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PROTEINE

Le proteine hanno un meccanismo di biosintesi molto articolato e molto curato dalla cellula. Esse
svolgono numerose funzioni, da quelle strutturali a quelle metaboliche e alla segnalazione con
altre cellule, ovvero nelle interazioni. Ricordiamo che quando si usano termini come sentire e
rispondere in relazione alle cellule si intende riassumere le loro interazioni. La biosintesi delle
proteine richiede un grande dispendio energetico, perch il prodotto finale deve essere di qualit,
inoltre vi sono dei controlli di qualit successivi alla biosintesi e meccanismi molto articolati di
degradazione delle proteine. Infatti, dato che c' bisogno di proteine ad alta efficienza, esse
vengono continuamente degradate: non conveniente intervenire con riparazioni sulle proteine, che
possono essere danneggiate da reazioni, ad esempio quelle
con i radicali liberi. Ci sono dei meccanismi di
riconoscimento delle proteine difettose che vengono poi
degradate (turnover), affinch la cellula disponga sempre
di proteine funzionanti.
Le proteine si formano a partire dagli amminoacidi, uniti
l'uno all'altro tramite un legame ammidico detto in questo
caso legame peptidico.

Amminoacidi

Gli amminoacidi sono molecole chirali, ovvero la loro struttura non simmetrica e la loro
immagine speculare non loro sovrapponibile, infatti ricordiamo che un atomo di C con 4
sostituenti diversi d vita ad una molecola asimmetrica.

Nella biosintesi naturale vengono usati solo gli L-amminoacidi. Ricordiamo che la dicitura D/L
deriva dalla gliceraldeide, l'aldoso pi semplice, in relazione al suo potere ottico rotatorio
destrogiro, posseduto dalla struttura con OH a destra nella proiezione di Fischer canonica, o
levogiro per la struttura con OH a sinistra. Perci le molecole con H a sinistra nella proiezione di
Fischer appartengono alla classe D, mentre quelle con H a destra alla classe L. La chiralit pu
essere indicata anche con il sistema R/S, da cui si pu risalire alla struttura esatta della molecola,
mentre la dicitura D/L non univoca.

Ogni ammonoacido ha una catena laterale che ne definisce le propriet. Tra i 20 amminoacidi
delle proteine, l'unico achirale la glicina perch la sua catena laterale semplicemente H e
possiede perci un piano di simmetria.
Amminoacidi con gruppi non polari (idrofobici):

Si noti che la prolina ciclica e ci ha delle conseguenze


sulle proteine in cui si trova.

Amminoacidi con gruppi aromatici (idrofobici):

Amminoacidi con gruppi polari non carichi:

Si noti che le catene laterali non necessariamente sono


cariche, ma possono essere cariche a seconda
del loro pKa, che influenzato dall'ambiente circostante.
Ad esempio, il pKa della cisteina diminuisce
se intorno ci sono molte cariche positive che
stabilizzano la sua carica negativa.

Amminoacidi con gruppi carichi positivamente (basici):

Amminoacidi con gruppi laterali carichi


negativamente (acidi):
Con la combinazione dei 20 amminoacidi si possono avere numerosissime proteine e alterazioni
anche di un solo amminoacido possono cambiare le propriet delle proteine: ad esempio,
nell'emoglobina basta una sostituzione di glutammato con valina, ovvero un gruppo carico
sostituito da un gruppo apolare, affinch l'emoglobina non sia pi in grado svolgere la sua funzione
e insorga l'anemia falciforme. Ci sono per altre mutazioni che vengono ben sopportate. Il
polipeptide normalmente cerca di arrangiarsi con le catene idrofobiche lontano dall'acqua e con
quelle positive e negative che interagiscono tra loro. Le porzioni delle proteine che sopportano
bene le mutazioni sono quelle che non causano variazioni nell'organizzazione spaziale.

La convenzione nella scrittura dei polipeptidi vuole che il primo amminoacido nel nome sia quello
che porta il gruppo amminico libero, ovvero l'N-terminale, mentre l'ultimo amminoacido nel nome
quello C-terminale. Ad esempio, seril-valil-tirosil-cisteina, ovvero N-seril-valil-tirosil-cisteina-C:

Comportamento acido-base di amminoacidi, polipeptidi e proteine

Dissociazione degli amminoacidi: ad esempio, l'alanina ha pKa1=2,34 e pKa2=9,69, perci a pH<2 si


trova come +H3N-CHCH3-COOH, a pH=6 +H3N-CHCH3-COO- mentre a pH>10 H2N-CHCH3-
COO-.
Vi un valore di pH in cui la molecola ha una carica positiva e una negativa ed perci
elettricamente neutra: tale valore di pH il punto isoelettrico (pI) e per calcolarlo basta fare la
media tra i due pKa di dissociazione.
In una proteina, i gruppi amminici e carbossilici sono legati e non possono dissociarsi e influire
sul pI, che determinato perci solo dalle catene laterali degli amminoacidi. Il pI non si calcola
facendo la media aritmetica di tutti i pK delle catene laterali ma solo tra i due gruppi che danno
carica +1 e -1. La predizione teorica del pI deriva da valori tabulati di pK di dissociazione, ma non
detto che il pI teorico coincida con il pI reale, perch i gruppi si influenzano tra di loro. Perci
per determinare il pI reale si usano dei metodi sperimentali: uno di questi, l'elettroforesi, consiste
nel sottoporre la molecola ad un campo elettrico ad un certo pH e farla migrare, non si fa in
soluzione perch la proteina diffonderebbe immediatamente, bens si fa su un gel nelle cui maglie la
proteina deve passare e il campo elettrico si genera applicando degli elettrodi alle estremit del gel,
inoltre con delle colorazioni vengono evidenziate le bande generate dalla proteina. Vi una tecnica
di separazione svincolata dalle dimensioni della proteina; se per i pori del gel sono di dimensioni
paragonabili a quelle della proteina, essi ne ostacolano la migrazione, perci si usa il sodio dodecil-
solfato o SDS:

CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-SO3- +Na

un detergente che denatura la


proteina e le conferisce una carica
negativa tale da mascherare le
cariche originarie, facendo in
modo che le proteine migrino
solo in base alle dimensioni.
Un altro metodo consiste nel
generare attraverso il gel un
gradiente di pH: la proteina
migra secondo la sua carica,
trovandosi man mano a diversi
pH, e si ferma in corrispondenza
del suo pI. Si fa perci una
localizzazione isoelettrica,
lasciando che le proteine si
dispongano in bande secondo il pI,
poi la striscia di gel con gradiente
di pH viene posta su una lastra di
gel perpendicolarmente al campo
elettrico, in cui le proteine
migrano secondo il loro peso
molecolare: questo metodo
consente di conoscere sia il pI sia
il peso molecolare delle proteine.

Le proteine al pI sono in condizioni di massima insolubilit, perch con una carica complessiva
neutra le varie componenti della proteine tendono a interagire tra di loro e intergiscono poco con la
soluzione acquosa circostante, mentre lontano dal pI le interazioni interne diminuiscono a favore di
quelle esterne. Infatti, le proteine al pI precipitano pi facilmente che fuori dal pI. Due proteine al
punto isoelettrico, ovvero con la stessa carica netta, non interagiscono, mentre ad altri valori di pH
che fanno variare la loro carica possono interagire.

Funzioni delle proteine

Le proteine costituiscono enzimi, ormoni (come l'insulina), ovvero molecole regolatrici, proteine di
riserva (ferritina), di trasporto (emoglobina, trasportatori di membrana), strutturali (collagene), di
protezione (anticorpi), proteine contrattili (actina e miosina), proteine tossiche (veleni).
Con la tecnica prima descritta, che consente di separare le proteine da un lisato in base al loro pI e
peso molecolare, in E. coli sono state trovate oltre 4000 diverse proteine, ma potrebbero essere
anche di pi in caso ci fossero proteine con stesso pI e stesso peso.
Struttura delle proteine

La struttura di una proteina definita da quattro livelli di organizzazione: ci sono strutture


caratteristiche che si ripetono nelle proteine e la loro struttura finale una combinazione di queste
strutture pi semplici, infatti per la natura stessa della proteina si possono individuare delle
sottoclassi di struttura. Conviene pensare alle forze, perci ai legami, che determinano una
particolare sottostruttura.
La struttura primaria data
dalla sequenza degli
amminoacidi (polipeptide),
che viene letta dall'N-
terminale al C-terminale.
La struttura secondaria una
strutturazione che nasce nella
sequenza amminoacidica nella
quale vengono coinvolti in
maniera ripetitiva i gruppi
che fanno parte dello
scheletro carbonioso, ovvero
di quel filo ideale che
collega tutti gli amminoacidi e
prescinde dalle catene laterali.
Per ogni coppia di
amminoacidi, c' un gruppo
-CO- carbonilico e un gruppo
-NH- ammidico: O e N hanno
un'elettronegativit
comparabile, perci tra i due
l'H forma un legame a
idrogeno che, entro certi
limiti, prescinde dalla catena
laterale, formando -eliche e
foglietti-.
La struttura secondaria si complica ulteriormente per dare la struttura terziaria, definita dalle
interazioni in cui sono coinvolti i gruppi laterali e da tutte le altre interazioni possibili.
Tutte le proteine hanno una struttura primaria, secondaria e terziaria, ma non tutte hanno una
struttura quaternaria, infatti questa il frutto delle interazioni che si verificano tra polipeptidi
diversi: o dalla interazione di un polipeptide con un'altra copia di se stesso, oppure dall'interazione
di polipeptidi diversi, si parla perci rispettivamente di omomultimeri e eteromultimeri.

