Salmonella sp. 1 hora 55C
Escherichia coli 1 hora 55C
Brucela Abortus 1 hora 55C
Corynebacterium diphtheriae 1 hora 55C
Fuente: EPA, 1992
El diseo de un proceso de compostaje debe tener en cuenta la destruccin de

patgenos, ya que la presencia de ellos afecta los cambios normales de temperatura.
Estos organismos prefieren temperaturas por debajo de los 42C, ya que normalmente
viven a la temperatura corporal del hombre y animales, o a la temperatura ambiental de
las plantas. En la fase termoflica del compostaje se busca eliminar patgenos con el fin
de minimizar focos de contaminacin y establecer un bioabono ptimo para ser aplicado a
cultivos de consumo directo.
Las tcnicas para la preparacin de compost se les sealan como muy efectivas para el
control de microorganismos patgenos y la tasa de mortalidad de estos microorganismos
esta en funcin del tiempo y de la temperatura. Cuando el proceso de compostaje
funciona correctamente se pone de manifiesto que la mayora de los organismos
patgenos mueren cuando se exponen todas las partes de la pila a temperaturas de 55 C
(Luque, 1997).
Humedad
El agua es requerida por los microorganismos para desarrollar sus funciones metablicas,
adems, es utilizada como vehculo de trasporte de nutrientes y productos de desecho.
En la pila de compostaje, el balance de la humedad es importante, ya que bajos valores

afectan el metabolismo microbiano, mientras que altos valores de humedad, conllevan a
la acumulacin de agua en las cavidades intersticiales, dificultando la difusin de O2 y
favoreciendo las condiciones de anaerobiosis.
As pues, la humedad de la pila de compostaje debe oscilar entre el 60 al 70% (Fundases,

2006).
pH
El valor del pH no slo determina la existencia de una ecologa microbiana particular sino
que su nivel y sus variaciones pueden inhibir fuertemente la actividad de las bacterias.
Un pH entre 5.5 y 8.5 es ptimo a los microorganismos del compost. En las fases
tempranas del proceso los cidos orgnicos excretados por los hongos y bacterias
aumentan, hay un crecimiento fngico y se empieza la degradacin de lignina y celulosa.
Si el sistema se vuelve anaerbico la acumulacin cida puede bajar el pH hasta 4.5 y
limitar la actividad microbiana; en estos casos la aireacin es importante para volver el pH
hasta sus rangos ptimos (Trautmann y Olynciw, 1999).
As mismo es importante resaltar como se menciona en estudios recientes que la

actividad enzimtica lipoltica se ve afectada por factores como el pH, la temperatura, la
composicin del medio y la aireacin, mostrando mayor afinidad por pHs alcalinos debido
a que se presenta una mejor solubilizacin de los productos de hidrlisis formados
(Chahinian et al., 2005).
Aireacin
Se trata de un proceso aerobio (requiere oxgeno) por lo que es importante mantener una
aireacin adecuada. Para ello, se han de mezclar materiales pastosos (lodos de
depuradora, estircol) con otros que aumenten la porosidad (paja, virutas, etc). Los
materiales de excesivo tamao (restos de poda), es conveniente triturarlos previamente
para que descompongan ms fcilmente. Una forma de mantener una adecuada aireacin
durante el compostaje es mediante volteos peridicos o con aireacin forzada. El material
de los materiales a compostar debe variar entre los 35 y los 75 mm (Trautmann y Olynciw,
1999).
Otra forma de oxigenar las pilas de compost son los mtodos de aireacin directa, ya sea
por succin o por presin (Roder, 1998).
Tamao de partcula
La actividad microbiana generalmente ocurre en la superficie de las partculas orgnicas.

Por consiguiente, el tamao de la partcula menor, con mayor rea de superficie,
aumentar la actividad y sucesivamente la proporcin de descomposicin. Por otro lado
cuando la partcula es demasiado pequea se unen inhibiendo la circulacin de aire en el
compost, y por ende el oxgeno disponible para los microorganismos, minimizando su
actividad (Trautmann y Olynciw, 1999).
Es importante tener en cuenta el tamao de las partculas, todos los tipos de residuos
verdes con excepcin del pasto deben ser triturados para optimizar el proceso de
degradacin ya que sta otorga propiedades como agrandar la superficie para que el
microorganismo pueda actuar, reduciendo el material original a un volumen del 30 %
(Stock, 2002).
Ambiente
En climas fros y hmedos conviene situarlo al sol y al abrigo del viento, protegindolo de
la lluvia con una lmina de plstico o similar que permita la oxigenacin. En zonas ms
calurosas es mejor situarlo en un lugar sombreado para evitar la desecacin (Vsquez,
2003).
Porcentaje de lquido efectivo (% LE)
Este parmetro se utiliza cuando hay presencia de lpidos (grasas y aceites) en los
materiales a compostar debido a que ellos son lquidos a las temperaturas de tratamiento
y causan interferencia en la medicin de humedad. Se ha encontrado que el porcentaje
LE debe estar entre el 68% y el 70 % de acuerdo con diversos estudios (Prez, 1999).
2.2 PROPIEDADES FSICO QUMICAS DE LOS RESIDUOS COMPOSTABLES
2.2.1 Propiedades Fsicas.
La descomposicin es llevada a cabo esencialmente en un ambiente acuoso. Los

componentes solubles de los sustratos slidos y residuos del metabolismo microbiano se
difunden a travs de una pelcula de humedad sobre el compost slido, el contenido de
humedad ptimo para el compostaje, est generalmente entre 40 y 60%, es decir, se sita
en el orden del 15 al 35% (Sztem y Pravia, 1999). Adems es importante para mejorar la
estructura y estabilidad del suelo, la textura y su permeabilidad ya que regula el balance
hdrico del suelo y reduce el riesgo de erosin porque los suelos compactos se sueltan y
los arenosos se compactan por la accin de la materia orgnica (Vsquez, 2003).
2.2.2 Propiedades Qumicas.
La aplicacin de residuos orgnicos y desechos de una amplia variedad de actividades

humanas a suelos arables ha recibido atencin alrededor del mundo por una potencial
mejora en la fertilidad del suelo e incremento en el contenido de materia orgnica. Los
residuos orgnicos son raramente aplicados al suelo en estado fresco o crudo.
Generalmente, ellos son procesados para obtener materia orgnica estabilizada, madura,
con produccin de sustancias hmicas (Gigliotti et al., 2002).
En la materia orgnica procesada, una parte de las sustancias orgnicas es soluble en

agua, por esta razn, un impacto inmediato de la aplicacin de materiales orgnicos sobre
los suelos agrcolas es la liberacin de materia orgnica dentro de la solucin del suelo
(Gigliotti et al., 2002).
2.3 ESTRUCTURA DE LPIDOS Y GENERALIDADES DE LAS LIPASAS
Los lpidos (del griego, lipos, grasa) se encuentran en todos los organismos vivos y
desempean un papel indispensable en el mantenimiento de la vida. Sin embargo a
diferencia de las protenas y los carbohidratos, los lpidos son en extremo polimrficos y
difciles de definir estructuralmente (Horton, 2003).
Aunque las estructuras de los lpidos son con frecuencia complejas, comparten en su
estructura partes similares. Los lpidos ms sencillos son los cidos grasos, cidos
monocarboxlicos de la frmula general R-COOH, en donde R representa una cola de
hidrocarburo.
Los lpidos se pueden clasificar de diferentes maneras, aunque en general se dividen en:
Lpidos simples: son los que contienen uno o dos tipos de molculas diferentes, e
incluyen, entre otros, a los hidrocarburos, los alcoholes, aldehdos y cidos grasos, los
eicosanoides, los polihidroxialcanoatos, las cutinas, las suberinas, los cianolpidos, los
acilgliceroles (o acilglicridos), las ceras, las ceramidas, los lipoaminocidos y
lipopptidos, los lpidos fenlicos, los terpenos, los alcaloides isoprenicos, las quinonas
lipidicas y los esteroides (Rivera y Garca, 2007).
Lpidos complejos: son aquellos que contienen glcidos en su estructura, y los que
estn formados por tres o ms tipos de molculas diferentes. Incluyen a los
gliceroglicolpidos, los glicerofosfolpidos, las esfingomielinas, los ganglisidos, los
cerebrsidos, los lipoaminocidos glicosdicos, los acilglicsidos, los lipopolisacridos y
los proteolpidos, entre otros (Rivera y Garca, 2007).
De los lpidos mencionados, los cidos grasos y los acilglicridos son de especial inters.
Los cidos grasos estn formados por cadenas hidrocarbonadas saturadas o insaturadas
que contienen al menos un grupo carboxlico en uno de sus extremos. Estas molculas
intervienen en mltiples funciones biolgicas, y estn en la base de la biosntesis del resto
de lpidos (Rivera y Garca, 2007). Una variedad de lpidos anfipticos, que incluyen los
glicerofosfolpidos y los esfingolpidos, son componentes de importantes de todas las
membranas biolgicas (Horton, 2003).
Los acilglicridos estn formados por uno, dos o tres cidos grasos esterificados a una
molcula de glicerol (mono, di y triacilglicridos, respectivamente), y estn, implicados en
varias funciones biolgicas: reserva energtica, aislamiento, sealizacin intra e
intercelular, etc. Estos compuestos pueden ser hidrolizados mediante soluciones alcalinas
(saponificacin), o mediante la actividad de unas enzimas llamadas lipasas que liberan un
cido graso (Cheetham, 2005).
Por otra parte, los lpidos estn envueltos en diferentes procesos biolgicos. La estructura
de la membrana celular depende de la combinacin de ciertas protenas y lpidos
especficos.
Las enzimas lipolticas juegan un rol importante en la movilizacin de lpidos entre clulas
individuales de los organismos como tambin en la transferencia de los lpidos de un
organismo a otro (Beisson et al., 2000). Los microorganismos han sido la principal fuente
de extraccin de diversas enzimas.
Las lipasas son parte de la familia de las hidrolasas, catalizan la hidrlisis de

triacilglicridos en la interfase lpido-agua. Adems de su rol fisiolgico en la hidrlisis de
grasas neutras, las lipasas catalizan la hidrlisis o sntesis enantio- y regio-selectiva de
una amplia variedad de sustratos naturales tales como soya, aceite de pescado, ricino y
frutas ctricas (Bjrkling et al., 1991), as mismo pueden llevar a cabo la esterificacin,
interesterificacin y transesterificacin en medios no acuosos (Houde et al., 2004).
Estas enzimas presentan su pH ptimo entre 8 y 9, tambin se han reportado lipasas con
pH ptimo cido. En cuanto a la temperatura, la mayora trabaja apropiadamente en el
rango de 30-40C, algunas son activas a temperaturas bajas como 29C. El calcio parece
estimular la actividad de la mayora de las lipasas, mientras que los agentes quelantes y
los iones de metales pesados las inhibe (Lpez, 1999).
2.4 LIPASAS
Son usadas para hidrolizar lpidos produciendo cidos grasos y glicerol, las reacciones
ms importantes en las cuales las lipasas estn implicadas son reacciones quirales
debido a la posibilidad de resolver mezclas racmicas (Snchez, 1999).
El mecanismo de accin de las lipasas consiste en la hidrlisis de un cido graso en

presencia de alcohol obteniendo un ster y liberando agua (Figura 1). As mismo el
mecanismo cataltico de las lipasas se basa en un sistema de intercambio de cargas que
consta de 4 etapas. Tras la unin del sustrato, se produce el ataque nucleoflico por parte
del grupo hidroxilo de la serina cataltica sobre enlace ster del lpido, lo que lleva a la
rotura del enlace y a la formacin de un intermediario entre el cido graso y la serina
nucleoflica. Posteriormente se libera el alcohol y se produce un segundo ataque
nucleoflico por parte de una molcula de agua que ataca el enlace ster del intermediario
transitorio, lo que produce la liberacin del cido graso y la regeneracin del centro
cataltico (Bornscheuer, 2002).
En algunos organismos, las grasas y los aceites (triacilgliceroles) funcionan como
depsitos de reserva de energa metablica. En algunos casos, los lpidos llevan a cabo
funciones biolgicas como molculas individuales; en otros interactan con otras
biomolculas para realizar una funcin como parte de un complejo o a un agregado. Los
complejos lipdicos comprenden las lipoprotenas (partculas compuestas de lpidos y
protena), y los agregados lipdicos incluyen las membranas biolgicas (capas delgadas
compuestos de lpidos, protenas y algunas veces carbohidratos) (Horton, 2003).
Las lipasas son una clase de enzimas de rpida produccin, poseen actualmente nuevas
aplicaciones en la industria de hidrocarburos en sntesis orgnica y han expandido su
penetracin en la produccin farmacutica. El primer objetivo son las lipasas bacterianas
y fngicas porque stas son ms fciles de producir, modificar por tecnologa de DNA
recombinante (Snellman y Cowell, 2004).
Ambientalmente las lipasas son utilizadas en inoculantes como depurador de tratamientos

cloacales y como tratamiento para hidrolizar grasa en residuos slidos y lquidos como
una alternativa de sustitucin de productos de origen qumico (Snchez, 1999).
O O
R1C------ OR 2 + H2O----------------- R1C-------OH----R2OH
Figura 1. Mecanismos de accin de las lipasas (Arpigny y Jaeger, 2000).

2.4.1 Mtodos de determinacin de lipasas
Las dificultades que conlleva el hecho de que las lipasas sean enzimas solubles en medio
acuoso que actan sobre sustratos hidrofbicos ha llevado al desarrollo de una gran
cantidad de mtodos para determinar la actividad de estas enzimas y su inhibicin, como
ensayos en placas con triacilglicridos, ensayos espectrofotomtricos con sustratos
naturales, derivados del p-nitrofenol o steres de resorufina, ensayos
espectrofluorimtricos con anlogos de acilglicridos que contienen fluorforos como la 4-
metilumbeliferona (MUF) o la resorufina, ensayos cromatogrficos para la deteccin de
molculas como los cidos grasos, el -naftol o el p-nitrofenol liberados por las lipasas al
hidrolizar los acilglicridos o sus correspondientes anlogos, mtodos, basados en la
neutralizacin de la acidez generada por los cidos grasos libres, mtodos tensiomtricos
que miden cambios en la tensin superficial de las monocapas lipdicas, mtodos
radiomtricos que utilizan sustratos marcados radiactivamente, y otros mtodos para la
deteccin de la actividad lipoltica o de las propiedades fisicoqumicas de estas enzimas
tales como ensayos conductimtricos, turbidimtricos, resonancia magntica nuclear,
microscopia de fuerzas atmicas, cristalografa, etc. (Beisson et al., 2000).
Por otro lado, estas enzimas son caracterizadas por tener una amplia actividad ya que
catalizan un gran rango de reacciones, usando as para ser evaluadas la tcnica de p-
nitrofenil laurato (sustrato), la cual en estudios recientes ha demostrado que dichas
enzimas lipolticas tienen en su mayora un alto contenido de cidos hidrofbicos (60.2%)
(Neerupmaa y Jagdeep, 2006).
As mismo, la mayora de las enzimas lipolticas han sido estudiadas segn sus
propiedades qumicas. Entre estas se encuentran la dependencia a la actividad de los
iones Ca2+, pH y temperatura (Arpigny y Jaeger, 2000).
2.4.2 Enzimas Termoestables
Las enzimas son los catalizadores de las reacciones de los sistemas biolgicos cuyas dos
principales caractersticas son la extrema especificidad y la ptima velocidad de reaccin.
La estructura de la membrana celular depende de la combinacin de ciertas protenas y
lpidos especficos (Rivera y Garca, 2007).
Las enzimas estables se encuentran generalmente en organismos adaptados a vivir en

condiciones hostiles. Actualmente, hay un gran inters en las enzimas de organismos ya
que se han realizado gran cantidad de estudios sobre la relacin estructura-estabilidad de
las enzimas provenientes de dichos microorganismos (Hubble, 1990).
En cuanto al crecimiento microbiano a temperaturas elevadas se pueden destacar las

adaptaciones que estas han venido desarrollando a lo largo de la evolucin. Estos
microorganismos para sobrevivir a temperaturas elevadas comprenden, entre otras, una
gran proporcin de lpidos saturados en las membranas, lo cual impide la fusin a esas
temperaturas (Atlas y Bartha, 2001). Muchos microorganismos termfilos producen
enzimas que no se desnaturalizan a altas temperaturas. A veces, las protenas de los
termfilos presentan secuencias de aminocidos poco frecuentes que estabilizan dichas
protenas a temperaturas elevadas. Cuando se sobrepasa el mximo de temperatura de
crecimiento, los ribosomas se funden y cesa la sntesis de protenas. Muchos termfilos
tienen proporciones muy altas de guanina y citosina en su ADN, que eleva el punto de
fusin y aade estabilidad a la molcula de cido nuclico del organismo (Atlas y Bartha,
2001).
Las termoenzimas son aquellas que se producen a temperaturas aproximadas de 60C y

