ANALISIS DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS BASADOS EN

TECNICAS DE CULTIVO

Este proceso consiste en separar los organismos de inters de una comunidad microbiana,
un procedimiento que se conoce como ENRIQUECIMIENTO, y que permite aislarlos
despus en un cultivo axnico. El aislamiento es importante por que se obtienen cultivos
para estudios detallados y controlados de laboratorio y para su aplicacin en biotecnologa
y microbiologa ambiental e industrial.

ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO

En un ambiente natural no es frecuente encontrar un solo tipo de microorganismo. Lo que

existe son comunidades microbianas, y el desarrollo de mtodos y procedimientos que
permitan el aislamiento y cultivo de microorganismos inters es un reto para el eclogo
microbiano.

El enfoque ms corriente para alcanzar este propsito es la TECNICA DEL CULTIVO

DE ENRIQUECIMIENTO.

TCNICA DEL CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO

Este mtodo requiere que el medio de cultivo y las condiciones de incubacin sean
selectivos para el organismo que se desea aislar y contra selectivos para los organismos
no deseados.

Por tanto se necesita reproducir lo ms fielmente posible los recursos y las condiciones
que se dan en este nicho ecolgico y buscar luego los habitantes potenciales de aquel
hbitat capaces de desarrollarse en las condiciones de enriquecimiento seleccionadas.

Para que un cultivo de enriquecimiento tenga xito es necesario contar con un inculo
apropiado (una muestra que contenga el microorganismo). Por tanto, la metodologa del
cultivo de enriquecimiento se inicia con la eleccin del hbitat adecuado.

El cultivo de enriquecimiento suele establecerse sembrando el inculo directamente en

un medio altamente selectivo; muchos de los procariotas ms frecuentes pueden aislarse
de esta manera.

Por ejemplo, el microbilogo holndes Martinus Beijerink, a quien se deben las primeras
tcnicas de cultivo de enriquecimiento, aisl por primera vez la bacteria fijadora de
nitrgeno Azotobacter por medio de lo que despus se convirti en una estrategia clsica
de enriquecimiento

Como Azotobacter puede crecer rpidamente fijando N2 del aire, los medios de
enriquecimiento carentes de amoniaco u otras formas de nitrgeno fijado son muy
selectivos para este organismo; las bacterias no fijadoras de nitrgeno o las bacterias
fijadoras de nitrgeno anaerbicas son contra seleccionadas con este mtodo.

Tanto el medio de cultivo como las condiciones de incubacin son crticos para que tenga
xito un cultivo de enriquecimiento; es decir deben optimizarse tanto los recursos como
las condiciones para tener las mejores posibilidades de enriquecer el microorganismo
que interesa.

LA COLUMNA DE WINOGRADSKY

Tradicionalmente, la columna de Winogradsky se ha utilizado en el cultivo de

enriquecimiento para el aislamiento de bacterias fototrficas rojas y verdes, de bacterias
sulfatoreductoras y de muchos otros anaerobios.

El nombre corresponde al famoso microbilogo ruso Sergei Winogradsky, quien utiliz

la columna por primera vez a finales del siglo XIX para estudiar microorganismos del
suelo.

La columna de Winogradsky es un ecosistema anxico en miniatura, que puede usarse

como suministro a largo plazo de bacterias para cultivos de enriquecimiento.

La columna de Winogradsky se prepara con un cilindro de vidrio grande que se llena

aproximadamente hasta la mitad con lodo rico en materia orgnica, y que preferiblemente
contenga sulfuro.

Los sustratos de carbono se mezclan previamente con el lodo; stos determinarn que
organismos sern enriquecidos, pero deben evitarse los sustratos fcilmente fermentables
(que pueden llevar a una formacin excesiva de gas). Al lodo se le aade CaCO3 y CaSO4
como tampn y como fuente de sulfato respectivamente.

El lodo se compacta en el envase, cuidando de no atrapar aire. El lodo se cubre con agua
de un lago, embalse o acequia (o agua de mar si se prepara una columna marina), y se
tapa el cilindro para evitar la evaporacin. Se coloca el cilindro cerca de una ventana
donde reciba luz solar atenuada y se deja durante varias semanas.
En una columna de Winogradsky tpica se desarrolla una mezcla de organismos.

Las algas y cianobacterias ocupan rpidamente la parte superior y al producir O2 ayudan

a mantener esta zona xica.

El proceso de descomposicin en el sedimento lleva rpidamente a la produccin de

cidos orgnicos, alcoholes y H2, sustratos adecuados para las bacterias sulfato
reductoras.

