UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE INGENIERA QUMICA

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERA
AMBIENTAL

COMPONENTES DE LA CADENA
RESPIRATORIA EFECTO DE INHIBIDORES

CURSO

BIOQUMICA

DOCENTE
CINTHYA ASPAJO VILLALAZ

INTEGRANTES

HIUGUAY SOTO LUIGIE ERNESTO

LAZARO ARGOMEDO JOHN KEYLOR

CICLO

VI

28 DE NOVIEMBRE DEL 2017

TRUJILLO-PER
 COMPONENTES DE LA CADENA RESPIRATORIA EFECTO DE
INHIBIDORES

I. INTRODUCCIN:
Segn se ha indicado, en las oxidaciones biolgicas los hidrgenos sustrados al sustrato
son transferidos en forma gradual a travs de aceptores que experimentan cambios
reversibles en su estado redox. En la membrana interna de las mitocondrias estos
aceptores estn dispuestos ordenadamente segn un gradiente de potencial de
reduccin creciente y asociados ntimamente a las enzimas que catalizan las
transferencias. El conjunto recibe el nombre de cadena respiratoria o cadena de
transporte de electrones. (Blanco, 2001, pg. 421)

Dos hidrgenos cedidos en una reaccin redox representan la suma de dos protones
(H+) y dos electrones (e-). Hidrgenos y electrones frecuentemente son denominados
equivalentes de reduccin. La cadena respiratoria comprende una serie de etapas.
Durante todo el recorrido, los electrones fluyen naturalmente en el sentido que les fija
el desnivel en el potencial de reduccin de los aceptores. En este sistema, los electrones
se deslizan desde A a B, a C, a D, y al oxgeno secuencialmente, impulsados por el
potencial creciente. Todos los integrantes de la cadena de transporte de electrones se
encuentran en la membrana interna de la mitocondria, constituyendo un sistema
multienzimtico altamente ordenado. Su inclusin en la membrana asegura la
disposicin espacial adecuada para un ptimo funcionamiento. (Blanco, 2001, pg. 430)

Al analizar el proceso de oxidacin de un sustrato y la transferencia de electrones, uno

podra preguntarse por qu el sustrato no entrega sus hidrgenos directamente al
oxgeno o a otros aceptores con mayor potencial de reduccin que el NAD por ejemplo
ya que esas reacciones son termodinmicamente ms favorables. Esto se explica si se
recuerda que, en las condiciones existentes en la clula, toda reaccin qumica
transcurre gracias a la existencia de catalizadores. Slo la presencia de enzimas
especficas asegura el cumplimiento de las etapas y la liberacin de energa en forma
gradual y controlable. Los hidrgenos no pasan directamente de un sustrato dado al
oxgeno o a cualquier otro aceptor si no existen enzimas que catalicen la transferencia.
(Blanco, 2001, pg. 432)

A excepcin de la ubiquinona (CoQ), que se encuentra libre en el interior de la doble

capa lipdica, y del citocromo c, cuyas molculas estn adosadas a la cara externa de la
membrana interna, los restantes componentes de la cadena respiratoria se agrupan en
cuatro complejos multimoleculares que ocupan todo el espesor de la membrana. Estos
complejos son designados con nmeros romanos. (Blanco, 2001, pg. 432)

Complejo I es la NADH-ubiquinona reductasa. Por intermedio de NAD, recibe

hidrgenos de sustratos oxidados por deshidrogenasas ligadas a esa coenzima.
Contiene FMN y varios centros Fe-S. Entrega los hidrgenos a ubiquinona.

Complejo II corresponde a la Succinato-ubiquinona reductasa. Posee un grupo

prosttico FAD y tres centros Fe-S. Transfiere equivalentes de reduccin desde
succinato a coenzima Q.

Complejo III es la Ubiquinona-citocromo c reductasa. Contiene citocromos b566, b562 y c1

y un centro Fe-S, Transfiere electrones desde ubiquinona a citocromo c.

Complejo IV es la Citocromo oxidasa, en la cual estn incluidos los citocromos a y aa3 y

dos iones Cu. Cataliza la reduccin de O2 a H2O.