80C (hipertermfilos). Son resistentes a la denaturacin irreversible y ptimamente
activas a altas temperaturas (60-120C), por lo cual son usadas en muchos procesos
industriales (Zeikus et al., 1998).
Estas formas termfilas de vida son de inters, no solo desde el punto de vista biolgico
sino porque poseen ventajas industriales y biotecnolgicas. Las enzimas de termfilos son
capaces de catalizar reacciones bioqumicas a altas temperaturas y son generalmente
ms estables; esto se debe a la presencia de los puentes de hidrgeno, interacciones
hidrofbicas, intercambio inico, unin a metales y puentes disulfuro; lo que prolonga la
vida til de las enzimas (Pez et al., 2000).
De la misma manera, los microorganismos extremfilos han despertado un gran inters

durante los ltimos aos, debido a la elevada estabilidad trmica, resistencia a
desnaturalizantes qumicos y pHs extremos de sus enzimas, que las hacen especialmente
adecuadas para su uso en procesos de biotransformacin en condiciones extremas de
pH, salinidad y temperatura. Los microorganismos termfilos crecen a temperaturas
superiores a 45C, y en algunos casos (hipertermfilos) incluso por encima de 90C. La
disponibilidad de lipasas termoflicas permitira operar a altas temperaturas, con el lgico
incremento de la velocidad de reaccin y una ms fcil solubilizacin de los sustratos,
aspecto que constituye con frecuencia un factor limitante en algunas aplicaciones de este
tipo de enzimas, por ejemplo reacciones de sntesis en medios con bajo contenido en
agua ( Rivera y Garca, 2007).
2.4.3 Enzimas en el tratamiento de residuos
La aplicabilidad de grupos enzimticos depende de la capacidad de hidrolizar polmeros

complejos para incrementar su posterior degradacin microbiana. Dentro de stas se
incluyen empleo de lipasas asociados a cultivos bacterianos para eliminar depsitos de
grasa procedentes de diversas industrias, como embutidos o lctea, entre otras. As
mismo en estudios recientes se ha demostrado que combinando microorganismos
aislados del agua residual de una industria de alimentos con microorganismos lipolticos
termfilos se acelera el proceso de compostaje al ser utilizados stos, mezclados en un
inoculante (Tsai et al., 2006).
Otras enzimas degradadoras de polmeros utilizadas en forma similar son las celulasas,
amilasas y proteasas. Adems de esta hidrlisis de materiales polimricos existen
tambin aplicaciones de enzimas capaces de degradar compuestos txicos que podran
ocasionar la inhibicin de procesos fundamentados en el desempeo microbiolgico.
2.4.4 Importancia industrial de las enzimas lipolticas
Pocas enzimas lipolticas son las que han sido aisladas en forma pura y cristalizada, y
poco se conoce acerca de su estructura y funcin. Las enzimas lipolticas han cobrado
gran atencin por su potencial aplicacin en biotecnologa (Benjamn y Pandey,1998).
Muchas son las aplicaciones que se han encontrado para las lipasas, en la industria del
aceite, la produccin de farmacuticos, agroqumicos y componentes aromticos (Jaeger,
1999).
Las lipasas son usadas en dos distintos mbitos. Ellas son usadas en la catlisis para la
manufactura de otros productos (como ingredientes alimentarios) y por sus aplicaciones
(produccin de qumicos). Todas ellas presentan una gran eficiencia cuando son
empleadas en la industria (Cheetham, 2005).
Las lipasas han pasado a ser una parte integral en la actual industria alimentaria. Se ha
potenciado el uso de enzimas para mejorar procesos qumicos tradicionales en la
manufactura alimentaria y, las lipasas, se usan actualmente en la produccin de una
variedad de productos como quesos y alimentos preparados (Ashok et al., 1999)
En la mayor parte de los casos la produccin de enzimas debe ser inducida por la adicin
de aceites y grasas. Aunque se reconocen casos en que las grasas no tienen efecto sobre
la produccin de estas. Las lipasas estn generalmente unidas a las clulas por tanto
inhiben la superproduccin pero mediante la adicin de un catin como magnesio; las
lipasas se liberan y esto conduce a un ttulo mayor de enzimas en el proceso de
produccin (Snchez, 1999).
Entre otras aplicaciones, estas enzimas se utilizan en la industria alimentaria (produccin

de aromas, emulgentes, etc.), en qumica orgnica (sntesis de antibiticos, pesticidas,
produccin de compuestos enantiopuros, etc.), en detergencia (aditivos en detergentes,
produccin de surfactantes para jabones y productos de limpieza, etc.), en la industria
papelera (eliminacin del pitch, de tintas, etc.), as como en el tratamiento de productos
residuales o txicos, en biosensores, en la produccin de biodiesel, etc (Bornscheuer,
2002).
La importancia de estas aplicaciones ha llevado a la optimizacin de las reacciones

catalizadas por las lipasas, a mejoras en la produccin y purificacin de estas enzimas,
as como a la obtencin de lipasas con nuevas propiedades catalticas o una mayor
estabilidad, lo que se ha conseguido mediante la modificacin de enzimas ya existentes, o
mediante el aislamiento de nuevas lipasas (Wiseman, 1995).
2.4.5 Microorganismos reconocidos biotecnolgicamente como productores de

lipasas
Las lipasas han sido aisladas de una gran variedad de microorganismos pero una de las
primeras fuentes ha sido la especie Bacillus, la cual adems de la produccin de lipasas,
produce otras enzimas de inters industrial como son las celulasas, amilasas, elastasas,
etc.
Las lipasas difieren en varias de sus propiedades, stas dependen de su origen (el cual
puede ser fngico, bacteriano, de mamferos, etc.), ellas catalizan la hidrlisis o sntesis
de una gran variedad de esteres carboxlicos y liberan cidos orgnicos y glicerol. Todas
ellas muestran una alta especificidad sobre los sustratos (Rivera y Garca, 2007).
En aos recientes, ms de 30 lipasas fueron asiladas de cepas de Rhizopus y muchas de

ellas han sido caracterizadas (Rivera y Garca, 2007). Las lipasas de Rhizopus estn
relacionadas con las lipasas de Rhizomucor miehei (existe una homologa >55%), stas
tienen una alta especificidad en la posicin 1,3 de triglicridos, las cuales las hacen muy
verstiles en la modificacin de lpidos.
En estudios recientes en la ciudad de Suiza se determin en la fase termoflica del

compost el gen Thermus perteneciente a Bacillus stearothermophillus, aislado de un
proceso de compostaje con residuos de cocina y de poda. Este compost alcanz una
temperatura mxima reportada de 80C la cual es ptima para el crecimiento de este
microorganismo (Beffa et al., 2006).
Las enzimas termoestables pueden ser obtenidas de organismo mesoflicos y termoflicos;

se han obtenido algunas enzimas termoflicas a partir de organismos psicrfilos (Imamura
y Kitaura, 2000). Los principales organismos de los cuales se han extrado enzimas de
inters industrial son hipertermfilos Pyrococcus furiosus y Thermotoga sp (Adams et al.,
1995). Otros organismos como hongos son productores de lipasas termoestables (Tabla
2).
Tabla 2. Microorganismos productores de lipasas
Organismo Temperatura ptima C pH ptimo
Candida Antarctica 70 6.5
Candida curvata 50-60 6.5
Mucor miehei 40 7.0
Fuente: (Rivera y Garca, 2007).
As mismo, las lipasas son producidas por muchos microorganismos, siendo las fuentes
tradicionales para la produccin comercial: Pseudomonas sp, Serratia sp, Rhizopus sp,
Mucor sp, Aspergillus spp y Candida. Algunos de los microorganismos producen varias
lipasas cuya especificidad vara con respecto a los cidos grasos y a la posicin en el
triglicrido (Lpez 1999).
Entre los microorganismos reportados como mayores productores de enzimas lipasas
termoflicas se encuentra el gnero de Bacillus sp, siendo la especie mas destacada B.
thermocatenolatus, stos producen dos lipasas extracelulares termoestables las cuales
dependen de la edad del cultivo (Nerupmaa y Jagdeep, 2006).
Se han encontrado estudios recientes de levaduras productoras de lipasas como:

Candida rugosa la cual produce lipasa extracelularmente y es ampliamente utilizada para
propsitos industriales. Una preparacin comercial de lipasa de esta levadura puede
separase en varias izoenzimas, con varios mecanismos como: diferente contenido de
carbohidratos, punto isoelctrico, substrato especfico y secuencia primaria (Neerupma,
2006).
2.5 IMPORTANCIA DE LOS INOCULANTES BIOLGICOS.
Los inoculantes biolgicos estn clasificados como: biofertilizantes, biocontroladores y

acelerantes.
Los biofertilizantes o abonos biolgicos tienen como principio activo microorganismos
vivos (bacterias y hongos) que promueven y benefician la nutricin y el crecimiento de las
plantas. Desde el punto de vista de una agricultura sostenible, el uso de biofertilizantes
representa una importante alternativa para limitar el uso de abonos qumicos, reduciendo
su negativo impacto ambiental y econmico, y mejorando la productividad de los cultivos
enfocado al ptimo crecimiento vegetal permitiendo as un mejor aprovechamiento de los
recursos naturales del suelo, por estas razones la produccin de bio-insumos agrcolas ha
cobrado importancia (Cuevas et al., 2000).
Es evidente que un desarrollo exitoso de esta tecnologa debe ir ligado a la generacin de

conocimiento bsico que conduzca a una mayor comprensin de los fenmenos
asociados al proceso de nutricin vegetal promovidos por los inoculantes (Lozano, 2005).
En la actualidad la implementacin de inoculantes termoflicos es una alternativa viable en

el tratamiento de residuos slidos orgnicos. La gran estabilidad que presentan las
enzimas de estos microorganismos, frente a temperaturas extremas, garantiza una
capacidad de degradacin mayor que la obtenida por gneros microbianos mesoflicos. La
utilizacin de inoculantes biolgicos a partir de microorganismos mesfilo - termfilos ha
trado grandes beneficios en compostacin de residuos domsticos, industriales y
hospitalarios.
En estudios recientes en una industria lctea, se realiz una prueba de compostaje de

campo, comparando un inoculante comercial con un inoculante que tena cepas nativas,
observando al final del proceso, la eficiencia de las bacterias nativas y la ptima utilizacin
de estas en la degradacin de diversos desechos producidos por la industria en estudio
(Moreno et al.,2001).
De la misma forma, otro proyecto de investigacin fue el realizado en la ciudad de

Sogamoso (Boyac), donde se evalu la accin de un inculo termoflico con actividad
enzimtica proteoltica, amiloltica, lipoltica y celuloltica, acelerador del proceso de
compostaje en residuos slidos municipales. En la prueba de campo se verific la
eficiencia del inoculante aplicado sobre la pila experimental, se evidenci la reduccin del
tiempo de degradacin a ocho semanas, ya que el tiempo del proceso de compostaje era
de 16 semanas. Por otra parte, este proceso garantiz el mejoramiento de las
caractersticas fisicoqumicas y la eliminacin de patgenos en el producto final (Palomino
et al., 2002).
En diversos proyectos se ha obtenido un rendimiento ptimo a partir de inoculantes

correspondiente a la tasa de degradacin de cada tipo de residuo a tratar, sin alterar de
modo alguno la calidad del producto final; por el contrario se ha logrado la produccin de
un compost con alto contenido de elementos como nitrgeno, fsforo y potasio, que
ayudan a aumentar la viabilidad de los suelos (Moreno et al., 2001).
2.6 MICROORGANISMOS PATGENOS

El control sanitario del compost es de vital importancia, ste debe ser tratado de manera
adecuada debido a que ser utilizado como biofertilizante o nutriente del suelo, ya sea en
agricultura orgnica o inorgnica, dando lugar a la contaminacin de los productos y/o de
las fuentes de aguas, por lo que su aplicacin descontrolada constituye un peligro para la
salud pblica y una amenaza para el medio ambiente por la exposicin a
microorganismos patgenos que esto representa (Fundases, 2006).
Los patgenos son causantes de enfermedades y pueden pertenecer a cualquiera de las

clases de microorganismos, bacterias, hongos, virus, ricketsias y protozoos. El diseo de
un proceso de compostaje debe tener en cuenta la destruccin de patgenos, ya que la
presencia de ellos afecta los cambios normales de temperatura (Islam et al., 2004).
A lo largo del proceso de compostaje, se espera una reduccin total de los agentes
patgenos por accin de diferentes condiciones como pH, temperatura, humedad,
sustancias antibiticas, entre otros.
Salmonella sp. es una bacteria Gram negativa, predominantemente mvil, anaerobia

facultativa, que al ser un microorganismo patognico de tipo entrico causa salmonellosis
en animales y humanos (EPA Mtodo 1682, 2006). De igual manera Salmonella sp.
puede causar una deshidratacin crnica y muerte en los nios mientras que en el
ganado puede causar abortos. Una vez la vaca es infectada con Salmonella su
erradicacin es difcil ya que hay cepas resistentes a antibiticos. Adems, puede
transmitirse por contacto directo de animales (Islam et al., 2004) As mismo, Salmonella
sp, es uno de los patgenos entricos ms estudiados encontrados en el compost. Es
conocido que la temperatura de 55C por 15 das es letal para los miembros de este
grupo (EPA, 1682).
Por otra parte Escherichia coli, es una bacteria Gram negativa, que causa infecciones de
tipo intestinal, es por esto que la presencia de este microorganismo patgeno en el
compost y su diseminacin en el medio ambiente (suelo, agua, superficie de las plantas)
merece especial atencin por las severas consecuencias que puede traer un mal manejo
de este producto para la salud y la higiene ambiental, por lo que es necesario que los
productores apliquen buenas prcticas agrcolas para manipular estos fertilizantes
naturales con el fin de reducir al mnimo los peligros microbiolgicos ( Islam et al., 2004).
3.- JUSTIFICACIN.
Bioagrcola del Llano S. A. E.S.P ubicada en el Departamento del Meta (Villavicencio); es

una empresa creada a travs del Acuerdo 004 de 1995 del Concejo Municipal y
constituida el 17 de agosto de 1995, a fin de atender a la necesidad surgida de la Ley 142
de 1994, que aplica a aquellas entidades que realizan actividades prestadoras de
servicios pblicos domiciliarios, alcantarillado, aseo, entre otros.
De sta manera la empresa se ha orientado en una gestin que promueve el

mejoramiento continuo de los procesos y la satisfaccin de los usuarios. Por esta razn,
se han obtenido reconocimientos por los avances efectuados en materia de disposicin
final y compensacin ambiental efectuada en el relleno sanitario Don Juanito, el cual en
la actualidad es el Parque Ecolgico Reciclante en esta ciudad.
As mismo, esta empresa es la encargada de realizar la recoleccin y transporte de

residuos slidos domiciliarios y comerciales. En la actualidad se reciben 308 toneladas/da
de residuos de la cuales aproximadamente 285 toneladas corresponden a la disposicin
de Villavicencio y 23 toneladas corresponden a la disposicin de otros municipios. En
cuanto a los residuos orgnicos generados se utilizarn como recurso para eliminar focos
de contaminacin y optimizar la higiene pblica.
Actualmente, se ha venido desarrollando un inoculante biolgico acelerante compuesto

por 14 cepas nativas termoflicas con actividad proteoltica y amiloltica (Galindo et al.,
2005) el cual ha contribuido a la reduccin del tiempo de produccin y a la obtencin de
un compost de buena calidad.
Por lo anterior, se buscar potencializar la eficiencia del inculo ya existente compuesto

por cepas termoflicas amilolticas y proteolticas, aislando microorganismos nativos con
actividad lipoltica que sern adicionados al inoculante microbiano termoflico con el fin de
optimizar su accin en el proceso de degradacin de residuos orgnicos. As mismo,
debido a la importancia que ha alcanzado este compost producido (bioabono) se plantea
el anlisis de patgenos humanos E.coli y Salmonella sp. al inicio y al final del proceso
para garantizar su calidad.
Por ultimo, la finalidad de este proyecto es poder obtener resultados favorables mediante
el aislamiento de las bacterias anteriormente mencionadas, para mejorar la eficiencia del
inculo con el que se ha venido trabajando en la Empresa Bioagrcola del Llano, el cual
aportar ptimos resultados al momento de obtener el bioabono producido.
4.- OBJETIVOS
4.1 Objetivo General.