L'analisi delle relazioni tra sequenze amminoacidiche e struttura tridimensionale delle proteine sta
chiarendo le regole che governano il ripiegamento delle proteine: si sta cominciando a capire
come prevedere la forma assunta dalle proteine, ad esempio certe sequenze amminoacidiche si
trovano sempre in strutture simili, perci bisogna disporre della struttura di molte proteine derivata
sperimentalmente (da cristallizzazione e spettro di diffrazione, oppure analisi in risonanza
magnetica), si costruisce cos una banca dati delle strutture e delle sequenze coinvolte. Non c'
una corrispondenza diretta tra una particolare sequenza e una particolare struttura, questo
problema va affrontato caso per caso.
Se una proteina deve assolvere una certa funzione e questa associata ad un particolare
arrangiamento strutturale della proteina stessa, necessario che i suoi siti di legame siano ben
definiti e precisi per essere specifici: una mutazione sulla molecola proteica pu portare alla perdita
o all'alterazione della funzione della proteina. Perci si pu verificare se nella sequenza
amminoacidica sono presenti mutazioni e studiare come il cambiamento della sequenza influenzi la
struttura e la funzione, oppure confrontare proteine che svolgono la stessa funzione in organismi
diversi.
Il confronto tra la sequenza di una stessa proteina in specie diverse fornisce informazioni sulle vie
seguite dall'evoluzione: si possono definire delle omologie strutturali tra specie diverse, ad esempio
il citocromo C una proteina molto conservata nell'evoluzione, infatti il citocromo C fa da
connessione tra O e i processi ossidativi che devono avvenire nelle cellule, perci ogni organismo
aerobio ha bisogno di questa proteina. Infatti il citocromo C lega l'O per permettergli di acquistare
gli elettroni derivanti dai processi ossidativi della cellula, l'O ossida il NADH a NAD+ e si riduce
assumento 2H, questo processo rigenera NAD+ e libera energia, che viene sfruttata per rigenerare
ATP da ADP.
Gli amminoacidi
vengono indicati con un
codice di tre lettere o di
una sola, per rendere pi
agevole la scrittura delle
sequenze primarie delle
proteine. Si pu quindi
studiare il numero di
variazioni
amminoacidiche nel
citocromo C rispetto
all'uomo, ad esempio
nella scimmia varia un
solo amminoacido e nel
lievito 44, quindi nelle
diverse specie ci sono
diverse proteine che
riescono tutte a svolgere
la funzione di accettore dell'O e interattore con il sistema ossidativo. Facendo questi confronti, ci si
accorge che ci sono degli amminoacidi nella sequenza del citocromo che non cambiano mai nelle
varie specie: evidente che a quegli amminoacidi assegnato un ruolo particolare, sono detti
amminoacidi essenziali, sono chiamati a generare un particolare assetto nella struttura
responsabile della funzione del citocromo, ma essi da soli non sono sufficienti, il resto della
struttura fa da impalcatura che consente agli amminoacidi essenziali di posizionarsi nel modo
migliore. Tutte le volte che nell'evoluzione si verificata una mutazione per un amminoacido
essenziale, quella specie diventata meno competitiva e la mutazione stata cos eliminata. I dati
ottenuti possono essere riportati su un albero filogenetico, dove si trovano grosse analogie con
alberi che si ottengono confrontando le stesse specie con parametri diversi.
Confrontando le strutture dei citocromi nelle diverse specie, si vede che c' una particolare nicchia
in cui si colloca il gruppo eme, un gruppo prostetico, non proteico, presente anche nell'emoglobina
e in alcuni enzimi, uno strumento attraverso il quale si manifesta una certa funzione, infatti esso
lega l'O che nel caso del citocromo C viene usato per ossidare i cofattori piridinici ridotti mentre
nell'emoglobina tale legame fuzionale al trasporto dell'ossigeno ai tessuti.
Sequenze amminoacidiche diverse possono dar luogo a strutture molto simili, questo indice del
fatto che una serie di amminoacidi nella sequenza ha un ruolo strutturale, l'importante che non ci
siano impedimenti per un certo residuo ad ottenere una certa struttura, ma non necessario che ci
siano gli stessi amminoacidi, mentre stringente la presenza degli amminoacidi essenziali, che
svolgono la funzione della proteina.
Parziale carattere di doppio legame del legame peptidico e struttura secondaria

Il legame peptidico coinvolge l'N che ha un doppietto libero e il C carbonilico che pu


delocalizzare carica sull'O, perci si pu scrivere anche una struttura di risonanza con N+ e O-: le
due forme di risonanza non sono equivalenti perch nella seconda c' uno squilibrio di carica e
risulta perci meno probabile della prima forma. La struttura che pi si avvicina alla realt ha una
parziale delocalizzazione di elettroni su O e una parziale carica positiva su N e un legame C-N-O
che ha un parziale carattere di doppio legame, infatti non n semplice n doppio. Si dice quindi
che il legame peptidico ha un parziale carattere di doppio legame, perci offre difficolt alla
rotazione attorno ad esso, c' un orbitale molecolare e un parziale orbitale , questo ha molta
importanza perch tra ogni amminoacido della catena polipeptidica c' un vincolo di rotazione,
perci il numero di strutture assumibili dal polipeptide, per quanto alto, pi basso di quello che
si sarebbe ottenuto con un legame semplice. Perci, pi che a una collana di perle, il polipeptide
somiglia a un accostamento di piani.

La lunghezza del legame C=O 1,24 , leggermente maggiore della previsione teorica, il legame
C-C 1,51 , concordemente alla previsione teorica per un legame singolo, e il legame C-N di
circa 1,33 , mentre teoricamente, se fosse singolo, avrebbe una lunghezza di 1,47 , e tale
discrepanza conferma il fatto che parzialmente doppio. Il piano individuato da ogni amminoacido
quello del legame peptidico CO-NH e attorno a questo legame non vi libera rotazione, invece
gli unici legami che possono dare rotazione sono tra il C- e il gruppo amminico (rotazione ) e
tra il C- e il C carbonilico (rotazione ), tra i quali il C- fa da perno. Ci si pu chiedere se tutte
le combinazioni di rotazioni e hanno la stessa energia: in realt non tutti gli angoli di rotazione
sono favorevoli, perch alcuni danno problemi di ingrombro sterico, soprattutto tra i gruppi C=O,
perci la molecola tende a disporsi con angoli che ne garantiscono la maggiore stabilit.

L'angolo di 0 di rotazione, ovvero =0 e =0,


si ha quando il legame C-N in trans rispetto al
legame C=O e quando il legame C-C trans
rispetto a N-H. Fissato questo punto di partenza, i
due legami possono ruotare in senso orario oppure
antiorario, quindi si definisce + la rotazione in
senso orario dell'uno rispetto all'altro e in senso
antiorario.
Ramachandran ha fatto uno studio teorico in cui ha razionalizzato questi parametri, costruendo
virtualmente un tripeptide e studiando le diverse energie che competono ad ogni coppia di angoli.
Il grafico di Ramachandran raccoglie le sue conclusioni: sugli assi sono riportati e , e ci sono
delle zone dette zone consentite che sono ad energia pi bassa, perci sono le pi probabili. I
risultati sperimentali combaciano con le previsioni di Ramachandran: per fare queste misure si
cristallizza una proteina, si fa la diffrazione a raggi X e poi, per ogni amminoacido, si misurano
sperimentalmente gli angoli e . Molti di questi amminoacidi si trovano nelle zone permesse da
Ramachandran. Le zone permesse pi estese sono le coppie di angoli che definiscono le -eliche e i
foglietti-, ovvero definiscono strutture di una certa stabilit. Vi sono anche strutture random ma
sono molto pi rare.

Ad esempio, nella catalasi di Micrococcus


lysodeikticus, molti amminoacidi si trovano nelle zone
permesse, ma si vede che il tutto va al di l dell'energia
associata agli angoli e . Una zona quella dell'-
elica destrorsa, l'altra dei foglietti-, l'altra dell'-elica
sinistrorsa. Gli amminoacidi si trovano nelle zone
permesse da Ramachandran perch nella molecola
proteica si realizza anche un'altra peculiarit. Accade
anche che alcuni amminoacidi tendono a trovarsi in
certe zone pi di altre: la glicina si trova sia nelle -
eliche sinistrorse, sia nelle strutture random, infatti essa
ha il minore ingombro sterico di tutti gli amminoacidi.
L'-elica sinistrorsa meno stabile di quella destrorsa,
infatti la buca di potenziale per -elica destrorsa e per il
foglietto- pi profonda. In ogni caso, l'energia di
tutta la struttura influisce sugli angoli tra i singoli
amminoacidi, ovvero la struttura assumer lo stato
conformazionale a energia pi bassa condizionato da
tutta la struttura. Perci non stupisce il fatto che ci
siano amminoacidi che si trovano anche in zone
random: sono amminoacidi che vengono costretti ad
assumere uno stato energetico pi alto a favore della
bassa energia del resto della struttura, ovvero in totale
la struttura a bassa energia ma localmente ci possono
essere delle tensioni.

La struttura secondaria data dall'interazione tra C=O e NH, ovvero i gruppi che determinano la
rotazione attorno al legame peptidico, e ad essa non contribuiscono le catene laterali. Linus
Pauling stato tra i primi ad indagare queste strutture delle proteine.
La proteina si pu arrangiare elicoidalmente, questo pu avvenire in maniera destrorsa o
sinistrorsa, a formare -eliche. Gli angoli e di un arrangiamento elicoidale sono =-57,8 e
=-47, che corrisponde ad una buca di potenziale di Ramachandran. Quello che si realizza che
tra i gruppi NH e C=O si formano dei legami che stabilizzano la struttura con la coppia di angoli
prevista da Ramachandran, ovvero questa coppia di angoli trova nella struttura elicoidale
un'ulteriore stabilizzazione. Infatti, nell'elicoide, tra il C=O di una spira e l'N-H della successiva si
pu formare un legame a idrogeno, e precisamente ogni 4 amminoacidi: ci accade in un'-elica
destrorsa. Le catene laterali degli amminoacidi protrudono dall'asse dell'elica, disponibili per
interazioni. Si possono generare pi tratti di -elica, che viene interrotta da interazioni tra le
catene laterali degli amminoacidi che si attraggono, determinando cos la struttura terziaria.
Ricordiamo che la polimericit della molecola proteica permette che ci siano interazioni che
stabilizzano le coppie di angoli a bassa energia.
Vi una peculiarit che ha a che fare con la prolina, che un amminoacido particolare, infatti la
sua catena laterale si chiude sull'N amminico, che pu comunque formare il legame peptidico, ma
una volta inserita una prolina in una sequenza di amminoacidi, l'angolo sempre libero di ruotare,
ma l'angolo non pi libero perch bloccato dal ciclo. Per questo motivo, quando c' una
prolina, l'-elica destabilizzata, interrotta, perci da quel punto in poi c' un tratto che non riesce
ad organizzarsi in una spira. La presenza della
prolina influenza la struttura proteica: quando la
prolina in posizione trans, la catena
amminoacidica distesa, e l'-elica viene
distesa per un tratto ma poi continua, ma se la
prolina fosse in cis, la catena si ripiegherebbe e
l'-elica tornerebbe su se stessa. In tutte le
proteine, la prolina in trans: ci sono degli
enzimi detti prolina-racemasi che rilevano
eventuali posizioni cis della prolina e le
convertono in trans.

Un'altra struttura possibile il


foglietto- antiparallelo, dato dal
ripiegamento della catena
polipeptidica che viene a far
interagire C=O e N-H di diversi
amminoacidi. detto antiparallelo
perch ogni tratto che interagisce
decorre in senso inverso a quelli
adiacenti e tra ogni tratto c' un
loop. Le catene laterali si trovano
alternativamente sopra e sotto il
foglietto. Per come strutturato il
foglietto-, l'interazione tra le
catene antiparallele arriva fino
all'ultimo amminoacido prima del
loop, che molto stretto e non destabilizza la catena. I tipi I e II del piegamento hanno a che fare
con il ripiegamento e la geometria della catena e su come arrangiata lungo tutto il tratto.

C' poi la struttura a


foglietto- parallelo, in
cui le catene decorrono
nella stessa direzione,
perci ci deve essere un
loop molto lungo. In
questo tipo di foglietto-
la direzione del
legame idrogeno tra
C=O e N-H non
ortogonale alla catena,
comunque i foglietti-
paralleli sono strutture
molto frequenti. Spesso
nelle proteine il loop tra
due tratti di foglietto
parallelo organizzato
ad -elica, si tratta di
una struttura di tipo
sovra-secondario.

I foglietti- possono interagire tra loro: essi si possono sovrapporre grazie alle interazioni tra le
loro catene laterali, impaccandosi. Per potersi avvicinare, le catene laterali devono essere piccole e
poco ingombranti, e ci si realizza con tante copie di glicina e alanina. Ad esempio, la fibroina
della seta ha foglietti- molto ricchi in alanina e glicina che si compenetrano con la minima
distanza realizzabile tra foglietti diversi: la sua struttura primaria presenta molte sequenze Gly-Ala-
Gly-Ala-Gly-Ala e nel foglietto le alanine sporgono da un lato e le glicine dall'altro, quindi
diversi foglietti di impacchettano avvicinando le facce con lo stesso amminoacido.

