DETERMINACIN DE RESIDUOS DE CLORANFENICOL EN

MUESTRAS DE RIN DE CERDOS Y EN LECHE POR

CROMATOGRAFA LIQUIDA Y GASEOSA.
Determination of waste chloramphenicol in kidney of pigs and milk for liquid and gas
chromatography.

Elaborado por TOMASZ niegocki , ANDRZEJ POSYNIAK , y Jan Zmudzki Elena del
Carmen Briceo-Fereira1*, Jenner de Jess Guevara-Prez2, Jos Gregorio Riera-
Betancourt3 , Darwuin Arrieta-Mendoza1 y Gema Carolina Maniglia-Mrida1
Departamento de Farmacologa y Toxicologa ,Instituto Nacional de Investigacin Veterinaria , 1Ctedra de
Farmacologa y 2 Ctedra de Medicina Poblacional, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Central
de Venezuela.
3Laboratorio SEDICOMVET. Maracay, Venezuela.
* edelcbf@hotmail.com; darwuin@yahoo.com
sniego@piwet.pulawy.pl

RESUMEN Cromatografa Liquida de Alta Resolucin (13,20).

Cloranfenicol es el amplio espectro antibitico que
ha sido ampliamente utilizado desde la dcada de
1950 en el ganado, con su aplicacin con xito en
todas las especies animales. Los efectos txicos
reconocidos de cloranfenicol para los seres
humanos traj que existiera una restriccin de su
utilizacin en la prctica veterinaria. En particular,
en los seres humanos, el efecto secundario adverso
ms comn es la dosis de la supresin relacionada
con la medula sea, dado en eritropenia
La trombocitopenia o leucopenia puede ocurrir
tambin. La falta de niveles seguros de residuos ha
hecho la Unin Europea prohibir la PAC para el
uso veterinario en 1994. Se ha establecido un lmite
mximo de residuos (LMR) de este antibitico
(6,7). Por lo tanto la UE ha definido un lmite
mnimo requerido de rendimiento (MRPL), para la
NAC en los alimentos de origen animal.(4)
El uso de una amplia variedad qumicamente
basado analtico para la determinacin de residuos
de cloranfenicol en esta incluye cromatografa
liquida-espectrometra de masa (LC-MS) y de
cromatografa gaseosa por espectrometra de masa
(2,9,12, 18,19). Se tomaron en forma aleatoria
muestras de rin de cerdos provenientes 11
granjas del estado de Maracaibo, de las cuales
fueron llevadas al laboratorio para su
procesamiento y el anlisis mediante la
Los resultados que se obtuvieron tubo la presencia
de cloranfenicol de un 66.67% del total de las
granjas evaluadas (14,17).
Estos resultados ponen en manifiesto la
comercializacin de productos de origen animal
con antimicrobianos nocivos desde el punto de
vista de la salud pblica, por otro lado, se violan las
normas (Codex Alimentarius, Organizacin de las
Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentacin / Organizacin Mundial de la Salud).
El objetivo de este estudio fue la determinacin y
comparacin de la eficiencia de los procedimientos
para la confirmacin y cuantificacin de los
residuos de la PAC en muestras de leche y rin de
cerdo por GC-MS/ MS o sistema/ MS-MS-LC y
comparar la utilidad de ambos mtodos.
Palabras claves: Leche, cloranfenicol, residuos,
cromatografa, espectrometra de masa.
ABSTRACT
Chloramphenicol recognized for humans toxic
effects brought that there is a restriction of their use
in veterinary practice.
In particular, in humans, the most common adverse
side effect is dose related suppression of the bone
marrow, given in erythropenia leucopenia or
thrombocytopenia may also occur.
The lack of safe levels of waste the European
Union has prohibited the CAP for veterinary use in
1994.
Therefore the EU has defined a minimum required
performance limit for the NAC in foods of animal
origin.
The use of a wide variety chemically based
analytical for determination of chloramphenicol
residues in this includes liquid chromatography-
mass spectrometry and gas chromatography mass
spectrometry kidney samples of pigs from were
taken randomly 11 state farms Maracaibo , which
they were taken to the laboratory for processing
and analysis by high performance liquid
chromatography resolution.
The results obtained chloramphenicol tube the
