Las enzimas.

Las enzimas son protenas o cidos nucleicos, tienen masas molares entre 12,000 y 1 milln
de Daltons. Son especficas de los sustratos y/o reacciones que catalizan, aceleran las
reacciones en el orden de 106 a 1017 veces, siendo la enzima ureasa una de las que posee
mayor poder cataltico.

Funciones de las Enzimas.

En la literatura se reportan varias funciones de las enzimas, que se describen a
continuacin.
1. Catlisis. La mayora de las reacciones qumicas del metabolismo son lentas, las
enzimas aceleran las reacciones permitiendo que el metabolismo se efecte a la velocidad
que las clulas demandan.
2. Direccin. Las enzimas no permiten la formacin de productos secundarios, de esta
manera evitan que se pierdan precursores y energa que la clula necesita.
3. Control. La actividad de las enzimas se puede regular para ajustarla a las necesidades
del metabolismo. La velocidad del metabolismo es determinada por las enzimas.
4. Acoplamiento. Las enzimas son los agentes encargados de acoplar reacciones no
permitidas con reacciones espontneas, permitiendo que las mismas se realicen.(Laidler,
1973)

1.1.1 Composicin y estructura.

En 1905 Arthur Harden descubri que la actividad de las enzimas requera de dos
fracciones, una no ultrafiltrable y sensible a la temperatura, a la que llam zimasa, y otra
filtrable y de resistente al calentamiento, la cozimasa. La zimasa de Harden, est formada
por las protenas, mientras que la cozimasa contena los sustratos y cofactores necesarios
para la actividad de las enzimas.
Los grupos qumicos no protenicos de las enzimas conjugadas se dividen en tres
categoras.

1
1. Cofactores. De naturaleza inorgnica, frecuentemente iones metlicos, entre los ms
comunes estn Fe2+, Cu1+, Mg2+, Mo2+, Mn2+ y Zn2+. (Nelson, 1992)
2. Coenzimas. Compuestos orgnicos, muchos de ellos derivados de vitaminas, tambin
conocidos como Cosustratos. Algunos ejemplos son cido lipico, pirofosfato de tiamina,
biotina y vitamina B12. Tradicionalmente, se llaman coenzimas a los cosustratos libres,
que se separan de la enzima por dilisis.
3. Grupos prostticos. Se denomina as a los Cofactores o Coenzimas que se unen con
fuerza a su enzima, a veces mediante enlaces covalentes, y no se separan por dilisis.
(Nelson and Cox, 1992a)

Las enzimas conjugadas pueden requerir tanto cofactores como coenzimas.

1. Holoenzimas. Son las enzimas conjugadas que tiene actividad cataltica alta porque
estn unidas a su coenzima o cofactor.
2. Apoenzima. Es la parte protenica de una enzima conjugada, cuando no se encuentra
presente el cofactor o coenzima necesarios. En estas condiciones la protena pierde parte o
toda su actividad cataltica.
Basndose en lo anterior, se dice que la protena es la parte responsable de la especificidad
de la enzima mientras que la coenzima o cofactor son responsables de la catlisis.

El primer paso en la catlisis enzimtica es la unin del sustrato a la enzima para formar el
llamado complejo Enzima-Sustrato (ES). El sustrato se une a la enzima en un lugar
especfico de esta llamado Sitio Activo.
El complejo ES, se ha estudiado en varias enzimas usando tcnicas como la microscopa
electrnica, difraccin de rayos X, Resonancia Magntica Nuclear y varios mtodos
espectroscpicos, determinndose que las propiedades ms importantes del sitio activo
son:(Voet and Voet, 2004 )
1. Constituye slo una pequea parte de toda la estructura de la enzima.
2. Es el sitio de reconocimiento y unin del sustrato.
3. Contiene los restos de aminocidos que participan en las reacciones qumicas.

2
4. Tiene una forma tridimensional caracterstica, determinada por el arreglo de restos de
aminocidos provenientes de diferentes secciones de la cadena de aminocidos, que se
aproximan entre s.
Los sustratos se unen al sito activo mediante interacciones no covalentes como:
1. Enlaces electrostticos.
2. Enlaces de hidrgeno.
3. Fuerzas de Van der Waals.
4. Interacciones hidrfobas.

1.1.2 Mecanismos de la Catlisis Enzimtica.

La complementariedad de forma tridimensional entre la enzima y el sustrato permite
disminuir la energa de activacin de la reaccin, mediante factores como:
1. La orientacin de los sustratos en el sitio activo es la ms apropiada para la reaccin.
2. La participacin de las cadenas laterales de los aminocidos en el complejo ES, permite
estabilizar los estados de transicin.
3. Los cambios de conformacin de la enzima, provocados por la unin del sustrato al sitio
activo, inducen tensin en la molcula y facilitan el rompimiento de enlaces.
Ocasionalmente tambin se pueden formar enlaces covalentes de corta duracin.(Webb,
1963).
Existen dos modelos para explicar la unin de la enzima y el sustrato en la catlisis
enzimtica:
1. Modelo de la llave y la cerradura. Fue propuesto por Emil Fischer a finales del siglo
XIX. Considera que la enzima es una estructura rgida a la cual se debe ajustar el sustrato.
(Arias, 2008)
2. Modelo de ajuste inducido. Desarrollado por Daniel Koshlanden la dcada de 1960.
Supone que la enzima es flexible, capaz de cambiar de forma cuando es inducida por la
unin del sustrato, moviendo los grupos R hacia posiciones que facilitan la reaccin.

1.1.3 Formas de expresar la actividad enzimtica

La actividad de una enzima se puede expresar en trminos de unidades de enzima o
unidades internacionales (UI). La UI (recomendada por la Unin Internacional de

3
Bioqumica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversin de un
micromol de sustrato en un minuto (mol/min). La actividad especfica es el nmero de
unidades internacionales de enzima por miligramo de protena (UI/mg de protena).

1.1.4 Fundamentos tericos de los estudios cinticos en reacciones enzimticas.

Las enzimas son catalizadores biolgicos, en la mayora de los casos de naturaleza proteica.
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima
libre (E).
La mayora de las reacciones biolgicas transcurren lentamente si no son catalizadas; en
esencia, las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilizacin de los estados de
transicin, disminuyendo as la energa de activacin, en consecuencia la velocidad de la
reaccin aumenta, este fenmeno se muestra en la figura 1.

Figura 1: Efecto de las enzimas sobre la energa de activacin de la reaccin.

1.2.5.1 Factores que inciden en la actividad enzimtica.

Varios son los factores que pueden incidir sobre la actividad de las enzimas tales como: la
temperatura del medio, el pH, la concentracin de enzima, el tiempo de incubacin y la
concentracin de sustrato.

Efecto de la temperatura de incubacin: Dentro de ciertos lmites, la velocidad de

reaccin aumenta con la temperatura. Como regla general se cumple que por cada aumento

4
de 10 C la velocidad de una reaccin se duplica. En caso de reacciones enzimticas se
observa una temperatura ptima; por encima de la cual, la velocidad decrece rpidamente
debido a la desnaturalizacin de la enzima. La temperatura de mxima actividad no se
corresponde necesariamente con la temperatura de mxima estabilidad. El efecto de la
temperatura sobre la actividad enzimtica se muestra en la Figura 2. (Arias, 2008)

Figura 2: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.

Efecto del pH del medio de incubacin: Cambios moderados en el pH afectan el estado

inico de la enzima y con frecuencia tambin del sustrato. A valores extremos de pH se
produce la desnaturalizacin de la enzima, de ah la importancia de conocer el efecto del
pH y la determinacin del pH ptimo, este comportamiento se muestra en la Figura 3,
donde se representa velocidad contra pH.

Figura 3: Efecto del pH sobre la actividad enzimtica.

Concentracin de la enzima: La Figura 4 muestra el comportamiento de la cantidad del

producto de reaccin en funcin del tiempo de incubacin. Adems se muestran varias
curvas correspondientes a diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de
concentracin de enzima desde E1 a E4).

5
Todas las curvas muestran que, a tiempos cortos, la cantidad de producto formado aumenta
en funcin del tiempo de forma lineal (velocidad inicial V0).
A tiempos prolongados se alcanza una cantidad constante del mismo (equilibrio). La figura
muestra que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracin de enzima empleada. Esto se evidencia claramente en la figura 5 donde se
grafica la velocidad de formacin de producto en funcin de la concentracin de enzima a
un tiempo fijo. A una concentracin de sustrato constante, y en un rango de concentracin
de enzima baja, la velocidad de formacin de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracin de enzima. Sin embargo, cuando la concentracin de
enzima es alta, la velocidad de la reaccin tiende a permanecer constante a pesar de que ella
aumente debido a que el sustrato es el reactivo limitante de esta reaccin. La velocidad se
expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej. moles/min).
(Nelson and Cox, 1992b)

Figura 4: Formacin de producto en funcin del tiempo con concentraciones crecientes de

enzima y una concentracin de sustrato constante

Figura 5: Velocidad de reaccin en funcin de la concentracin de enzima.