Ci possono essere tratti nella molecola proteica che non tendono ad organizzarsi n ad -elica n a
foglietto-: ad esempio, in presenza di prolina le -eliche non possono formarsi e si interrompono.
Ci pu essere un tratto nella sequenza amminoacidica che non ha modo di strutturarsi e si parla
perci di strutture random: esse sono molto importanti perch sono parte integrante della struttura
finale della molecole, consentono il ripiegamento permettendo, ad esempio, che le catene laterali di
due eliche diverse si avvicinino e interagiscano tra di loro, consentendo la formazione della
struttura terziaria.
I vari tipi di strutture secondarie sono variamente rappresentate nelle proteine: ad esempio, la
mioglobina possiede molte -eliche e strutture random e non ha foglietti , mentre la IgG ricca
in foglietti- e povera in -eliche, enzimi proteolitici presentando una percentuale diversa e
intermedia delle due strutture, ad esempio la subtilisina e la chimotripsina sono proteasi altamente
destrutturate, ovvero ricche in strutture random coil. Queste ultime due proteine sono
endopeptidasi, che scindono il legame ammidico in una molecola proteica, e devono potersi legare
in modo opportuno con dei substrati grandi quanto loro o pi di loro, che sono anch'essi
strutturati, perci devono avere
ampia possibilit di movimento, il
che non significa che non sono ben
definibili. Struttura random non
implica assenza di interazioni, ma
semplicemente presenza di
interazioni che non sono altamente
ripetute e hanno ampia possibilit
di movimento.

Strutture supersecondarie

Oggigiorno, con la disponibilit di tante strutture che vengono dedotte tramite diffrazione a raggi X,
si vede che in molte proteine si trovano dei tipici riarrangiamenti sovrastrutturali. Le strutture
sovrasecondarie sono combinazioni di strutture secondarie che si trovano con una certa frequenza.
Ad esempio, tra due tratti organizzati in foglietto- parallelo, c' un'-elica, perci si ha una
struttura --, oppure la struttura a -hairpin, ovvero foglietti- che si affiancano, poi le -,
ovvero due eliche unite da un tratto random e con interazioni tra le catene laterali delle eliche. Poi
c' la struttura a greca, di ripiegamento da hairpin, derivante dalla presenza di foglietti
intervallati da strutture random e che si ripiegano due volte a met, formando una struttura con i
foglietti affiancati in modo antiparallelo-parallelo-antiparallelo a formare come una decorazione
greca. Vi poi una struttura a barile -, con interazioni parallele tra -foglietti tra i quali sono
disposte -eliche destrorse, quindi foglietto-elica-foglietto-elica, i foglietti sono tra loro paralleli,
questa struttura molto diffusa.
I domini strutturali di una molecola proteica sono particolari assemblaggi di strutture secondarie,
ovvero le strutture supersecondarie, che hanno una grande stabilit e si trovano a generare dei
cluster, delle zone anche ampie della molecola proteica, che sono particolarmente stabili e le
conferiscono le caratteristiche di funzionalit. I domini sono cos stabili e ricorrenti da suggerire
che sono punti attorno ai quali la struttura va ad organizzarsi ulteriormente. Se si disponesse di
strumenti abbastanza delicati, si potrebbero allentare alcune interazioni della proteina nativa e si
noterebbe che alcune interazioni restano particolarmente compatte e stabili, queste sono quelle dei
domini strutturali, che spesso non sono influenzati dalla particolare sequenza della molecola
proteica: sequenze amminoacidiche alternative possono generare domini strutturali simili e in
molte proteine funzionali la funzionalit spesso nasce dal contatto di domini. La porzione della
proteina che deve svolgere funzioni spesso costituita da zone della molecola proteica che si
generano dall'avvicinamento di porzioni molto stabili che generano microambienti particolari,
necessari per svolgere una determinata funzione. La formazione dei domini dipende
principalmente dai gruppi C=O e N-H, ma pu essere influenzata dalle catene laterali, per la
sequenza non stringente nel determinare la forma dei domini.

Struttura terziaria

La struttura terziaria data dalle interazioni


delle catene laterali, che influenzano le
interazioni tra i diversi domini. La struttura
terziaria non la struttura tridimensionale
della proteina, bens quel tipo di struttura che
si viene a generare principalmente a seguito
delle interazioni tra le catene laterali degli
amminoacidi, infatti gi le strutture secondarie
sono tridimensionali. Questa struttura perci
pi dipendente dalla sequenza amminoacidica rispetto alla struttura secondaria, ovvero dipende
dalla struttura primaria. Le catene laterali protrudono
dall'-elica e la loro dimensione paragonabile a quella
della sezione dell'elica, se non maggiore, perci si pu
immaginare come i gruppi laterali possono interagire tra
di loro. Spesso, le catene laterali idrofobiche e quelle
polari o cariche si trovano ad affacciarsi da lati diversi
dell'elica, e in particolare le catene laterali polari o
cariche hanno un'ottima interazione con l'acqua, mentre
la porzione idrofobica tende ad allontanarsi dall'acqua,
rivolgendosi verso l'interno della proteina. I gruppi
idrofilici trovano stabilizzazione dall'interazione con le
molecole d'acqua, che formano un guscio di idratazione
attorno ad essi, neutralizzando l'intensit dei campi di forze che si generano da quei gruppi: ad
esempio, attorno ad un NH3+ si genera un campo elettrico molto grande, ma se attorno ad esso si
dispongono le molecole d'acqua, l'intensit del campo si
disperde su un volume maggiore, perci la forza del campo
elettrico si trova dispersa su una grossa superficie. La porzione
idrofobica evita invece il contatto con l'acqua associandosi
con altre porzioni idrofobiche, con un'interazione detta
interazione idrofobica.

Questi tipi di interazioni sono fondamentali per determinare la


struttura terziaria, con un'ulteriore stabilizzazione della
macromolecola: nell'interazione si libera un'energia pari al
lavoro che bisogna compiere per separare i domini che interagiscono.
Questo tipo di interazioni consiste in legami a idrogeno, ad esempio tra un C=O e un -OH, o tra
-NH e anello imidazolico, che si formano ad una distanza di circa 3 ; oppure interazioni di tipo
ionico tra un COO- e un NH3+, infatti se due residui carichi vengono costretti a trovarsi in una
porzione della molecola che esclude l'acqua, essi interagiscono tra loro e contribuiscono alla
struttura, e la loro interazione in ambiente idrofobico molto pi forte rispetto alla loro
interazione in ambiente idrofilico, cos come sono fortissime le repulsioni tra cariche delle stesso
segno, per le cariche dello stesso segno possono essere legate da uno ione metallico a ponte tra di
loro e di carica opposta, ad esempio COO- Mg++ COO-. Spesso interazioni di tipo ionico si possono
formare tra enzima e substrato. Vi pu essere interazione diretta tra cariche o interazione tra
cariche mediata dal solvente.

Vi sono poi interazioni elettrostatiche idrofobiche,


ovvero le catene idrofobiche tendono ad aggregarsi tra
loro.
Vi anche la possibilit di generare legami covalenti: la
cisteina ha in catena laterale un gruppo tioloico -CH2-SH
e lo zolfo facilmente ossidabile, due SH possono perdere
idrogeno e formare un ponte disolfuro, perci se due
cisteine si trovano vicine e ci sono le condizioni adatte, si
forma un legame disolfuro che costituisce un punto fermo
della struttura perch l'energia di questo legame molto
pi alta della energie in gioco negli altri legami.
Anche nella struttura delle proteine vale la strategia di usare tanti legami deboli per generare una
struttura di grande stabilit, e a seguito della rottura di un legame possono cambiare anche molti
altri legami, cosa sfavorevole perch le proteine possono denaturarsi ma utile perch le proteine
devono poter cambiare conformazione in caso di necessit.
Vi sono infine interazioni ancora pi deboli, le forze di van der Waals, che si realizzano quando in
un atomo si possono indurre dei dipoli momentanei a causa dell'avvicinamento con un altro atomo,
sono perci interazioni estremamente deboli tra atomi neutri. Nelle macromolecole come le
proteine questo tipo di interazione pu assumere una grande importanza perch vi sono tanti atomi
costretti a stare gli uni vicini agli altri, perci le forze di van der Waals possono funzionare in
modo sinergico, e sono perci rilevanti nel definire la struttura finale della proteina, ovvero la
proteina allo stato nativo.
Le interazioni idrofobiche sono invece quelle in cui due molecole apolari in soluzione acquosa si
avvicinano perch il sistema risulta pi stabile se le molecole idrofobiche sono aggregate, infatti la
superficie di contatto tra esse e l'acqua si riduce, determinando una maggiore stabilit: nel caso
delle forze idrofobiche non ci sono forze di interazione tra le molecole idrofobiche, non sono
coinvolte energie di legame, si potrebbe parlare pi propriamente di assetti entropicamente stabili.

Uno dei parametri nelle reazioni chimiche l'entalpia: ad esempio, il contenuto entalpico di un
sistema costituito da due cariche pi alto se esse sono separate e pi basso se sono vicine. Nella
formazione della struttura proteica, il contenuto entalpico ha a che fare con tutte le interazioni che
si formano tra i gruppi, e determina l'energia dei legami: l'entalpia dello stato nativo della
proteina minore rispetto a quella di una struttura random. Bisogna considerare anche il contenuto
entropico: pi la struttura libera di muoversi, pi il sistema ha alta entropia.
L'energia libera G definita come G=H-TS, perci tiene conto sia dell'entalpia sia
dell'entropia, ed collegata alla costante K di equilibrio della reazione struttura
randomstruttura nativa in quanto G=-RTlnK. Perci, pi negativa la variazione di energia
libera associata ad una reazione,
pi il sistema stabile nello stato
che acquista come prodotto di
reazione. Questi parametri si usano
per studiare il folding delle proteine
nel vuoto, ovvero in assenza di
acqua. Se il folding dipendesse solo
dall'entropia, la proteina sarebbe
completamente unfolded perch
questo stato ha maggiore entropia,
ma bisogna considerare anche il
contenuto entalpico, infatti l'entalpia
dello stato folded pi bassa dello
stato random, quindi la possibilit di
strutturazione di una proteina nel
vuoto dipende dalla combinazione di
questi due parametri. In soluzione
acquosa bisogna tenere conto della
G della proteina ma anche della
G dell'acqua, perci la reazione
diventa proteina unfolded +
solvente dello stato unfolded
proteina folded + solvente dello
stato folded. Nello stato random e
unfolded, la superficie di contatto con l'acqua molto maggiore rispetto a quella folded.
Nel vuoto, tra i gruppi idrofobici delle proteine si hanno solo forze di dispersione, ovvero quelle che
si generano dal contatto molecole poco reattive, che non tendono a interagire le une con le altre, in
cui si possono generare dei dipoli ma non ci sono interazioni significative. In soluzione acquosa,
invece, l'acqua tende a polarizzare i gruppi idrofobici, generando uno stato a maggiore entalpia.
Guardando solo alla proteina, sia il parametro entalpico sia quello entropico favorirebbero lo stato
unfolded, ma bisogna considerare anche entalpia ed entropia dal solvente: l'acqua pu preservare la
maggior parte dei legami a idrogeno con se stessa a scapito di un locale aumento di ordine, ovvero
attorno all'oggetto idrofobico si dispone uno strato di molecole d'acqua ordinato, formando il
clatrato, e l'entropia dell'acqua pi alta al diminuire delle dimensioni del clatrato perch meno
molecole perdono gradi di libert, perci l'acqua favorisce lo stato nativo della proteina. Guardando
all'entalpia si giunge alla stessa conclusione: l'acqua disponendosi nel clatrato perde alcuni legami
a idrogeno, ovvero l'entalpia del sistema aumenta attorno ad una proteina unfolded perch perde
pi legami a idrogeno rispetto alla disposizione attorno ad una proteina folded, perci ancora una
volta il solvente favorisce lo stato folded. Perci il solvente a determinare il ripiegamento nativo
della proteina. Le forze idrofobiche si chiamano perci anche forze entropiche.

