BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS

PROTEASA

Una proteasa es una enzima que ayuda a degradar las protenas. Se encuentran
en todos los organismos y son importantes para muchas funciones metablicas,
desde la digestin hasta la coagulacin sangunea. Las proteasas se usan en los
detergentes para lavar la ropa y productos alimenticios y tambin para eliminar
pelos de la piel de los animales y con fines mdicos.

APLICACINES

APLICACIONES EN ALIMENTOS
Las proteasas han sido utilizadas en alimentos durante siglos. La renina,
un tipo de proteasa obtenida de los estmagos de los terneros, ha sido utilizada
tradicionalmente para la fabricacin de quesos. Las proteasas tambin tienen un
papel en la produccin de salsa de soja, embutidos, fiambres y harinas.

USOS MDICOS Y RELACIONADOS

Las proteasas son usadas para tratar cogulos sanguneos, limpiar heridas y
aumentar la efectividad de algunos antibiticos. Un tipo de proteasa obtenida de
los tallos de pias es utilizada como antiinflamatorio y otras enzimas proteasas
degradadoras de protenas se utilizan para tratar las sepsis severas.

OTROS USOS
Las proteasas microbianas se utilizan en la industria del cuero para eliminar el
pelo de la piel de los animales y ablandar el cuero. Tambin ayudan a evitar que
se encoja la lana. Agregadas a los detergentes, las proteasas ayudan a eliminar
las manchas producidas por protenas.

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TEMA:

Purificacin y caracterizacin de proteasas de Pseudomonas

fluorescens y sus efectos sobre las protenas de la leche

RESUMEN

El aumento de los niveles de contaminacin de la leche

cruda por bacterias psicrotrficas, durante el perodo en
que sta permanece refrigerada previo a su tratamiento
en la planta, puede traducirse en la produccin de
enzimas termorresistentes responsables del deterioro de
productos lcteos industrializados del tipo larga
vida. Pseudomonas fluorescens, es la especie
bacteriana psicrotrfica que con mayor frecuencia se
encuentra en las leches del sur de Chile. En el presente trabajo se purificaron los
extractos enzimticos de proteasas obtenidos de cultivos a 6C
de Pseudomonas fluorescens RV10 en leches crudas recin ordeadas. Se
encontr que la proteasa corresponde a una protena de masa molecular 49,5
kD, que presenta termorresistencia y que ataca rpidamente a la k-casena y
luego a la -casena. Del trabajo es posible concluir que el almacenamiento de
la leche a 6C es riesgoso cuando va a ser destinada a productos del tipo larga
vida, debido a la prdida de calidad por la accin de proteasas de bacterias
psicrotrficas.

INTRODUCCION

Es frecuente la contaminacin de la leche cruda por bacterias psicrotrficas

durante el perodo en que la leche se encuentra almacenada en los estanques
prediales refrigerados, el transporte a la planta lechera en camiones cisterna y el
almacenamiento en la industria. Si la contaminacin es alta, puede traducirse en
la produccin de proteasas y lipasas termorresistentes, principales responsables
del deterioro de productos lcteos industrializados, especialmente leches UHT
(Ultra High Temperature) y otros del tipo larga vida (1- 5).

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En Chile los estanques prediales, el transporte y los estanques silos operan a

temperaturas reales entre 4C y 6C. Dentro de las cepas bacterianas
encontradas en leches refrigeradas en la X Regin, es importante por su alta
frecuencia Pseudomonas fluorescens (6). En nuestro laboratorio se ha aislado la
cepa RV10 con la cual se efectuaron estudios de crecimiento bacteriano y
produccin de enzimas termorresistentes en leches crudas recin ordeadas
almacenadas a 4C (7).

Las protenas de la leche principalmente estn compuestas por casenas (8),

las que son degradadas por accin de las enzimas termorresistentes producidas
por microorganismos psicrotrficos provocando la protelisis de la leche, lo que
lleva a la coagulacin, gelificacin y la formacin de sabores amargos en el
producto terminado (9). Las casenas se clasifican de acuerdo a su secuencia
aminoacdica en as1-, as2-, - y k-casena. Las distintas casenas son muy
susceptibles a la hidrlisis debido a que presentan una estructura no helicoidal
al azar. Casi todas las casenas de la leche fresca recin secretada estn
contenidas en partculas agregadas denominadas micelas. El modelo ms
aceptado para la conformacin de las micelas de casena presenta numerosas
subunidades compuestas de (-casena en la mayor parte de la superficie, y as1-
, as2- y -casenas comprimidas al interior de las micelas. Cuando la leche es
almacenada a bajas temperaturas, la ?-casena se disocia de las micelas y la
cantidad de casena soluble puede alcanzar hasta un 30%. Se ha sugerido
entonces, que la refrigeracin podra hacer a las fracciones de casenas ms
susceptibles a la protelisis (10).