Un recurso til para establecer la secuencia de la cadena ha sido el uso de inhibidores

que actan en sitios especficos. El estado redox de los distintos componentes puede
determinarse por espectrofotometra directamente en suspensiones de mitocondrias.
Cuando se agrega a la preparacin un inhibidor que bloquea la transferencia de
electrones en un punto determinado, los componentes de la cadena que participan en
las instancias previas al sitio afectado aparecern reducidos y los de etapas posteriores
estarn oxidados, pues no reciben electrones. Los estudios con distintos agentes
bloqueantes del transporte de electrones apoyan el ordenamiento propuesto. Como
ejemplo se mencionarn algunos de los inhibidores ms utilizados. (Blanco, 2001, pg.
434)

Actan a nivel del complejo I (NADH-ubiquinona reductasa): rotenona, producto

vegetal, poderoso veneno de peces, amital y otros barbitricos, y anestsicos como
halotano. Estas sustancias impiden la llegada a la CoQ de hidrgenos procedentes de
sustratos oxidados por deshidrogenasas ligadas a NAD. No afectan, en cambio, la
oxidacin de succinato y otros sustratos que ceden hidrgenos a flavoprotenas con
FAD, probando as que stos siguen otra va. El antibitico antimicina A inhibe el
transporte de electrones en el complejo III. Cianuros (CN), monxido de carbono (CO)
y azidas (N3-) inhiben especficamente la citocromo-oxidasa o complejo IV y bloquean
la etapa final de activacin del oxgeno. (Blanco, 2001, pg. 434)
 El uso de inhibidores no slo ha ayudado a deducir la secuencia de la cadena
respiratoria, sino que ha permitido conocer mejor el mecanismo de accin de algunos
frmacos y venenos. (Lubert, 2002, pg. 652)

La presente experiencia est dirigida a demostrar el efecto de algunos inhibidores sobre

la cadena respiratoria con el objetivo final de identificar sus componentes, empleando
para ello enzimas de homogeneizado heptico.

II. MATERIAL Y MTODO:

Para el desarrollo de la presente practica se utiliz materiales como: gradilla para tubos,
11 tubos de ensayo, pipetas de 1, 2 y 5 ml, homogenizados y tambin reactivos y
soluciones como: Buffer fosfato de sodio 0.1 M pH 7.4, 2.6-diclorofenolindofenol 0.02,
Succionato 0.1M, Malonato 0.1M, Cianuro de sodio 0.1M, Barbiturato de sodio 0.1M,
Homogenizado heptico, p-Fenilendiamina 1% en KCL 0.154 M

El desarrollo experimental se inici verificando que los tubos de ensayo estn

completamente limpios de impurezas, luego se separaron y rotularon en 2 grupos,
Grupo A (1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A) y Grupo B (1B, 2B, 3B, 4B, 5B). Primeramente, se
procedi a desarrollar el sistema de incubacin con el sustrato oxidable Succinato para
lo cual utilizamos los tubos del grupo A, se pipeteo Buffer fosfato de sodio 0.1 M pH 7.4
en las siguientes cantidades 1.5 ml (1A), 1.2 ml (2A), 1.0 ml (3A), 0.5 ml (4A), 0.5 ml
(5A) y 0.5 ml (6A), luego se agreg 1.0 ml de 2.6-diclorofenolindofenol 0.02% a todos
los tubos, luego se agreg 0.2 ml de succionato 0.1M a todos los tubos excepto el tubo
2A, 0.5ml de Malonato 0.1M al tubo 4A, 0.5ml de cianuro de sodio 0.1M al tubo 5A, 0.5ml
de Barbiturato de sodio 0.1M al tubo 6A, finalmente se aadi 0.5ml de Homogenizado
heptico a todos los tubos excepto el tubo 1A, se mezcla y se deja en reposo a
temperatura ambiente por espacio de 15 min despus de este lapso de observa y se
registra los cambios.

Despus se procedi a realizar el sistema de incubacin con el sustrato indicador

p-Fenilendiamina para lo cual utilizamos los tubos del grupo B, se pipeteo Buffer fosfato
de sodio 0.1 M pH 7.4 en las siguientes cantidades 2.0ml (1B), 1.5ml (2B), 1.0ml (3B),
1.0ml (4B) y 1.0ml (5B), tambin se agreg 0.5ml de cianuro de sodio 0.1M al tubo 3B,
0.5ml de Malonato 0.1M al tubo 4B, 0.5ml de Barbiturato de sodio 0.1M al tubo 5B, a
todos los tubos se le aadi 0.5ml de p-Fenilendiamina 1% en KCL 0.154 M y finalmente
se aadi 0.5ml de Homogenizado heptico a todos los tubos excepto el tubo 1B, se
mezcla y se deja en reposo a temperatura ambiente por espacio de 15 min despus de
este lapso de observa y se registra los cambios.
 III. RESULTADOS:

Tabla A.- Sistema de incubacin con el sustrato oxidable succionato

Tubos
Caractersticas
1 2 3 4 5 6

Sustrato + Sustrato +
Sustrato Sustrato +
Cianuro de Barbiturato de
Contenido Sustrato Enzima + Malonato +
Sodio + Sodio +
Enzima Enzima
Enzima Enzima

Color inicial Azul Azul Azul Azul Azul Azul

Color final Azul Azul Incoloro Azul Azul claro Incoloro

Ocurri oxido reduccin (si/no) No No Si No Si Si

Ocurri inhibicin (si/no) No No No Si No No

Indicador(Ox/red) Ox Ox Red Ox Red Red

Tabla B.- Sistema de incubacin con el sustrato indicador p-Fenilendiamina

Tubos
Caractersticas
1 2 3 4 5

Sustrato + Sustrato +
Sustrato +
Sustrato + Cianuro de Barbiturato de
Contenido Sustrato Malonato +
Enzima Sodio + Sodio +
Enzima
Enzima Enzima

Marrn Marrn
Color inicial Marrn Claro Marrn Claro Marrn Claro
Claro Claro

Marrn Marrn Marrn Marrn

Color final Marrn Claro
Claro Oscuro Oscuro Oscuro

Ocurri oxido reduccin (si/no) No Si No Si Si

Ocurri inhibicin (si/no) No No Si No No

Indicador(Ox/red) Red Ox Red Ox Ox

IV. DISCUSIN:
A. Sistema de Succinato
El tubo 1A contiene 2,6 diclorofenolindofenol (indicador), Succinato
(sustrato) pero no tiene el homogenizado heptico (enzima- cadena
respiratoria) por lo que no se lleva a cabo ninguna reaccin de reduccin.
En el tubo 2A contiene 2,6 diclorofenolindofenol (indicador) pero a
diferencia del tubo N 1 no tiene Succinato (sustrato) pero si tiene el
homogenizado heptico (enzima-cadena respiratoria) por lo que no se
reduce el indicador.
En el tubo 3A al contener el 2,6 diclorofenolindofenol (indicador), Succinato
(sustrato) y homogenizado heptico (enzima- cadena respiratoria) se
produce la reduccin del indicador.
En el tubo 4A el Malonato agregado acta a nivel del complejo II inhibiendo
a la Succinato deshidrogenasa evitando la reduccin del 2,6
diclorofenolindofenol.
En el tubo 5A el Cianuro de Sodio agregado acta a nivel del complejo IV, por
lo cual no puede inhibir al Succinato deshidrogenasa y se da la reduccin.
En el tubo 6A el Barbiturato de Sodio inhibe a nivel de complejo II e impide
que la Flavoproteina done sus electrones a la CoQ. Por lo que el 2,6
diclorofenolindofenol acepta los e- reducindose.
B. Sistema de p-Fenilendiamina
El tubo 1B contiene solo p-Fenilendiamina (sustrato indicador) por lo que
no hay reaccin redox.
En el tubo 2B la cadena respiratoria contenida en el homogenizado heptico
oxidada a la p-Fenilendiamina (marrn oscuro) a nivel del Citocromo c a la
vez que este se reduce, luego este sigue transfiriendo los electronos por el
resto de la cadena transportadora.
En el tubo 3B el Malonato acta a nivel de complejo II inhibindolo, pero la
p-Fenilendiamina dona sus e- al Citocromo c oxidndose (marrn oscuro).
 En el tubo 4B el Cianuro de sodio acta a nivel de complejo IV, impidiendo
que reciba los electrones del citocromo c, donados por la p-Fenilendiamina,
impidiendo que esta siga oxidndose, manteniendo su color claro.
En el tubo 5B el Barbiturato de sodio inhibe la transferencia de e- de las
flavinas a la CoQ, pero la p-Fenilendiamina dona sus e- al Citocromo c
oxidndose (marrn oscuro).

V. CONCLUSIN:
El Malonato inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo II.

El cianuro de sodio inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo IV.

El Barbiturato de sodio impide la transferencia de e- a nivel de complejo I y

II.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICA:

Referencias:
Blanco, A. (2001). QUMICA BIOLOGICA (8ta edicin ed.). Editorial El Ateneo.

Lubert, S. (2002). BIOQUMICA (5ta edicin ed.). Editorial Reverte S.A.