L'unico legame covalente che si forma nella struttura proteica terziaria


quello tra i due residui di cisteina: la cisteina si ossida con facilit e
tende a formare un ponte disolfuro (il dimero di cisteina prende il
nome di cistina), l'O in grado di favorire la reazione perch fa da
ossidante e accetta gli H+ derivanti dall'ossidazione della cisteina.
Non tutte le cisteine della molecola proteica sono ossidate: per
formare un ponte disolfuro, le cisteine si devono trovare alla giusta
distanza e deve essere disponibile O. Ogni cisteina perde un H+ e un
elettrone; si noti che se si deprotonasse semplicemente, perdendo solo
H+ si formerebbe uno ione abbastanza stabile, ma non questo il caso.
In una proteina, quando si realizza l'ossidazione della cisteina, la
molecola proteica in fase di strutturazione acquisisce un grosso
vincolo.
Ad esempio, nell'insulina, un ormone peptidico, ci sono dei ponti
disolfuro: inizialmente l'insulina viene sintetizzata come un unico polipeptide detto pre-pro-
insulina, poi si struttura formando dei ponti disolfuro tra due diversi tratti della catena e prende il
nome di pro-insulina, infine si ha la maturazione vera e propria che consiste in una reazione
proteolitica del polipeptide, con rimozione di una porzione della sequenza, e l'insulina matura, in
forma attiva, costituita da due catene polipeptidiche pu corte legate da ponti disolfuro, dette
catena A e catena B. I ponti disolfuro sono perci molto importanti per la maturazione delle
proteine e la loro funzionalit: se l'insulina venisse ridotta, precipiterebbe in soluzione. Non tutte le
proteine hanno per ponti disolfuro, ad esempio se hanno delle cisteine che si trovano in porzioni
troppo distanti della proteina, infatti la proteina comincia a strutturarsi gi mentre esce dal
ribosoma. Le altre forze implicate nel folding concorrono a formare i giusti ponti disolfuro.

Anfinsen fece un esperimento sul refolding della ribonucleasi, che un enzima in grado di
degradare l'RNA, piccolo, dal peso di circa 10 kDa, in cui sono presenti -eliche, foglietti-, tratti
random di connessione e ponti disolfuro. Anfinsen ha messo la ribonucleasi in condizioni
riducenti e in presenza di urea 8 M, che un denaturante delle proteine, una diammide dell'acido
carbonico con struttura NH2-C=O-NH2, e le condizioni riducenti sono quelle che dovrebbero
consentire a eventuali ponti disolfuro di tornare a cisteina libera. L'urea, che
possiede sia un gruppo C=O sia due gruppi NH2, pu andare a interferire con
la formazione dei legami a idrogeno tra i C=O e gli NH della struttura
secondaria della proteina, e ne causa l'apertura, perci la denaturazione. Infatti,
man mano che l'urea entra nella proteina, essa si apre ed espone altri siti che vengono attaccati
dall'urea, fino ad avere una struttura random in soluzione.
La rottura dei ponti disolfuro, anche in condizioni
fisiologiche, viene realizzata mediante gli agenti
tiolici, che sono riducenti, ad esempio il glutatione
un tripeptide formato da glutammato, cisteina e
glicina, dove il glutammato legato al gruppo
amminico della cisteina con il suo gruppo carbossilico laterale e non con quello legato al C-,
perci non un legame peptidico, e lo si chiama -glutammilcisteina. Questo peptide viene usato
per difendere l'organismo dallo stress ossidativo, infatti funziona da riducente e pu ridurre dei
legami disolfuro.
Un altro agente riducente usato da Anfinsen il -
mercapto-etanolo CH2OH-CH2SH, che attacca il
ponte disolfuro formando un altro ponte disolfuro con
una delle due cisteine mentre l'altra resta con S- che
diventa SH, poi un'altra molecola di -mercapto-
etanolo attacca anche il legame -mercaptoetanolo-
cisteina, si forma un ponte disolfuro tra le due
molecole di -mercaptoetanolo e si libera anche l'altra
cisteina. Questa reazione detta transtiolazione, e
consente di rompere il ponte disolfuro senza ricorrere
ad un processo redox netto, perch si ha un
ponte disolfuro all'inizio e un ponte disolfuro
alla fine; avviene spessissimo nelle cellule.

Trattando con urea e agenti riducenti,


Anfinsen ha denaturato la ribonucleasi e ha
causato la rottura di tutti i ponti disolfuro,
rendendo inattivo l'enzima. In seguito, ha
rimosso l'agente riducente (-
mercaptoetanolo) ma non l'urea, quindi le
cisteine che si incontrano possono ossidarsi
e riformare dei ponti disolfuro: con questa operazione, si ottiene una struttura proteica detta
scrambled, strutturata ma non attiva, infatti non consentendo alla proteina di organizzarsi
secondo la struttura secondaria, i ponti disolfuro si sono riformati a caso, il che non rende la
proteina funzionale. Dall'altra parte Anfinsen, dalla soluzione con proteina denaturata ha rimosso
prima l'urea e solo dopo l'agente riducente, riottenendo la proteina di partenza, attiva per oltre il
90%.
Anfinsen cercava la relazione tra struttura primaria e quella terziaria, ovvero la sua ipotesi era che la
struttura primaria determina quella terziaria, e infatti rimuovendo prima l'urea e poi il riducente, egli
ha consentito alla proteina di cominciare ad organizzarsi spazialmente senza i legami disolfuro,
formando le giuste strutture secondarie, e questo riarrangiamento pu portare le giuste cisteine a
trovarsi l'una vicino all'altra, perci il processo ossidativo fa s che vengano cristallizzate le
forme assunte nella strutturazione non covalente. Questo esperimento ha funzionato con la
ribonucleasi ma non con tutte le proteine,
infatti la proteina nativa biosintetizzata viene
ripiegata man mano che esce dal ribosoma e
la struttura che si ottiene dalla
rinaturazione pu essere diversa, perch in
tal caso la proteina ha pi possibilit di
trovare una struttura stabile. Non quindi
detto che il percorso di folding sia unico e
che il prodotto finito sia unico, ma
certamente c' un prodotto finito in grado di
svolgere la funzione della proteina, perci il
refolding sbagliato pu portare la proteina a
riarrangiarsi in modo diverso da come
dovrebbe essere per svolgere la sua
funzione.

Il folding avviene in pi fasi, il processo di strutturazione pu cominciare in diversi punti della


proteina, che possono poi interagire tra di loro, sulla base del bilancio dell'energia. Questo percorso
procede a tappe: la proteina comincia a tentare
diverse possibilit, i suoi gruppi interagiscono
finch si forma un assetto relativamente stabile,
che pu poi interagire con un'altra struttura
relativamente stabile, ci possono essere tanti
tentativi per giungere all'interazione pi
favorevole. Il folding la strutturazione che deriva
dalla biosintesi, mentre il refolding deriva dalla
denaturazione e rinaturazione. Vi sono quindi
tante tappe che portano verso una strutturazione
sempre pi complessa, come se si dovessero
superare delle tappe di energia. Questo percorso a
tappe rappresentato bene da un grafico che
riporta sull'asse delle y l'energia del sistema, e
dall'altra parte, sempre sull'asse y, il numero di
residui amminoacidici che si trovano nella
conformazione finale nativa, ovvero stiamo
assumendo che man mano che ci si avvicina alla
conformazione nativa l'energia del sistema si
abbassa, rendendolo pi stabile, quindi si fa un
parallelo tra diminuzione di energia e somiglianza
alla struttura finale. Sull'asse delle x riportata
l'entropia del sistema: nello stato random, l'entropia pi alta, con il massimo di gradi di libert,
mentre man mano che si formano legami, complessivamente l'energia del sistema diminuisce e
diminuisce anche l'entropia, perch ci sono meno gradi di libert e i gruppi sono meno liberi. I
picchi del grafico sono barriere energetiche, energie di attivazione, che la molecola deve superare
per arrivare al prodotto finito.
Si parla di molten globule, ovvero globulo fuso, una
struttura intermedia dalla quale la proteina pu tornare
indietro denaturandosi oppure andare avanti per piccoli
passi verso la forma nativa, questa fase critica per la
strutturazione. Pu accadere che nella strutturazione della
proteina, una porzione idrofobica resti a contatto con
l'acqua: questa porzione tende ad aggregarsi con un'altra
porzione idrofobica di un'altra proteina, formando cos la
struttura quaternaria, che si basa su interazioni non
covalenti tra proteine diverse. La porzione idrofobica pu
andare a posizionarsi nella porzione idrofobica della
membrana, ma questo processo non scontato perch deve
superare la porzione esterna della membrana che idrofilica.
Il molten globule si forma nel giro di microsecondi,
poi in tempi pi lunghi (millisencondi) avviene la
rifinitura della struttura, trovando per tappe i passi
che consentono di formare una struttura stabile.
La strutturazione delle proteine importante anche a
livello di sintesi della proteina stessa: se la molecola
proteica che fuoriesce dal ribosoma viene lasciata
libera, nella porzione neosintetizzata possono
avvenire interazioni che impediscono la giusta
strutturazione finale della proteina, perci il folding
della proteina viene assistito da altre molecole
proteiche dette chaperonine. Esse interagiscono
con la catena proteica nascente, andando a
interferire sulla cinetica di folding, impedendo ad
esempio la formazione di ponti disolfuro in posti
sbagliati, quindi le chaperones rallentano i processi cinetici, consentendo alla proteina di
esplorare le varie possibilit di struttura.
Ci sono chaperones passivi e chaperones
attivi, che sfruttano l'ATP, mantenendo la
proteina pronta a strutturarsi senza che ci
ne condizioni la reattivit, semplicemente
quello che altrimenti avverrebbe con un
passaggio velocissimo e irreversibile, ora
avviene in tempi pi lenti, che consentono
alla proteina di formare anche altre
interazioni. Man mano che la proteina si
struttura, c' sempre meno spazio per i
chaperones, finch la proteina pronta pu
passare nel distretto al quale destinata.
Quando ci sono delle proteine non ben
foldate, queste non possono essere
indirizzate dal RE alla via di secrezione
vescicolare, bens vengono estruse
assieme ai chaperones e degradate.
I chaperones hanno funzioni delle pi varie. Ad esempio, nel cristallino ci sono delle chaperone-
like proteins dette -cristalline, che impediscono la precipitazione di altre proteine perch sono in
grado di bloccare i gruppi idrofobici che vengono esposti in soluzione acquosa e che sono
responsabili della precipitazione, perch si aggregano tra loro casualmente pur di escludere l'acqua.
Questi chaperones hanno una piccola porzione idrofobica e per il resto sono idrofiliche, e la
porzione idrofobica interagisce con le altre proteine e stabilizza le loro porzioni idrofobiche,
proteggendole. Nei fenomeni di formazione della cataratta, si hanno aggregati proteici che si
formano per mancanza di chaperonine -cristalline.
Un chaperone molecolare ha il nome di disolfuro isomerasi, infatti una proteina chaperone e
anche un enzima: possiede due residui di cisteina, decisamente reattivi. La proteina bersaglio di
questo chaperone strutturata e possiede dei ponti disolfuro: se questa non nella sua
conformazione nativa, ovvero quella funzionale, la disolfuro isomerasi, con un meccanismo di
transtiolazione, interviene sul legame disolfuro e forma lei stessa un legame disolfuro con una
delle cisteine della proteina bersaglio. La cisteina liberata della proteina bersaglio pu andare a
interagire con un altro disolfuro, sempre tramite transtiolazione, formando un ponte disolfuro con
una delle altre cisteine e liberandone un'altra, che pu ora, sfruttando i gradi di libert acquisiti,
formare un ponte con la cisteina originariamente legata alla chaperonina. Viene cos modificata
la strutturazione della proteina bersaglio. Se invece l'ultima cisteina dovesse rimanere libera, il
chaperone pu formare un disolfuro intramolecolare con se stesso ed essere poi ridotto da un
enzima riducente che lo rende di nuovo disponibile per queste reazioni. L'azione di chaperone non
si basa sul riconoscimento di un disolfuro sbagliato, infatti il chaperone non sa se il disolfuro
sbagliato, semplicemente se trova un disolfuro vi si lega, una questione di chances offerte dal
chaperone alla proteina: se all'attacco del chaperone la cisteina che si libera esplora altre vie di
strutturazione, prosegue per quelle vie, mentre se non ci sono altre vie, ovvero se il disolfuro era
corretto, la cisteina liberata torna al legame che formava in precedenza e scalza il chaperone.