6
Tiempo de incubacin: En la figura 6 se observa la variacin de las concentraciones de:
complejo enzima sustrato (E-S), de sustrato (S), de enzima (E) y de producto (P), en
funcin del tiempo.

Figura 6. Variacin de la concentracin de las especies qumicas que participan en una

reaccin catalizada por enzimas, en funcin del tiempo. (E): concentracin de enzima; (S):
concentracin de sustrato; (ES): concentracin de complejo enzima sustrato; (P):
concentracin de producto.

Efecto de la concentracin de sustrato: Modelo cintico de Michaelis-Menten

Para explicar las caractersticas cinticas de algunas reacciones, Michaelis y Menten
propusieron un modelo sencillo que las describe (figura 7). Este modelo asume que la
reaccin inversa prcticamente no ocurre, lo cual es posible a tiempos muy cortos. (Perillo,
2013). Se denomina condiciones de velocidad inicial (Vo) a las condiciones en que se debe
trabajar para que las condiciones del modelo se cumplan.
La velocidad inicial Vo corresponde a la velocidad de incremento de producto en funcin
del tiempo cuando la concentracin de producto es baja, es decir, a tiempos prximos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad
de sustrato inicial.
A su vez, la ecuacin de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condicin de estado estacionario, en donde la concentracin del complejo enzima - sustrato
se mantiene estable en el tiempo.

7
Figura 7: Curva de MichaelisMenten de Vo en funcin de la concentracin de sustrato.

La ecuacin de MichaelisMenten puede transformarse algebraicamente en otras formas

que son ms tiles para el manejo de los datos experimentales. Una de las ms utilizadas es
la transformacin Lineweaver-Burk (Nelson and Cox, 1992b) que permite calcular los
valores de Km y V mxima de forma sencilla, figura 8.(Voet and Voet, 2004 )

Figura 8: Representacin de Lineweaver-Burk.

A partir del grfico se puede determinar las constantes cinticas que caracterizan a una
enzima: Km (constante de Michaelis) y Vmx (velocidad mxima), para un sustrato en
condiciones determinadas.
Km: este valor corresponde a la concentracin de sustrato necesaria para alcanzar una
velocidad igual a la mitad de la Vmx y est relacionada inversamente con la afinidad de la
enzima por el sustrato.

8
Vmx: es la velocidad que se alcanza cuando la enzima est saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato).
En cuanto a KM como ya se expres que viene dada por:

k1 k2
KM
k1
Siendo:
Constante de reaccin directa de la primera etapa: k1
Contante de la reaccin inversa de la primera etapa: k-1
Constante de la reaccin de la segunda etapa: k2
Los valores de KM para la mayora de las enzimas oscilan entre 10-1 y 10-7 mol/L.(Stryer et
al., 2013)

1.3 La enzima ureasa (urea amidohidrolasa).

La ureasa de los frijoles jack fue la primera enzima purificada y cristalizada, James Batcheller
Sumner lo hizo en 1926, hecho que le permiti recibir el Premio Nobel en la Qumica en
1946.
La ureasa (urea amidohidrolasa), una enzima que se encuentra en muchas plantas, cataliza
la hidrlisis de urea para formar amonaco e hidrgeno carbonato. La funcin principal de
la ureasa en las plantas es reciclar nitrgeno (N) a partir de la urea externa o generada
internamente. (Romero, 2013)
La enzima ureasa se encuentra en el grupo de las hidrolasas y recibe esta clasificacin
debido a las reacciones que cataliza.
Accin sobre enlaces carbono-nitrgeno (salvo enlaces peptdicos).
Sobre amidas lineales.
Una gran variedad de ureasas han logrado aislarse de diversas fuentes tales como algas,
plantas, hongos y bacterias.
Independientemente de las diferencias estructurales y de la ureasa microbiana, se deduce el
mismo patrn de catlisis, principalmente a causa de la secuencia similar de aminocidos y
a la presencia de dos iones de Ni2+ en el sitio activo de la enzima. (Hanif et al., 2012)
Las ureasas de hongos y plantas son protenas homooligomricas de 90 KDa, mientras que
las ureasas bacterianas son multmeros de dos o tres subunidades complejas. Los residuos

9
amino terminales de los monmeros de las ureasas de plantas son similares en secuencia a
las pequeas subunidades de las enzimas bacterianas. La ureasa mejor caracterizada es la
que se obtiene de las plantas de semillas de chcharo (Canavalia Ensiformis), otras ureasas
bien caracterizadas son las que provienen de morera (Morus alba) as como las plantas de
los frijoles de soya (Glycine max) y las del gnero Arabidopsis. Las ureasas en la mayora
en los tejidos vegetativos se encuentran en bajas concentraciones. (Olivera et al., 2006).
Las ureasas bacterianas desempean roles de virulencia humana y animal. Bacterias
productoras de ureasa consideradas patolgicas son: Proteusmirabilis, Staphylococcuss
aprophiticus, Yersiniaenterocolitica, Klebsiellaaerogenesy Ureaplasmaurealiticum, entre
otras. (Sirko and Brodzik, 2000) Otra de las ureasas frecuentemente mencionada en la
literatura es la proveniente de Helicobacter pylori, la cual coloniza la mucosa estomacal y
es el principal factor de riesgo en enfermedades como lceras duodenales y estomacales,
carcinomas gstricos y linfomas.

1.3.1 Estructura de la ureasa

La ureasa est unida a dos iones de nquel por subunidad, tiene cuatro histidinas, un
aspartato y una molcula de carbamatolisina que sirve como ligando para estos metales,
una histidina adicional est involucrada en el mecanismo cataltico. El dominio de la ureasa
forma una estructura de barril (, ) con una estructura similar a la de otras hidrolasas.
(Carlsson and Nordlander, 2010)
La estructura cristalina del centro activo de la ureasa contiene probablemente dos molculas
de agua y un puente OH-. La estructura se muestra en la figura 9.

Figura 9: Estructura qumica de la ureasa

10
1.3.2 Mecanismo de reaccin de la ureasa.
El mecanismo de reaccin es una interaccin cooperativa entre los dos iones del nquel.
Uno de los iones de nquel acta como un cido de Lewis. El in metlico polariza el grupo
carbonilo de la urea reforzando la carga positiva del carbono carbonlico y hacindolo ms
reactivo a la adicin nucleoflica. (Carlsson and Nordlander, 2010)
El otro in de nquel aumenta la acidez de la molcula de agua enlazada a l, provocando la
prdida de un protn y formndose el in OH- fuerte nuclefilo que ataca al carbono
carbonlico parcialmente positivo de la urea, producindose el ataque nucleoflico.
Uno de los dos grupos amino (NH2) de la urea es protonado. Se postula que la histidina es
el cido. Como resultado de la reaccin se forma amonaco y carbamida cida. El
mecanismo de la ureasa se presenta en la figura 10. (Romero, 2013)

Figura 10: Mecanismo de reaccin de la ureasa.

La carbamida cida se descompone espontneamente para formar amonaco y dixido de

carbono. (Romero, 2013)

En disolucin acuosa se presenta el siguiente equilibrio:

La ureasa es una enzima absolutamente especfica por su sustrato, la urea, y compuestos

anlogos estructurales como la thiourea, no son degradados por esta enzima.

11
1.4. La urea como sustancia qumica.
Urea: Carbamida o Urea. Compuesto qumico cristalino e incoloro. Su frmula qumica
global es:
(NH2)2CO
Tambin es conocida como carbonildiamida o cido carbamdico. El nombre IUPAC es
diaminocetona.
Es una sustancia nitrogenada producida por variados seres vivos como medio de
eliminacin del amonaco, el cul es altamente txico para ellos. En los animales se halla
en la sangre, orina, bilis y sudor.
Posee propiedades higroscpicas y al disolverse en agua absorbe calor por lo que resulta
fro y hmedo al tacto.

1.4.1 Propiedades fsicas y qumicas.

Frmula global: CON2H4
Frmula semidesarrollada: NH2CONH2
Masa molecular: 60.06 g.mol-1
Estado de agregacin: slido.
Densidad: 1.34 g/cm
Temperatura de fusin: 132.7 C
Calor de fusin: 24.18 J/g
Calor de combustin: 10 590 J/g
Calor de disolucin en agua: 241.8 J/g

1.4.2 Estructura
El carbono es el tomo central de la molcula de carbamida, al cual se une un tomo de
oxgeno mediante doble enlace y dos grupos aminos lo que confiere a la molcula una
estructura trigonal plana.

1.4.3 Obtencin
La carbamida se obtiene sintticamente a partir del amonaco (NH3) y el dixido de
carbono (CO2) cuya interaccin comprende dos etapas.