El sulfuro producido por las bacterias sulfato reductoras provoca el crecimiento de

bacterias rojas y verdes del azufre.
Estos organismos aparecen generalmente como zonas de crecimiento en el lodo de la
columna, pero tambin pueden desarrollarse profusamente en el agua si los fottrofos
oxignicos son escasos.

Para el muestreo de bacterias fototrficas de la columna se introduce una pipeta larga con
la que se recoge un poco de lodo o agua coloreada. Estas muestras se pueden usar para
microscopa y para inocular medios de enriquecimiento para aislamiento y
caracterizacin.

SESGO EN EL ENRIQUECIMIENTO
Aunque el cultivo de enriquecimiento es una herramienta poderosa, en muchos casos se
produce un sesgo en el enriquecimiento.

En los cultivos lquidos de enriquecimiento tpicos, el organismo ms adaptado a las

condiciones escogidas puede convertirse en la poblacin dominante.

Desgraciadamente, el organismo mejor adaptado en los cultivos de laboratorio a menudo

es slo un componente minoritario del ecosistema microbiano, en lugar de ser el
mayoritario o el ms relevante desde el punto de vista ecolgico.

El sesgo en el enriquecimiento puede demostrarse cuando se comparan los mtodos de

dilucin con el clsico enriquecimiento en lquido.

La dilucin del inculo seguida de un enriquecimiento a menudo da lugar a un organismo

diferente que cuando se enriquece un inculo sin diluir.

Se cree que la dilucin elimina aquellas poblaciones minoritarias pero de rpido

crecimiento, dando de este modo la oportunidad de desarrollarse a otros miembros de la
comunidad. Por tanto, la dilucin del inculo es una prctica comn en el cultivo de
enriquecimiento en la microbiologa actual.

AISLAMIENTO EN CULTIVO AXNICO

Los cultivos axnicos (o puros) se pueden obtener de muchas maneras a partir de un

enriquecimiento; los mtodos empleados ms frecuentes son la siembra por estra en
superficie (en placa petri), la siembra en profundidad (agar shake) y la dilucin en lquido.
Para aquellos microorganismos que crecen bien en medio de cultivo slido (con agar), el
mtodo de eleccin es la siembra por estra.

A partir de una poblacin mixta, mediante la siembra por estra se obtienen colonias
separadas; repitiendo esta tcnica con una de estas colonias aisladas se consigue un
cultivo axnico, que puede ser transferido a un medio lquido.

Las placas sembradas de este modo e incubadas en las condiciones adecuadas (por
ejemplo en una jarra anxica para anaerobios) nos permiten aislar tanto microorganismos
aerobios como anaerobios

SIEMBRA EN PROFUNDIDAD Y NMERO MS PROBABLE

El mtodo de siembra en profundidad consiste en la dilucin de un cultivo mixto en tubos
de agar fundido; cuando el agar solidifica, las colonias se desarrollan embebidas en el
tubo de agar en vez de en la superficie, como ocurre en la siembra por estra en placa.

Es un mtodo de gran utilidad para purificar determinados tipos de microorganismos

anaerobios, por ejemplo, las bacterias fototrficas del azufre y sulfato reductoras de las
columnas de Winogradsky.

Es posible obtener cultivos axnicos mediante diluciones sucesivas de una suspensin de

clulas en tubos de agar fundido. A partir de una colonia crecida en el tubo de mayor
dilucin utilizada como inculo, se puede volver a hacer otro banco de diluciones, de tal
manera que se acabe obteniendo un cultivo axnico.

Un procedimiento similar sin usar agar es la dilucin seriada de un inculo en un medio

lquido hasta que el tubo o tubos finales de la serie no muestran crecimiento.

Utilizando diluciones seriadas de diez en diez, por ejemplo, el ltimo tubo que muestre
crecimiento tiene que haberse originado a partir de 10 clulas o menos. Si se repite varias
veces este proceso se obtienen cultivos axnicos. Esta tcnica se conoce como la Tcnica
del Nmero Ms Probable (NMP).

La Tcnica del NMP se usa para estimar el nmero de microorganismos en alimentos,

aguas residuales y en otras muestras donde hay que evaluar rutinariamente el nmero de
clulas. Se puede hacer con medios altamente selectivos y condiciones de incubacin
dirigidos a uno o a un pequeo grupo de organismos, como por ejemplo un determinado
patgeno, o usando un medio complejo para obtener una estimacin del nmero total de
clulas.