Aislar bacterias lipolticas y determinar patgenos humanos Escherichia coli y Salmonella
sp. a partir de residuos orgnicos domiciliarios en compostaje.
4.2 Objetivos Especficos.
Aislar bacterias con actividad lipoltica a partir de los residuos orgnicos a

compostar.
Evaluar la capacidad antagnica de las cepas en estudio.
Evaluar cualitativamente y cuantitativamente actividad enzimtica lipoltica de las
cepas seleccionadas.
Estandarizar la tcnica de p-nitrofenol para la evaluacin cuantitativa de las cepas.
Determinar patgenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp. en compost, al

inicio y final del proceso de compostaje.
5.- METODOLOGA
Este proyecto fue realizado en el relleno sanitario Don Juanito en la ciudad de

Villavicencio manejado por la empresa Bioagrcola del Llano S.A. E.S.P, en donde se llev
a cabo el montaje de tres replicas de compostaje, utilizando 55% de residuos de plaza,
contenido ruminal, poda y cascarilla de arroz, para el aislamiento de bacterias lipolticas y
para llevar a cabo la determinacin de patgenos humanos Escherichia coli y Salmonella
sp. Las muestras fueron procesadas y analizadas en los laboratorios de Microbiologa
Ambiental y Biotecnologa Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana. La
determinacin de los parmetros fisicoqumicos del producto inicial y final se realiz en
AGRILAB, laboratorio certificado por el ICA (Anexo 12).
5.1 REACTIVACIN DE CEPAS
Se llev a cabo la reactivacin de 14 cepas nativas termofilicas, con actividad proteoltica

y amiloltica provenientes de residuos orgnicos domiciliarios del relleno sanitario Don
Juanito de la ciudad de Villavicencio, las cuales fueron conservadas en glicerol al
25%(v/v), en el banco de clulas del laboratorio de Biotecnologa Aplicada de la Pontificia
Universidad Javeriana (Galindo et al; 2005).
El proceso de reactivacin de las 14 cepas se llev a cabo en medio lquido leche-almidn

al 1%(p/v) (Anexo1) hasta obtener una concentracin de 1020 UFC/mL a una temperatura
de 55C. A partir de estas, se produjo la cantidad de inoculante necesaria para aplicar a
las pilas de compostaje. Para comprobar la produccin de biomasa de las cepas
reactivadas se determin mediante tcnicas cualitativas (formacin de halos de hidrlisis)
en agares especficos (leche-almidn al 1%), se realizaron recuentos en placa para
determinar biomasa, fueron incubadas a 55C por 24 horas. La cantidad de inoculante a
preparar se calcul de acuerdo a los metros cbicos de residuos orgnicos que se
compostaron y a la concentracin final deseada de 1020 UFC/mL, siendo 2.5 litros por
metro cbico la cantidad destinada para cada tonelada (Galindo et al., 2005).
5.2 FASE DE LABORATORIO
5.2.1 MUESTREO
A partir de las 3 rplicas de compostaje, se tomaron de las materias primas y del compost
final 5 muestras de 100 g cada una para completar 500 g, utilizando un tubo de PVC de
70 cm de largo por 3 de dimetro, para esto se retir el material de tal forma que la
materia qued al descubierto, de dicha pared se tomaron las 5 muestras de diferentes
alturas y distancias (Universidad de los Andes, 2003).
Posteriormente, se trasladaron en bolsas plsticas de cierre hermtico dentro de una

nevera plstica al laboratorio de Biotecnologa Aplicada de la Pontificia Universidad
Javeriana. El anlisis realizado a estas muestras primero fueron anlisis fsico qumico y
segundo screening de bacterias lipolticas y patgenos.
5.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
5.2.2.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipoltica
A partir de 500g de muestra homogenizada se tomaron 10 gramos y se realizaron

diluciones seriadas en agua peptonada al 1% (p/v) de 10-1 a 10-8. Luego se sembr en
superficie y por duplicado 0.1 mL de las diluciones, en medio lecitina (Ramrez et al.,
2004) (Anexo 1) se utiliz como control medio de cultivo tributirina.
Algunos de los microorganismos aislados hidrolizaron el cido graso presente en el

medio, generando una zona de hidrlisis o aclaramiento alrededor de las colonias que se
evidenci despus del tiempo de incubacin a 55C por 24 horas. Se tuvo como
parmetro de seleccin, las cepas con halos 1mm de dimetro (Jaeger et al., 1999,
citado por Moreno et al., 2001)
Las siembras realizadas fueron sucesivas, mediante la tcnica de parcheo para purificar
cada colonia, en donde se observ la actividad enzimtica, la cual se determin de forma
cualitativa en mm de dimetro con la siguiente ecuacin (1):
C = A B (ecuacin 1)
En donde:
A: Dimetro de la colonia ms el halo de hidrlisis en mm.
B: Dimetro de la colonia en mm.
C: Dimetro del halo de hidrlisis (Rodrguez et al., 2002)
5.2.2.2 Identificacin microscpica y macroscpica de las colonias
Para llevar a cabo la identificacin microscpica se realizaron montajes en lminas de

cada una de las colonias seleccionadas y se realizaron tinciones de Gram para evidenciar
morfologa celular (Madigan, 1997).
En la identificacin macroscpica se tuvieron en cuenta caractersticas de las colonias

como halos de hidrlisis, color, textura, tamao y elevacin de las colonias bacterianas.
5.3 BANCO DE CLULAS PRIMARIO (Conservacin De Cepas).
La conservacin de las cepas seleccionadas se realiz mediante la tcnica de

criopreservacin con glicerol al 30% (v/v).
Para alcanzar la concentracin ptima de 108 UFC/mL del banco fue necesario realizar
recuentos en placa en medio lecitina para confirmar la concentracin inicial. Cada cepa
fue cultivada en 25 mL de caldo lecitina por 12 horas a 55C. Posteriormente se aadieron
25 mL de caldo lecitina ms glicerol al 60% (v/v).
Finalmente se tom 1 mL de dicha suspensin y se almacen en tubos eppendorf a -70C
(Poutou et al., 1994). Este procedimiento se llev a cabo con cada una de las cepas
aisladas.
5.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO
Las 14 cepas existentes correspondientes al inculo utilizado en La Empresa Bioagrcola

del Llano S.A E.S.P. se llevaron a cultivar de 48 horas a 55C en el medio
correspondiente a cada cepa, para determinar el tiempo ptimo de crecimiento del
microorganismo. (Galindo et al., 2005).
Se realiz un inculo con una concentracin de 108UFC/mL en un erlenmeyer relacin 1/5

en caldo Almidn-leche al 1% (p/v) y lecitina bajo las siguientes condiciones 55C por 12
horas, despus de este tiempo se realizaron las pruebas de antagonismo para cada una
de las cepas.
Para la prueba se sembraron masivamente cada uno de los microorganismos en medio

almidn-leche al 1%(p/v) y lecitina. A partir de la suspensin anterior se tomaron 20l y se
dispusieron en pozos, como control se tom el microorganismo que se sembr
masivamente, esta tcnica se realiz por triplicado enfrentando las 14 cepas existentes
con las cepas lipolticas aisladas. Este antagonismo se evalu con el fin de evidenciar si
las cepas lipolticas pueden ser adicionadas al inculo ya existente .Las 14 cepas ya
existentes no presentan antagonismo entre ellas comprobado en estudios anteriores.
(Galindo et al.,2005)
El efecto antagnico se evalu midiendo el dimetro de los halos de inhibicin, tomando

como antagonismo positivo a las cepas que enfrentndose entre s, inhibieron el
crecimiento de las otras en 5mm de dimetro (Gauze, 1967).
Adicionalmente, se realizaron pruebas antagnicas de las cepas lipolticas enfrentadas

entre si obtenidas del screening, sembrando masivamente cada cepa lipolitica. De igual
manera al iniciar las pruebas fue necesario que los microorganismos alcanzaran la misma
concentracin (108UFC/mL) para evitar falsos positivos. Para esto se llevaron a cabo
nuevamente recuentos en placa en medio lecitina, lo cual permiti determinar la
concentracin inicial de cada microorganismo, posteriormente se realiz la metodologa
anteriormente mencionada.
5.5 CURVAS DE CRECIMIENTO
Esta prueba se realiz con el fin de determinar el tiempo de la fase de crecimiento de

cada una de las cepas aisladas y de esta manera saber, el tiempo ptimo para la
produccin del inculo nativo termoflico, en el cual se genera mayor actividad enzimtica.
5.5.1 Produccin del inculo

Se prepar un inculo de 100mL de caldo lecitina, inoculando un vial obtenido del banco
primario de cada una de las cepas en un erlenmeyer de 500 mL (1/5), el cual dur en
incubacin un tiempo aproximado de 24 horas. Transcurrido este tiempo para la
fermentacin se transfiri a un erlenmeyer de 1000mL con 500 mL de medio lecitina,
relacin (1/2) adicionalmente se realiz coloracin de Gram para corroborar pureza
(Moreno et al., 2001).
5.5.2 Fermentacin Discontinua
Se tom del inculo preparado en el numeral anterior la cantidad correspondiente a 0.5

mL para realizar diluciones de 10-1 a 10-10 para luego determinar biomasa mediante la
tcnica de recuento en placa (UFC/mL) por triplicado, por un periodo de incubacin de 18
horas a 55C. Para la determinacin de biomasa de los diferentes tiempos de muestreo se
ley absorbancia utilizando la tcnica de lavado con buffer Fosfato 1 M a pH 7 (K 2HPO 4
+ KH2 PO4) y adicin de Triton X-100 al 1%, debido a la turbidez del medio. Esta tcnica
se ley a 540 nm (Otlora et al., 2003) la metodologa anterior se uso para bacterias, para
actinomycetes utiliz nicamente la tcnica de recuento en placa.
5.6 TCNICA COLORIMTRICA P-NITROFENIL PALMITATO PARA ACTIVIDAD

LIPOLTICA
5.6.1 Curva patrn de p-nitrofenol

La curva de p-nitrofenol se realiz en tubos 13 x 100mm, utilizando una solucin buffer
fosfato 1M (Anexo 3), el cual fue utilizado como blanco y como solucin buffer del p-
nitrofenil (Otlora et al., 2003).
Para realizar la curva patrn (Anexo 4), se prepar una solucin stock de p-nitrofenil de
1umol/mL en buffer fosfato pH 7.0, a partir de esta solucin se determinaron las diferentes
concentraciones para la construccin de la curva de p-nitrofenol, las cuales fueron ledas
por duplicado en un espectrofotmetro Spectronic 21D Milton Roy a 450nm (Beltrn et
al., 2006).
Las concentraciones de p-nitrofenol que arrojaron valores de absorbancias entre 0.1 y 0.9
fueron escogidos para realizar el trabajo de acuerdo con la Ley de Beer-Bouguer-Lambert
(Otlora et al., 2003).
5.6.1.1 Evaluacin y estandarizacin cuantitativa de actividad lipoltica
Para determinar la actividad lipoltica se prepar una solucin buffer fosfato 1M a pH 7 + o

2 (Na2HPO4 + NaH2PO4) con diferentes concentraciones de p-nitrofenil palmitato
(0,08%(p/v), 0,5%(p/v), 1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v)) + 1% de TRITON X-100 (Shuen et
al., 1996). A partir de esta solucin se tom 900l en tubos 16*150 y se le adicion
diferentes volmenes de extracto crudo (20l, 500l y 700l). La solucin se incub por
30 y 60 minutos a 55 C. Transcurrido este tiempo se fren la reaccin con NaOH.
Posteriormente cada una de las mezclas fue llevada a centrifugacin a 10000 rpm por 10
minutos, a partir del sobrenadante se tom 1mL y fue depositado en las celdas de cuarzo,
para luego realizar la lectura usando como blanco la solucin buffer sin extracto crudo de
la enzima en espectrofotmetro Spectronic 21D Milton Roy a 450nm (Beltrn et al.,
2006). Las unidades lipolticas fueron determinadas a travs de la curva patrn de
calibracin donde una unidad de p-nitrofenol liberada corresponde a una unidad lipoltica
por minuto (UL). (Kampen, 1999).
5.6.1.2 Prueba preliminar de actividad enzimtica
Se realizaron pruebas preliminares de actividad enzimtica de las cepas escogidas,

llevando a cabo una fermentacin discontinua, para lo cual se llev a cabo la produccin
de un inculo en 100mL de caldo lecitina, inoculando un vial de cada cepa obtenido del
banco primario en un erlemmeyer de 500mL para alcanzar una relacin (1/5) con un pH
inicial 7.5 y un tiempo de incubacin de 24h a 55C.
Pasado el tiempo de incubacin se trasladaron 100mL del inculo a un erlenmeyer de

1000mL que contena 400 mL de caldo lecitina relacin (1/2) con pH 7.5 inicial, stos se
cultivaron durante 12 horas, a 55C, posteriormente se retir el erlenmeyer, iniciando el
muestreo en la hora 0, luego se realizaron muestreos cada media hora hasta llegar a la
hora y media, a partir de aqu se realizaron muestreos cada 2 horas de fermentacin
hasta la hora 18, para corroborar pureza del cultivo se realizaron coloraciones de Gram en
cada hora de muestreo (Otlora et al.,2003).
En cada muestreo se tomaron del erlenmeyer 5mL de muestra, esta se centrifug a 150
rpm durante 15 minutos para obtener el sobrenadante, es decir, el extracto crudo que
contiene la enzima lipoltica como se mencion el numeral anterior.
Por otro lado, se prepar una solucin de Buffer Fosfato 1 M a pH 7 (K 2HPO 4 + KH2 PO4),
el cual fue mezclado con el p-nitrofenil palmitato mas Triton X 100 a una concentracin
del 1% (Beltrn et al.,2006). A partir de esta solucin se tomaron las cantidades
especificadas anteriormente de p-nitrofenil palmitato y extracto crudo en tubos 13*100.
La solucin se incub por 30 y 60 minutos a 55C transcurrido este tiempo se fren la

reaccin con 1575 ul de NaOH (Otlora et al., 2003).
Luego se realiz la lectura usando como blanco la solucin de Buffer sin el extracto crudo
de la enzima (Beltrn et al., 2006). Para realizar la tcnica de cuantificacin de la actividad
enzimtica, se formula que una unidad lipoltica se define como la cantidad de enzima
capaz de liberar una micromol de p- nitrofenol por minuto por litro (Moreno et al., 2001).
5.7 DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS PATGENOS. Escherichia.coli y

Salmonella sp.
5.7.1 Determinacin de microorganismos patgenos. Salmonella sp.
Las muestras iniciales fueron tomadas de la primera y ltima semana de residuos del
proceso de compostaje, stas fueron recolectadas en bolsas plsticas de cierre hermtico
y llevadas a refrigeracin a 4C hasta el momento de su anlisis.
Para la presencia de Salmonella sp se us el mtodo de NMP (nmero ms probable).
A partir de 500g de muestra se tomaron 25g para diluirlo en 225mL de agua peptonada al
0.1%(p/v), enseguida se homogenizo por inmersin (EPA, 1682, 2005). Seguido a esto se
realizaron tres diluciones: el primer juego se realiz con frascos de vidrio, con 10mL de
medio lquido TSB (Anexo 1) mas 20mL de muestra homogenizada, el segundo juego se
realiz en tubos tapa rosca (16x150mm) con 5mL de medio lquido TSB ms 5mL de
muestra homogenizada y finalmente el tercer juego con tubos tapa rosca (16x150mm)
con 10mL de medio liquido TSB mas 1mL de muestra homogenizada. Cada juego
correspondi a las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 respectivamente. Se incub 24h a 36C (EPA,
1682-2006), para cada una de las diluciones (10-1, 10-2 y 10-3) se prepar el medio
Rappaport Vassiliadis (semislido) (Anexo 1). Sobre cada caja se distribuyeron cinco
puntos equidistantes y se depositaron 30l de cada juego de diluciones. Esto se llev a
incubar a 42C por 24h. De cada una de las gotas depositadas (5) en el medio semislido
Rappaport Vassiliadis correspondiente a cada dilucin, se repicaron a medios selectivos
XLD y Sulfito Bismuto (EPA, 1682-2006).
De los aislamientos se escogieron colonias caractersticas de Salmonella sp y de estas

se hicieron pases a: TSI, LIA y UREA (Tabla 3), seguido de esto se escogieron las
colonias que presentaron reaccin metablica positiva, y se realiz la prueba serolgica
con solucin salina y antisuero polivalente o``, esta prueba consiste en obtener una
muestra de la superficie inclinada del tubo de cada una de las bioqumicas, emulsionando
sobre una lmina con suero fisiolgico estril, evidenciando aglutinacin en caso de un
resultado positivo (EPA, 1682-2006).
Tabla 3.Tabla gua para la lectura indicadores de Presencia de Salmonella sp
Medio Resultados Mtodo 1682 Mtodo 1682

Salmonella Reaccin Positiva Reaccin
Negativa
Tripticasa soya Positivo Turbidez No turbidez
Medio Rappaport Positivo Clulas que migran Medio de color
Vassialiadis en el medio igual al inicial sin
modificado alrededor del halo halo
donde se realiz la
inoculacin de color
blanco grisceo
XLT4 Positivo rosado a rojo con Otro color con
colonias que centro negro ejm:
presentan centro E.coli: colonias
negro amarillas con el
centro negro
TSI Positivo Viraje de rojo a Otro tipo de color
amarillo con o sin
produccin de H2S
LIA Positivo Columna vertical y Otra combinacin
superficie inclinada de colores ejm:
color violeta, E.coli presenta
formacin de H2S color rojo o
variacin entre rojo
y morado sin
produccin de H2S
REA Negativo Color Rosado No hay cambio de
color ( Salmonella
es ureasa negativo)
Polivalente O Positivo Aglutinacin No Aglutinacin
Fuente: EPA 2006 United States Enviromental Protection Agency Method 1682:
Salmonella in Sewage Sludge (Biosolids) by Modified Semisolid Rappaport-Vassiliadis
(MSRV) Medium
La determinacin de NMP se realiz a partir de los tubos originales de TSB con resultados
positivos para Salmonella sp en MSRV, XLD, Hecktoen, Sulfito Bismuto, TSI, LIA, urea
negativo y antisuero polivalente positivo, se leyeron en la tabla de NMP.
Para la determinacin de slidos totales se tomaron 15g de la muestra a 100C por 24

horas. El porcentaje de peso seco se calcul utilizando la siguiente ecuacin (1)
g de la muestra seca
(1) % peso seco = * 100%

g de la muestra
Para la determinacin de Salmonella sp como NMP/15g peso seco se utiliz la siguiente

ecuacin (2):
NMP/ ml (peso hmedo) * 15
(2) NMP/15g (peso seco) =
Porcentaje de slidos totales
5.7.2 Determinacin de Escherichia coli.