12
En la primera tiene lugar la formacin de carbamato de amonio segn la reaccin:
2 NH3 + CO2 NH2COONH4 H= 159.1 kJ

En la segunda etapa ocurre la deshidratacin del carbamato formndose la carbamida:

NH2COONH4 (NH2)2CO + H2O H= 285 kJ

Estas reacciones se verifican en los procesos industriales a temperaturas de 180 a 200 C y

presin de 18106 - 2107 N/m2 (200 atmsferas).

1.4.4. Aplicaciones de la urea.

Ms del 90 % de la produccin mundial de carbamida se destina a su uso como fertilizante,
el cual se aplica tanto al terreno como a la superficie foliar de las plantas a travs del riego.
A partir de la carbamida se obtienen resinas para producir plsticos valiosos como los
llamados plsticos amnicos, losas de viruta de madera, colas sintticas y compuestos para
impregnar tejidos. La carbamida tiene una amplia aplicacin en la industria farmacutica
estando presente en la composicin qumica de medicamentos como la carbamazepina y
otros.

1.5 Reacciones para la determinacin de urea en plasma sanguneo.

A partir del anlisis bibliogrfico realizado se identificaron varios mtodos para la
determinacin de urea en plasma sanguneo, los cuales se mencionaran a continuacin.

1.5.1 Reaccin de Berthelot

Fundamento del mtodo: La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea presente en la muestra
formndose amonaco y anhdrido carbnico (CO2). El amonaco reacciona con el fenol en
presencia de hipoclorito de sodio produciendo un compuesto de color azul, cuya
concentracin se puede determinar espectrofotomtricamente. (Cruz, 2004)

1.5.2 Reaccin de Nessler

La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea presente en la muestra formndose amonaco y
anhdrido carbnico (CO2). El reactivo de Nessler (yoduro doble de potasio y mercurio)
reacciona con el nitrgeno del amonaco para producir un compuesto de color amarillo.

13
1.5.3 Reaccin de Berthelot modificada para determinar urea en sangre.
La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea, presente en la muestra, en amonaco en forma de
ion amonio (NH4+) y anhdrido carbnico (CO2). Los iones amonio reaccionan con
salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO), en presencia del catalizador nitroprusiato, para
formar 2,2 dicarboxiindofenol de color verde. La intensidad del color formado es
proporcional a la concentracin de urea en la muestra ensayada. (Cruz, 2004)
La tcnica analtica a aplicar se basa en la reaccin de Berthelot modificada, por lo cual se
utilizarn los reactivos provistos por QUIMEFA. Esta tcnica tiene su fundamento en los
mtodos espectrofotomtricos que permiten la determinacin cuantitativa de muchas
especies tanto orgnicas como inorgnicas por lo que es necesario tener conocimientos
sobre los mismos.

1.6 Mtodos espectrofotomtricos.

Los mtodos espectrofotomtricos de absorcin molecular se basan en la medida de la
absorcin de la radiacin electromagntica por las sustancias y son tambin llamados
mtodos absorciomtricos. La absorcin de la radiacin visible y ultravioleta se utiliza
como la base de la determinacin cuantitativa de muchas especies qumicas. (Harris, 1996)

1.6.1 La absorcin de la radiacin. Ley fundamental de la absorcin (Ley de Lambert-

Bouguer-Beer).
Cuando un haz de energa radiante incide sobre una sustancia (en general en forma de
disolucin homognea), contenida en un recipiente pueden ocurrir varios fenmenos:
1. La radiacin puede pasar a travs de la sustancia sin que ocurra absorcin.
2. La radiacin puede ser absorbida total o parcialmente (de forma selectiva).
3. La direccin de propagacin de la radiacin puede ser alterada mediante la reflexin,
refraccin o dispersin por las partculas en suspensin. (Ayres, 1970)
La ley fundamental de la absorcin plantea:

Donde: es la absortividad molar de la sustancia, b es la longitud de la celda (camino

ptico) y c es la concentracin de la sustancia.

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El cumplimiento de dicha ley es la base del mtodo espectrofotomtrico de anlisis
cuantitativo. Su representacin grfica es una recta cuya pendiente es y que pasa por el
origen de coordenadas. .(Salvatierra et al., 2005)

1.6.2 Determinaciones cuantitativas mediante la espectrofotometra de absorcin UV-

VISIBLE.
Las determinaciones cuantitativas mediante la absorcin de la radiacin UV-VISIBLE se
basan en general en la comparacin de la absorcin de la radiacin de determinada longitud
de onda de una disolucin de la especie absorbente que se analiza, con la de una serie de
disoluciones patrones de esa misma especie bajo idnticas condiciones.
En la prctica se preparan una serie de patrones de la especie absorbente de diferentes
concentraciones y se mide la absorbancia de cada una contra una disolucin de referencia o
blanco, la cual contiene todos los reactivos utilizados menos la sustancia que se analiza.
(Alexiev, 1988)
Se obtiene as una curva de calibracin que no es ms que un grfico que expresa la
dependencia de la absorbancia con la concentracin de los patrones. Se determina la
absorbancia de la disolucin que se analiza y de interpola su valor a la curva de calibracin,
para obtener as la concentracin de la sustancia en la muestra.

1.7 Procesos de extraccin.

La extraccin es una tcnica de separacin que se puede aplicar a todo tipo de mezclas, ya
sean stas slidas, lquidas o gaseosas. La extraccin se basa en la diferencia de solubilidad
de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado. La forma ms simple de
realizar una extraccin consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los dems no. Sin embargo, la tcnica de
extraccin ms empleada consiste en la disolucin de la mezcla a separar en un disolvente
que disuelva a todos los componentes.(Mitra, 2003) A continuacin, se procede a la adicin
de un segundo disolvente, no miscible con el primero, de manera que los componentes de la
mezcla se distribuyan entre los dos disolventes segn su coeficiente de reparto.

15
En el caso de las enzimas el primer paso de la extraccin consiste en la obtencin del
extracto que implica la destruccin de la clula y el paso de la enzima a la solucin o
suspensin esto puede llevarse a cabo por:
Homogenizacin mecnica. Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero,
licuadora a veces con el uso de abrasivos como almina, con un solvente adecuado,
isotnico (sacarosa 0.25 mol/L, NaCl 0.9 %, KCl 0.15mol/L) o ligeramente
hipertnico en un buffer adecuado para controlar el pH.
Homogenizacin snica. El choque de ondas snicas o ultrasnicas provoca cambio
de presin que rompe las paredes celulares. Se usa generalmente para bacterias,
levaduras y en ocasiones para determinados tejidos animales (baso, rin
eritrocitos).
Desintegracin trmica. El congelamiento y descongelamiento rpidos y repetidos
suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelacin se forman
cristales de hielo intracelulares destruyendo la estructura. Al descongelarse las
clulas se destruyen osmticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su
contenido. (Calvo, 2016)
Desintegracin qumica. Se utilizan agentes que atacan la pared celular como son el
etanol, ter de petrleo, isopentanol, etc.
Homogenizacin por deshidratacin. Se basa en la precipitacin de protenas por
disolventes orgnicos como la acetona.(Calvo, 2016)

1.8 Protenas
1.8.1 Solubilidad y precipitacin de las protenas
La solubilidad de una buena cantidad de protenas es funcin de la fuerza inica, el pH y la
concentracin de disolventes orgnicos. A bajas concentraciones salinas del disolvente, las
protenas (como electrolitos multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a
los iones simples, es decir cumplen la teora de Debye-Huckel, o sea en esta regin de
concentraciones de sal, el aumento de sta estabiliza los grupos cargados sobre la protena y
por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacin por salado: salting-In). (Tangarife,
2008) El fenmeno contrario (precipitacin por salado: salting-out) que se observa a altas
fuerzas inicas. Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas, la

16
concentracin efectiva de las molculas de agua (disolvente) disminuye y son insuficientes
para la solvatacin total de la protena, por lo tanto la interaccin protena-protena
predomina sobre la interaccin protena-agua y ocurre la precipitacin.
La solubilidad de la mayora de las protenas a una fuerza inica constante, presenta un
mnimo cerca del punto isoelctrico. A este pH, las repulsiones electrostticas
intermoleculares entre las molculas de soluto estn minimizadas, lo mismo que las
interacciones electrostticas entre los grupos polares cargados y el agua, por lo tanto las
protenas precipitan ms fcilmente. (Perillo., 2013) La mayora de los disolventes
orgnicos son buenos precipitantes pues en general tienen baja constante dielctrica.

1.8.2 Clasificacin de Osborne de las protenas, por el criterio de solubilidad

La clasificacin comnmente usada no se basa en aspectos estructurales de stas sino
principalmente en su solubilidad frente a diferentes disolventes. Desafortunadamente entre
los grupos clasificados no existe un lmite fijo, sin embargo permite el fraccionamiento de
las protenas provenientes de una misma fuente. Segn Osborne, las protenas vegetales
pueden clasificarse segn su solubilidad en: albminas, globulinas y glutelinas.
Las albminas corresponden al grupo de protenas que son solubles en agua
destilada y en soluciones salinas diluidas.(Tangarife, 2008)
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas.
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en disoluciones acuosas de
alcoholes de baja masa molar, en concentraciones entre el 50 y el 90 %.
Las glutelinas son insolubles en los disolventes anteriores pero se solubilizan en
disoluciones diluidas de cido o bases.