Con independencia del mtodo utilizado para purificar el cultivo, una vez obtenido un
supuesto cultivo axnico es esencial comprobar su pureza. Se utiliza para ello una
combinacin de tcnicas microscpicas, observacin de las caractersticas de la colonia
en placas, o en siembras en profundidad en tubo, y comprobacin del crecimiento en
medios donde el microorganismo que nos interesa aislar crece muy poco, pero que
favorecen el crecimiento de los microorganismos acompaantes.

La observacin microscpica de un solo tipo morfolgico de clula, junto con unas

caractersticas uniformes de la colonia y ausencia de contaminacin en test con diversos
medios de cultivo, puede tomarse como prueba de que un cultivo es axnico (puro).
CULTIVOS AXNICOS DE ALTA TECNOLOGA: LAS PINZAS DE LSER

Adems de los mtodos clsicos descritos, los avances tecnolgicos han permitido la
utilizacin de nuevas herramientas para la obtencin de cultivos axnicos; una de ellas
son las pinzas (pticas) de lser.

Las pinzas de lser consisten en un microscopio ptico invertido equipado con un laser
infrarrojo enfocado con precisin y un instrumento de micro manipulacin.

Una clula individual del campo de visin es atrapada por el haz de rayos laser y separada
del resto de microorganismos. La clula queda atrapada por que la fuerza creada por el
lser que empuja hacia abajo los objetos pequeos (como las clulas microbianas) y los
mantiene en el lugar; cuando el haz de lser se desplaza, las clulas atrapadas se mueven
junto con l. Si la muestra est en un tubo capilar, se atrapa una nica clula que despus
se asla rompiendo el tubo en un punto entre la clula y el resto de la poblacin.

La clula recogida se introduce entonces en un tubo pequeo de medio estril para iniciar
su crecimiento como cultivo axnico.

La tecnologa de pinzas de lser es especialmente til para el aislamiento de bacterias de

desarrollo lento, que pueden ser superadas por el desarrollo rpido de otras poblaciones
en los cultivos de enriquecimiento tpicos, o para los organismos presentes en nmeros
tan bajos que podran perderse con los mtodos de enriquecimiento a partir de la dilucin.
Y junto con el uso de tinciones especficas capaces de identificar organismos
determinados en un campo del microscopio, las pinzas de lser se emplean para
seleccionar organismos a partir de una mezcla para su purificacin y posterior estudio en
el laboratorio.
 ANLISIS MOLECULAR DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS

1. VIABILIDAD Y CUANTIFICACION MEDIANTE TECNICAS DE

TINCION
Tincin Fluorescente con DAPI:
Las tinciones fluorescentes se han usado mucho para teir microorganismos
en hbitats opacos. El colorante DAPI (4,6-diamido-2-fenilindo) se utiliza
con frecuencia para este propsito; las clulas teidas con DAPI presentan
fluorescencia azul brillante y son muy fciles de ver y enumerar. La tincin
DAPI se emplea para la enumeracin de microorganismos en muestras
clnicas, del ambiente y de alimentos.
Dependiendo de la muestra, la tincin con colorantes fluorescentes no
especficos puede representar un problema, pero el DAPI, que tie cidos
nucleicos, no suele reaccionar con la materia inerte.
Por tanto, para muchas muestras de suelo y agua, la tincin DAPI proporciona
una estimacin razonable del nmero de clulas presente. Para muestras
acuticas, las clulas se tien en la superficie de un filtro despus de haber
filtrado un volumen determinado de lquido. Estas tcnicas sencillas tienen la
ventaja de no ser especficas (tien todos los microorganismos de una
muestra), pero con el inconveniente de que no diferencian entre clulas vivas
y muertas, ni permiten el rastreo de organismos especficos en el ambiente.
Tincin de viables.
Se ha desarrollado una tincin con colorantes fluorescentes que diferencia
entre clulas vivas y muertas. Esto proporciona informacin no slo del
nmero de organismos de una muestra sino tambin de su viabilidad. Esta
distincin se basa en la integridad de la membrana citoplasmtica celular.
A la muestra se aaden dos colorantes, verde y rojo; el colorante fluorescente
verde penetra en todas las clulas, viables o no, mientras que el rojo, que
contiene yoduro de propidio, penetra slo en aquellas clulas cuya membrana
ya no se encuentra intacta y por tanto, estn muertas.
Las clulas verdes estaban vivas y las rojas muertas, lo que ofrece una
evaluacin instantnea de la viabilidad.
Este mtodo se utiliza con cultivos bacterianos de laboratorio, pero no es
 adecuado para el examen microscpico de hbitats naturales debido a
problemas de tincin inespecfica de los materiales inertes.
Anticuerpos fluorescentes.
Las tcnicas de tincin con sustancias fluorescentes pueden hacerse ms
especficas con el empleo de anticuerpos fluorescentes.
La gran especificidad de los anticuerpos frente a los constituyentes de la
superficie de un organismo particular puede explotarse para identificar o
rastrear un organismo en un hbitat complejo; por ejemplo, suelo o una
muestra clnica que contenga una mezcla de muchos organismos.
El mtodo requiere la preparacin de anticuerpos especficos contra los
organismos que interesan, lo cual es largo y laborioso.
Sin embargo, para el caso de microorganismos de importancia clnica, se
dispone comercialmente de anticuerpos de alta especificidad.
PROTEINA FLUORESCENTE VERDE PARA EL ETIQUETADO
CELULAR
En el genoma bacteriano se puede insertar un gen que codifica una protena
fluorescente verde (GFP, green fluorecens protein). Al expresarse, las clulas
que contienen la GFP aparecen de color verde cuando se observan con un
microscopio de luz ultravioleta.
Aunque no resulta til para el estudio de poblaciones naturales (por que estas
clulas carecen del gen GFP), las clulas etiquetadas con GFP se pueden
introducir en un medio, como las races de las plantas y seguir con el
microscopio la cepa etiquetada.
Con este mtodo los eclogos microbianos pueden estudiar in situ la
competencia microbiana entre la microbiota nativa y la cepa con GFP
introducida o evaluar el efecto de la perturbacin en el ambiente.