Las muestras para el anlisis fueron tomadas de la primera y ltima semana de la mezcla
del compost, stas fueron recolectadas en bolsas plsticas de cierre hermtico y llevadas
a refrigeracin a 4C hasta el momento de su anlisis.
Para la presencia de Escherichia coli se us el mtodo de NMP (nmero ms probable).
A partir de 500g de muestra se tomaron 10g para diluirlo en 90ml de agua peptonada al
0.1%(p/v), enseguida se homogeniz por inmersin (EPA, 1680, 2006). Seguido a esto se
realizan tres diluciones 10-1, 10-2 y 10-3. Alternamente se preparan 9 tubos, cada uno con
9ml de caldo LMX ,los cuales cada serie de tres sern inoculados con 1ml de las
diluciones ya preparadas, que correspondern la primera serie de tres a la dilucin 10 -1, la
segunda serie de tres ala dilucin 10-2, y la ultima serie de tres a la dilucin 10-3.
Se tom como resultados positivos para Escherichia coli aquellos tubos que presentaran
tres reacciones positivas como lo son: Indol positivo, fluorescencia y presencia de
glucoronidasa (EPA, 1680, 2006).
Para la determinacin de NMP/4g se revis en la tabla establecida por la EPA, 1680,

2006.
5.8 FASE DE CAMPO
5.8.1 Determinacin de pH y Temperatura
La temperatura fue analizada mediante un termmetro de punzn de 70 cm de largo con

receptor digital, las mediciones se realizaron diariamente. Estas temperaturas se
registraron de las 3 replicas de compostaje para luego ser promediadas y encontrar el
valor medio. Este procedimiento se realiz diariamente los resultados fueron registrados
para su posterior anlisis.
El pH se determin semanalmente en el laboratorio de Biotecnologa Aplicada por medio

del mtodo de pasta de saturacin, que consiste en tomar cinco submuestras de cada pila
hasta completar 500g y agregar 500mL de agua destilada; se debe mezclar y pasados de
5 a 10 minutos, se toma el valor del pH sobre el extracto liquido superficial (Galindo et al.,
2005).
Finalmente se calibra el potencimetro con las soluciones reguladoras de pH 7.0 y 4.0
(soluciones buffer) y se introduce el electrodo de vidrio en la pasta saturada y se registra
la lectura (ICONTEC, 2004).
5.8.2 Anlisis Fisicoqumico De Las Muestras
Se tomaron 500 g del compost final y fueron destinadas para el anlisis de los parmetros
fisicoqumicos realizados por AGRILAB, laboratorio registrado ante el ICA, con el fin de
establecer parmetros fisicoqumicos: Relacin C/N Humedad, Cenizas. Carbobo
orgnico oxidable, Capacidad de Intercambio Catinico, Nitrgeno orgnico, Fsforo total,
Potasio total, Calcio total, Magnesio Total, Azufre total, Hierro total, Manganeso total,
Cobre total, Zinc total.
5.9 ANLISIS ESTADSTICO
De acuerdo a los registros de actividad enzimtica se que se obtendrn, con las diferentes
cantidades de sustrato y de extracto crudo, se llevara a cabo un anlisis de ANOVA, para
el posterior anlisis en el programa JUMP.
Planteamiento de Hiptesis.
Ho: No existen diferencias entre la actividad lipoltica obtenida a partir de

microorganismos nativos de compost en los tiempos de contacto, los volmenes de
extracto y las diferentes concentraciones de sustrato.
Ho: H1 = H2 = H3
Hi: Al menos una de las variables analizadas presenta diferencias significativas.

Hi: H1 H2 H3
Por otra parte, segn los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo se realiz
un estudio de tipo descriptivo en el que se plantearon las siguientes hiptesis
Ho: Las cepas enfrentadas presentan antagonismo

Hi: Las cepas enfrentadas no presentan antagonismo
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
Bioagrcola del Llano S.A. E.S.P, ubicada en Villavicencio (Meta) se ha convertido en un
puente entre la civilizacin y la biodiversidad, debido al Parque Ecolgico Reciclante, en el
que se encuentra ubicado el Relleno Sanitario Don Juanito. Este parque a travs del
tiempo ha dado respuesta a la necesidad de brindar una nueva imagen a la comunidad
demostrando una excelente gestin ya que brinda un adecuado manejo de los residuos
slidos logrando as un ecosistema benfico ( Galindo et al., 2005).
Por lo anterior, se demuestra la importancia de la obtencin de estos resultados ya que se

le proporcionar a Bioagrcola del Llano avances en cuanto a las posibilidades del
inoculante acelerante ya desarrollado con cepas amilolticas y proteolticas con una
actividad de 114.5 UA y 98.5 UP respectivamente (Rodrguez et al., 2005) las cuales
permitirn un mejoramiento continuo para optimizar la calidad del bioabono que se
comercializa en cultivos de la regin.
6.1 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
6.1.1 Aislamiento de Bacterias con Actividad Lipoltica
Las materias primas utilizadas para el aislamiento fueron: poda, residuos de plaza,
contenido ruminal y cascarilla de arroz.
A partir del screening inicial en medio lecitina despus de realizar las respectivas
diluciones, siembras en superficie e incubacin a 55C por 48 horas, se obtuvo un total de
9 cepas presuntivas (Tabla 4) debido a la presencia de un halo de hidrlisis, como
consecuencia de la utilizacin de la fuente de carbono del medio (cidos grasos
contenidos en la lecitina) estas se les realizo tcnicas de agotamiento para obtener cepas
purificadas. Luego de las siembras sucesivas se obtuvieron 3 cepas denominadas: L1, L2
y L3 (Figura 2a, b y c). Se debe tener en cuenta que la lecitina es el nombre comn para
un determinado tipo de fosfolpidos, estos son componentes importantes que se
encuentran en la estructura de todas las membranas celulares. De la misma manera la
lecitina, es una importante fuente de fosfolpidos, la cual es necesaria para todas las
clulas vivas. Las membranas de las clulas que regulan los nutrientes que pueden
penetrar o no en la clula, estn compuestas en gran medida de lecitina (Rivera y Garca,
2007).
Tabla 4. Cepas presuntivas lipolticas
Halo de
hidrlisis en mm
Cepa Lipoltica de dimetro
1L 1,5
2L 1,3
3L 1,2
4L 1,0
5L 1,0
6L 1,1
7L 1,0
8L 0,5
9L 0,8
Fuente: Autores, 2007
Cabe anotar que de las cepas aisladas nicamente tres presentaron un halo > de 1 mm
de dimetro se seleccionaron aquellas cepas que tenan un halo de hidrlisis entre 1.2mm
y 1.5 mm ya que estos fueron los mayores dimetros.
Sin embargo, en los mismos procesos algunas lipasas son reportadas con una alta
especificidad por cidos grasos. El ms amplio ejemplo es la lipasa extracelular aislada de
la cepa Geotrichum candidum, la cual es reportada por poseer una alta especificidad por
los cidos grasos insaturados (Strnsk et al., 2006). En la preparacin del inculo para
Geotrichum se utilizaron medios de cultivo que tenan al igual que el lecitina MgSO 4 y KCL
lo que otorga al microorganismo un sustrato favorable para su desarrollo, diferencindose
nicamente en la fuente de carbono (Aceite de Oliva), utilizado como inductor de lipasas
(Strnsk et al., 2006).
Figura 2a. Cepa aislada L1. Figura 2b. Cepa aislada L2.
Medio lecitina Medio lecitina
Figura 2c. Cepa aislada L3.
Medio lecitina
Figuras 2. a,b,c Cepas Purificada con un tiempo de incubacin de 48 horas a 55C.
En estudios recientes se ha encontrado que la mayora de microorganismos lipolticos y

sus enzimas se obtienen del suelo, donde se encuentran bacterias muy activas en el
reciclaje de nutrientes como las pertenecientes al gnero Bacillus y otros gneros
relacionados. Estos gneros estn considerados como una de las mayores fuentes de
enzimas con aplicacin industrial debido a que, en general, son microorganismos no
patgenos, bien estudiados y fciles de manipular, que producen y secretan grandes
cantidades de enzimas como lipasas, celulasas, entre otros ( Snellman, 2004).
6.1.2 Identificacin macro y microscpica de las cepas
De acuerdo al aislamiento, se identificaron morfologas macro y microscpicas de las 3

cepas, siendo 1 actinomycete y 2 bacterias (Tabla 5). Al realizar coloraciones de Gram, se
determino la presencia de bacilos gram positivos filamentosos para el actinomycete y
bacilos Gram negativos para las dos bacterias (Figura 3 a,b y c)
Tabla 5. Identificacin Macro y Microscpica de las colonias
Cepa Origen Morfologa Morfologa

Microscpica Macroscpica
Cepa L1 Pila No 3 Bacilos Gram Colonias cremosas

negativos de color amarillo
Cepa L2 Pila No 3 Bacilos Gram Colonias rugosas
negativos de color blanco
filamentosos
Cepa L3 Pila No 3 Bacilos Gram Colonias cremosas
de color amarillo
negativos
Fuente: Autores 2007.
Cepa L1. Bacilos Gram negativos Cepa L2. Bacilos Gram negativos
filamentosos
Cepa L3. Bacilos Gram
negativos
Fuente: Autores, 2007.
Figura 3 a,b,c . Coloraciones
de Gram
6.1.3 Criopreservacin de
Cepas
En total fueron criopreservadas 3 cepas con glicerol al 30 %(v/v). Cada cepa fue
almacenada en 35 viales a -70C para un total de 105 viales.
6.1.4 Pruebas de Antagonismo
Esta prueba se realiz con las 3 cepas seleccionadas como lipolticas, con el fin de
evaluar la posible inhibicin en el crecimiento. Se llevo acabo enfrentando las tres cepas
entre s. Los resultados no evidencian antagonismo entre las cepas seleccionadas (Figura
4), lo que favorecera su actividad en el inoculante, ya que estas pruebas tienen como
propsito evaluar la ausencia de inhibicin de crecimiento entre las cepas. El hecho de no
presentar inhibicin de crecimiento entre los microorganismos puede atribuirse a que
probablemente no liberan sustancias que impida el crecimiento de la cepa enfrentada o
las liberan en cantidades que no alcanzan a afectar su desarrollo. Tambin puede
deberse a que la produccin de sustancias inhibitorias se vea estimulada por condiciones
de estrs, como falta de nutrientes y en este caso el medio en el cual se desarrollaron
(agar lecitina) contena los nutrientes en cantidades necesarias para su crecimiento.
(Duran, 1996). As mismo cabe destacar que estas cepas posiblemente no presentan
antagonismo al ser aisladas de la misma fuente (residuos orgnicos) donde conviven sin
presentar ningn tipo de competencia por sustrato debido a que esta fuente muy
posiblemente cuenta con todos los requerimientos ptimos para su desarrollo.
Las pruebas se realizaron en agar lecitina, por triplicado; los resultados reflejan un posible
efecto de sinergismo que podra acelerar la degradacin de los residuos slidos presentes
en el compost, constituidos por lpidos, disminuyendo el tiempo del compostaje. (Tabla 6).
Tabla 6. Promedio de Resultados de las pruebas antagnicas.
(Dimetro de Halos en mm)
Cepa No L1 L2 L3
L1(R1) - 0 0
L2(R1) 0 - 0
L3(R1) 0 0 -

Figura 4. Enfrentamiento de cepas lipolticas sin halo de inhibicin
Las pruebas antagnicas tambin se realizaron enfrentando las cepas aisladas lipolticas
con las cepas del inculo, para evaluar si las cepas seleccionadas como lipolticas, tienen
efecto antagnico frente a las cepas del inculo. La cepa L1 (Figura 5) present efectos
antagnicos con las cepas 3P (Proteoltica), 4 A (Amiloltica), 5AP ( Actividad compartida:
Amiloltica y Proteoltica), 8AP ( Actividad compartida: Amiloltica y Proteoltica) y 14AP
(Actividad compartida: Amiloltica y Proteoltica) . Se tomo como dimetro de halo
representativo o inhibitorio (> 5mm). Los resultados reflejan que la cepa L1 tiene efecto
antagnico. Las pruebas antagnicas fueron realizadas en un medio que contena tres
fuentes de carbono para cumplir con las exigencias nutricionales de los microorganismos
evaluados. El medio contena 1%(p/v) leche, 1%(p/v) almidn y lecitina (Anexo1). La
pequea inhibicin presentada por la cepa 1 (Anexo 7) muy seguramente se present
debido a que en este caso si hubo una competencia por sustrato, tambin se puede
deber a que esta bacteria Gram negativa secreta sustancias que inhiben el crecimiento de
las cepas 3 P, 5AP, 8 AP y 14P es por esto necesario que en futuros estudios se realice
una identificacin bioqumica de dicho microorganismo para descartar una cepa patgena,
ya que sera perjudicial si se tuviera en cuenta al momento de ser adicionado en el inculo
debido a que este compost como ya se ha mencionado anteriormente es utilizado en
cultivos propios de la regin.
Figura 5. Enfrentamiento de cepas lipolticas con cepas de inculo
6.2 CURVAS DE CRECIMIENTO
Cabe resaltar que se hizo un estudio preliminar realizando una curva de 12 horas, y al
observar que el microorganismo, correspondiente a la cepa L3 no lleg a su fase de
muerte, se decidi realizar una curva de 18 horas. As mismo, en la curva de 12 horas se
tom como medio control el medio tributirina, para realizar los respectivos recuentos
(Anexo 6), arrojando resultados de ausencia de crecimiento en las primeras horas de la 0
a la 1 y , demostrando que el medio ptimo para su crecimiento es el medio lecitina.
Este medio contiene cidos grasos simples los cuales son de fcil asimilacin por los
microorganismos. De la misma manera se debe tener en cuenta que estos
microorganismos se encontraban en caldo lecitina, y es probable que al momento de
realizar la siembra a medio tributirina este pudo haber presentado estrs.
Para esto se determin un recuento inicial el cual report un recuento inicial de 10*10 5
UFC/ml en caldo lecitina y se evalu su crecimiento, produccin de biomasa en funcin
del tiempo (Figura 6).
Es importante resaltar que el microorganismo no presenta una fase de adaptacin debido

a lo mencionado anteriormente, presentando la fase exponencial desde la hora 0 a la 5
aproximadamente, observando luego su fase estacionaria hasta la hora 13, descendiendo
as hasta su fase de muerte en la hora 18.
12
10
8
Log UFC/mL
0
0 5 10 15 20
Tiempo (Horas)
Figura 6. Curva Produccin de biomasa en funcin del tiempo