17
Captulo II: Materiales y mtodos.
En este captulo se presentan cuatro mtodos para la extraccin de la ureasa presente en la
soya, a la cual se les medir la actividad de acuerdo al cambio de pH que se produce al
formarse el amonaco. A continuacin se realizar la cintica a la reaccin con la enzima
ureasa del extracto que mayores cambios de pH haya experimentado para establecer los
parmetros que garanticen la mayor actividad de la misma, para ello se determinarn los
efectos de la temperatura y el pH, cuya influencia sobre la actividad es determinante, a cada
prueba se le realizaran tres rplicas.
Una vez fijados estos parmetros se proceder a cuantificar el efecto de la concentracin de
sustrato para la enzima obtenida a partir del extracto. Posteriormente se medir
cuantitativamente la actividad para dicho extracto y se comparar con la actividad de la
enzima ureasa comercial a la cual se le realizar el mismo tratamiento, este resultado
permitir avalar o no, el posible uso del extracto para la evaluacin de urea en sangre,
ensayo que ser realizado de obtenerse un resultado positivo. Para una caracterizacin ms
completa del extracto y debido a que la soya es un producto altamente proteico se realizar
la determinacin de protenas totales por el mtodo de Biuret de acuerdo al criterio de
solubilidad planteado por Osborne. Adems se desarrollar una evaluacin preliminar de la
estabilidad del extracto obtenido.

2.1 Extraccin de la ureasa del frijol de soya.

Para la extraccin de la ureasa del frijol de soya se utilizaron cuatro mtodos reportados en
la literatura. La diferencia entre ellos est en el tipo de disolvente empleado. A
continuacin se describen cada uno de ellos.

Mtodo 1: Mtodo de Lorenc. (Lorenc, 2008)

Instrumental:
Balanza analtica Sartorius, modelo BP221S
Pipeta graduada. (0.1 mL, 0,5 mL, 5 mL, 10 mL)
Papel de filtro

18
Reactivos:
Agua destilada
soya
Procedimiento:
1. Remojar las semillas de soya en agua, durante 1 hora (preferiblemente durante la
noche).
2. Colocar la mezcla de semillas de soya en una licuadora de alimentos con 10 mL de
agua por gramo de materia seca de soya (el agua para el remojo de los granos de
soya puede ser utilizada) hasta que la mezcla est suave (unos 5 min).
3. Filtrar el pur de soja a travs de papel de filtro en un embudo.
4. Reunir y conservar el filtrado, que contiene ureasa.

Mtodo 2: Mtodo de Schosinsky (Bolaos et al., 2003)

Instrumental
Balanza analtica: Sartorius, modelo BP221S
Pipetas graduadas. (0.1mL, 0,5 mL, 5 mL, 10 mL)
Bomba a vaco marca ILMVAC GmbH y modelo MPC101Zp
Papel de filtro
Centrfuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos:
Etanol.
Acetona.
Agua destilada.
Soya molida.
Disoluciones:
Etanol al 30%: Tomar 15.79 mL de etanol al 95% y llevar a un matraz aforado de 50 mL
enrasando con agua destilada.
Procedimiento:
1. Moler la soya.
2. Pesar 10 g de frijol de soya molido.

19
 3. Aadir 30 mL de etanol al 30% a la soya molida y agitar durante 1 hora en bao de
hielo.
4. Filtrar la mezcla al vaco recogiendo el filtrado y aadir 50 mL de acetona.
5. Centrifugar y decantar el lquido sobrenadante. Disolver el precipitado con agua
destilada y llevar a un matraz aforado 50 mL.

Mtodo 3 : Mtodo de Donal y Van Slyke (Velzquez, 1998)

Instrumental:
Balanza analtica: Sartorius, modelo BP221S
Pipetas graduadas. (0.1mL, 0,5 mL, 5 mL, 10 mL)
Centrfuga
Matraz aforado (50mL)
Reactivos:
Acetona.
Agua destilada.
Soya molida.
Procedimiento:
1. Pesar 10 g de harina de soya y agregar 150 mL de agua destilada, agitar la mezcla
durante 1hora.
2. Decantar el lquido sobrenadante y aadir a este 10 mL de acetona.
3. Centrifugar descartando el lquido sobrenadante llevando el precipitado a un matraz
aforado de 50 mL.

Mtodo 4: Mtodo salting- in (Tangarife, 2008)

Instrumental
Balanza analtica: Sartorius, modelo BP221S
Centrfuga
Matraz aforado (50 mL)
Reactivos:
NaCl 1%.

20
Procedimiento:
1. Pesar 1,0 g de harina y disolver en 10 mL de NaCl al 1%.
2. Agitar durante 3 minutos.
3. Llevar al tubo de centrfuga y centrifugar a 3500 rpm durante 5 min.
4. Descartar el precipitado y llevar el sobrenadante a un matraz de 25 mL.

2.2 Medicin de la actividad uresica en el extracto de soya.

En los laboratorios de anlisis de alimentos para conocer si los inhibidores de tripsina han
sido eliminados, someten a la muestra de harina de soya a la prueba de la actividad uresica
ya que estos tienen un comportamiento similar a la ureasa frente a la temperatura, y al
aumentar la misma quedan inactivados al igual que la ureasa, por lo que en este trabajo se
utiliza este mtodo, pero en sentido contrario, poniendo en contacto al extracto obtenido a
partir de la soya que contiene ureasa, con una solucin de urea- buffer de fosfatos sin
aumentar la temperatura, lo que provoca que el pH de la misma aumente, siendo este
aumento proporcional a la actividad enzimtica, este es el fundamento del mtodo
cualitativo. (Botta, 1999)
Por otra parte, una forma para establecer actividad enzimtica, es a travs de la medicin de
su producto generado. Este puede ser determinado a travs de la espectrofotometra, es por
eso, que este ser el mtodo cuantitativo empleado, teniendo en cuenta que para el suero, el
rango en que se encuentra la urea es de 3.3-8.3 mmol/L en niveles normales y hasta 26.6
mmol/L en niveles patolgicos, datos reportados por el EPB Carlos J. Finlay, quienes
plantean la necesidad de que estos valores sean tomados como una referencia para que cada
laboratorio plantee su propio intervalo de concentraciones, la longitud de onda de mxima
absorcin es 630 nm. (2000a)

2.2.1 Mtodo cualitativo para determinarla actividad enzimtica.

La tcnica empleada para la medicin cualitativa de la actividad enzimtica se describe a
continuacin:
Instrumental
Potencimetro: Microprocessor pHmeter, modelo pH213, provisto de electrodos de vidrio
y calomel.

21
 Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm provistos de tapn de caucho.
Balanza analtica, sensible al 0,1 mg. Marca Sartorius, modelo BP221S.
Reactivos:
- Dihidrgeno fosfato de potasio (KH2PO4).
- Hidrgeno fosfato de potasio (K2HPO4).
- Urea, reactivo para anlisis.
Preparacin de las disoluciones de trabajo:
- Disolucin tampn 0,05 mol/L de fosfato de potasio. Disolver 0,3403 g de Hidrgeno
fosfato de potasio y 0,4355 g de dihidrgeno fosfato de potasio en 10 mL de agua destilada
aproximadamente. Mezclar y llevar a un volumen final de 100 mL
El pH debe ser 7,0; si no lo es, ajustar a este valor mediante soluciones de cidos o bases
fuertes segn sea el caso. La vida til de esta disolucin es de 90 das. (Botta, 1999). El
tampn debe mantenerse refrigerado para evitar su descomposicin.
- Disolucin tampn de urea-fosfato de potasio. Disolver 1,5 g de urea en 50 mL de
disolucin tampn de fosfato de potasio.
- De la disolucin tampn de urea fosfato de potasio se tomaron volmenes de 0.53 mL,
0.33 mL, 0.24 mL, 0.16 mL, 0.12 mL, 0.07 mL, en matraces de 10 mL enrasando con
disolucin buffer de fosfatos.
Procedimiento para medir la actividad uresica en el extracto de soya.
Tomar 10 mL de extracto de ureasa en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de disolucin
tampn de urea-fosfato de potasio.
Preparar un blanco tomando 10 mL de extracto en un tubo de ensayo y agregar 5 mL de
disolucin tampn de fosfato de potasio.

Clculos
La actividad de la ureasa, medida como el incremento de pH, se determina aplicando la
siguiente ecuacin:
pH = pH1- pH2
donde:
pH: incremento de pH debido a la ureasa,
pH1: pH ledo para la muestra analizada,

22
pH2: pH ledo para el blanco.
Una vez realizada la medida de pH para las cuatro extracciones (tres rplicas de cada una)
se procede a seleccionar aquel extracto para el cual se obtuvo mayor variacin en el pH.