Fairbairn y Law (1), han postulado un mecanismo que describe como ocurrira
la protelisis en la leche producida por enzimas de microorganismos
psicrotrficos. Generalmente, las proteasas bacterianas de Pseudomonas
fluorescens, atacaran a la k-casena para producir para-k-casena, esto
producira la desestabilizacin de las micelas de casena, y por lo tanto, una
severa hidrlisis de la k-casena que traera como consecuencia la coagulacin
de la leche, su gelificacin y desarrollo de sabores a sucio y amargo.

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OBJETIVOS

Purificar y caracterizar extractos enzimticos obtenidos de cultivos en

leche cruda a 6C

Determinar la fraccin de protenas de la leche sobre las cuales actuaran

estas proteasas bacterianas.

MATERIALES Y MTODOS

CULTIVOS

Los cultivos de Pseudomonas fluorescens RV10 se efectuaron en un

fermentador modular (Gallenkamp) de 1 L, con control automtico de pH y
temperatura (6C) sin aireacin y con mnima agitacin, en 500 mL de leche
recin ordeada de vacas sanas pertenecientes al fundo Vista Alegre de la
Universidad Austral de Chile. Las leches fueron inoculadas con un cultivo previo
de Pseudomonas fluorescens RV10 en caldo cerebro corazn de forma tal de
obtener una concentracin inicial de 4 a 6 x10 3 ufc/mL. Se tomaron muestras
cada 2 horas durante 100 horas y se determin cada vez el recuento total en
placa Agar Plate Count de acuerdo con Houghtby y col. (11) y la actividad
protesica mediante el mtodo de Linden y col. (12), que fue modificado en el
presente trabajo como sigue: 3 mL de leche se mezclan con 1 mL de una solucin
de leucyl-p-nitroanilida 6mM (Sigma Chemical Co.) en 20 mM buffer bis-tris
propano (Sigma Chemical Co.) e incubados a 37C por 2 h, al trmino del cual
se toman 2 mL de la mezcla y se mezclan con 4 ml de etanol absoluto (Merck).
Luego de dejar reposar unos minutos la mezcla es centrifugada a 14.700g por
20 min a 4C. El sobrenandante es extrado cuidadosamente y se lee su
absorbancia a 405 nm. Se construye una curva de calibracin estndar de p-
nitroanilina (Sigma Chemical Co.) en el rango de 0-200 moles/L. La actividad
protesica se expresa como M de p-nitroanilina (pNA) liberados en 2 h a 37C.

PURIFICACIN DE PROTEASAS

El procedimiento seguido para extraer las enzimas de la muestra de leche

con Pseudomonas fluorescens est basado en los prococolos de Extercate y

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Shamsuzzaman y McKellar (13,14). A cada una de las fracciones obtenidas en

cada etapa se les determin la actividad protesica y concentracin de protenas,
esta ltima mediante el ensayo mejorado de cobre alcalino (15).

ENSAYOS DE TERMORRESISTENCIA

Se efectuaron ensayos de termorresistencia (100C y 130C, 120 s) a leche

cruda inoculada con Pseudomonas fluorescens y a la fraccin enzimtica
purificada por cromatografia de filtracin gel y se determin la actividad
enzimtica residual.

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DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR

Para la estimacin del tamao molecular se realiz una electroforesis del

extracto enzimtico obtenido por cromatografa en gel, utilizando geles de
poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Para esto,
se utiliz una solucin de acrilamida-bisacrilamida al 15%-0,4%. Se utiliz un
sistema continuo, es decir la muestra de protena fue colocada directamente
sobre el gel separador. Para el gel separador se utiliz como tampn tris-HCl pH
8,8 y como tampn de corrida tris-glicina pH 8,3 (16,17).

Se adicionaron 20 L de estndar y 50 L de muestra de enzima en cada carril.

La curva de calibracin fue realizada con protenas estndares de peso
molecular conocido grado electrofortico de origen Sigma Chemical Co.:
albmina de leche bovina (66 Kd), a-casena (40% de b-casena), k-casena (19
Kd), b -lactoglobulina (18,4 Kd). Las corridas se realizaron a temperatura de
refrigeracin y con una intensidad de 25 mA.

CONCLUSION

De este estudio se puede concluir en general, que el almacenamiento de la

leche a 6C es riesgoso cuando va a ser destinada a productos del tipo larga
vida, debido a la prdida de calidad por la accin de proteasas de bacterias
psicrotrficas.

BIBLIOGRAFIA

Costa L, Marcia, Gmez S., M. Francisca, Molina C., Luz H., Simpson R.,
Ricardo, & Romero M., Alejandro. (2002). Purificacin y caracterizacin
de proteasas de Pseudomonas fluorescens y sus efectos sobre las
protenas de la leche. Archivos Latinoamericanos de Nutricin, 52(2), 160-
166. Recuperado en 06 de enero de 2017, de
http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-
06222002000200007&lng=es&tlng=es.