Cepa L3.
La cepa L3 no present fase de adaptacin, sino que el microorganismo comienza la fase

exponencial aproximadamente a la hora 0 de fermentacin debido al pre inculo
realizado, alcanzando su mximo punto en la hora 8, evidencindose una pequea fase
estacionaria, para luego comenzar a descender hasta llegar a fase de muerte en la hora
18. Segn microscopia se observaron bacilos Gram negativos, este tipo de morfologa se
evidencia en gran parte de las bacterias aisladas del suelo ya que estn involucradas en
el reciclaje de nutrientes, es por esto que en el presente proyecto se obtuvieron dos cepas
con estas caractersticas.
Posteriormente se realiz una curva de crecimiento en caldo lecitina en donde se

determin la formacin de biomasa (Anexo 6) por un tiempo de 18 horas del
actinomycete aislado, para este al igual que la bacteria se realiz un inculo en 100 ml de
caldo lecitina bajo las siguientes condiciones 55C, 12 horas a 150 rpm, para esto se
determin un recuento inicial que report un valor de 25*107 UFC/ml.
14
12
10
Log UFC/mL
0
0 5 10 15 20
Tiempo (Horas)
Figura 7. Curva de crecimiento cepa L2. Actinomycete

Fuente: Autores: 2007.
Como se observa en la figura 7 de la hora 0 a la 8 se observa la fase de crecimiento

denominada trofofase que es donde se producen metabolitos secundarios, en este caso
lipasas. La ideofase se evidencia desde la hora 10 hasta la muerte que se da a la hora 18.
Por ultimo, la produccin de biomasa de los dos microorganismos evaluados present un

comportamiento ascendente en la produccin de biomasa. El descenso durante las curvas
de crecimiento puede deberse al agotamiento gradual de nutrientes presentes en el medio
lecitina (Ramrez et al., 2004). De la misma manera se debe tener en cuenta que en
procesos de fermentacin el crecimiento de los microorganismos se ve relacionado con el
tipo del medio, la temperatura, el pH, la composicin del medio, el volumen de
inoculacin, la aireacin entre otros ( Snellman, 2004).
6.3 CURVA DE CALIBRACIN
La curva de calibracin (Anexo 4) reporto un factor de correlacin (r2) de 0,996 indicando

la estrecha relacin entre los valores del eje X y los de Y, que finalmente se ve
representada en la distribucin lineal de la curva y por ende el comportamiento normal de
los datos. Sabiendo que el valor de r2, en los casos de la curva de calibracin, debe estar
cercano a 1 (Otlora et al., 2003).
6.3.1 ACTIVIDAD LIPOLTICA
La fermentacin de la cepa 3 tuvo un perodo inicial de 12 horas, bajo las siguientes

condiciones 150rpm a 55C, luego al observarse que el microorganismo no lleg a su fase
total de muerte se realizaron pruebas de 18 horas, en total se tomaron14 muestras, las
cuales fueron puestas a evaluacin enzimtica lipoltica por la tcnica de p-nitrofenol,
reportando los valores en el Anexo 5.
6.3.1.1 Estandarizacin del tiempo de contacto entre el sustrato y el extracto crudo
La primera evaluacin realizada fue la evaluacin del tiempo de contacto, en el cual se

cuantificaran ms unidades lipolticas, esto se hizo evaluando 30 y 60 minutos. En los
datos arrojados en la figura 14 si existen diferencias significativas entre estos dos tiempos
de contacto con un p<0,05 aceptando la hiptesis nula. Sugiriendo que el mejor tiempo de
contacto es el de 30 minutos pues es en este donde se ve mas la cuantificacin de la
actividad lipoltica (Figura 8). As mismo cabe resaltar que segn estudios reportados por
Gessesse et al., 2003, se tom un tiempo de contacto de 10 minutos, porque es en este
tiempo donde se presenta una mayor actividad enzimtica. Aunque, Neerupma y
Jagdeep, 2006 reportan un tiempo ptimo de 45 minutos.
30
25
20
UL
15
10
30 60
T. contacto
Figura 8. Tiempo de contacto

6.3.1.2 Estandarizacin de diferentes concentraciones de sustrato
La estandarizacin de la tcnica, se realiz probando diferentes concentraciones de p-

nitrofenil palmitato (0,08%(p/v), 0,5%(p/v) ,1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v)).
Transcurrido el tiempo de fermentacin 24h/55C/150 rpm de las cepas seleccionadas, la

enzima se obtuvo por centrifugacin, para la evaluacin cuantitativa de la actividad
enzimtica de cada una de las cepas, utilizando las diferentes concentraciones de
sustrato anteriormente mencionadas con el fin de determinar la concentracin ptima en
relacin con la mxima actividad lipoltica. Para llegar a encontrar la concentracin en la
cual se obtienen ms unidades lipolticas, primero se hizo un ensayo con las siguientes
concentraciones 0,08%(p/v),0.5%(p/v),1%(p/v) y de este primer ensayo se obtuvo que no
hay diferencias significativas (Anexo 10) entre las concentraciones de sustrato utilizadas,
rechazando la hiptesis nula con un p > 0,05.(Figura 9). Sin embargo la concentracin del
1% se acerca ms al valor de la media por lo tanto, se decidi probar concentraciones
ms altas para observar si as se logra encontrar la concentracin de sustrato en la cual
cuantifique mas la actividad enzimtica. As mismo durante estas evaluaciones se realiz
la evaluacin de la produccin de biomasa en funcin del tiempo (Figura 10).
18
16
14
12
10
UL
8
6
4
2
0
0,08 0,5 1
C. sustrato
Figura 9. Evaluacin de las diferentes concentraciones de sustrato.

Biomasa L3 vs UL al 1%
14 14
12 12
Log 10 UFC/ml
10 10
8 8 Log 10 UFC/ml
UL
6 6 UL
4 4
2 2
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tiempo (horas)
Figura 10. Curva de UL al 1% y produccin de biomasa en funcin del tiempo.
La produccin de enzima se lleva a cabo desde la hora 0 hasta la hora 8, se observa de la

misma manera un aumento en la produccin de biomasa, lo cual indica que esta se
encuentra asociada con la produccin de enzima, como ya se ha reportado (Ra et al.,
1997). De la misma manera la alta produccin de lipasa fue observada en la fase
logartmica en estudios presentados por Strnsky, 2006.
Por otra parte, en estudios realizados por Moreno et al., 2001 se evidencia una alta
produccin enzimtica asociada a la fase de crecimiento de los microorganismos.
Observando que este crecimiento es directamente proporcional a la produccin
enzimatica, segn los estudios realizados por Janny en el 2001.
En el segundo ensayo se evaluaron las concentraciones de 1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v),

y en esta segunda evaluacin tampoco se encontraron diferencias significativas entre
estas concentraciones con un p>0,05 rechazando la hiptesis nula (Figura 11). De la
misma manera se evalu la produccin de biomasa en funcin del tiempo (Figura 12).
30
25
20
UL
15
10
1 1,5 2
C.Sustrato
Figura 11. Segunda evaluacin de diferentes concentraciones de sustrato al 1%,

1.5% y 2%.
>
Biomasa L3 vs UL al 1,5%
14 35
12 30
Log 10 UFC/ml
10 25
8 20 Log 10 UFC/ml
UL
6 15 UL
4 10
2 5
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tiempo (horas)
Figura 12. Curva de UL al 1.5% y produccin de biomasa en funcin del tiempo
Segn lo observado, al igual que en la figura 14 hay un incremento en la produccin

enzimtica conforme aumenta su biomasa, observando la ptima produccin en la hora
10 aproximadamente. Es importante tener en cuenta que en estudios recientes se ha
demostrado que la produccin de las lipasas es afectada por el tipo del medio, la
temperatura, el pH, la composicin del medio, el volumen de inoculacin, la aireacin
entre otros. La composicin del medio de cultivo en particular la incorporacin de
diferentes sustancias lipdicas, pueden resultar de diferentes fuentes de produccin de
isoenzimas. Reportando en otros estudios que las lipasas y la especificidad por la
estereasa pueden ser modificadas variando las condiciones operacionales durante el
crecimiento (Arpigny y Jaeger, 2000).
6.3.1.3 Estandarizacin con diferentes volmenes de extracto crudo 20l, 500l y

700l
Adems de probar diferentes concentraciones de sustrato tambin se probaron diferentes

volmenes de extracto crudo para ver cual volumen cuantificaba ms enzima.
Transcurrido el tiempo de fermentacin 24h/55C/150 rpm de la cepa seleccionada, la
enzima se obtuvo por centrifugacin, para la cuantificacin de la actividad enzimtica, as
mismo en otros estudios para la extraccin de la enzima se manejaron parmetros
similares al de este estudio; se centrifuga a 5000 g por 10 minutos a 4C , de aqu se
obtiene el sobrenadante que es la fuente de la enzima, para determinar la actividad
lipoltica utilizaron al igual que p-nitrofenil palmitato como sustrato y una solucin stock de
p- nitrofenil a 20 mM fue preparada usando isopropanol. Trabajando con la solucin de
sustrato la cual fue preparada diluyendo el p-nitrofenil con la solucin stock 1:20 utilizando
20 mM Tris HCL buffer (Gessese, 2003). Se utilizaron diferentes volmenes de extracto
crudo (20l, 500l y 700l) con el fin de determinar el volumen ptimo en relacin con la
mxima actividad lipoltica, encontrando que existen evidencias significativas (Anexo 10)
entre los tres volmenes evaluados aceptando la hiptesis nula con un valor de p < 0,05
(Figura 13). Con este resultado los siguientes experimentos fueron realizados sin el
volumen de 20 l. sta diferencia estadsticamente significativa demuestra que la cantidad
de extracto es demasiado pequea para llevar a cabo la hidrlisis del ster p- nitrofenilo
de propionato (sustrato) (Jenny, 2001).
30
25
20
UL
15
10
20 500 700
V. de extracto
Figura 13. Estandarizacin de los diferentes volmenes de extracto crudo.
Luego de descartar el volumen de 20l, se realiz otro anlisis para ver si existan
diferencias significativas entre las concentraciones de 500l y 700l, encontrando, que
entre estos dos volmenes no existe diferencia significativa, rechazando la hiptesis nula
con un valor de p >0,05 (Figura 14). Es as que con estos resultados para trabajos futuros
se aconsejara utilizar el volumen de extracto crudo de 500l, ya que arroja resultados
confiables y se disminuira volumen de extracto.
30
25
20
UL
15
10
0
500 700
V. de extracto
Figura 14. Estandarizacin de los diferentes volmenes de extracto crudo.
Como se observa en la figura 16, no existen diferencias significativas entre los volmenes
evaluados. Confirmando los estudios de Neerupmaa Nawani y Jagdeep Kaur, 2006, que
usaron un volumen de trabajo entre 500l y 700l para sus estudios de cuantificacin de
lipasas extracelulares de Bacillus sp.
La adicin de Triton-x100 al buffer y al nitrofenil palmitato, hace que en el momento de la

cuantificacin de la actividad enzimtica, permita que la molcula de la enzima se
disperse cuando entra en contacto con esta solucin, lo que facilita la degradacin de los
lpidos (Shuen et al., 1996).
Segn un estudio de Moreno et al., 2001 la produccin de unidades lipolticas en

microorganismos aislados de una industria lctea arrojan valores entre 86,91-91,35 UL,
comparando con los resultados del presente estudio las unidades lipolticas obtenidas
oscilaron entre los valores de 28 y 31 UL, observando un nivel bajo de produccin de
enzima. Puede deberse a que el sitio de aislamiento de microorganismos lipolticos del
presente estudio no contiene niveles altos de grasa.
Por otra parte en estudios realizados por Janny et al., 2001 se observan valores
enzimticos mucho mas bajos (0.26 UL y 0.21UL) que los obtenidos en el presente
estudio, debido a que su fuente de aislamiento fue la caa de azcar.
Segn lo anterior, se corrobora que hay una relacin directa entre las caractersticas del
halo de hidrlisis y la actividad enzimtica, ya que los halos obtenidos por Moreno et al.,
2001 fueron de 9 mm de dimetro, a diferencia de este estudio que fueron de 1.5 mm.
6.4 Toma de muestras
Las materias primas utilizadas para el aislamiento fueron: poda, residuos de plaza,
contenido ruminal y cascarilla de arroz (Figura 15). As mismo, se llevo a cabo la toma de
muestras, correspondiente para el anlisis de patgenos humanos Escherichia coli y
Salmonella sp. Sin reportes de temperatura al momento del montaje, debido a que estos
se comenzaron a evaluar desde el da 3.
Figura 15. Conformacin de las pilas. Fuente: Autores 2007.
6.4.1 Determinacin de pH y Temperatura
Durante las 8 semanas que dur el proceso de compostaje, se determin pH y

temperatura a las 3 replicas (Figura 16). La temperatura se determin diariamente y el pH
semanalmente.
El proceso de compostaje, se describe comnmente como un proceso aerbico de

degradacin de materia orgnica, donde el calor esta relacionado con el consumo de
oxgeno debido al metabolismo microbiano, dando como resultado un incremento en la
temperatura (MacGregor et al., 2001).
Figura 16. Medicin de Temperatura. Fuente: Autores 2007.

Un sistema de compostaje es dinmico cuando hay una intensa actividad biolgica,
debido a los cambios en el sistema y a las condiciones del medio ambiente, en especial el
incremento en la temperatura (Sundberg, 2005). De la misma manera el valor de pH vara
en el compost con el tiempo durante el proceso, en este el pH inicial de la fraccin
orgnica de los residuos slidos urbanos se encuentran en valores de 5 y 7.
Se debe tener en cuenta que durante el proceso de compostaje se presentan tres fases
de acuerdo a la temperatura y a su efecto sobre los microorganismos; la primera
mesoflica o fase de temperatura moderada; hace que la temperatura se eleve
rpidamente hasta los 40C; segunda, la termoflica, donde se alcanzan temperaturas de
65C, la cual puede durar pocos das o semanas y finalmente la fase de maduracin y de
enfriamiento que tiene una duracin de semanas, obteniendo valores de temperatura de
40C hasta alcanzar la temperatura ambiente que indica que alcanz la fase de
maduracin. Por lo anterior, fue importante llevar a cabo un monitoreo de la temperatura,
cabe anotar que los resultados obtenidos son de los promedios alcanzados por las tres
pilas, ya que estas corresponden a un solo tratamiento (Anexo 2) (Figura 17).
70 10
60
Temperatura C
8
50
40 6 Temperatura (C)
pH
30 4 pH
20
10 2
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Semanas
Figura 17. Resultados de pH y Temperatura vs. Tiempo durante el proceso de

compostaje de residuos orgnicos, Fuente: Autores, 2007
De la misma manera, la energa liberada al inicio del proceso se emplea para elevar la
temperatura de la masa en el proceso secando el material por evaporacin
(Gmez, 1998), lo que permite el paso a la degradacin de diversos compuestos ya que a
medida que aumenta la temperatura se transformaron en molculas ms sencillas para
que microorganismos presentes en bajas temperaturas sinteticen completamente hasta
obtener compost.
Teniendo en cuenta los resultados observados en la figura 4, se puede decir que las pilas
comienzan a salir de la etapa mesoflica al tercer da, ya que se registra un valor de 50.21
C. En cuanto al pH, se observa un valor neutro lo cual indica que va en aumento para
alcanzar la etapa termoflica. A partir de la segunda semana se evidencia igualmente un
aumento de ambas variables, observando que el punto mximo se obtiene en la semana
6 cuando alcanza la etapa termoflica, encontrando una temperatura de 65.2C y un pH
entre 8 y 9 debido a que se presenta un consumo de cidos orgnicos por parte de los
microorganismos, adems en esta fase forman esporas a manera de resistencia
(Trautmann et al., 1999).
Por otro lado, el pH sufre cambios durante el proceso de compostaje, debido a los
cambios en la composicin qumica. En general el pH cae por debajo de la neutralidad en
el comienzo, durante la formacin de cidos orgnicos y mas adelante sube alrededor de
la neutralidad porque los cidos orgnicos son consumidos y hay produccin de amonio,
es por esto que durante el monitoreo se observ un aumento a medida que pasaban las
semanas, hasta que se alcanz un pH cercano a la neutralidad. Sin embargo, mientras
ocurre este cambio de acidez a neutralidad, se presentan alrededor de la semana 4
valores cercanos a la alcalinidad, esto debido a la adicin de cal (10 Kg/T de residuos)
que corrigi la acidificacin (Galindo et al., 2005); esto a su vez evita presencia de
vectores as como malos olores. De la misma manera se sabe que al adicionar cal o
hidrxido de calcio se aumenta la velocidad de degradacin de materiales orgnicos,
debido a la activacin de enzimas termfilas, que actan principalmente en pHs
comprendidos entre 7 y 9; este uso a su vez tiene una desventaja ya que se presentan
prdidas de nitrgeno en forma de amoniaco, debido al pH ligeramente bsico que
favorece su formacin (Gmez, 1998).
Finalmente en la semana 9 los resultados arrojados denotan una cada poco notoria tanto
del pH como de la temperatura, alcanzando valores de 6,5 y 52.45C respectivamente. Lo
anterior puede atribuirse a que probablemente hubo un largo perodo de termofilia (5
semanas) debido a que quiz ocurrieron desigualdades en la homogenizacin de los
residuos en el momento del volteo (Galindo et al., 2005) se present un alto porcentaje
en la fuente de carbono, en este caso Residuos de Plaza (55%) (Sylvia et al., 1999).
De la misma manera cabe resaltar que el pH en el proceso de compostaje es influenciado

