Determinacin de prtena ttal

Objetivo
Determinar la concentracin de protena de las muestras requeridas.

Materiales y Equipo
dH2O Balanza analtica
Reactivos de Bradford, Biuret y/o Esptula
BCA Espectrofotmetro
Micropipetas y puntas Tubos falcon (15mL 50mL)
Placa de 96 pozos Tubos de 1.5 mL
Albmina srica bovina (BSA)

Notas y recomendaciones
No tocar la parte inferior de las microplacas
Utilizar guantes para el manejo de las muestras y los reactivos
El blanco se prepara con dH2O mientras que el control con el mismo buffer de la muestra.
Se recomienda realizar ensayos por triplicado.
Se recomienda que un valor de r2 de al menos un 95% para considerar la curva estndar como
aceptable.
El reactivo (Bradford, Biuret y/o BCA) remanente debe juntarse en un solo recipiente. No desechar
en la tarja.
Mtodo de Bradford
Metodologa
De acuerdo al volumen de muestra disponible y a la concentracin de protena se pueden emplear ensayos
estndar o microensayos para cubetillas y microplacas respectivamente. Sin embargo, aqu solo se har
referencia a los ltimos.

Tabla 1 Ensayos en microplacas para determinacin de protena total por el mtodo de Bradford
Ensayo Tipo Rango Dilucin del Vol. De Vol. de
reactivo muestra reactivo
1 Estndar 0.05 a 0.5 mg/mL (1:4) 10 L 200 L
2 Micro 8 a 80 g/mL No 160 L 40 L

Una vez elegido el ensayo a realizar lo siguiente:

1. Hacer una solucin stock de BSA de 10 mg/mL en dH2O o en el buffer en el que se encuentre las
muestras.
2. Hacer las diluciones necesarias para hacer una curva tipo con al menos 5 puntos dentro del rango
seleccionado.

Tabla 2 Ejemplo para curva tipo para el ensayo de Bradford

Curva tipo ensayo 1
Vol. dH2O o Vol. BSA Vol. Total Concentracin
buffer [L] (10mg/mL) [L] [mL] BSA [mg/mL]
1000 0 1 0
995 5 1 0.05
990 10 1 0.1
975 25 1 0.25
960 40 1 0.4
950 50 1 0.5

Nota: De ser necesario, utilizar tubos de 1.5 mL para hacer las diluciones de la curva estndar
3. Adicionar, con ayuda de micropipetas, la cantidad de estndar o muestra en los pozos de la
microplaca.
Nota: Realizar las diluciones de las muestras, conforme a la concentracin esperada
4. Adicionar el reactivo de Bradford conforme a los volmenes especificados en el Tabla 1.
Nota: En caso de requerirlo, utilizar la pipeta multicanal.
5. Incubar a temperatura ambiente durante ms de 5 minutos, pero menos de 1 hora.
6. Leer las muestras a una longitud de onda de 595nm
Mtodo de Biuret
Metodologa
Tabla 3 Ensayos para determinacin de protena total por el mtodo de Biuret

Ensayo Rango Dilucin del Vol. De Vol. de

reactivo muestra reactivo
1 0 a 10 mg/mL No 100 L 200 L
2 0 a 5 mg/mL No 100 L 200 L

Una vez elegido el ensayo a realizar lo siguiente:

1. Hacer una solucin stock de BSA de 10 mg/mL en dH2O o en el buffer en el que se encuentre las
muestras.
2. Hacer las diluciones necesarias para hacer una curva tipo con al menos 5 puntos dentro del rango
seleccionado.

Tabla 4 Ejemplo para curva tipo para el ensayo de Biuret

Curva tipo ensayo 1

Vol. dH2O o Vol. BSA Vol. Total Concentracin
buffer [mL] (10mg/mL) [mL] [mL] BSA [mg/mL]
1.0 0 1 0
0.8 0.2 1 2
0.6 0.4 1 4
0.4 0.6 1 6
0.2 0.8 1 8
0 1.0 1 10

Nota: De ser necesario, utilizar tubos de 1.5 mL para hacer las diluciones de la curva estndar
3. Adicionar, con ayuda de micropipetas, la cantidad de estndar o muestra en los pozos de la
microplaca.
Nota: Realizar las diluciones de las muestras, conforme a la concentracin esperada, con dH2O o
buffer.
4. Adicionar el reactivo de Biuret conforme a los volmenes especificados en el Tabla 3.
Nota: En caso de requerirlo, utilizar la pipeta multicanal.
5. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, pero menos de 1 hora.
6. Leer las muestras a una longitud de onda de 550nm
Mtodo de BCA
Metodologa
Tabla 5 Ensayos para determinacin de protena total por el mtodo de BCA

Ensayo Rango Dilucin del Vol. De Vol. de Contenedor

reactivo muestra reactivo
1 0 a 1000 g/mL No 25 L 200 L Microplaca

Una vez elegido el ensayo a realizar lo siguiente:

1. Hacer una solucin stock de BSA de 10 mg/mL en dH2O o en el buffer en el que se encuentre las
muestras.
2. Hacer las diluciones necesarias para hacer una curva tipo con al menos 5 puntos.

Tabla 6 Ejemplo para curva tipo para el ensayo de BCA

Vol. dH2O o Vol. BSA Vol. Total Concentracin

buffer [mL] (10mg/mL) [L] [mL] BSA [g/mL]
1.0 0 1 0
0.98 20 1 200
0.96 40 1 400
0.94 60 1 600
0.92 80 1 800
0.90 100 1 1000

Nota: De ser necesario, utilizar tubos de 1.5 mL para hacer las diluciones de la curva estndar
3. Adicionar, con ayuda de micropipetas, la cantidad de estndar o muestra en los pozos de la
microplaca.
Nota: Realizar las diluciones de las muestras, conforme a la concentracin esperada.
4. Mezclar 50 partes del reactivo A con 1 parte del reactivo B para generar el volumen requerido de
reactivo de BCA.
Nota: El reactivo debe verse de un color verde claro
5. Adicionar el reactivo de BCA conforme a los volmenes especificados en el Tabla 5.
Nota: En caso de requerirlo, utilizar la pipeta multicanal.
6. Cubrir la microplaca e incubar a 37C durante al menos 30 minutos.
7. Leer las muestras a una longitud de onda de 562nm
Referencias
Bio/Rad. (29 de Junio de 2016). Bradford Protein Assay. Obtenido de http://www.bio-
rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/LIT33.pdf