Struttura quaternaria

Non tutte le proteine hanno una struttura quaternaria, che si basa


sull'interazione tra due o pi polipeptidi. Ad esempio, due
molecole strutturalmente simili, mioglobina ed emoglobina,
hanno strutture quaternarie diverse, infatti la mioglobina un
monomero mentre l'emoglobina forma tetrameri. Se due proteine
espongono gruppi che possono interagire o formare assetti
idrofobici stabili, questo fa da trigger per la formazione della
struttura quaternaria, ci sono anche cariche positive e negative
che stabilizzano la struttura quaternaria. Ci sono anche strutture
multimeriche estremamente complesse. La glutammina-sintetasi
un dodecamero: sei subunit formano un esamero esagonale e
due esameri si avvicinano a sandwich. Le strutture quaternarie
possono essere estremamente articolate. Negli anticorpi, la
struttura quaternaria viene potenziata anche con la formazione
di legami disolfuro, questa una caratteristica degli anticorpi.
Proteine fibrose

Vi sono proteine globulari e proteine fibrose, queste ultime trovano la stabilizzazione finale in
strutture che si sviluppano pi in una direzione che nelle altre. Ad esempio, una proteina fibrosa
la fibroina della seta, infatti si hanno proteine fibrose quando le catene laterali piccole favoriscono
la formazione di foglietti- pi che delle -eliche.
La glicina spesso detta agente destabilizzante
delle -eliche, questa una definizione
concettualmente sbagliata perch la glicina molto
poco reattiva, ma deriva dal fatto che con numerose
glicine la catena polipeptidica ha pi tendenza ad
arrangiarsi in foglietti- che in -eliche.
Nella fibroina della seta ci sono ripetizioni di
alanina e glicina, che portano a stabilizzare i
foglietti- in pacchetti di foglietti-, che distano 3,5
nello strato di glicine e 5,7 nello strato di
alanine. Questo porta alla formazione di
sovrastrutture dette microfibre e fibre, infatti la
seta ha una struttura quasi cristallina, estremamente
compatta e resistente.

Un altro tipo di proteina fibrosa il collagene, in cui la struttura primaria contribuisce diversamente
che nel caso della fibroina della seta: ogni tre amminoacidi c' una glicina, e nella terna degli
amminoacidi presente una prolina o una idrossiprolina, che non uno dei 20 amminoacidi di
base delle proteine, una prolina modificata post-traduzionalmente, questa sequenza non potrebbe
formare mai delle -eliche, bens si forma una struttura molto
rigida, l'angolo non pu ruotare liberamente perch nella prolina
la catena laterale chiusa a ciclo su quel legame. Si pu generare
una struttura elicoidale con un passo molto pi ampio delle -
eliche, una struttura rigida detta pro-, la prolina ha una catena
laterale idrofobica e tenderebbe a precipitare, ma questo consente
ad altri due filamenti simili di inserirsi nell'elica, accoppiandosi a
formare una tripla elica. Il collagene infatti offre delle propriet
di resistenza alla trazione ed alla base del tessuto connettivo e dei tendini.
Questa tripla elica, detta protofibra, molto resistente e dall'unione di queste triple eliche
opportunamente disposte si formano le fibre del tendine.
Guardando questa tripla elica, si osserva che
la struttura porta tutti i residui di glicina
all'interno, infatti l'amminoacido pi
piccolo, che non d n interazioni n
ingombro sterico, se ci fosse una catena
laterale pi ingombrante la struttura
verrebbe destabilizzata. Le glicine, che si
trovano ogni 3 amminoacidi, vengono a
trovarsi nei punti di incontro dei tre
filamenti, consentendo loro di compattarsi.
La tripla elica riesce a restare stabile perch
viene opportunamente processata. Nella sequenza vi l'idrossiprolina, la
cui modificazione a partire dalla prolina con aggiunta di OH una prima
tappa che si realizza per rendere pi solubile il residuo e consentirgli di
formare legami a idrogeno. Anche la lisina viene modificata in
idrossilisina, inoltre c' la possibilit di formare dei veri e propri clip
covalenti, che una volta formati impediscono a questa struttura di
disassemblarsi, per nel tropocollagene, la tripla elica allo stato finale, non
sono presenti cisteine che potrebbero formare legami covalenti, perci si
hanno modifiche post-traduzionali che rendono pi reattivi alcuni
amminoacidi, ad esempio al posto del gruppo amminico della lisina si ha un gruppo carbonilico,
che molto attivo.

Una struttura di questo tipo ha una particolare


resistenza alla trazione e non a caso somiglia ad una
corda. L'impacchettamento favorito dal fatto che la
glicina capita nei punti di connessione tra le eliche, il
che ne permette l'avvicinamento, inoltre per
mantenere stabile questa struttura c' bisogno anche di legami che blocchino la tripla elica e di altri
che blocchino la tripla elica assieme ad altre triple eliche, si parla perci di legami crociati. Nella
cellula, quando si forma il tropocollagene, necessario che esso sia solubile, perci va incontro a
modificazioni post-traduzionali: la prolina non molto solubile, perci diversi residui di prolina
vengono idrossilati, questo conferisce solubilit al filamento, inoltre l'ossidrile pu formare dei
ponti a idrogeno.
I legami crociati possono essere ponti a idrogeno e legami covalenti. Vi sono anche processi
ossidativi sui residui amminoacidici che generano gruppi reattivi che possono interagire e formare
legami covalenti che stabilizzano l'intera struttura. Per potersi assemblare con le altre triple eliche,
c' bisogno di una rigorosa selezione di triple eliche che vanno ad assemblarsi, perci intervengono
delle proteasi che tagliano i filamenti sporgenti alle estremit e dopo questo step si parla di
tropocollagene vero e proprio, esso ora interagisce con altre fibre di tropocollagene,
organizzandosi in microfibrille, fibrille e fibre di collagene. Il tropocollagene interagisce testa-
coda con altri filamenti e ad anche con quelli ai lati. Il taglio da parte delle proteasi serve per avere
delle unit ripetitive tutte uguali tra loro, per generare una struttura regolare e ordinata.
Si possono avere legami a idrogeno intra-tripla elica o inter-tripla
elica, legami covalenti intra-tripla elica e inter-tripla elica. La
prolil-idrossilasi e la lisil-idrossilasi aumentano la solubilit e la
possibilit di legami a idrogeno. I meccanismi delle reazioni sono
complessi e richiedono dei cofattori. La lisina, per mezzo della
lisil-idrossilasi e in presenza di acido -chetoglutarico, riceve il
gruppo OH idrofilico su una catena laterale gi idrofilica, questo
processo ossidativo crea dei centri di reattivit sulle catene laterali
del tropocollagene. Nel caso della prolina, l'enzima prolil-
idrossilasi catalizza lo stesso tipo di reazione e l'OH pu essere
legato in posizione 3' o 4' della prolina.

Sulla lisina pu intervenire anche la lisina ossidasi che catalizza la reazione di deamminazione
ossidativa, ovvero viene rimosso il gruppo amminico e ad esso viene sostituito ossigeno, che
aumenta il numero di ossidazione del C a cui legato, perci la molecola viene ad avere un gruppo
carbonilico aldeidico, che molto reattivo. Infatti, in generale, la cellula tende a limitare la
presenza di gruppi aldeidici liberi perch sono molto reattivi e potrebbero dar luogo a reazioni non
controllate, perci la cellula usa molecole meno reattive che vengono attivate all'occorrenza e le
cui reazioni vengono catalizzate da enzimi, perci il controllo sulle reazioni di tipo cinetico e
non termodinamico. La lisina con il gruppo aldeidico detta allisina, essa pu seguire diversi
destini, ad esempio reagire con un gruppo amminico formando una base di Schiff o immina,
questo doppio legame pu essere poi ridotto diventando un legame singolo molto stabile.
Se due allisine reagiscono insieme, i loro gruppi carbonilici possono interagire nella
condensazione aldolica, con la formazione di un doppio legame C=C e su uno dei due C c' un
gruppo carbonilico, che in grado di reagire ulteriormente con altre molecole. Nel tempo,
nell'organismo si formano sempre pi legami crociati e il collagene si irrigidisce, infatti in tarda
et i tendini diventano pi rigidi. Il gruppo carbonilico derivante dalla reazione aldolica pu
reagire con un'istidina, esso possiede infatti un doppio legame coniugato, con un C abbastanza
acido che pu reagire con il gruppo imidazolico dell'istidina e fare da perno tra tre amminoacidi, poi
questo carbonio pu interagire anche con 5-idrossi-lisina, formando una struttura di 4
amminoacidi che prende il nome di merodesmosina. Queste reazioni non sono catalizzate, bens
avvengono spontaneamente nei residui che si trovano vicini.
Le microfibrille formano fibrille e fibre di
collagene, una struttura ad elevatissima
resistenza alla trazione. Nel RE rugoso
viene sintetizzato il polipeptide pro- e
immediatamente scattano i meccanismi per
evitare che esso precipiti: esso viene reso
pi solubile tramite idrossilazione e avviene
anche la glicosilazione, infatti gli zuccheri
sono in equilibrio con la forma aperta e
possono formare basi di Schiff. Ora il pro-,
all'interno dell'apparato di Golgi, pu
cercare stabilizzazione nell'interazione con
altri due pro-. Il pro- ha delle cisteine
localizzate nella porzione terminale della
catena che hanno la possibilit di formare
dei ponti disolfuro, i quali fanno da clip
iniziale a partire dalla quale il procollagene
comincia a strutturarsi. Il procollagene
viene quindi esportati fuori dalla cellula,
nella matrice extracellulare, dove avviene la
maturazione della tripla elica: intervengono
le proteasi, con il taglio delle estremit che
contengono cisteine e ponti disolfuro, non
pi utili in fase di assemblaggio delle
microfibrille. Si ottengono cos strutture di
tropocollagene tutte uguali che hanno la
possibilit di organizzarsi in sovrastrutture,
microfibrille e poi fibre.
Un'altra proteina fibrosa l'elastina, che ha la peculiarit di
poter essere stirata e rispondere in modo elastico a forze
provenienti da direzioni diverse, come nella pelle. Per poter
avere questa propriet, vi sono legami trasversali che si
formano tra tre residui di allisina e un residuo di lisina, che
possono condensarsi a formare una struttura molto stabile
detta desmosina, che viene ad avere al centro un anello
aromatico, in particolare piridinico, che fa da perno per
possibili trazioni in direzioni diverse. La desmosina
conferisce il colore giallastro al tessuto connettivo perch la
piridina gialla.
Un altro tipo di proteine fibrose sono le -cheratine, che seguono una strategia diversa nella
stabilizzazione, infatti un polipeptide si stabilizza interagendo con altri polipeptidi, che hanno una
sequenza tale da formare elicoidi in grado di stabilizzarsi con altri elicoidi. Si hanno due catene che
interagiscono tra di loro e queste unit interagiscono testa-coda e lateralmente con altre strutture
identiche a due filamenti. Questi protofilamenti si assemblano in protofibrille, che si trovano ad
esempio nei capelli, e sono stabilizzati da legami crociati. Le -cheratine sono ricchissime in
cisteina e la maggior parte dei legami crociati sono dei ponti disolfuro: dal parrucchiere vengono
ridotti i ponti disulfuro, separando le catene, poi si interviene con un processo ossidativo (ad
esempio con H2O) per riformare i ponti disolfuro con una strutturazione diversa da quella iniziale.