por el CO2, el cual se forma durante el proceso de descomposicin, el cual puede
evaporarse como gas o disolverse en forma lquida como cido carbnico (H2CO3),
bicarbonato (HCO3) y carbonato (CO3 -2). Este sistema tiene dos constantes de disociacin
(pKa) 6.35 y 10.33 a 25C, las cuales tienden a neutralizar el pH en el compost,
aumentando un pH bajo y reduciendo un pH alto (Sundberg, 2005).
El amonio es formado cuando hay una descomposicin de las protenas durante la fase
inicial del compostaje gran parte del nitrgeno es metabolizado y retenido por
microorganismos que se encuentran en etapa de crecimiento (Sundberg, 2003). El
amoniaco tiene un pKa de 9.24 a 25C, lo que hace que haya un incremento en los
valores de pH. As mismo, como ya se mencion anteriormente, otro de los factores que
afectan dichos valores son los cidos orgnicos, donde predominan el acido actico y el
lctico, estos se han demostrado en estudios recientes que pueden disminuir el pH hasta
valores de 4.14 (Sundberg, 2005).
6.5 ANLISIS DE MICROORGANISMOS PATGENOS Escherichia.coli y Salmonella

sp.
El control sanitario del compost es de vital importancia, ste debe ser tratado de manera
adecuada debido a que ser utilizado como biofertilizante o nutriente del suelo, ya sea en
agricultura orgnica o inorgnica, dando lugar a la contaminacin de los productos y/o de
las fuentes de aguas, por lo que su aplicacin descontrolada constituye un peligro para la
salud pblica y una amenaza para el medio ambiente por la exposicin a
microorganismos patgenos que esto representa (Fundases, 2006).
6.5.1 NMP de Salmonella con medio Rappaport Vassiliadis semislido modificado
A lo largo del proceso se espera una reduccin de los agentes patgenos por accin de
diferentes condiciones como pH, temperatura, humedad, sustancias antibiticas, entre
otras (Turner, 2001).
En cuanto a la tcnica despus del tiempo de incubacin de cada juego se tomaron los
tubos con medio TSB que presentaron turbidez para llevar a cabo una siembra en
microgota (30ul), en medio Rappaport Vassiliadis semislido modificado (Figura 18), el
cual busca aislar cepas mviles de Salmonella sp.,detectando alrededor de la zona de
inoculacin un halo de crecimiento.
Despus del tiempo de incubacin, nicamente para las muestras iniciales, se repicaron
en medios selectivos XLT4 y Sulfito Bismuto (Figuras 19 y 20) (EPA, 1682).
Figura 18. Medio semislido Rappaport modificado con halo

Figura 19. Medio XLT4 con colonias Figura 20. Medio BS. Con colonias
presuntivas presuntivas
Fuente: Autores, 2007 Fuente: Autores, 2007
Teniendo en cuenta el fundamento del medio, para XLT4 se seleccionaron aquellas cajas
que presentaron colonias rosadas o rojas con centro negro y para Sulfito Bismuto,
colonias del color del medio con centro negro (Tabla 7), para posteriormente llevar a cabo
la realizacin de las respectivas bioqumicas TSI, LIA y rea (Anexo 8) (EPA Mtodo
1682, 1996).
Tabla 7 a, b,c Medios XLT4 y Sulfito Bismuto (Muestras Iniciales)
Promedio del No
de Colonias
Pila No 1 Caractersticas
Medio XLT4 Medio B.S
1. Juego serie
de cinco tubos 2 2
2. Juego
serie de cinco
tubos 1 1
3. Juego
serie de cinco
tubos 1 1
Promedio del No
de Colonias
Pila No 2 Caractersticas
1. Juego
serie de cinco
tubos 2 2
2. Juego
serie de cinco
tubos 2 1
3. Juego
serie de cinco
tubos 1 1
Promedio del No
de Colonias
Pila 3 Caractersticas
1. Juego serie
de cinco tubos 1 2
2. Juego serie
de cinco tubos 1 1
3. Juego serie
de cinco tubos 1 1

Luego de realizar las bioqumicas (Figura 21) estas tres arrojaron para algunos resultados
negativos y para otros positivos para Salmonella sp, es por esto que se debe tener en
cuenta que estas tres bioqumicas deben ser positivas (Anexo 9), informando tanto para
muestras iniciales como finales: < 0,006473 NMP/4g, resultado ptimo y adecuado al
comparar con el reportado por la NTC 5167 (< 1 NMP/4g).
Figura 21. Resultados de Bioqumicas para identificacin

de Salmonella sp. (TSI, LIA y rea positiva)
Considerando los resultados anteriores, es importante tener en cuenta la relacin de los

microorganismos patgenos con la temperatura de exposicin a la cual se presentar su
respectiva destruccin. Debido a esto importante enlazar los resultados de temperatura
obtenidos en las pilas para poder analizar la eliminacin de ste patgeno. Para llevar a
cabo la destruccin de Salmonella sp. es necesario exponerla a temperaturas entre 55C
y 60C temperaturas que se evidenciaron entre las semanas 2 y 4 del proceso de
compostaje. As mismo, en algunos estudios se ha demostrado que organismos fecales
son destruidos en el propio proceso, si las temperaturas en el rango termoflico se
mantienen por un tiempo suficiente y todo el material es sujeto a dichas temperaturas. Las
bacterias patgenas se destruyen rpidamente cuando todas las partes de la pila de
compost estn sujetas a temperaturas de 60C durante 30 a 60 minutos (Islam et al.,
2004). Cabe resaltar que este microoranismo a diferencia de Escherichia coli es
termosensible, es por esto que probablemente se obtuvo una total eliminacin del
patgeno (Turner, 2001).
La norma ICONTEC 5167, 2004, especifica la ausencia de Salmonella sp., y de acuerdo a
los resultados se indica que los materiales con los que se elaboraron las pilas en ningn
momento presentaron este indicador, por lo que el producto cumple con la norma
colombiana en materia de patgenos humanos (Anexo 9).
6.5.2 NMP Escherichia coli
Posterior a la incubacin a 37C por 24 horas, se tomaron como positivos (Tabla 8 y 9)

aquellos tubos que presentaron turbidez, fluorescencia con Luz UV a 365 nm y prueba de
indol positiva al adicionar reactivo de Kovacs (Figuras 22 y 23).
Figura 22. Turbidez e indol positivo Figura 23. Fluorescencia Positivo
Tabla 8. Promedios Resultados Materias Primas
MATERIA RESULTADO
PRIMA NMP/ 4 g
Rumen >2400
Poda 1100
Cascarilla 1100
Residuos de
plaza 4
Tabla 9. Promedios Muestras Finales
RESULTADO
Rplica NMP/ 4 g
Pila 1 4
Pila 2 180
Pila 3 8
Los resultados finales evidencian en la pila 2 que hubo una diferencia en el muestreo, ya
que se observa un valor alto a diferencia de las otras dos pilas. De la misma manera los
resultados arrojados muestran una disminucin al relacionar las muestras iniciales con
respecto a las finales, aunque es importante resaltar que en estudios se ha demostrado
que el tratamiento trmico provoca la reduccin de los indicadores fecales a niveles
comparables a muchos patgenos, particularmente bacterias patgenas, pero la
concentracin inicial de los indicadores es normalmente mayor en factores de 10 que la
de los patgenos, por lo que aunque su nmero disminuya siempre sobrevivir una
cantidad apreciable de estos microorganismos (EPA, 1992). Esto se debe a diferentes
factores como el origen de los materiales de elaboracin de las pilas, el comportamiento,
el tiempo de duracin de las fases, el pH, la humedad, la temperatura y la frecuencia de
los volteos, entre otros. De igual forma, se puede considerar que la adicin inicial de cal
en grandes proporciones durante la conformacin de las pilas, gener alcalinidad en el
medio facilitando el crecimiento microbiano y estimulando su actividad enzimtica (Turner,
2001).
As pues, se ha demostrado que en algunos casos se puede inducir la proliferacin de

agentes patgenos, los cuales pueden emerger y causar infecciones por el manejo del
material orgnico de uso agrcola. De igual forma, se ha encontrado resistencia y
supervivencia de Escherichia coli a temperaturas termoflicas de 60C de 2 a 21 meses,
debido a que este microorganismo se mantiene en fase de latencia y al final se expresa
nuevamente ( Lemunier et al., 2005).
En la degradacin llevada a cabo en termofilia 60-70C se estimula el crecimiento de

hongos y bacterias, los cuales sintetizan compuestos complejos, en este transcurso de
degradacin se generan mezclas de antibiticos y sustancias txicas (Ciemat, 2000). De
esta manera, la acidificacin del pH durante el proceso de compostaje depende de la
produccin de sustancias antibiticas, cidos o fitotoxinas, que pueden llegar a destruir
una gran parte de la poblacin patgena.
6.6 ANALISIS FISICOQUMICOS
A partir de estos resultados se determin la calidad del bioabono obtenido. Los

resultados fueron determinados por el laboratorio de referencia AGRILAB expresados en
base seca (Tabla 10).
ANLISIS DE MATERIALES ORGNICOS
-Composicin nutricional
IDENTIFICACIN INICIAL FINAL
ANLISIS
Humedad DE MATERIALES ORGNICOS 66,9 42,03
CARACTERIZACIN
Nitrgeno (Norg) 1,86 1,62
IDENTIFICACIN INICIAL FINAL
Fsroro total 1,126 1,03
Humedad (%)
Potasio total 2,166,9 42,06
2,01
Cenizas (%)
Calcio total 3,3738,9 56,86
3,31
Perdidas por volatilizacin (%) 61,1 43,13
Magnesio total 1,01 1,04
Carbono Orgnico Oxidable (%) 25,36 13,2
Azufre total 0,3 0,28
Ph 8,13 7,57
Hierro total 0,77 0,84
Densidad (g/c.c) 0,45 0,67
Manganeso total 43,13 431
Conductividad Elctrica (Ds/m) 7,16 11,9
Cobre total 30 28,6
Capacidad Retencin Humedad (%) 231 103
Zinc total 127 118,3
Capacidad Intercambio Catinico 55,9 49,1
Boro total (Norg) (%)
Nitrgeno 30,331,86 31
1,62
Sodio
C/N total 435013,6 4516,6
8
Residuo insoluble en cido 29,26 48,76
(Promedio de tres replicas de pilas de compostaje)
(Promedio
RESULTADOS de tres
ENreplicas de pilas de
BASE SECA
compostaje)
RESULTADOS EN BASE SECA
Fuente: AGRILAB, 2007
La humedad es uno de los factores ms importantes en el proceso de compostaje. Si su

contenido es muy bajo, se detiene la actividad microbiolgica del proceso; y si es muy alto
se dan condiciones anxicas porque el agua desplaza al aire de los espacios libres
existentes (Soto, 2003). Para que un proceso de compostaje sea exitoso es necesario que
la humedad de la materia orgnica inicial se encuentre entre el 40 y 60%(Sylvia et
al.,1999) , sin embargo este parmetro comparado con la humedad inicial de las replicas
de pilas de compostaje se acerca poco a la norma, observndose que durante el
transcurso del proceso este disminuy considerablemente.
El porcentaje de humedad al finalizar el proceso fu alto (42,3%) de acuerdo al lmite

establecido en la NTC 5167, 2004 reportando que el lmite mximo de humedad es 35%
este hecho evidencia la necesidad de alargar el tiempo de la etapa de maduracin. Segn
otros reportes para que un compost sea comercialmente aceptable debe tener una
humedad < 40%. (Pal et al., 1996). Esto hace pensar que la humedad se pudo ver
influenciada por las materias primas empleadas, sabiendo que los residuos de plaza y el
contenido ruminal son los que presentan cantidades altas de humedad.
Por otra parte la densidad (g/c.c) se encuentra asociado a la porosidad, el cual se define
como el espacio del material orgnico que no es ocupado por la matriz slida, que
permitir el flujo de aire y de agua. Segn los resultados obtenidos (0.67%), este valor se
acerca considerablemente a la norma ICONTEC (0.6%). Las altas porosidades (mas del
50 %) se consideran favorables para el adecuado desarrollo de las especies vegetales
(Gmez, 1998).
El carbono orgnico oxidable determina el contenido de materia orgnica, y la materia

orgnica da ciertas propiedades al suelo, este valor debe aumentar mnimo al 15% para
cumplir con lo establecido en la norma ICONTEC 5167 del 2004. El valor obtenido en este
estudio cumple con lo que se establece en la norma puesto que se obtuvo un valor final
de 13,2%.
La capacidad de intercambio catinico (C.I.C) es la capacidad que tiene la materia

orgnica de extraer cationes del suelo como K+, Ca++, Mg++ aportndole nutrientes a la
planta. Para abonos orgnicos esta debe ser mnimo de 30% .Se encontr un valor final
de 49,1% obteniendo un resultado ptimo para lo que establece la norma ICONTEC 5167
del 2004. Este valor obtenido indica una alta capacidad de atraer cationes de la solucin
de suelo, evitando su lixiviacin o prdida y mantenindolos para que la planta pueda
tomarlos (Galindo et al., 2005)
Por otra parte estn los parmetros que estn directamente influenciados por elementos
como el carbono y el nitrgeno. La relacin C/N, obtuvo un resultado final de 8 .Este
resultado, comparado con otros estudios realizados en un compost producido a partir de
residuos urbanos slidos en la cuidad de Sogamoso de 4,26 es bajo , determinando que
el origen de las materias primas usadas est directamente relacionado con la fuente de
nitrgeno que es este caso es elevada, permitiendole a las bacterias que lo agoten
rapidamente dejando el nitrgeno no utilizado en forma de amonio.
De igual forma, se expres el porcentaje de nitrgeno total, dentro del cual se encuentra
el nitrgeno mineral y orgnico. El orgnico es el elemento que forma parte considerable
del suelo ya que supera el 98%. Por esta razn un abono de buena calidad debe estar
reportado entre el 2% y 3% (Gmez, 2000). Es por esto que segn los resultados
obtenidos (1.63%) se observa un valor relativamente bajo lo cual puede deberse como un
consumo excesivo de la fuente de nitrgeno para la sntesis de compuestos de carbono.
Tambin se tuvo en cuenta el anlisis inicial y final de dos metales pesados cobre y zinc,
la evaluacin de estos metales pesados en el compost es importante puesto que estos
pueden aumentar su concentracin en las cosechas y ser txicos para los seres
humanos. Estos dos metales no estn contemplados en NTC 5167, 2004. Sin embargo
segn Labrador, 2001 el lmite permisible de estos metales son para cobre 450 ppm y zinc
1.100 ppm. Se observ que en los resultados obtenidos por el laboratorio de referencia se
obtuvieron valores que estn en los rangos permisibles para estos metales en el
tratamiento evaluado.
En cuanto al contenido de macro y micronutrientes estos deberan aumentar al finalizar el

proceso. Se espera que estos lleguen a valores superiores del 1% segn lo establecido
en la norma ICONTEC 5167, muchos de estos nutrientes cumplieron este parmetro.
El compost obtenido se clasifica segn la NTC 5167, 2004 en abono orgnico que es un
producto solido obtenido a partir de la estabilizacin de residuos animales o vegetales.
7.- CONCLUSIONES
Se aislaron 3 cepas L1, L2 y L3, de las cuales L1 present antagonismo.