La GFP tambin se ha usado ampliamente en cultivos de laboratorio como gen

indicador.
2. TINCION GENETICAS
TINCION FILOGENETICA CON HIBRIDACION FLUORESCENTE
IN SITU
Los colorantes filogenticos son oligonucleotidos fluorescentes
complementarios en la secuencia de base a las secuencias en el ARNr 16s o
18s. Los colorantes filogenticos penetran en la clula, donde hibridan con el
ARNr directamente en los ribosomas.
Como se han identificado sondas filogenticas para especies microbianas
individuales, as como para dominios enteros de organismos, el grado de
especificidad de un colorante filogentico puede controlarse mediante la
secuencia de la sonda fusionada. La FISH permite identificar o rastrear un
organismo particular o un grupo de organismos relacionados, dependiendo de
la especificidad de la sonda.
TINCION DE CROMOSOMAS Y TRANSCRIPCION INVERSA IN
SITU:
La tincin de cromosomas se emplea para identificar genes especficos de la
microbiota de muestras naturales, mientras que la transcripcin se dirige a un
ARNm especfico (es decir genes expresados).
La tincin de cromosomas se inicia con el marcado fluorescente de una sonda
de oligonucletidos o del gen completo, de un conjunto de genes, o incluso de
un genoma completo digerido para obtener sondas pequeas. Las sondas se
utilizan para averiguar que organismo(s) de una muestra contiene(n) el gen o
los genes presentes en las sonda(s).
La tincin de cromosomas es til para identificar bacterias que contienen
genes especficos, como los que codifican la nitrogenasa (responsable de la
fijacin del nitrgeno), los componentes del centro de reaccin fotosinttico,
o vas autotrficas especficas.
Los nmeros de clulas fluorescentes en cada caso daran una estimacin de
las bacterias fijadoras de nitrgeno, fottrofas o auttrofas, respectivamente,
en una muestra natural
A diferencia de la tcnica anterior, la transcripcin inversa in situ, busca si un
organismo est expresando un gen o genes determinados en la naturaleza en
un momento determinado.

El mtodo utiliza una sonda que hibrida con un ARNm especfico previamente
transcrito por las clulas en una muestra.
Una vez que la sonda reacciona, tiene lugar la transcripcin inversa,
produciendo un ADN complementario que es amplificado por la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR).

Finalmente, el ADN amplificado reacciona con una sonda fluorescente.

PCR: RELACIONANDO GENES ESPECIFIFICOS CON ORGANISMOS
ESPECIFICOS:
Muchos estudios en ecologa microbiana no necesitan aislar los
microorganismos, ni siquiera identificarlos por microscopa con las tinciones
antes descritas.
Generalmente, el objetivo de un estudio es evaluar la biodiversidad de un
hbitat sin emplear tcnicas de cultivo, ni observar clulas. Con este objetivo,
se han aislado y caracterizado genes especficos como medida de la
biodiversidad de la comunidad microbiana. Como los genes especficos estn
ligados frecuentemente a organismos especficos la deteccin del gen implica
la presencia del organismo.
Las principales tcnicas de este tipo de anlisis microbiana son:
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y anlisis de la comunidad
microbiana
Electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE):
Separacion de genes similares
Clonacin molecular
Secuenciacin y anlisis de ADN