Relazione tra struttura e funzione delle proteine: mioglobina ed emoglobina

La mioglobina e l'emoglobina sono proteine globulari strutturalmente molto simili ma con


funzioni diverse, dovute a piccole differenze che conferiscono loro propriet particolari.
Negli eritrociti presente ad elevatissime concentrazioni l'emoglobina, che si fa carico di assolvere
ad una funzione fondamentale, quella di permettere a tutte le cellule di disporre di O: attraverso il
circolo sanguigno, essa pu caricarsi di O nei polmoni, dove la sua pressione parziale elevata, e
poi raggiungere i distretti dove l'O richiesto dai tessuti e la sua pressione parziale minore;
quindi essa deve essere in grado di legarlo bene nei polmoni ma anche di rilasciarlo bene nei
tessuti. Vi sono dei tessuti nei quali c' un estremo bisogno di O, ad
esempio nel tessuto muscolare, per rigenerare ATP, e in questa
esigenza interviene un'altra proteina, la mioglobina, anch'essa in
grado di legare reversibilmente l'O: l'O preso dall'emoglobina
deve essere indirizzato in maniera efficiente nelle cellule muscolari e
ceduto alla mioglobina. L'O un gas, si discioglie in soluzione
acquosa fino a saturazione, ma se esso legato ad una proteina
diventa pi solubile, perci, data l'elevata esigenza di O, questa la
strategia adottata. In questo modo i tessuti possono essere arricchiti di
O oltre la soglia che la sola solubilit consentirebbe. Affinch ci sia
l'unidirezionalit di processi di carico e scarico di O
sull'emoglobina, quando esso viene rilasciato ci deve essere qualcosa
che lo lega nuovamente, e questa la mioglobina, che nelle
condizioni in cui l'emoglobina ha una bassa affinit per O e lo
rilascia, deve avere una alta efficienza di captazione di O.

La mioglobina un monomero, mentre l'emoglobina un tetramero di quattro subunit uguali a


due a due, perci essa possiede una struttura quaternaria mentre la mioglobina no. La mioglobina
ha una sequenza di 153 amminoacidi, un peso di 17,8 kDa e una struttura globulare compatta di
45x35x25 ; il 75% della sequenza organizzato in 8 diverse -eliche, indicate in progressione
dalle lettere da A fino ad H a partire dall'N-terminale, contenenti ognuna da 7 a 26 residui
amminoacidici. L'interruzione delle -eliche causata da residui di prolina e da interazioni tra
alcuni carbonili che forzano l'-elica e la destabilizzano. Non ci sono foglietti-, solo -eliche e
tratti di connessione random. All'interno sono assenti residui polari e vi un'alta frequenza di
residui non polari, inoltre vi un gruppo prostetico, la protoporfirina o gruppo eme, un gruppo
di atomi di natura non proteica, una molecola planare che possiede uno ione ferroso e si pone
nella porzione idrofobica della mioglobina e su di essa avviene il processo di ossigenazione.

L'emoglobina un tetramero di quattro subunit, ciascuna con il suo gruppo eme, e uguali due a
due, perci due subunit sono dette e due sono dette . Nell'emoglobina, una e una
interagiscono tra di loro e questo dimero interagisce con un altro dimero - a formare il
tetramero. La mioglobina e le subunit dell'emoglobina hanno una struttura molto simile, eppure
hanno una omologia di solo il 10-25% degli amminoacidi, a seconda delle specie, perci la
struttura primaria diversa ma l'assemblaggio tridimensionale molto simile. La struttura diversa
quel tanto che basta a rendere la mioglobina stabile come monomero e l'emoglobina tendente a
formare un tetramero; questo in generale nelle proteine non necessariamente causa una variazione
nella funzione, ma in questo caso ci sono delle differenze.

Il gruppo eme ha un nucleo tetrapirrolico connesso da ponti metilenici e gli atomi di azoto che si
affacciano dai pirroli sono in grado di complessare uno ione ferro, una struttura ad alta
idrofobicit, quasi planare, con una piccola curvatura, come il palmo della mano. Lo ione ferro
che presente deve trovarsi nello stato ridotto, come ione ferroso, per funzionare, invece se si
dovessero verificare fenomeni di ossidazione del ferro, causando una trasformazione della ferro-
emoglobina in ferri-emoglobina, non sarebbe pi in grado di trasportare O.
Il gruppo eme non collegato covalentemente, n alla mioglobina n
all'emoglobina, bens va ad incunearsi in una tasca altamente idrofobica
della molecola proteica in cui resta segregato, questo un rigoroso
posizionamento nella struttura della proteina.

C' un esperimento semplice che dimostra che il


ferro non legato covalentemente e che queste
molecole hanno grossa tendenza a strutturarsi: se si
procede tramite estrazione con urea e
abbassamento del pH, si ha il disassemblamento
della struttura, e, aggiungendo cloroformio, il
gruppo eme pu essere allontanato mediante
estrazione con solvente; questa molecola
destrutturata prende il nome di apomioglobina
aperta; si ricordi che il prefisso "apo-" si usa per
indicare proteine che sono separate dai loro gruppi
prostetici. Se ora si procede con dialisi e
innalzamento del pH, la proteina comincia a
ristrutturarsi in apomioglobina, che somiglia molto
alla mioglobina nativa, e se si aggiunge il gruppo eme si riottiene la mioglobina nativa.
La dialisi una tecnica usata per allontanare una specie chimica da altre specie: vi sono
membrane particolari che fanno passare molecole piccole ma non molecole grandi, quindi
l'apomioglobina aperta pu essere separata dall'urea, rimuovendo cos il denaturante.
Questo esperimento mostra che il disegno di folding della mioglobina molto preciso.

Il ferro nel gruppo eme coordinato a 4 atomi di N e possiede altri


due assi lungo i quali si pu avere un ulteriore legame di coordinazione
sopra e sotto il piano degli N. Il posizionamento dell'eme sulla proteina
tale che esso si pone in un punto in cui vi un'istidina che fornisce
al ferro il suo quinto
legame di coordinazione,
mentre la sesta
coordinazione quella
che viene sfruttata per
legare reversibilmente
l'O. Questa istidina
prende il nome di istidina
prossimale o istidina F8,
in quanto l'ottavo
residuo dell'-elica F. L'interazione con l'istidina prossimale avviene sia nella mioglobina sia
nell'emoglobina. In assenza di O, il gruppo eme leggermente incurvato perch il ferro viene
tirato verso l'istidina F8, mentre quando presente O, esso tira a sua volta il ferro, perci l'eme
tende ad aprirsi e diventare planare. L'istidina prossimale segue il ferro in questo microscopico
spostamento (0,6 ) che si fa sentire sull'-elica a cui essa legata, l'interazione con l'O viene
quindi sentita dall'intera proteina. Nel caso della mioglobina, quando la pressione parziale dell'O
si abbassa nel distretto in cui presente, essa rilascia l'O secondo l'equilibrio chimico.
Nell'emoglobina, invece, dato che un tetramero, lo spostamento strutturale dell'-elica F a
seguito del legame con O sentito dalla sua subunit e si ripercuote sulla struttura delle altre tre
subunit del tetramero, che cambiano leggermente conformazione e ci influisce sulla loro
capacit di legare O, infatti dopo che si legato O sulla prima subunit, le altre diventano pi
affini all'O, questo fenomeno detto cooperativit. La diversit strutturale dell'emoglobina
rispetto alla mioglobina fa emergere una propriet che non si trova nel monomero.

L'O, essendo biatomico, pu interagire con il ferro tramite un solo


atomo di O (interazione oxo) oppure con entrambi (interazione peroxo):
nell'emoglobina avviene il primo caso, e il legame pi stabile si ha
quando la molecola di O si trova inclinata di 45% rispetto al gruppo
eme e l'O interagisce anche con un residuo di istidina detto istidina
distale o E7, che va a stabilizzare l'interazione dell'O con l'eme.
Una molecola che ha la capacit di
entrare in questa tasca e interagire
con l'eme, coordinando il ferro,
anche il monossido di carbonio
C=O, anzi il C=O complessa il
ferro molto meglio, inoltre il suo
angolo di complessazione pi
stabile perpendicolare all'eme.
L'istidina distale per interagisce con esso e lo forza in un
angolo di 45%, rendendo l'interazione meno stabile:
l'istidina distale riduce il rapporto di affinit CO/O da
25.000 per l'eme libero a 200 per l'eme inserito nella
proteina. Comunque il CO ha un'affinit pi alta dell'O per l'emoglobina. Se non ci fosse l'istidina
distale, il CO prodotto dagli stessi processi cellulari sarebbe sufficiente per intossicare le cellule,
perci una mutazione dell'istidina distale non si trova in nessuna specie vivente, perch questa
avrebbe vita molto breve, come anche nel caso dell'istidina prossimale. Questi amminoacidi,
nell'emoglobina e nella mioglobina, sono essenziali per la funzione della proteina.

Si conoscono diversi tipi di emoglobine, di peso molecolare 66 kDa, ogni subunit ha tra i 140 e i
150 amminoacidi: l'emoglobina A quella dell'adulto, l'emoglobina A2 un'altro tipo di
emoglobina adulta e l'emoglobina F quella fetale, queste tre emoglobine contengono tutte due
subunit mentre le altre due subunit sono diverse. L'emoglobina A2 presente in basse
concentrazioni e la sua funzione non ben chiara, forse un retaggio evolutivo.
Confrontando l'-elica F nelle subunit , e , si vede che un'-elica estremamente conservata,
con la variazione di un solo un amminoacido tra le diverse forme, infatti sull'-elica F presente
l'istidina prossimale F-8 che svolge un ruolo importantissimo; inoltre anche importante tutta
l'elica F perch il movimento dell'istidina dovuto all'arrivo dell'ossigeno sposta tutta l'elica F, si
ripercuote su tutta la molecola e questa ripercussione molto importante per la funzione.
A livello embrionale gi presente la subunit e si trova
insieme alla subunit che decade rapidissimamente, e si
osserva un progressivo aumento della sintesi della subunit ,
che con la subunit forma l'emoglobina fetale. Al momento
della nascita, comincia un declino dell'emoglobina fetale,
compensato da un'aumentata sintesi della subunit , che con la
subunit forma l'emoglobina dell'adulto. La subunit
sempre in piccole concentrazioni ed poco rappresentata. Dato
che questo meccanismo molto ben conservato nelle diverse
specie, evidente che l'emoglobina F e l'emoglobina A hanno
ognuna una precisa funzione. L'emoglobina dell'aduto assorbe
O nei polmoni e lo rilascia nei tessuti, l'emoglobina F deve
assumere O dal circolo materno, ovvero deve scambiare O
prendendolo dall'emoglobina A della madre.