A partir de la cepa L3 con actividad enzimtica lipoltica se logr estandarizar una
tcnica cuantitativa para detectar lipasas utilizando como sustrato principal el p-
nitrofenil palmitato utilizando concentraciones de sustrato desde 0.08% y un
volumen de extracto crudo desde 500ul.
La cepa lipoltica L3 present una actividad mxima entre 29 y 30 UL definiendo
una UL como la cantidad necesaria para liberar una una umol/min/L.
El compost obtenido result con N orgnico1.59%, P 1.32%, K 2.53% y respecto a
Escherichia coli y Salmonella sp presentaron una disminucin en la cantidad
probablemente porque las replicas alcanzaron una temperatura mxima de de
65.2 en la semana 6.
8.- RECOMENDACIONES
Producir un inoculante biolgico con las 14 cepas que se han manejado en la

empresa Bioagrcola del Llano adicionando las dos cepas lipolticas aisladas, con
el fin de evaluar su actividad llevando a cabo un nuevo montaje de pilas.
Realizar curvas de actividad enzimtica manejando volmenes de extracto crudo
entre 20 ul y 500 ul y tiempo de contacto entre 10 y 30 minutos.
Caracterizar bioqumicamente las cepas aisladas y evaluar otras caractersticas
como promocin de crecimiento vegetal y actividad enzimtica.
Realizar estudios alternos para el aislamiento de microorganismos pectinolticos
para potencializar la efectividad del inculo.
9.- REFERENCIAS
Adams M, Perler F, Kelly R 1995 Extremozymes: expanding the limits of

biocatalyst. Bio/Technology, 13: 662-668.
Ashok, P; Sailas, B; Zoclo, CR; Nigam, P; Krieger, N; Zoclo, VT. 1999 The
realm of microbial lipases in biotechnology. Biotechnol. Appl. Biochem. 29: 119-
131.
Arpigny, J y Jaeger, K. 2000 Bacterial Lipolytic enzymes: clasification and

properties. Biochem. J 343: 177-183.
Atlas R y Bartha R. 2001. Ecologa Microbiana y Microbiologia Ambiental.

Addison Wesley. Espaa. pp. 292 295.
Beffa, T; Blanc, M; Marchianni, M. 2006 Isolation of Thermus strains from hot

composts ( 60C to 80C) Applied and Enviromental Mycrobiology. Vol 62. N
5: 1723-1727.
Beisson, F; Arondel, V y Verger, R. 2000 Assaying Arabidopsis lipase

activity. Biochem. Soc. Trans. 28: 773-775.
Beltrn, S; Torrado, Y; Martnez, M y Matiz, A. 2005. Aislamiento de

bacterias con actividad fosfato solubilizadora a partir de suelos cidos del
Norte de Boyac y Produccin de un inculo mixto en una fermentacin
discontinua. Trabajo de grado. Microbiologa Industrial. pp 32-34.
Benjamn, S y Pandey , A; 1998 Candida rugosa lipase: molecular biology

and versatility in biotechnology. Yeast, 14: 1069-1087.
Bjrkling, F; Godtfredsen, SE; Kira, O. 1991 The future impact of industrial

lipases. Trends Biotechnol. 9: 360-363.
Bornscheuer, U. 2002 Microbial carboxyl esterases: classification, properties
and application in biocatalysis. FEMS Microbial. Rev. 26: 73-81.
Carballo, G. Microbiologa industrial: los microorganismos de inters industrial.

Editorial Acribia. Zaragaza Espaa. 2000.
Chaininian, H; Ali, B; Abousalham, A y Petri, S. 2005 Substrate specificity

and kinetic properties of enzymes belonging to the hormona-sensitive lipase
family: Comparison with non lipolytic and lipolytic carboxylestereasa.
Biochimica Et Biophysica ACTA. 1738: 29-36.
Cheetham, P. 2005 Principles of industrial biocatalysis and bioprocessing,

Handbook of enzyme biotechnology. UK: Elis Horwood. pp. 83-234.
CIEMAT, R 2000 Centro de Investigaciones Energticas, Medioambientales y

Tecnolgicas. Gua Tcnica.
Cuevas Prez F, Medina Bass N, Daz Lpez GS, Morejn Rivera R. 2000
Efecto de la biofertilizacion con bacterias rizofricas en el cultivo del tomate.
Avances 2: 15-21. ISSN 1562.3297. La Habana.
Durn, L. 1996 Aislamiento de bacterias fosfato solubilizadoras en fincas de

los municipios de Bojac, Gachancip, Sop del Departamento de
Cundinamarca. Pontificia Universidad Javeriana. Colombia pp 36-45.
EPA Environmental Protection Agency 2006. An analysis of composting as

an environmental remediation technology. EPA 530-R-98-008. USA.
EPA Environmental Protection Agency July 2005. Salmonella in Sewage

Sludge (Biosolids) by Modified Semisolid Rappaport-Vassiliadis (MSRV)
Medium. EPA-821-R-06-14. USA.
FUNDASES. Febrero 2006 Boletn Informativo Tcnico sobre compostaje. Ao
3 No 3.
Galindo, C; Londoo, N; Martnez, M y Matiz, A. Agosto, 2005 Aislamiento

de bacterias termfilas y hongos mesfilos a partir de la fraccin orgnica de
residuos slidos urbanos. Bogot Colombia. Trabajo de grado Microbiologa
Agrcola pp 30-42.
Gauze, G. 1967. Conferencia de antibiticos elaborados con hongos. La

Habana Cuba. Editorial Universitaria La Habana pp 32-40.
Gessese, A; Dueholm, T; Steffen, B; 2003 Lipase and Protease extraction

from activated sludge. Journal Microbiol Biotechnol. Vol 37: 3652-3657.
Gigliotti, G; Kaiser, K; Guggenberger, G. and Haumaier, l. 2002. differences

in the Chemical Composition of Dissolved Organic Matter from Waste Material
of Different Sources. Biology and Fertility Soils 36:321-329.
Gmez, C; Lomabana, P; Martnez, M; Penaranda, V. 1998. Tratamiento de

Residuos slidos del municipio de Gramalote para la produccin de compost.
Bogot Colombia. Trabajo de Grado Microbiologa Industrial pp 49-51.
Horton, R. 2003. Bioqumica. Editorial Prentice Hall. Mxico. Pp 90-97.
Houde, A; Kademi, A; Leblanc, D 2004. Lipases and their industrial

applications: an overview. Appl. Biochem. Biotechnol. 118: 155-170.
Hubble, J. 1990. Tecnologa de las enzimas. Acribia. Zaragoza Espaa. pp

52-57.
Imamura, S; Kitaura, S; 2000 Purification and characterization of a

monoacylglycerol lipase from the moderately thermophilic Bacillus sp. H-257, J.
Biochem.,127: 419-25.
Islam, M; Morgan, J; Doyle, M; 2004 Fate of Salmonella enterica Serovar
Typhimurium on Carrots and Radishes Grown in Fields Treated with
Contaminated Manure Composts or Irrigation Water. Appl, Envir MIcrobiol. Vol
70 No. 4: 2497-2
Jaeger, KE. 1999 Bacterial biocatalysts: molecular biology, three-dimensional

structures, and biotechnological applications of lipases. Annu. Rev. Microbiol.
53: 315-351.
Janny, C; Odette, H; Berrio, R; Martnez, S 2001. Produccin y

caracterizacin de las lipasas de Aspergillus niger y A. fumigatus. Seccin de
Biotecnologa Aplicada. Centro de Ingeniera de Procesos, Facultad de
Ingeniera Qumica. Instituto Superior Politcnico .Jos Antonio Echeverra. Vol
18: 216-220.
Kampen, V 1999 Modifying the substrate specifity of Staphylococcal lipases.

Biochemestry. 38 (29)
Lemunier. M. Francou. F. Rousseaux. S., Houot. S., Dantigny. p., Piveteau.

P., Guzzo. J. 2005. Long Term Survival Pathogenic and Sanititation Indicator
Bacteria in Experimental Biowastw Compost. France. February. P 1-8.
Lpez, E., 1999. Tratamientos enzimticos en la Industria. UNED pp 23-40.
Lozano, A 2005 Produccin de Biofertilizantes de Laboratorio a Campo.

Universidad Nacional de Colombia pp 56-71.
Luque M, O., 1997. Alternativas econmicas para el manejo de residuos

Orgnicos en centros de reciclaje. Fundacin para la investigacin agrcola,
(Ed.), X Jornada de Conservacin Ambiental, Valencia, Venezuela, 18 - 20 de
Julio de 1997, 10 pp.
Macgregor, S; Miller, F; Psarianos, K 2001 Composting Process Control
Based on Interaction Between Microbial Heat Output and Temperature. Applied
and Enviromental Mycrobiology. Vol 41. N 6: 1321- 1330.
Madigan, M. 1997. Brock Biologa de los microorganismos. Editorial/Prentice

may Inc. Mxico. 466-470p.
Moreno. X., Oate. M. Martnez, M. M., Pedroza. A. 2001. Produccin de un

Inoculo Acelerador de Compostaje a partir de Bacterias Lipoliticas y
Proteolticas Aisladas de un Tren de Tratamiento de Residuos en una Industria
Lctea. Trabajo de Grado. Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad
Javeriana. Bogota. P 70-89
Neerupmaa, N y Jagdeep, K; 2006 Studies on lipolytic isoenzymes from a

thermophilic Bacillus sp. Production, purification and biochemical
characterization. Enzyme and microbial technology. Vol 40 881-887.
Norma Tcnica Colombiana 5167. 2004. Productos Para la Industria

Agrcola. Productos Orgnicos Usados como Abonos o Fertilizantes y
Enmiendas de Suelo. Editada por ICONTEC. Bogot-Colombia.
Otlora, J., Patio, L., Martnez, M y Pedroza, A., 2003. Estandarizacin de

prueba para la deteccin de fosfatasa producida por Bacterias solubilizadoras
de fosfatos. Pregrado Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias.
Departamento de Microbiologa. Bogot-Colombia 136 p.
Pez, A., Castro, D., Martnez, M., Pedroza. A., 2000. Produccin de un
inculo acelerador de compost a partir de bacterias termfilas. Pregrado.
Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de
Microbiologa. Bogot-Colombia. 89p.
Palomino, M., Snchez, Y., Martnez, M. M., Pedroza. A 2002. Evaluacin de
un Inoculante Termoflico como Acelerador del Proceso de Compostaje de
Residuos Slidos Municipales realizado en Sogamoso (Boyac). Pregrado.
Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de
Microbiologa. Bogota-Colombia.P 82.
Pal et al., 1996. Comparison between conventional soil tests and the use of
resin capsules for measuring P, K and N in two soils under two moisture
conditions. Soil science and Plant nutrition. Vol 46 No 2 Pg 461-471.
Prez, O; 1999 Compost de materiales orgnicos provenientes de la planta de

tratamiento de aguas residuales de Alpina-Sopo, II CONGRESO
INTERNACIONAL DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL, Mayo, Bogot D.C.
Colombia.
Poutou, R; Amador, E; Candelario, M. 1994. Banco primario: Caracterizacin

y papel en la produccin de protenas recombinantes. Centro de Ingeniera
Gentica y Biotecnologa Aplicada. Sociedad Iberoamericana de Biotecnologa.
11 (1):55-59.
Ramirez, J.; Quevedo, B.; Lopez, E. y Renjifo, J. 2004. Purification

and partial characterization of phospolipases A2 from Brothops aspe
(Barba amarilla), snake venom from Chiriguana, Cesar, Colombia.
Journal of Venom Animal Toxins Incl. Trop. Dis. Vol 10 No. 3. Pp. 242-
259.
Rivera, C y Garca, F. 2007. Enzimas Lipoticas y su aplicacin en la Industria

del Aceite. Centro de Investigaciones Biologgicas del Noreste, A.P. 128, La
Paz Baja California Sur, Mxico. Vol 11 (2): 37- 43.
Roder, R 1998 Composting Bensale P.A 19020. pp 32-40

Rodrguez, D; Ruz, M; Martnez, M; Matiz, A. 2005. Evaluacin de un inculo
termoflico con actividad enzimtica amiloltica y proteoltica acelerador del
proceso de compostajeen diferentes mezclas de residuos slidos urbanos.
Microbiologa Industrial. pp 78-92.
Rodrguez E, Rueda A, Pedroza A, Poutou R. 2002. Aislamiento,

identificacin y caracterizacin de bacterias termflicas aerbicas, con
actividad proteoltica, a partir de pilas de compost en fase termoflica. Biologa
y Ciencias de la Salud., pp. 1- 13.
Ra, L; Dannert, CS; Wahl, S; Sprauer, A. 1997 Thermoalkhalophilic lipase of

Bacillus thermocatenulatus large-scale production and properties: agregation
behaviour and its effect on activity. Journal of Biotechnology (56): 89-102.
Salcedo, E., 1998. El compost Una alternativa con actualidad y futuro.78

Guadalajara, 170 pp.
Snchez, T., 1999. Proyecto de Lipasas. Departamento de ingeniera Qumica

de la Universidad de Barcelona., pp. 25-39
Scragg, A. 2002. Biotecnologia Mediombiental. Acribia. Espaa., pp. 27-52,

97-127.
Shuen, L., Chiou, C., Yeh, C., Tsai, Y., 1996. Purification and partial
characterizacion of an alkaline lipase from Pseudomonas pseudoalcaligenes
F111. Applied and Enviromental Mycrobiology. Vol 62. N 3: 1093-1095.
Snellman, A y Colwell, R. 2004. Acinetobacter lipases: molecular biology ,

biochemical properties and biotechnological potential. J and Microbiol
Biotechnol 31: 391-400.
Soto M, G., 2003. Abonos orgnicos, Principios, aplicaciones e impacto en la
agricultura. En: Abonos orgnicos: definiciones y procesos, Centro Agronmico
Tropical de Investigacin y Enseanza (CATIE), San Jos, C.R., pp. 20 49.
Stefan, J; Ehud Ir; Frederick C 2006 Succession of Bacterial Communities

during Early Plant Development: Transition from Seed to Root and Effect of
Compost Amendment. Applied and Enviromental Mycrobiology. Vol 72. N 6:
3975-3983.
Stell, R., y Torrie, J. 1998. Bioestadstica: Principios y procedimientos

segunda edicin. McGraw-Hill. Bogot-Colombia. 622.p
Stock, A., 2002, Manual de Gestin de Residuos y Slidos Urbanos. Instituto

minero metalrgico de Cuba. Enero, pp. 69-90
Strnsky, K; Zarevcka, M; Kejk, Z; Wimmer, Z; Mackova, M; 2006

Substrate specificity, regioselectivity and hydrolytic activity o lipases activated
from Geotrichum sp. Biochemical Engineering Journal. Vol 34: 209-216.
Sundberg, C; 2005 Proving compost process efficiency by controlling aeration,

temperature and pH. Faculty of Natural Resources and Agricultural Science
Department of Biometry and engineering upssala. Doctoral Thesis.
Sylvia, D., Fuhrmann, J., Hartel, P. y Zuberer, D. 1998. Principles and

Applications of Soil Microbiology. Pubishers/ Prentice Hall, Inc. NJ, USA pp
115-132.
Sztern, D y Pravia, M. 1999 Organizacin Panamericana de la Salud. Manual

para la elaboracin de compost: bases conceptuales y procedimientos.
Uruguay. 69p.
Trautmann, N y Olynciw, E; 1999 Compost Microorganism Chemistry. Cornell

Composting Science and Engineering.
Tsai, S; Liu, C; Yang, S. 2006 Microbial conversion of food wastes for
biofertilizer production with thermophilic lipolytic microbes. Elsevier Vol 32 No
7: 904-915.
Turner. C. 2001 The Thermal Inactivation of E. coli In Straw and Pig Manure.
Universidad de los Andes, Facultad de Ingeniera 2003 Departamento de

Ingeniera civil y ambiental, Centro de Investigaciones en Ingeniera Ambiental-
CIIA. Protocolo muestreo de compost. 2p.
U. S. Environmental Protection Agency (1992). Environmental Regukations

and Technology: control of pathogens and vector attraction in sewage sludge.
Office of Research and Development. pp 90.
Vasquez, E. 2003. Gua para compostaje y manejo de suelos. Convenio Adres

Bello. Bogot., pp. 12-27.
Wiseman, A 1995 Introduction to principles. In: Handbook of Enzyme

Biotechnology. 3rd ed. Wiseman A (ed). Padstow, Cornwall, Uk: Ellis Horwood
Ltd. T.J. Press Ltd., pp. 3-8.
Zeikus, G., Vielle C., Savchenco A., 1998. Thermoenzymes: Biotechnology

and structure function relationships. Extremophiles. 2. 179-183
Anexo 1
Medio Leche- Almidn al 1%

Componentes g/l
Leche en polvo descremada 10

Almidn 10
Extracto de Levadura 2.5
Peptona Universal 2.5
Sulfato de Amonio 0.5
Cloruro de calcio 0.5
Fosfato monobsico de potasio 0.1
Fosfato dibsico de potasio 0.1
Agar 15
Medio Lquido TSB

Componentes en g/l
Peptona pancretica de casena 17g

Peptona de harina de soya 3.0
Cloruro de sodio 5
Fosfato dipotsico 2.5
Dextrosa 2.5
Medio Rappaport Vassiliadis Modificado

Componentes en g/l
Triptosa 4.59
Cloruro de sodio 7.34
Fosfato monopotsico 1.4
Cloruro de Magnesio 10.93
Verde Malaquita 0.037
Agar 2.7
Medio Lecitina
Componentes g/100ml
Fosfato de amonio dibsico 0,10

Cloruro de potasio 0.02
Sulfato de Magnesio* 7 H2O 0.02
Extracto de levadura 0.3
Agar 2
Adicin de Yema de huevo: 1 yema en 100 ml de NaCl al 0.85% (p/v).