2.2.2 Determinacin cuantitativa de la actividad uresica por mtodos

espectrofotomtrico.
Para la realizacin de este ensayo se proceder a la preparacin de una curva de calibracin
en la cual sern sustituidos los resultados obtenidos tanto para la ureasa comercial como
para el extracto de la soya con el objetivo de comparar cuan semejante son los valores
obtenidos mediante el empleo de ambas enzimas. El procedimiento fue realizado teniendo
en cuenta lo expresado por el kit de reactivos provistos por EPB Carlos J. Finlay, a una
longitud de onda de 630 nm. En el caso de la medicin de la actividad del extracto, se
aaden 0.05 mL de extracto y se omite la preparacin del reactivo de trabajo utilizando en
este caso el reactivo color.
Para la preparacin de la curva de calibracin se tomaron 0.0449 mL de una solucin de
NH4OH al 28,0 % y se llev a un matraz de 25 mL del que se tomaron volmenes de 1.13
mL, 1.99 mL, 3.12 mL, 6.29 mL y 10 mL, correspondientes a la concentraciones de 3.3
mmol/L, 6.3 mmol/L, 8.3 mmol/L, 16.7 mmol/L y 26.6 mmol/L respectivamente en cada
caso de enras con solucin buffer de fosfatos de pH =7 en matraces de 10 mL y el anlisis
se realiz una 37 0C.
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que para el mtodo
cualitativo.

Instrumental:
Balanza analtica: Sartorius, modelo BP221S
Pipetas graduadas. (2mL)
Micropipeta. (50L)
Matraces aforados (25 mL, 10mL)
Termostato.
Reloj.
Espectrofotmetro. Spekol 11

23
Reactivos:
Reactivos provistos por QUIMEFA:
Reactivo color: que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio.
Reactivo alcalino: que contiene hipoclorito de sodio e hidrxido de sodio.
Ureasa comercial.
Reactivo de trabajo: reactivo color + ureasa comercial.
Urea.
NH4OH (28,0%).
Procedimiento:
1. Desarrollar color.
2. Medir absorbancia a 630 nm.
3. Calcular la actividad uresica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto.
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 3, 4 y 5. Una vez
preparados los ensayos en los 3 casos (curva de calibracin, ureasa presente en el extracto
de soya y la ureasa comercial), se procede siguiendo las siguientes etapas.
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura ptima.
Adicionar el reactivo alcalino, 2 mL en cada tubo.
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura ptima
Leer la absorbancia a 630 nm. El color es estable por 1 hora.

Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
NH4OH
( L) - 20 20 20 20 20
Agua
destilada 20 - - - - -
( L)
Reactivo
color 2 2 2 2 2 2
(mL)

Tabla 3: Procedimiento a seguir para la preparacin de la curva de calibracin.

24
Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo color
(mL) 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
( L) 20 - - - - -
Urea
( L) - 20 20 20 20 20
Ureasa
extracto 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
(mL)

Tabla 4: Procedimiento a seguir para la medicin cuantitativa de la actividad enzimtica

del extracto.

Reactivos Blanco 1 2 3 4 5
Reactivo de trabajo
(mL) 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
( L) 20 - 20 - 20 -
Urea
( L) - 2 - 20 - 2
0 0

Tabla 5: Procedimiento a seguir para la medicin cuantitativa de la actividad enzimtica de

la ureasa comercial.

25
2.3 Estudio cintico de la enzima ureasa extrada de la soya.
Para la medicin correcta de la actividad enzimtica es necesario tener en cuenta un grupo
de factores que la modifican, y que pueden provocar la desnaturalizacin de la enzima.
Estos factores son el pH, la temperatura y el efecto de la concentracin de sustrato, que
varan en cada enzima, e incluso una misma enzima de acuerdo a la fuente de la cual haya
sido extrada, puede presentar diferencias en estos factores, de ah la importancia de su
medicin. Para el estudio cintico se tuvieron en cuenta los ensayos propuestos por (2000
b) empleando los reactivos provistos por QUIMEFA.
Instrumental
Matraces aforados de 50 mL y 10 mL
Tubos para centrfuga
10 tubos de ensayo
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas graduadas de 2.0 mL y 1.0 mL.
Micropipeta 50 L
Espectrofotmetro. Spekol 11
Termostato.
Reloj.
Reactivos
Urea
NaOH
Agua destilada
Buffer fosfato 0, 1 mol/L y pH 4,5
Buffer fosfato 0,1 mol/L y pH 5,7
Buffer fosfato 0,1 mol/L y pH 7,0
Buffer fosfato 0, 1 mol/L y pH 8

Reactivos provistos por QUIMEFA:

Reactivo color: que contiene salicilato de sodio y nitroprusiato de sodio.
Reactivo alcalino: que contiene hipoclorito de sodio e hidrxido de sodio.

26
Preparacin de las soluciones de trabajo.
Buffer de fosfatos (Solucin A y B) e hidrxido de sodio:
Solucin A (NaH2PO4 0,2 mol/L): disolver 1.38 g de NaH2PO4. H2O en agua
destilada, y enrasar hasta 50 mL.
Solucin B (NaHPO4 0,2 mol/L): 2.6825 g de Na2HPO4. 7 H2O se disuelven en
agua destilada, llevando el volumen final a 50 mL.
Hidrxido de sodio (NaOH) de concentracin 0.1 mol/L: Pesar 0.04 g de NaOH y
enrasar con agua destilada hasta 10 mL.
Se preparan disoluciones a los diferentes pH, segn se muestra en la tabla 6, las cuales
sern utilizadas posteriormente para evaluar el efecto del pH en la actividad enzimtica.
(Pucciarelli, 2001), (Ortellado and Casas, 2001)

NaOH Solucin A Solucin B Agua destilada pH

(mL) (mL) (mL) (ml)
2.6 15 - - 4.5
- 23.4 1.6 25 5.7
- 9.8 15.3 25 7
- 1.3 23.8 25 8

Tabla 6: Preparacin de las soluciones a los diferentes pH.

Procedimiento
1. Desarrollar color.
2. Determinacin de la absorbancia.
3. Determinacin de la temperatura y el pH ptimos as como el efecto de la
concentracin de sustrato.
Las concentraciones de urea se calcularon de la misma forma que en el mtodo cualitativo
en el anlisis del efecto de la temperatura, para el efecto del pH se pesaron 0.0124 g de urea
para cada disolucin buffer a ensayar.
La secuencia de experimentos seguida en cada caso se refleja en las tablas 7, 8 y 9, en cada
cado B es el blanco y los nmeros representan los patrones a ensayar. Una vez preparados

27
 los ensayos en los 3 casos (efecto de la temperatura, efecto del pH y de la concentracin de
sustrato), se procede siguiendo las siguientes etapas.
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura ptima (excepto en el efecto
de la concentracin de sustrato, donde tambin se evala el efecto del tiempo y se
realiza segn se refleja en la tabla 9).
Adicionar el reactivo alcalino, 2 mL en cada tubo.
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura ptima
Leer la absorbancia a 630 nm. El color es estable por 1 hora.

Reactivos B 1 B 2 B 3 B 4 B 5 B 6

Reactivo color 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
(mL)
Agua destilada 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
(L)
Urea 8.3 mmol/L - 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
(L)
Extracto 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
(mL)
Temperatura (0C) 25 25 30 30 37 37 40 40 45 45 50 50

Tabla (VII): Procedimiento a seguir para la medicin el efecto de la temperatura sobre la

actividad uresica.

28
 Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo
color (mL) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua
destilada(L) 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea
8.33mmol-L - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
(L)
Extracto 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
(mL)
pH 4.5 4.5 5.7 5.7 7 7 8 8 10 10

Tabla 8: Procedimiento a seguir para la medicin el efecto del pH sobre la actividad

uresica.

Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5
Reactivo color (mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(L) 20 - 20 - 20 - 20 - 20 -
Urea - 20 - 20 - 20 - 20 - 20
(L)
Extracto
(mL) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
Tiempo de incubacin
(minutos) 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10

Tabla 9: Procedimiento a seguir para la medicin del efecto de la concentracin de sustrato

sobre la actividad uresica.

29
Tratamiento de resultados.
Los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la temperatura y del pH, se procesan de
forma similar de la siguiente manera:
Calcular la actividad a partir de los valores de absorbancia.
Obtener el grfico de actividad vs temperatura y pH, respectivamente.
Determinar la temperatura y el pH ptimo, segn corresponda.