presence of a 66.67% of total farms evaluated.
The objective of this study was to determine and
compare the efficiency of procedures for
confirming and quantifying the residues of the CAP
in milk samples and pig kidney GC-MS / MS or
system / MS-MS-LC and compare the usefulness
of both methods.
Keywords: Milk, chloramphenicol, residues,
chromatography, mass spectrometry.
1. INTRODUCCIN
Los factores de riesgos asociados a
agentes bacterianas y parasitarias. Actualmente se
agregan necesidades de conocimientos de nuevos
agentes o factores de riesgos que amenazan dicha
salud, ya sea por la incorporacin de sustancias
ajenas a los alimentos naturales, tales como los
aditivos alimentarios, plaguicidas y frmacos
veterinarios.
La demanda de alimentos, cada da es ms elevada,
ha impuesto una mayor presin sobre los mtodos
de produccin pecuarios. Al intensificarse la
produccin de protenas animal para el consumo
humano, cada vez es ms importante el empleo de
los medicamentos.
El uso de medicamentos en los animales
productores de alimentos puede generar residuos
en carnes, leche y huevos que pueden producir
efectos txicos potenciales. Los principales grupos
de medicamentos usados con fines teraputicos en
animales son los antimicrobianos, antiparasitarios
y ectoparsitos. Los residuos de medicamentos en
el alimento suponen un amplio abanico de riesgos
para la salud humana que dependen de la
frecuencia y grado de exposicin. Los
antimicrobianos constituyen uno de los grupos de
medicamentos ms utilizados en la industria
pecuaria. Su uso ha sido eficaz para incrementar la
eficiencia en la conversin de los alimentos y la
ganancia poderal, principalmente en las aves y los
cerdos (sus scrofa domesticus), es necesario
disponer de un sistema de medicin de los residuos
que protejan al consumidor.
El uso de antimicrobianos en animales
est regulado por la legislacin de muchos pases,
se rige por las pautas dictadas por el Codex
Alimentarius, organismo creado por la
Organizacin de las Naciones Unidas de la Salud
(OMS), que sirve de orientacin a la industria
alimentaria y que a su vez protegen la salud de los
consumidores.
El no aplicar un periodo de suspensin
medicamentosa adecuado es, muchas veces,
responsable de la presencia de residuos qumicos
en los animales de consumos. La presencia de
residuos en los alimentos de origen animal
comnmente se enfoca en tres elementos muy
importantes: la salud pblica, el comercio
internacional y la tecnologa de procesamiento de
subproductos. En salud pblica, porque las
sustancias en los alimentos que superen los lmites
mximos de residuos (LMR), ponen en riesgo la
salud de los consumidores. La segunda
preocupacin son las restricciones comerciales
internacionales que puedan sufrir los pases
productores de alimentos sin garantas de
inocuidad y calidad; y; finalmente, por el impacto
tecnolgico negativo en los procesos de
elaboracin de subproductos con lo cual se
perjudican las industrias crnicas o lcteas.
Las consecuencias adversas que estos
producen, como las discrasias sangunea, una de las
reacciones inversa fatal aun en concentraciones
subterapeuticas, que provoca una forma rara, pero
a menudo letal de aplasia de la medula sea. El
grupo p-NO2, del cloranfenicol es el rasgo
estructural responsable de la anemia aplasca por
cloranfenicol. Estudios revelaron que el
cloranfenicol-nitroso en concentraciones tan bajas
como 2x10-5M, induce dao simple en el ADN
despus de tres horas de exposicin de las clulas a
la droga, la nitroreduccin es el mecanismo clave
en la induccin de anemia aplasca por
cloranfenicol.
En los humanos los efectos txicos ms
importantes por su gravedad se produce en la
medula sea y pueden ser de dos tipos a) Depresin
toxica de la medula sea, que se manifiesta con
reticulocitopenia, anemia, leucopenia,
trombocitopenia b) anemia aplasca de tipo
idiosincrsico y de evolucin mortal en la mayora
de las condiciones. En los pacientes que