Anexo 2
Temperatura y pH de las 3 rplicas
REPLICA 1
DIAS T C
3 47.3 1 N.R
4 48.5 2 N.R
5 50.1 3 55.6
6 51.3 4 50.3
7 51.8 5 52.8
8 52.4 6 54.5
9 53.6 7 57.3
10 N.R 8 N.R
11 N.R 9 61.7
12 54.6 10 64.2
13 55.4 11 63.1
14 56.2 12 60.7
15 57.5 13 58.5
16 58.4 14 58.6
17 N.R 15 N.R
18 N.R 16 60.2
19 60.9 17 59.3
20 59.2 18 60.5
21 54.8 19 61.2
22 50.9 20 N.R
23 52.3 21 60.7
24 N.R 22 N.R
25 52.8 23 N.R
26 53.1 24 58.9
27 53.4 25 58.0
28 53.9 26 57.1
29 54.7 27 N.R
30 54.9 28 54.3
29 N.R
30 N.R
31 51.2
FUENTE: BIOAGRICOLA,
2007 1 50.7
REPLICA 2
DIAS TC
3 46.4 1 N.R
4 47.1 2 N.R
5 47.9 3 57.9
6 48.3 4 56.6
7 49.2 5 57.3
8 50.6 6 58.1
9 51.2 7 58.5
10 N.R 8 N.R
11 N.R 9 59.5
12 53.8 10 60.2
13 54.5 11 58.7
14 55.9 12 58.4
15 56.7 13 58.2
16 58.7 14 N.R
17 N.R 15 N.R
18 N.R 16 58.7
19 60.2 17 60.3
20 59.3 18 60.3
21 55.1 19 60.7
22 50.4 20 60.5
23 52.6 21 60.2
24 N.R 22 N.R
25 52.8 23 N.R
26 53.5 24 60.1
27 53.7 25 58.2
28 54.6 26 56.1
29 55.8 27 N.R
30 56.1 28 N.R
29 N.R
30 N.R
31 52.1
FUENTE:BIOAGRICOLA,
2007 1 50.3
REPLICA 3
DIAS TC
3 49.2 1 N.R
4 49.7 2 59.7
5 50.3 3 48.0
6 50.8 4 51.4
7 51.7 5 54.7
8 52.4 6 56.3
9 N.R 7 N.R
10 N.R 8 58.1
11 54.8 9 58.1
12 55.9 10 58.4
13 60.8 11 58.6
14 61.9 12 58.8
15 63.2 13 N.R
16 N.R 14 N.R
17 N.R 15 60.3
18 67.8 16 61.5
19 67.3 17 62.4
20 64.1 18 62.0
21 62.4 19 60.1
22 67.2 20 60.1
23 N.R 21 N.R
24 65.2 22 N.R
25 65.8 23 59.3
26 64.2 24 57.8
27 63.4 25 57.1
28 63.0 26 56.0
29 62.3 27 55.6
30 N.R 28 N.R
29 50.9
30 50.8
31 50.6
FUENTE: BIOAGRICOLA,
2007 1 50
Semana Valores de pH
Pila 1 Pila 2 Pila 3
Junio 3 7.3 7.2 7.5
Junio 27 8.06 8.07 8.0
Julio 4 8.17 8.35 8.0
Julio 11 8.16 8.41 8.25
Julio 18 8.4 8.4 8.17
Julio 25 8.32 8.1 7.75
Agosto 9 6.8 7.04 6.96
Anexo 3
Preparacin de Buffer Fosfato Concentracin 1 M
1. Preparar 57.7 ml de Na2HPO4 concentracin 1M

2. Preparar 42.3 ml de NaH2PO4 concentracin 1M
3. Mezclar lentamente las dos soluciones
4. Ajustar pH a +- 7
Anexo 4
Curva Patrn p-nitrofenol
Fueron elaboradas dos rplicas de la misma solucin stock de p-nitrofenil, con el fin de
obtener datos significativos
Concentracin (u mol/ ml) Promedio de Absorbancias

0.2 0.175
0.3 0.267
0.4 0.346
0.5 0.486
0.6 0.577
0.7 0.717
0.8 0.829
0.9 0.918
Ecuacin: Y: mx+b
X: y-b/m
m: 1.09
b:-0.06
r:0.99
Curva de calibracin p-nitrofenol. Fuente: Autores, 2007
Anexo 5
TABLAS DE DATOS DE LAS PRUEBAS REALIZADAS
Promedio de absorbancias de actividad enzimtica en curva de 12 horas de la cepa

3 con P-nitrofenil a concentraciones de sustrato 0.08%, 0.5% y 1%, en medio
lecitina .Con 500 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos y
Unidades Lipoliticas (umol/min/l)
Hora Absorbancia UL Absorbancia UL Absorbancia UL

0.08% (umol/m 0.5% (umol/mi 1% (umol/mi
in/l) n/l) n/l)
0 0.037 2.9 0.044 3.2 0.052 3.4

0.138 6 0.128 5.8 0.082 4.4
1 0.180 7.3 0.222 8.6 0.122 5.6
1 0.196 7.8 0.313 11.33 0.151 6.5
2 0.251 9.53 0.354 12.66 0.261 9.83
4 0.272 10.16 0.364 12.96 0.276 10.2
6 0.342 12.3 0.388 13.7 0.373 13.23
8 0.305 11.16 0.378 13.4 0.473 16.26
10 0.292 10.66 0.364 12.96 0.452 15.58
12 0.281 10.43 0.351 12.56 0.425 14.8

3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 0.08%, 0.5% y 1%, en medio
lecitina
con 700 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos

0.08% (umol/ 0.5% (umol/m 1% (umol/mi
min/l) in/l) n/l)
0 0.112 5.3 0.261 9.8 0.124 5.6
0.167 5.3 0.304 10 0.138 6
1 0.246 9.6 0.305 11.16 0.146 6.2
1 0.255 9.6 0.321 11.93 0.159 6.73
2 0.275 10.26 0.352 12.6 0.191 7.7
4 0.304 11.2 0.364 12.96 0.275 10.26
6 0.320 11.63 0.355 12.7 0.375 13.3
8 0.313 11.4 0.343 12.33 0.361 12.86
10 0.282 10.46 0.343 12.33 0.324 11.73
12 0.271 10.13 0.333 12 0.305 11.16
3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina

1% (umol/m 1.5% (umol/m 2% (umol/mi
in/l) in/l) n/l)
0 0.213 8,3 0.493 16.9 0.524 17.86
0.409 14.33 0.539 18.33 0.560 18.96
1 0.490 16.83 0.685 22.76 0.639 21.36
1 0.498 17.06 0.702 23.3 0.679 22.6
2 0.515 17.6 0.724 23.96 0.698 23.16
4 0.558 18.9 0.757 26.83 0.712 23.6
6 0.701 23.26 1.151 30.5 0.951 30.93
8 0.725 24 0.945 30.73 0.930 29.43
10 0.700 23.23 0.902 29.43 0.885 28.9
12 0.658 21.96 0.896 25.26 0.802 26.36
14 0.639 21.36 0.723 22 0.793 26.1
16 0.498 17.06 0.501 17.16 0.413 14.46
18 0.215 8.4 0.325 11.76 0.301 11.3

Hora Absorbancia UL Absorbanci UL Absorbancia UL

1% (umol/ a 1.5% (umol/min/ 2% (umol/mi
min/l) l) n/l)
0 0.513 17.53 0.637 21.3 0.542 18.4
0.654 21.83 0.750 23.16 0.650 21.7
1 0.702 23.3 0.778 25.63 0.679 22.6
1 0.785 25.83 0.785 26.13 0.702 23.3
2 0.801 26.33 0.793 26.93 0.750 24.76
4 0.823 27 0.824 28.26 0.785 25.83
6 0.898 29.3 1.155 29.33 0.998 32.36
8 0.900 29.36 0.906 29.53 0.899 29.33
10 0.855 27.96 0.899 29.33 0.795 27.43
12 0.705 23.4 0.878 28.7 0.755 2.93
14 0.527 17.96 0.756 23.13 0.746 24.63
16 0.462 14.13 0.585 19.73 0.520 17.73
18 0.102 14.4 0.398 11.76 0.415 14.53
Hora Absorban UL Absorbancia UL Absorbancia UL

cia 1% (umol/min/ 1.5% (umol/mi 2% (umol/mi
l) n/l) n/l)
0 0.541 9.18 0.610 10.23 0.646 10.78
0.560 9.48 0.650 10.35 0.673 11.2
1 0.585 9.86 0.692 11.51 0.676 10.11
1 0.602 10.11 0.701 12.5 0.700 11.61
2 0.689 11.45 0.710 12.93 0.708 11.75
4 0.791 13.01 0.761 14.63 0.750 12.38
6 0.802 13.18 0.787 16.16 1.002 16.23
8 0.850 13.91 0.859 17.18 0.999 16.2
10 0.799 13.13 0.865 17.31 0.863 14.11
12 0.658 10.98 0.899 16.1 0.795 13.06
14 0.499 8.55 0.823 11.93 0.723 11.96
16 0.205 4.05 0.639 10.68 0.612 10.28
18 0.125 2.83 0.539 8.86 0.438 7.61

Hora UL Absorbancia UL Absorbancia UL Absorbancia

(umol/mi 1% (umol/mi 1.5% (umol/ 2%
n/l) n/l) min/l)
0 10.08 0.600 11.15 0.670 10.78 0.605
10.85 0.650 12.68 0.770 12.01 0.726
1 11.45 0.689 12.95 0.787 10.93 0.655
1 11.6 0.699 13.21 0.805 11.85 0.782
2 12.43 0.753 13.4 0.817 13.18 0.802
4 13.18 0.802 15.7 0.867 13.58 0.827
6 14.05 0.859 18.33 0.878 17.78 1.103
8 14.66 0.899 17.83 0.889 16.38 1.012
10 13.15 0.900 16.33 0.893 14.7 0.901
12 11.65 0.702 14.33 0.895 14.63 0.897
14 7.26 0.415 11.55 0.855 13.38 0.815
16 5.51 0.301 9.85 0.620 10.38 0.619
18 3.98 0.201 5.88 0.598 8.41 0.490
Anexo 6
Recuentos de las cepas aisladas
CEPA L3 B
RECUENTO
HORA UFC/ml
0 8,0E+05
30 3,00E+06
1 1,50E+07
1 y 30 2,00E+07
2 9,00E+08
4 1,20E+10
6 4,00E+10
8 1,80E+10
10 3,00E+10
12 2,10E+09
14 2,30E+08
16 8,00E+07
18 5,00E+05
CEPA L2
RECUENTO
HORA UFC/ml
0 3,0E+07
30 8,00E+07
1 5,00E+08
1 y 30 1,30E+09
2 2,80E+09
4 1,50E+10
6 2,30E+10
8 1,80E+12
10 1,50E+10
12 3,00E+09
14 1,00E+08
16 5,00E+06
18 2,00E+06
Anexo 7
Resultados pruebas de antagonismo en mm

Cepa No 2P 3P 4A 5AP 6P 7 8AP 9AP 10AP 11P 12AP 13P 14P

L1(R1) 0 1,0 0 1,3 0 0 1,5 0 0 0 0 0 1,4
L1 (R2) 0 0 0 1,5 0 0 1,3 0 0 0 0 0 1,2
L1(R3) 0 1,6 1,5 1,0 0 0 1,0 0 0 0 0 0 1,5
L2(R1) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
L2(R2) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
L2(R3) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
L3(R1) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
L3(R2) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
L3(R3) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Anexo 8
Pruebas Bioqumicas de las Colonias Positivas
Pila 1 Colonias presutivas Bioqumica Replica
Sulfito Bismuto y XLT4
1 Urea:Negativo Negativo
TSI: Posititivo Positivo
LIA: Positivo Positivo
3 Urea: Negativo Negativo
TSI: Negativo Negativo
LIA: Negativo Negativo
TSI: Negativo Negativo
TSI:Positivo Positivo
LIA:Negativo Negativo
Pila 2 1 Urea:Negativo Negativo
LIA:Positivo Positivo
TSI:Negativo Negativo
Pila 3 1 Urea:Negativo Negativo

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLTICAS Y DETERMINACIN DE PATGENOS

LEIDY ANDREA CEPEDA PATIO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLTICAS Y DETERMINACIN DE PATGENOS

LEIDY ANDREA CEPEDA PATIO

Dra. Adriana Matiz Villamil Dra. Mara Mercedes Martnez

Dra. Andrea Aguirre Dr. David Gmez

AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLTICAS Y DETERMINACIN DE PATGENOS

LEIDY ANDREA CEPEDA PATIO

Dra. ANGELA UMAA MUOZ.,M.Phil Dra. Janeth Arias

Leidy Andrea Cepeda Patio

A Dios por haberme acompaado en el transcurso de mi carrera. A mi

Sandra Patricia Valencia Crdenas.

2.- MARCO TERICO 2

2.6 MICROORGANISMOS PATGENOS

Tabla 1. Tiempo y temperatura de eliminacin de patgenos comunes en

Figura 1. Mecanismos de accin de las lipasas (Arpigny y Jaeger, 2000). 11

Anexo 1. Medio Leche- Almidn al 1% 77

Este proyecto de investigacin se fundamenta en el aislamiento de microorganismos

Igualmente se hizo una caracterizacin fisicoqumica al producto obtenido (bioabono) en

They also made a physicochemical characterization on the product (bioabono) Agrilab,

La generacin de residuos slidos municipales, vara en funcin de diferentes factores

Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este proyecto de investigacin, fue aislar

El compostaje es la descomposicin biolgica y la estabilizacin de sustratos orgnicos,

2.1.1 Beneficios del Uso del Compost

El compost se obtiene industrialmente por la transformacin biolgica de la materia

Los cidos resultantes de los procesos de degradacin de la materia orgnica disuelven

El nitrgeno contenido en el compost se encuentra en forma asimilable por las races y

El compost incorpora al terreno micro y oligo elementos (cobre, magnesio, zinc,

Fsicamente, la aplicacin de compost reduce la erosin y mejora la estructura del suelo,

2.1.2 Factores de Importancia

En la composicin elemental del sustrato, se encuentra la cantidad relativa de carbono,

Conviene mezclar materiales de origen vegetal y animal para procurar un contenido

Un contenido menor de nitrgeno no permite la formacin de biomasa microbiana

La actividad metablica de los microorganismos, al actuar sobre los sustratos orgnicos,

Es importante tener en cuenta que para determinado grupo de microorganismos existen

Tabla 1. Tiempo y temperatura de eliminacin de patgenos comunes en materiales

Microorganismo Tiempo Temperatura

El diseo de un proceso de compostaje debe tener en cuenta la destruccin de

En la pila de compostaje, el balance de la humedad es importante, ya que bajos valores

As pues, la humedad de la pila de compostaje debe oscilar entre el 60 al 70% (Fundases,

As mismo es importante resaltar como se menciona en estudios recientes que la

La actividad microbiana generalmente ocurre en la superficie de las partculas orgnicas.

Porcentaje de lquido efectivo (% LE)

2.2 PROPIEDADES FSICO QUMICAS DE LOS RESIDUOS COMPOSTABLES

2.2.1 Propiedades Fsicas.

La descomposicin es llevada a cabo esencialmente en un ambiente acuoso. Los

2.2.2 Propiedades Qumicas.

La aplicacin de residuos orgnicos y desechos de una amplia variedad de actividades

En la materia orgnica procesada, una parte de las sustancias orgnicas es soluble en

2.3 ESTRUCTURA DE LPIDOS Y GENERALIDADES DE LAS LIPASAS

Las lipasas son parte de la familia de las hidrolasas, catalizan la hidrlisis de

El mecanismo de accin de las lipasas consiste en la hidrlisis de un cido graso en

Ambientalmente las lipasas son utilizadas en inoculantes como depurador de tratamientos

R1C------ OR 2 + H2O----------------- R1C-------OH----R2OH

Figura 1. Mecanismos de accin de las lipasas (Arpigny y Jaeger, 2000).

2.4.2 Enzimas Termoestables

Las enzimas estables se encuentran generalmente en organismos adaptados a vivir en

En cuanto al crecimiento microbiano a temperaturas elevadas se pueden destacar las

Las termoenzimas son aquellas que se producen a temperaturas aproximadas de 60C y

De la misma manera, los microorganismos extremfilos han despertado un gran inters

La aplicabilidad de grupos enzimticos depende de la capacidad de hidrolizar polmeros