Efecto de la concentracin de sustrato, se procede segn se describe a continuacin:

Sustituir los valores de absorbancia en la curva de calibracin para el amonaco y
obtener los mmol/L de producto formado dividiendo estos entre 2 obtener los
mmol/L de urea que reaccionaron para cada tubo.
Obtener el grfico de concentracin (mmol/L) vs tiempo y hallar las velocidades
iniciales.
Realizar el grfico de Lineweaver-Burk.
Representar el comportamiento segn el modelo de Michaelis - Menten

2.4. Mtodo de Berthelot modificado para la determinacin de urea en suero.

Para la determinacin de urea en suero se aplic Mtodo de Berthelot, el cual se describe a
continuacin. El procedimiento se realiz segn lo planteado por el EPB Carlos J. Finlay
en el kit de reactivos para la determinacin de urea en sangre.
Reactivos.
Reactivos provistos por QUIMEFA.
Disoluciones estndar de urea (3.3 mmol/L - 26.6 mmol/L).
Agua destilada.

Instrumental.
Espectrofotmetro Spekol 11
Pipetas (2 mL).
Micropipeta (50L)
Termostato.

30
 Reloj.
Procedimiento:
1. Desarrollo de color.
2. Medicin de la absorbancia a 630 nm.
3. Clculo de la actividad uresica en cada tubo para la ureasa comercial y el extracto.

La secuencia de experimentos seguida se refleja en la tabla 10. Una vez preparados los
ensayos, se procede siguiendo las siguientes etapas.
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura ptima.
Adicionar el reactivo alcalino, 2 mL en cada tubo.
Mezclar e incubar durante 5 minutos a la temperatura ptima
Leer la absorbancia a 630 nm. El color es estable por 1 hora.

Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 Muestra

Reactivo color
(ml) 2 2 2 2 2 2 2
Agua destilada
(L) 20 - - - - - -
Urea (L) - 20 20 20 20 20 -
Ureasa extracto
(ml) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
plasma
sanguneo - - - - - - 20
(L)

Tabla 10: Procedimiento a seguir para la determinacin de urea en suero.

31
2.5 Caracterizacin del extracto de ureasa obtenido de la soya.

2.5.1 Cuantificacin de Protenas totales.

La soya es uno de los alimentos con mayor contenido de protenas, es por esta razn y con
el objetivo de lograr una mejor caracterizacin del extracto, que se determinar el contenido
de protenas totales por el mtodo de Biuret que es aplicable a concentraciones mayores a 1
g/L segn lo planteado por (Tangarife, 2008). Esta reaccin la producen los pptidos y las
protenas, pero no los aminocidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptdico que
se destruye al liberarse los aminocidos, cuando una protena se pone en contacto con un
lcali concentrado, se forma un complejo, que en contacto con una solucin de sulfato
cprico diluida, da una coloracin violeta caracterstica. (Calle et al., 2013), (Butendieck.
and Castillo., 2014).
Instrumental
Matraces aforados de 25 ml.
Tubos para centrfuga.
10 tubos de ensayo.
Gradilla para tubos de ensayo.
Pipetas graduadas de 0.5 ml y 5.0 ml.
Espectrofotmetro. Spekol 11
Reloj.
Reactivos.
NaCl 1%
Agua destilada
NaOH 0.1 mol/L
Reactivo de Biuret: Disuelva 2.5 g de sulfato cprico en un litro de agua destilada.
Disuelva 440 g de hidrxido de sodio en un litro de agua destilada. Luego mezcle estas dos
soluciones. Esta preparacin debe almacenarse en botellas oscuras (color mbar).

Preparacin de las fracciones proteicas de muestra vegetal.

Pesar 2.0 g de harina de soya, agregar 10 mL de H2O desmineralizada, agitar manualmente
durante 10 minutos y centrifugar la suspensin a 2500 rpm por 3 minutos. Vaciar el

32
sobrenadante a un baln aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior. Despus de centrifugar, el
sobrenadante de esta segunda extraccin se adiciona al baln que contiene al primer
sobrenadante. Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase.
As se tiene separada la fraccin de las albminas.
Sobre el residuo que queda de la separacin de las albminas, se repite ahora todo el
proceso anterior, pero agregando esta vez NaCl al 1%. Despus de centrifugar, los
sobrenadantes de la primera y segunda extraccin con NaCl al 1%, se llevan a otro baln
aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1%. Esta es la
fraccin de las globulinas.
Por ltimo sobre el residuo anterior, se adiciona NaOH 0.1 mol/L y aplicando el mismo
procedimiento general, se separa la fraccin de las glutelinas. Este procedimiento se
muestra en la figura 11.

Figura 11: Proceso de extraccin de protenas.

Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo se
proceder a la determinacin de protenas, aplicando el mtodo de Biuret. Para las muestras
de las fracciones de albminas y glutelinas deber tomarse 0,5 mL de cada una y llevarse a

33
un volumen de 5 mL (dilucin 1 a 10) con agua destilada para las albminas y con NaOH
0,1 mol/L para las glutelinas. Estas diluciones se usarn como extractos problemas para
dichas fracciones.
Curva de calibracin
Se preparar la curva utilizando como patrn una solucin de albmina de concentracin
(40 g/L), tomando de la misma volmenes de 0.025 mL, 2.5 mL, 5 mL, 7.5 mL y 10 mL en
matraces de 10 mL enrasando en cada caso con agua destilada.
Procedimiento.
En 9 tubos de ensayo rotulados pipetear las cantidades de reactivos que se indican en la
tabla. Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o
introducirlos tubos en un bao de agua a 30C durante 10 minutos para desarrollo del color.
Leer en cada tubo a 540 nm.
La secuencia de ensayos se muestra en la tabla 11.

Tubos Blanco 1 2 3 4 5 Albmina Globulina Glutelina

Albmina
(40g/L) (mL) - 2 2 2 2 2 - - -
Fraccin
albmina - - - - - - 2 - -
(mL)
Fraccin
globulina - - - - - - - 2 -
(mL)
Fraccin
glutelina(mL) - - - - - - - - 2
Reactivo de
Biuret 4 4 4 4 4 4 4 4 4

Tabla 11: Mtodo de Biuret para la determinacin de protenas totales.

34
2.5.2 Estabilidad del extracto enzimtico obtenido de la soya.
Para la realizacin de este ensayo se procedi a medir la cantidad de amonaco formado
para un patrn de urea de 8.33 mmol/L durante un perodo de 7 das siguiendo el mismo
procedimiento mostrado en la tabla 4 para la medicin cuantitativa de la actividad uresica.

2.6 Anlisis estadstico y elaboracin matemtica de los resultados experimentales.

Una vez obtenidos los resultados experimentales es necesario someterlos a un tratamiento
estadstico que permita obtener datos ms elaborados y confiables. A continuacin se
explican los procedimientos empleados para complementar los resultados obtenidos y dar
cumplimiento a objetivos cruciales propuestos en esta investigacin.

2.6.1 Presentacin de los resultados.

Los resultados experimentales cuantitativos carecen de inters si no van acompaados de
una estimacin de los errores involucrados en su medida. Una prctica usual en la literatura
de qumica analtica es citar la media como estimacin de la cantidad medida y la
desviacin estndar como la estimacin de la precisin. En el caso que en este trabajo se
presenta, fue mediante la prctica anteriormente mencionada, que se reportaron los
resultados para las extracciones realizadas. En el caso del estudio cintico se eliminaron
los valores errticos para cada determinacin y calculados los parmetros cinticos. Para
comparar los resultados obtenidos mediante el uso de las enzimas comercial y extracto de la
soya se realiz una comparacin mediante el ANOVA lo cual permitir establecer cuanto
difieren los resultados obtenidos. Los resultados son tratados de acuerdo a lo planteado por
(Normalizacin, 2010) y (Jurado, 2008)

35
Captulo III. Resultados y discusin.
En este captulo se hace el anlisis de los resultados obtenidos, siguiendo los experimentos
descritos en el Captulo II.
El mismo se concentra en evaluar los diferentes mtodos de extraccin de la ureasa
presente en la soya, la determinacin de la actividad enzimtica mediante un procedimiento
cualitativo y uno cuantitativo, as como en la evaluacin del efecto que producen los
factores: temperatura, pH y concentracin de sustrato en dicha actividad. Adems, se
interpretan los resultados de la determinacin de la urea presente en suero empleando el
extracto obtenido de la soya.

3.1 Extraccin de la enzima ureasa a partir del frijol de soya.

Se obtuvieron 4 extractos a partir del frijol de soya siguiendo los procedimientos descritos
en el Captulo II de este trabajo. En todos los casos la muestra perteneca a un mismo lote,
de igual variedad y almacenadas bajo las mismas condiciones, es decir a temperatura
normal atmosfrica. La descripcin del aspecto fsico de los extractos obtenidos se
muestran en la tabla 12.

Tcnica de Mtodo I Mtodo II Mtodo III Mtodo IV

extraccin
Color Lquido Lquido amarillo Pasta Lquido
amarillento claro amarillenta. amarillo claro
Olor Inoloro Olores tpicos de los Olor tpico de Inoloro
disolventes la acetona.
empleados.
pH 7.03 7.01 7.00 6.98

Tabla 12: Comparacin entre los 4 extractos obtenidos a partir de la soya.