La struttura terziaria delle subunit e


dell'emoglobina molto simile a quella della
mioglobina, ricordiamo che la mioglobina e
la subunit dell'emoglobina hanno
un'omologa di sequenza solo del 25%, per
certi assetti e sequenze particolari sono
conservati per garantire e modulare un certo
tipo di funzione, prima tra tutte l'istidina F8.
Sono conservate le istidine prossimale e
distale, gli amminoacidi che prendono
contatto con l'eme e gli amminoacidi di
contatto tra due -eliche, questi
amminoacidi sono essenziali e conservati in
tutte le globine studiate.

Differenze tra mioglobina ed emoglobina

Il legame dell'O alla mioglobina si


realizza attraverso una semplice reazione di
equilibrio: una reazione semplice quella in
cui i reagenti interagiscono tra di loro
secondo la loro reattivit, ovvero non ci
sono altri fenomeni che intervengono nello svolgimento della reazione, e la mioglobina pu essere
descritta da un equilibrio semplice mioglobina+O mioglobina ossigenata.
Nell'emoglobina, il legame di un O favorisce il legame di un altro O alla stessa molecola di
emoglobina, perci l'O si lega all'emoglobina in modo cooperativo, ovvero nella reazione tra una
subunit e l'O intervengono anche gli effetti delle altre subunit, che quando sono legate ad O
aumentano l'efficienza complessiva della molecola nel legare O: non si tratta perci di una
reazione semplice.
L'affinit dell'emoglobina per l'O dipendente dal pH, mentre la mioglobina non presenta
questa dipendenza. L'affinit per l'O dell'emoglobina influenzata anche da composti organici
fosforilati, come l'acido 2,3-difosfoglicerico.
La sintesi di queste differenze si traduce con il fatto che l'emoglobina una proteina allosterica,
ovvero possiede pi siti di legame, e in essa intervengono processi di cooperativit.
Cooperativit

Quando la prima subunit dell'emoglobina, preferenzialmente la , lega O, quella coppia -


subisce un cambiamento conformazionale, infatti avviene una rototraslazione. Questo
cambiamento conformazionale implica che ci siano cambiamenti nelle interazioni della struttura
terziaria date dal movimento dell'elica F: alcuni residui che interagivano si allontanano tra loro e a
cascata avviene un riarrangiamento strutturale. In questo processo vengono a cadere alcune
interazioni elettrostatiche tra le quattro subunit e entro esse, ad esempio tra Asp94 2 e His146 2.

Questo cambiamento comporta un


aumento dell'affinit delle altre
subunit per l'O. La possibilit che ci
sia cooperativit importante dal punto
di vista funzionale, questo evidente nel
confronto tra la mioglobina e le subunit
dell'emoglobina: nel grafico
rappresentato sull'asse y il grado di
saturazione,ovvero la percentuale di
molecola ossigenata, mentre sull'asse x
rappresentata la concentrazione dell'O
in soluzione come pressione parziale di
O. Per la mioglobina c' una rapida
tendenza alla saturazione e il suo
andamento di tipo iperbolico, tipico
delle reazioni semplici, tende
asintoticamente al valore massimo di
saturazione (cio 1), mentre l'emoglobina presenta una curva sigmoidea, infatti all'inizio la
capacit dell'emoglobina di legare O pi bassa rispetto alla mioglobina, e man mano che
aumenta la pressione parziale di O la curva si impenna e presenta un flesso, per poi tendere
asintoticamente alla saturazione, questo un tipico comportamento della cooperativit positiva.

Il concetto di cooperativit si pu applicare anche alle molecole semplici: si consideri un acido


dicarbossilico, come l'acido ossalico COOH-COOH, che pu perdere due protoni, che hanno un
pKa diverso. Si ha un fenomeno cooperativo perch a priori i due gruppi carbossilici sono identici e
isolati hanno la stessa probabilit di dissociarsi, per, trovandosi nella molecola, dopo il distacco
del primo protone, il secondo se ne allontaner pi difficilmente, perch si trova in una molecola
gi negativa. Guardando lo stesso fenomeno nel senso inverso, ovvero da COO--COO-, il processo
cooperativo negativamente poich, dopo la prima associazione con un protone, la seconda pi
difficile perch il primo protone risente dell'attrazione di due cariche negative ed ha due possibili
siti in cui posizionarsi, mentre il secondo risente di una sola carica e non ha scelta su dove
posizionarsi.

Quando si ha a che fare con molecole grandi come le proteine, il fenomeno della cooperativit non
cos automatico, perch due subunit possono stare una vicina all'altra me se i loro due siti sono
molto lontani possono funzionare indipendentemente l'uno dall'altro, perci il fatto che in alcuni
enzimi vi sia cooperativit vuol dire che questa viene sfruttata, infatti si realizza solo quando ci
sono condizioni favorevoli. Ad esempio, la glutammina sintetasi di E.coli un dodecamero e
ognuna delle sue subunit agisce indipendentemente, perci non un enzima cooperativo.
L'emoglobina invece una proteina allosterica e mostra fenomeni di cooperativit positiva: una
proteina allosterica definita come una proteina nella quale il legame con un ligando in un sito
di legame influenza l'attivit di un altro sito di legame.

La reazione di equilibrio della mioglobina scritta come dissociazione e si ha una costante di


dissociazione K (nella rezione scritta in modo inverso si avrebbe una costante di formazione che
equivale a 1/K), definita come K= ([Mb][O])/[MbO]. Il grado di saturazione invece dato dal
rapporto Y=[MbO]/([MbO]+[Mb]). Per mettere in relazione K e Y, si ricava [MbO]
dall'espressione di K e si sostituisce in Y, e, con opportune semplificazioni, si ha Y= pO/(pO+K),
perci si vede che il grado di dissociazione legato esclusivamente alla costante di dissociazione.
Se Y=0,5 allora la K=pO, perci la costante di dissociazione equivale alla pO in cui si ha il 50%
di molecole ossigenate e l'altro 50% deossigenato, perci si pu scrivere K=P, perci per
ricavare K dai dati sperimentali si cerca la P. Si pu scrivere, in maniera pi omogenea,
Y=pO/pO+P e questa equazione d un'iperbole.

Nel 1910 Hill, studiando le proteine,


introdusse la scrittura siti occupati/siti
liberi= Y/(1-Y)=pO/P detta
equazione di Hill, dove l'unica variabile
pO mentre P una costante del
processo. Questa equazione stata usata
anche per altri processi biologici ed
empirica. In scala logaritmica, si ha
log(Y/(1-Y))=log(pO)-log(P) e si
ottiene una retta di pendenza 1 perch
log(P) una costante additiva. A
seconda del tipo di processo, la retta pu
essere pi in alto o pi in basso ma la
pendenza sempre 1, il che corrisponde
ad un'iperbole in scala normale.
Questo approccio metodologico di Hill si rivela particolarmente utile nel caso dei comportamenti
cooperativi. Consideriamo l'emoglobina: se consideriamo un caso di estrema cooperativit in cui i
quattro O si legano contemporaneamente al tetramero di emoglobina, ovvero non appena un O si
avvicina per legarsi, si legano anche gli altri tre. Assumendo dunque il caso limite in cui il processo
avvenga in un unico stadio, si ha K=([Hb][O]4)/[Hb(O)] e Y dipende da pO, perci la curva
di tipo sigmoide, infatti la quarta potenza fa impennare la curva all'inizio e il numero finito di
subunit disponibili d un plateau alla fine. Se applichiamo il grafico logaritmico di Hill, log(Y/(1-
Y))=4log(pO)-4log(P), perci in via teorica ci si aspetta una pendenza di 4 nel grafico, ma dai
dati sperimentali si ottiene una pendenza di 2,8. Questo ci dice che l'emoglobina non si comporta
secondo una cinetica semplice e il numero 4 il grado di cooperativit teorico mentre il grado di
cooperativit 2,8 quello reale, che tende asintoticamente a 4 ma 4 un caso limite.

Questo approccio si pu applicare sia a processi con cooperativit positiva, che danno pendenza
>1, sia a processi con cooperativit negativa, che danno pendenza <1.

L'emoglobina si carica nei polmoni, dove pO=100 torr, poi viaggia all'interno del circolo
sanguigno e viene portata in distretti nei quali la pressione parziale di ossigeno sempre pi bassa e
l'emoglobina comincia a scaricarsi di O: l'intervallo di pressione parziale di O che si trova
tipicamente nei tessuti corrisponde all'intervallo di massima pendenza dell'affinit
dell'emoglobina per l'O. Nello stesso intervallo, la mioglobina gi quasi satura, infatti essa
capta immediatamente l'O rilasciato nei tessuti dall'emoglobina.
Negli anni '50-'60, i ricercatori pensavano di usare il grafico di Hill per stimare il numero di
subunit delle proteine, ma questo un errore empirico perch il grafico di Hill dipende dalla
funzione della proteina e non dalla struttura, ad esempio se applicassimo l'equazione di Hill alla
glutammina sintetasi si avrebbe pendenza 1 perch non c' cooperativit, ma questo non implica che
essa sia formata da una sola subunit, infatti un dodecamero.

Ci sono diversi modelli in grado di spiegare i risultati sperimentali sulla cooperativit, di cui due
sono i pi importanti: il modello sequenziale e il modello simmetrico. Si ricordi che i modelli
servono per spiegare quello che pu succedere ma non necessariamente corrispondono agli eventi
fisici che accadono realmente.
Nel modello sequenziale, proposto da
Koshland, l'arrivo del primo legante causa
un cambiamento di conformazione della
subunit legata di cui risentono le altre, e una
seconda subunit lega il legante, causando
un'altro cambiamento conformazionale che
aumenta ancora l'affinit delle restanti due,
poi il terzo legante arriva e poi il quarto. La
cooperativit scaturisce dal fatto che le
propriet di ciascuna subunit sono
influenzate dallo stato conformazionale delle
subunit vicine. Bisogna considerare anche la
geometria della molecola. Questo modello
adatto sia ai fenomeni di cooperativit
positiva, sia a quelli di cooperativit negativa.