sobreviven, hay una incidencia anormalmente
elevada de leucemia. En la medicina veterinaria, la
administracin de cloranfenicol en los perros
(Canislupus familiaris) parece segura cuando se
respetan las dosis recomendadas, mientras que el
los gatos (Felis catus) son ms susceptibles a las
alteraciones de la medula sea. En Venezuela, la
prohibicin data de 1988, en investigaciones
previas se evidencio residuos de este frmaco en
hgados de pollos (Gallus gallus) de engorde, en la
leche de larga duracin para el consumo humano,
hgado y rin de cerdo y en hgados de pollos 0.15, 0.3, 1.0mg/ml y fueron procesado mediante el
beneficiados de los estados Aragua y Carabobo.
Alvarado y col. Sealan que en Venezuela
para el ao 2008, no exista mayor control en
cuanto a la dosificacin de los antimicrobianos,
menos an, servicios de inspeccin oficiales que
vigilen la presencia de residuos y establezcan los
lmites mximos de residuos sugeridos,
considerando adems que el consumo de cerdos o
derivados de estos con presencia de residuos de
cloranfenicol representa un riesgo a la salud
pblica.
Los autores de este artculo plantearon la
determinacin de la presencia de residuos de
cloranfenicol en rin de cerdos y la leche en el
estado de Aragua.
2. Materiales y Mtodos
1. Espectrometra gaseosa
Tomasz Sniegocki, Andrzej Posyniak y Ene
Zmudzki obtuvieron el cloranfenicol de igmaCO.
BSTFA (trimedisill) trifloruroacetamida +
1%TMCS (trimetilclorosilano) y amonio formiato,
agua, acido actico, metanol, acetato de etilo y las
columnas Bekerbond octadecilo C18 eran JT
Baker. La solucin madre fue de 1mg/ml ellos
prepararon en metanol y se almacenaron en la
oscuridad a temperatura mayor 16C (1). La PAC
Aparte de eso tambin se prepar ron una solucin
de metanol y se almacenaron en la oscuridad a
temperatura mayor a 6C durante no ms de 6
meses. La solucin madre para el estndar interno
es 1mg/ml este se prepar en metanol. El
cromatografo se acoplo a un espectrofotmetro de
masa Finnigan Polaris.
El gas portador que ellos utilizaron fue el
helio y el metano para la separacin se realiz en la
columna capilar DB-IMS (30m x 0.25m x
0.25mm). La lnea de inyeccin y transferencia se
mantuvieron a 280C. El horno de cromatografa
de gases se program de 110C a 200C a razn de
20C/min, y posteriormente a 241C A 8C /min, y
finalmente a 200C a 20C/min y se deja enfriar
durante 5 min (22). El detector MS Finnigan
Polaris, que opera en NCI modo MS/MS: m/z 466
como un ion precursor y los iones de m/z 304,322,
358, 394 y 430 como producto de transicin para el
cloranfenicol. En este procedimiento de la muestra
de leche se cargaron con cloranfenicol a un nivel de
procedimiento de extraccin descrito
anteriormente. La recuperacin del cloranfenicol
estaba evaluado para comparar la concentracin
que se encontraba en los estndares de la solucin.
2. Cromatografa liquida
Del total de 30 muestras de rin
recolectadas por cada granja Elena del Carmen
realizo un pool, efectundose una homogenizacin
de las misma, para posterior deteccin de residuos
de los antimicrobianos cloranfenicol, mediante la
tcnica de Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin (HPLC), por el mtodo sugerido por
Bele y col. [7], en un Cromatgrafo lquido
(modelo Agillent 1100, Hewlett Packard, EUA),
con detector UV visible, polaridad positiva, con
longitud de onda 272 nm; todo conectado a
computadora Compaq Pentium V (China), con una
impresora HP Laserjet 18 (China), y un paquete
computacional Chem Station versin A 0.09B
(23,24). La extraccin de los antimicrobianos se
efectu mediante el principio de la dispersin de
matriz en fase slida, que consiste en romper las
membranas celulares por medio de fuerzas
hidrofbicas y mecnicas para dejar al descubierto
los componentes hidroflicos.
Se elaboran curvas de calibracin a partir de
soluciones patrn de cada uno de los
antimicrobianos en estudio (estndares puros de
cloranfenicol y dimetridazol). Cada muestra se