Al analizar los resultados un aspecto significativo es que no se aprecian variaciones en el

valor del pH, aspecto este de mayor relevancia para la aplicacin del extracto, donde en

36
todos los casos el valor del pH es muy cercano a 7 y corresponde con lo reportado en la
literatura donde plantean que al emplear este extracto con el fin de evaluar la presencia o no
de urea en una muestra, se debe esperar un incremento del pH. Adems el valor de pH de la
ureasa comercial que se emplea en la determinacin de la urea, es 7.
El aspecto fsico, se observa una disolucin de color amarillento y olor propio del grano de
soya coincide con lo reportado en la literatura. (Jhon, 2012)
Otro aspecto importante con esta etapa de extraccin es que los mtodos son fciles de
realizar experimentalmente, emplean materiales y reactivos accesibles en los laboratorios
qumicos y clnicos, as como un equipamiento disponible en las instalaciones docentes y
de salud.

3.1.1 Determinacin cualitativa de la actividad uresica.

La actividad uresica se evalu midiendo el pH a las diferentes muestras de urea de
concentracin conocida una vez que se ponan en contacto con el extracto de soya y
siguiendo el procedimiento descrito en el Captulo II. En la tabla 13 se reflejan los valores
de pH obtenidos para los cuatro extractos y la ureasa comercial al ponerse en contacto con
un buffer de fosfatos. En todos los casos se alcanzan valores cercanos a pH =7.

Solucin - buffer de fosfatos pH 2

Ureasa comercial + buffer fosfato 6.99
Extracto (I) 7.03
Extracto (II) 7.01
Extracto (III) 6.98
Extracto (IV) 7.00

Tabla 13: Valores de pH para la mezcla de ureasa- buffer de fosfatos.

Tal y como se describi en el Captulo II, se procede a evaluar el cambio que se produce en
el pH de la disolucin que contiene la ureasa al ponerla en contacto con la urea presente
en diferentes disoluciones preparadas en el rango de concentracin de 0.1 g/L a 1g/L.

37
La tabla 14 muestra el valor promedio de la determinacin del pH obtenido con la ureasa
comercial, as como el valor de las 3 rplicas efectuadas para cada concentracin
estudiada.

Concentracin 1 g/L 0.8 g/L 0.6 g/L 0.4 g/L 0.2 g/L 0.1 g/L
pH1 7,64 7,55 7,45 7,08 7,04 7,00
pH2 7,62 7,54 7,43 7,07 7,02 6,99
pH3 7,64 7,59 7,5 7,09 7,05 7,03
pH corregidos 7,64 7,56 7,46 7,08 7,04 7,01

Tabla 14: Valores de pH aplicando la ureasa comercial.

Para la primera extraccin (Mtodo de Lorenc), los resultados obtenidos se reflejan en la

tabla15.

Concentracin 1 g/L 0.8 g/L 0.6 g/L 0.4 g/L 0.2 g/L 0.1 g/L
pH1 7,82 7,63 7,40 7,12 7,09 7,04
pH2 7,86 7,62 7,43 7,10 7,08 7,05
pH3 7,80 7,62 7,45 7,12 7,09 7,04
pH corregidos 7,83 7,62 7,415 7,12 7,09 7,04

Tabla 15: Valores de pH aplicando el extracto de la primera extraccin.

38
Para la segunda extraccin (Mtodo de Schosinsky) se presentan los resultados en la tabla
16.
Concentracin 1 g/L 0.8 g/L 0.6 g/L 0.4 g/L 0.2 g/L 0.1 g/L
pH1 7.70 7.47 7.27 7.08 7.06 7.01
pH2 7.72 7.48 7.28 7.09 7.07 7.02
pH3 7.69 7.50 7.26 7.09 7.08 7.03
pH corregidos 7,70 7,48 7,38 7,09 7,07 7,02

Tabla 16: Valores de pH aplicando el extracto la segunda extraccin.

Los resultados obtenidos para la tercera y cuarta extraccin se muestran a continuacin en

las tablas 17 y 18 respectivamente.
Concentracin 1 g/L 0.8 g/L 0.6 g/L 0.4 g/L 0.2 g/L 0.1 g/L
pH1 7.43 7.42 7.40 7.31 7.11 7.03
pH2 7.42 7.40 7.41 7.32 7.10 7.02
pH3 7.43 7.41 7.40 7.31 7.13 7.05
pH promedio 7,43 7,41 7,40 7,22 7,11 7,03

Tabla 17: Valores de pH aplicando el extracto la tercera extraccin.

Concentracin 1 g/L 0.8 g/L 0.6 g/L 0.4 g/L 0.2 g/L 0.1 g/L
pH1 7.11 7.07 7.03 7.00 6.99 6.98
pH2 7.10 7.07 7.04 7.01 6.98 6.99
pH3 7.10 7.06 7.05 6.99 6.99 6.98
pH corregidos 7,10 7,07 7,38 7,09 6,99 6,98

Tabla 18: Valores de pH aplicando el extracto la cuarta extraccin.

39
Para conocer si los mtodos difieren en su precisin con respecto a la ureasa comercial se
realiza la prueba de Fisher de dos colas. Para esto se emplea la siguiente ecuacin, donde:
F: F calculada
S12: Varianza Mtodo 1.
S22: Varianza Mtodo 2.

Siendo la F (0.05, 17,16) = 2,32 (Miller and Miller, 2002). Los valores de F se muestran en
la tabla 19.
F extraccin F extraccin F extraccin F extraccin
(Mtodo I) (Mtodo II) (Mtodo III) (Mtodo IV)
1,2627 1,0925 2,8426 102,77

Tabla 19: Valores de F calculados para cada una de los extractos.

Obtenindose valores inferiores a la F tabulada para los extractos obtenidos por los
mtodos I y II, lo que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos
mtodos no son significativas a un nivel de confianza de 5%.
En los casos de los extractos restantes se obtienen valores superiores a la F tabulada, lo
que indica que las diferencias de las varianzas obtenidas por ambos mtodos son
significativas a un nivel de confianza de 5%.
Para comparar las medias muestrales de los mtodos con la ureasa comercial se aplica la
prueba de la t student de dos colas.
Siendo la t tabulada 4.303 (Miller and Miller, 2002). Los valores de t calculados para cada
mtodo de extraccin se muestran en la tabla 20.

t extraccin t extraccin t extraccin t extraccin

(Mtodo I) (Mtodo II) (Mtodo III) (Mtodo IV)
2,4492 0,9817 0,0181 -4,6119

Tabla 20: Valores de t calculados para cada una de los extractos.

40
Los valores de t para los mtodos I, II y III son menores que el valor de t tabulada, por lo
tanto, no son significativamente diferentes al valor obtenido para la ureasa comercial. En el
caso del mtodo IV el valor de F obtenido es mayor que el tabulado lo que manifiesta la
diferencia entre los resultados obtenidos por este mtodo y por la ureasa comercial.
La actividad uresica evaluada para el extracto obtenido por los mtodos de extraccin y su
comparacin con el comportamiento al aplicar la ureasa comercial, se muestra en la tabla
21. Esta actividad se expresa en variacin del pH, tal y como se ha descrito en los captulos
anteriores de este trabajo.

Concentracin 1 g/L 0.8 g/L 0.6 g/L 0.4 g/L 0.2 g/L 0.1 g/L
pH ureasa
comercial 0,64 0,56 0,46 0,08 0,04 0,01
pH ureasa
(Mtodo I) 0,80 0,59 0,39 0,09 0,06 0,01
pH ureasa
(Mtodo II) 0,69 0,47 0,37 0,08 0,06 0,01
pH ureasa
(Mtodo III) 0,43 0,41 0,40 0,22 0,11 0,03
pH ureasa
(Mtodo IV) 0,12 0,09 0,4 0,11 0,01 0

Tabla 21: Determinacin cualitativa de la actividad uresica.