Il modello simmetrico MWC o concertato o di Monod viene spesso usato per spiegare il
comportamento dell'emoglobina. Questo modello spiega soltanto la cooperativit positiva. In esso
ogni subunit pu esistere in due diverse conformazioni, indipendentemente dal legante, ovvero la
proteina in equilibrio tra due forme; inoltre, questo equilibrio deve essere concertato o
simmetrico, ovvero tutte le subunit si trovano in una conformazione o tutte si trovano nell'altra,
ovvero nello stesso momento tutte le subunit hanno la stessa conformazione, questo pu avvenire
se ad esempio il cambio di conformazione di una subunit viene indotto anche sulle altre. Inoltre, i
due stati della proteina, T0 ed R0, sono in equilibrio tra di loro con una costante di equilibrio L;
infine, l'affinit di una subunit per il legante dipende dalla conformazione, perci il legante
pi affine verso uno di questi due assemblaggi, ed essi hanno due costanti di dissociazione diverse.
A pressioni parziali di legante pi basse, privilegiato il legame con la forma pi affine (R,
relaxed), ma se l'O si lega alla forma pi affine, quindi la forma R viene sottratta all'equilibrio con
T, l'equilibrio iniziale tra T ed R viene perturbato e si sposta verso R. Questo vuol dire che il
legante stesso induce un processo che fa arricchire la soluzione della forma pi affine, come se
si guadagnasse continuamente in forme pi affini. Ci d una curva sigmoide, perch ogni aggiunta
di legante avviene con una concentrazione maggiore di molecole affini, perci questo modello non
pu includere la cooperativit negativa.
Il modello sequenziale dipende essenzialmente dal legame tra la proteina e il legante, il modello
concertato invece dipende dalla presenza di due conformazioni in equilibrio tra di loro in maniera
concertata delle quali una ha maggiore affinit per il substrato. Questi due modelli sono agli
estremi di tante possibilit esistenti, che possono essere rappresentate in una matrice in cui ogni
elemento differisce per numero di subunit in una conformazione e legame di un certo numero e
tipo di subunit con il legante. Nel caso del modello concertato, la condizione di maggiore
efficienza quella in cui l'equilibrio spostato verso la forma meno affine con una certa
differenza di affinit, perch quel poco di forma affine presente viene tutto legato dal legante e
l'equilibrio viene continuamente spostato verso la
forma affine. Nella matrice, il modello sequenziale si
trova illustrato dalla prima e dall'ultima colonna,
mentre quello sequenziale rappresentato dalla
diagonale. La situazione reale pu non essere
descritta da nessuno dei due modelli, ma magari da
un percorso diverso all'interno della matrice, ad
esempio ammettendo forme ibride di conformazione
oppure variazioni non lineari dell'affinit.
importante ricordare che i modelli servono per
descrivere il fenomeno e non corrispondono
necessariamente alla situazione reale. Spesso si
associa l'emoglobina deossigenata alla forma T,
perch la forma meno affine, ma questo un errore
perch pu esserci anche la forma R deossigenata
che ha pi probabilit di perdere l'O.

L'emoglobina dunque considerata trovarsi in due forme all'equilibrio, secondo il modello di


Monod, con una forma T a bassa affinit per O e una forma R pi affine. Molecole come O, CO,
H+ e 2,3-DPG sono in grado di alterare l'equilibrio tra lo stato T e lo stato R dell'emoglobina: l'O
considerato un modulatore positivo, perch fa aumentare l'affinit; quando il legante, legandosi,
crea le condizioni perch si manifesti cooperativit, si parla di effetto omotropico. Invece CO, H+
e 2,3-DPG (difosfoglicerato) sono effettori negativi, questo si chiama effetto eterotropico perch
sono molecole che interferiscono con la normale funzione e abbassano l'affinit. Aumentando CO,
H+ e 2,3-DPG oppure diminuendo la concentrazione di O, l'effetto il rilascio di O, perch questi
effettori spingono l'equilibrio verso la forma meno affine, stabilizzandola.

Si immagini di poter fermare l'equilibrio e poter fare uno studio nella condizione in cui la forma R
resta R e la forma T resta T: in questo caso, ogni subunit del tetramero sarebbe indipendente
senza cooperativit, e per ognuna delle forme ci sarebbe una cinetica semplice data da
un'iperbole ad alta affinit per la forma R e un'iperbole a bassa affinit per la forma T, entrambe
tendono alla saturazione ma ci arrivano con pressioni parziali di O diverse. La curva reale
dell'emoglobina una sigmoide, e pu essere spiegata sia con il modello sequenziale sia con
quello concertato: nel primo tratto la pendenza bassa perch le molecole di emoglobina hanno
ancora bassa affinit dato che non sono ancora legate, per il primo modello, oppure perch si
trovano in gran parte nella forma meno affine, per il secondo modello; poi la curva si impenna
perch con il legame aumenta l'affinit oppure perch l'equilibrio viene spostato verso la forma pi
affine; infine si arriva ad una saturazione.
A concentrazioni basse di O, quindi, la sigmoide molto vicina all'iperbole della forma meno
affine, mentre alla saturazione molto vicina all'iperbole della forma pi affine. Studiando
l'emoglobina in un ampio range di pressioni parziali di O, nel grafico di Hill ci sono un primo
tratto con pendenza 1, poi un tratto intermedio con pendenza maggiore, e poi un altro tratto con
pendenza 1 vicino alla saturazione, perch all'inizio il sistema risponde come la forma T e alla fine
come la forma R, mentre per pressioni parziali intermedie si pu apprezzare un indice di Hill >1.
Effettori dell'emoglobina
Il pH influisce sull'affinit tra O ed emoglobina:
pi alta la concentrazione di H+, pi
l'emoglobina tende a rilasciare l'O. Nei tessuti c'
una pi alta concentrazione di CO: essa in acqua
d origine all'acido carbonico, che si dissocia in H+
e HCO3- perci la produzione di CO in un certo
distretto del corpo abbassa il pH di quel distretto. Il
pH scende dagli alveoli polmonari, dove pi alto,
ai tessuti, dove pi basso, inoltre la pressione
parziale di O diminuisce dagli alveoli polmonari ai
tessuti: perci l'emoglobina satura di O2 appena
esce dai polmoni e, man mano che si avvicina ai
tessuti, la sua capacit di mantenere l'O crolla. La
differenza nelle concentrazioni del pH dunque
molto importante nel traghettare l'O dai polmoni ai
tessuti.

L'effetto del pH prende il nome di effetto Bohr: nel riarrangiamento che si instaura
nell'emoglobina dopo il legame con O vengono a cadere alcuni legami a idrogeno che prima
erano presenti e cambia la conformazione, tra questi vi sono una istidina e un aspartato che
vengono allontanati a seguito del legame con O. Inizialmente, nella forma deossigenata, istidina e
aspartato interagiscono e il protone dell'istidina viene stabilizzato sull'anello imidazolico, dove la
carica ben dispersa, inoltre essa viene stabilizzata ulteriormente dalla carica negativa del COO-
dell'aspartato e l'istidina risulta cos un acido molto pi debole rispetto a quando sola. Se
l'istidina perde il protone, essa non interagisce pi con l'aspartato. Quando arriva l'O, esso
causa l'allontanamento tra istidina protonata e aspartato, forzando il loro legame a idrogeno:
l'istidina, che non ha pi la stabilizzazione dell'aspartato, si deprotona perch un acido un po' pi
forte, quindi il pH dell'ambiente diminuisce. Se al sistema viene fornito un eccesso di H+, esso
riprotona parte dell'istidina, tornando a farla interagire con l'aspartato, e questa conformazione
rende il legame con l'O meno stabile: perci abbassando il pH si mette in atto un processo che
contrasta con l'attivit dell'O, che normalmente li allontana, forzandolo ad uscire dalla molecola.
La reazione di formazione di acido carbonico da CO catalizzata dall'anidrasi carbonica, un
enzima ad altissima efficienza catalitica.

La CO ha anche un effetto primario, oltre all'abbassamento del pH, che fa diminuire l'affinit
dell'emoglobina per l'O. Se si impone un certo valore di pH al sistema con l'uso di tamponi e
senza CO, l'affinit si abbassa, se poi viene mantenuto il pH e si aggiunge CO l'affinit si riduce
ulteriormente. La CO infatti in grado di modificare le subunit dell'emoglobina formando dei
carbammati (ammine+acido carbonico), questo fa s che l'emoglobina sia meno efficiente nel legare
O perch i carbammati formano dei ponti salini che stabilizzano la forma T. La CO viaggia
infatti sotto forma di carbammati al ritorno dai tessuti ai polmoni, dove viene rilasciata.
Un altro potente effettore dell'emoglobina l'acido 2,3-difosfoglicerico,
molecola che presenta un carbossile e due gruppi fosfato, perci ha una grande
carica negativa e tende ad interagire con centri con carica positiva. Esso si
pone, uno per tetramero di emoglobina, in un sito al centro della struttura,
che si genera dal contatto tra le coppie -, lontano dai gruppi eme, ma
comunque esso in grado di esercitare una potente azione modulatoria. Il 2,3-
DPG mantenuto in questa posizione da residui amminoacidici carichi
positivamente, ovvero istidine e lisine delle subunit . Con l'aggiunta di 2,3-
DPG, la curva di saturazione dell'emoglobina si sposta verso pressioni
parziali di O pi elevate, ovvero esso ha un effetto modulatorio negativo.

Al livello del mare, la concentrazione di 2,3-DPG sintetizzato dalla cellula intorno a 5 mM,
mentre in alta montagna aumenta a circa 8 mM; questo, al contrario di ci che si potrebbe pensare
a prima vista, un effetto positivo, infatti si tratta di un meccanismo di adattamento in quota. Al
livello del mare, dove l'O molto disponibile, nel passaggio dai polmoni ai tessuti il 38%
dell'emoglobina scarica O. Se la concentrazione di 2,3-DPG non variasse in alta quota,
l'emoglobina nei polmoni sarebbe molto meno satura rispetto al livello del mare, e nei tessuti
rilascerebbe solo il 30% dell'O, quindi ci sarebbe una perdita dell'8%. Con 2,3-DPG 8mM in alta
montagna, la saturazione nei polmoni diminuisce di poco mentre nei tessuti diminuisce di molto, e
il rilascio netto di emoglobina del 37%, quasi quanto a livello del mare.
Il 2,3-DPG una molecola importante, derivante dalla glicolisi, in particolare dall'1,3-DPG con
una reazione alternativa alla sintesi di una molecola di ATP, ovvero per sintetizzare una molecola
di 2,3-DPG l'organismo rinuncia ad una molecola di ATP, e questo un indice della sua importanza.
Un'altra funzione importante del 2,3-DPG ha a che fare con
l'ossigenazione del feto: l'emoglobina fetale ha maggiore
affinit per O mentre quella materna ha la normale affinit
dell'emoglobina adulta, e questo fa s che l'O passi dal circolo
materno a quello fetale. L'emoglobina fetale ha minore
affinit per il 2,3-DPG perch nella subunit
dell'emoglobina fetale un'istidina sostituita da una serina,
perci mancano nel sito di legame del 2,3-DPG due cariche
positive che stabilizzano il 2,3-DPG nell'emoglobina materna.

Emoglobina nell'anemia falciforme

Un esempio della grande importanza degli amminoacidi essenziali nell'emoglobina, la cui assenza
causa la perdita di funzionalit, l'anemia falciforme, in cui si vengono a generare strutture fibrose
per aggregazione di molecole di emoglobina detta in questo caso emoglobina S. Essa presenta la
sostituzione di un solo amminoacido, un acido glutammico con una valina, ovvero da un
amminoacido carico negativamente ad un amminoacido idrofobico, e questo apporta una grande
differenza. Sulle subunit c' un sito detto sticky site: nell'emoglobina S, nel momento in cui
viene scaricato l'ossigeno e lo sticky site viene esposto, il residuo di valina pu interagire con
esso. Perci quando i tetrameri deossigenati si avvicinano, la valina pu interagire con questo sito
idrofobico e trovare stabilizzazione, perci i tetrameri tendono ad aggregarsi a catena fino a
formare delle vere e proprie strutture fibrillari, cos stabili da poter danneggiare la membrana
dell'eritrocita e far fuoriuscire il materiale cellulare, inoltre anche l'emoglobina normale
deossigenata pu partecipare alla struttura delle fibrille passivamente perch ha lo sticky site
(dove ci sono leucina e fenilalanina) ma non la valina. Invece le emoglobine ossigenate, sia
normale sia S, non si aggregano o hanno una tendenza molto bassa ad aggregarsi. Il problema delle
fibrille si manifesta quindi nei tessuti, dove l'emoglobina deve svolgere la sua funzione e dove i
capillari sono pi stretti e le cellule falciformi passano pi difficilmente, ostruendoli.