Analizando los resultados de la tabla 21, se puede concluir que la ureasa presente en los
extractos obtenidos por los mtodos I y II, muestra la mayor actividad enzimtica, que en
este caso est relacionada con la mayor variacin en el valor del pH.
Adems, los resultados obtenidos en los 4 mtodos de extraccin, pueden correlacionarse
con los solventes estudiados de la forma siguiente. La polaridad del disolvente disminuye
cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona.
(Calvo, 2016) Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrfobo de las
protenas disminuyendo el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la

41
molcula proteica y desorganizando la estructura terciaria, provocando su precipitacin.
(Lpez, 2013) Esta es la razn por la cual son utilizados en este trabajo, para lograr una
precipitacin de la ureasa, en el caso de los extractos II y III. Sin embargo, las protenas se
desnaturalizan con mayor facilidad en soluciones acuosas que contienen solventes
orgnicos de constante dielctrica baja, que cuando estos solventes se encuentran ausentes.
Esto explica la razn por la cual, el extracto I cuyo solvente fue agua present una mayor
actividad que los extractos II y III que emplean solventes orgnicos.
Por otra parte, la solubilidad de una protena cuando la fuerza inica es pequea aumenta,
(Maas, 2005) pues los contraiones recubren con ms eficacia las mltiples cargas inicas
de las molculas de protenas aumentando por ello la solubilidad de las protenas, este
efecto es conocido como disolucin por salado.
Al presentar el NaCl baja fuerza inica se utiliza en la obtencin del extracto IV para
aumentar la solubilidad de la ureasa.
De acuerdo a los resultados obtenidos mediante el empleo del mtodo cualitativo se
concluye que los mtodos que ofrecen mejores resultados son el I y el II por lo que a ambos
se le realiza la medicin cuantitativa de la actividad segn lo planteado en la tabla 4
expresando en cada caso los mmol/L de producto formado, teniendo en cuenta las
condiciones fijadas por la literatura que establecen pH=7 y 37 oC de temperatura. Teniendo
en cuenta, adems, que fue necesario en ambos casos disminuir la cantidad de extracto a
adicionar debido a que la disolucin presentaba cierta turbidez lo que interfiere en la
determinacin, logrndose la obtencin de una disolucin transparente al adicionar 0,02 mL
de extracto enzimtico, por lo que es este el volumen con el que se realizarn los ensayos
siguientes. Los resultados se muestran en la tabla 29 de los anexos donde puede observarse
que el extracto para el cual se obtiene los mejores resultados es para el extracto de Lorenc
el cual presenta una mayor formacin de producto que se traduce en una mayor actividad.
De ah que este sea el extracto seleccionado para la realizacin de los estudios cinticos con
el objetivo de fijar los valores que garanticen la mayor actividad, pues estos parmetros
dependen de la fuente y mtodo de extraccin de la enzima.(Martnez et al., 2002)

42
3.2 Estudio cintico de la reaccin enzimtica con la ureasa extrada de la soya.
Una vez seleccionado el extracto que ofrece mejores resultados se procede a realizar el
estudio cintico de la reaccin enzimtica. Los estudios cinticos permiten fijar las
condiciones que garantizan la mayor actividad de la enzima. En este caso se analizaron los
efectos del pH, la temperatura y la concentracin de sustrato cuya influencia es
determinante sobre la actividad enzimtica.

3.2.1. Resultados del efecto del pH en la actividad enzimtica.

Los resultados de la aplicacin del efecto del pH se muestran en la tabla 30 de los anexos y
el ploteo de los datos obtenidos se muestra en la figura 12.

Figura 11: Efecto del pH sobre la actividad enzimtica.

El grfico muestra la mayor actividad de la enzima a pH = 7, lo cual se corresponde a su

vez con lo reportado en la literatura. Sabiendo que las enzimas son protenas, cualquier
cambio brusco de pH puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la
superficie proteica, (Nez, 2012) afectando as las propiedades catalticas de una enzima.
A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su
inactivacin.
Un cambio en el pH que puede provocar la variacin tanto de la estructura de la enzima
como del sustrato impidiendo en consecuencia la formacin del complejo enzima sustrato
que es el primer paso para que se efecte la reaccin enzimtica.

43
3.2.2 Resultados del efecto de la temperatura en la actividad enzimtica.
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la tabla 31 de los anexos, el
grfico correspondiente al mismo se muestra en la figura 13.

Figura 13: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.

Igual que ocurre en las reacciones qumicas no enzimticas, al aumentar la temperatura

aumenta la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Esto se debe a que un
mayor nmero de molculas alcanzan la energa cintica necesaria para superar la energa
de activacin de la reaccin. Sin embargo, el aumento de temperatura tambin disminuye la
estabilidad de la estructura de las protenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse, de
modo que a medida que aumenta la temperatura la actividad enzimtica tiende a disminuir.
Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura, existe una
temperatura ptima en la cual la actividad enzimtica tiene un valor mximo.
En el caso de la ureasa obtenida a partir del frijol de soya, la temperatura ptima es de 40
o
C, lo que puede estar relacionado con la fuente de extraccin de la enzima, ya que se ha
encontrado en la literatura que este valor difiere ligeramente cuando cambia el origen de la
enzima. (Martnez et al., 2002), (Gonzlez, 2000), (Almanza et al., 2009) como se observa
en la tabla 32 de los anexos.

Por otra parte, la temperatura es un factor que se relaciona con la velocidad de la reaccin y
esta relacin se expresa en la ecuacin de Arrhenius:

k=

44
Donde:
k = Constante de velocidad especfica.
A = Factor prexponencial de Arrhenius.
e= Base de los logaritmos naturales.
Ea = Energa de Activacin.
R = Constante universal de los gases.
T = Temperatura absoluta.
De todos los parmetros, el ms importante es la energa de Activacin, que representa la
barrera energtica necesaria para que los reactivos alcancen el estado activado intermedio y
constituye una barrera que deben sobrepasar los reactivos en su proceso de conversin
hacia los productos.
Valores elevados de la energa de activacin se asocian comnmente con reacciones lentas
y viceversa. Con el objetivo de incrementar notablemente la velocidad de reacciones con
barreras energticas considerables (energas de activacin altas) se utilizan los
catalizadores, que son sustancias que aumentan la velocidad de la reaccin sin modificar
sus propiedades termodinmicas, esta funcin es desempeada en este trabajo por la ureasa
que es la enzima que cataliza la hidrlisis de la urea, la cual a su vez aumenta su poder
cataltico al aumentar la temperatura, favorecindose as la disminucin de la energa de
activacin producto de la estabilizacin de los estados de intermedios de alta energa.
Este efecto de la temperatura tambin coincide con lo planteado por (Khan and Mohsin,
2013), donde considera que un incremento de la temperatura por encima del valor ptimo
pudiera destruir las interacciones por enlace de hidrgeno que se forman y desestabilizar la
estructura tridimensional de la enzima.

3.2.3 Resultados del efecto de la concentracin de sustrato en la actividad enzimtica.

Para medir el efecto del tiempo sobre la reaccin, expresado por la variacin de
concentracin de urea que se va transformando por la actividad enzimtica, se procedi
como se indica en el captulo anterior y los resultados se muestran en las tablas 33- 39 que
aparecen en los anexos las figuras 14 20 correspondientes se muestran a continuacin.
La correspondencia entre la concentracin de la urea transformada y el tiempo transcurrido
partiendo de diferentes concentraciones iniciales, es la siguiente;

45
Figura 14: Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracin inicial
igual a 3.3 mmol/L.
Figura 15: Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracin inicial
igual a 6.3 mmol/L.
Figura 16: Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracin inicial
igual a 8.3 mmol/L.
Figura 17: Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracin inicial
igual a 16.7 mmol/L.
Figura 18: Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracin inicial
igual a 26.6 mmol/L.
Figura 19: Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracin inicial
igual a 39.1 mmol/L.
Figura 20: Muestra el comportamiento de una muestra de urea de concentracin inicial
igual a 48.3 mmol/L.

Figura 14: Efecto del tiempo sobre la Figura 15: Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimtica. actividad enzimtica.

46
Figura 16: Efecto del tiempo sobre la Figura 17: Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimtica. actividad enzimtica.

Figura 18: Efecto del tiempo sobre la Figura 19: Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimtica. actividad enzimtica.

47
Figura 20: Efecto del tiempo sobre la
actividad enzimtica.

Del anlisis de las curvas de comportamiento de la variacin de la concentracin de urea en

el tiempo, se concluye que en todos los casos la transformacin de prcticamente toda la
urea presente en la muestra se produce a un tiempo de 10 minutos. Se puede observar
tambin que a un tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor cuanto mayor es
la concentracin de sustrato empleada. Esto se evidencia claramente en la figura 12 donde
se grafica la velocidad de formacin de producto en funcin de la concentracin de sustrato
a un tiempo fijo. A una concentracin de enzima constante, y en un rango de concentracin
de sustrato baja, la velocidad de formacin de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentracin de sustrato. Sin embargo, cuando la concentracin de
sustrato es alta, la velocidad de la reaccin tiende a permanecer constante a pesar de que
ella aumente debido a que la enzima es el reactivo limitante de esta reaccin.

A partir de las expresiones obtenidas para el comportamiento a las diferentes

concentraciones estudiadas, se determinan las velocidades iniciales para cada concentracin
ensayada obteniendo el modelo de Michaelis Menten y la representacin de Lineweaver-
Burk que se muestran en las figuras 21 y 22 respectivamente, y cuyos datos aparecen en las
tablas 40 y 41 de los anexos.

48
Figura 21: Efecto de la concentracin de Figura 22: Efecto de la concentracin de
sustrato en la actividad enzimtica. sustrato en la actividad enzimtica.
(Michaelis - Menten) (Lineweaver - Burk)

49