trabaja junto con tejidos libres de los
antimicrobianos (controles negativos), y otro
adicionado con los antimicrobianos de inters
(controles positivos), a fin de calcular el porcentaje
de recuperacin de la tcnica. Los niveles
detectados de los antimicrobianos en estudio se
expresaron en mg/kg. Lmite de deteccin:
cloranfenicol 0,37 mg/kg y dimetridazol 1,30
mg/kg.
Resultados y Discusin
1. Cromatografa gaseosa
En la GC-MS/MS el estndar de solucin
( blanco de la leche y cloranfenicol) fortalecido en
las muestras de leche, se muestran en la figura 1 y
2, respectivamente en el cromatograma. La muestra
de leche y cloranfenicol segn TOMASZ
NIEGOCKI tena que estar en el nivel 0.3g/l
(10,11).
Muchos procedimientos analticos tiene
estados descrito para la determinacin de residuos
de la PAC en matrices biolgicas, pero solo unos
pocos estn disponibles para matrices de leches.
Generalmente, se usan disolventes orgnicos
(8,15). El procedimiento para el anlisis del
cloranfenicol, predominante para es el acetato de
etilo, que proporcionan buenas recuperaciones,
pero tambin muchos compuestos que interfieren
fue coaislados que no permite la PAC que se
proyecta en los niveles inferiores. TOMASZ
NIEGOCKI propusieron una extraccin de PAC
a partir de la muestra de leche con acetonitrilo, en
lugar del acetato de etilo (25). Ellos utilizaron
adicionalmente un SPE con un doble C18 cartuchos
de limpiar se utiliz para una mejor separacin de
los compuestos endgenos aislados.
2. Cromatografa liquida
Los niveles de residuos de cloranfenicol
que Elena del Carmen detecto en las muestras en
las muestras de rin porcino procedentes de
granjas, localizadas en los estados de Aragua y
Carabobo, esto se muestra en la TABLA 3(26). De
la cual no hubo niveles detectado de cloranfenicol
En el anlisis que realizo Elena del Carmen en las
muestras de rin de los cerdos se determin que
seis de las nueve granjas evaluadas (66.67%)
resultaron positivas a la presencia de residuos de
cloranfenicol, con niveles que iban desde
4.13mg/kg hasta 28.3mg/kg. Estos valores son muy
superiores a los reportados por Vsquez y col.
Briceo y col, quienes evidenciaron el uso ilegal
del frmaco en relacin a los promedios delos
niveles de residuos evidenciaron que el
cloranfenicol, de acuerdo a la regin de las
respectivas muestras procesadas, se observa
(TABLA 4) que la media para los niveles de
cloranfenicol detectados para las granjas
procedentes del estado fueron
(14.5888.3202mg/kg) es decir que es
estadsticamente superior (P<0.05) a las oriundas
del estado de Aragua donde no fueron detectables.
FIGURA 1 .- NIVELES DE CLORANFENICOLY
DIMETRIDAZOL (mg/kg), DETECTADOS EN
MUESTRAS DE RION DE CERDOS
PROCEDIENTES DE GRANJAS PORCINAS DEL
ESTADO CARABOBO, PERIODO OCTUBRE
2010 MARZO DEL 2011
Tanto el cloranfenicol han sido prohibidos
en Europa, estando el cloranfenicol incluido en el
Anexo IV del Consejo de Regulacin de drogas de
uso veterinario de la comunidad Europea, ya que
son sustancias farmacolgicas activas, lo que
significa que cualquier residuo de estos que se
encuentren en los alimentos producidos por
animales destinado al consumo humano, es
considerado como una violacin a las regulaciones.
Su uso tambin ha sido prohibido por la FDA en
los Estados Unidos. Siendo regulados mediantes
especficos de cero tolerancia (27).
 TABLA 1

Fase mvil gradiente

Tiempo (min) Flujo (l/min) UN (%) B (%)

0.00 200 90.0 10.0
1.50 200 90.0 10.0
6.50 200 68.0 32.0
10.00 200 68.0 32.0
11.00 200 90.0 10.0
20.00 90.0 10.0

TABLA 2
Informe de validacin
Parmetro Tcnica
Ecuacin de regresin lineal(y=mx+b) Y=12339.9x-69.086
Coeficiente de correlacion 0.9789
Linealidad(intervalo de trabajo), g/kg 0.15-2.0
Limite de decisin(CCu), g/kg 0.083
Capacidad de deteccin 0.14
Nivel de leche muestras en pinchos, g/kg 0.15 0.3 1.0
Recuperacin % 61.9 78.0 68.5
Repetibilidad
X, g/kg 0.093 0.237 0.685
Xi s, g/kg 0.014 0.018 0.091
Xii RSD, % 15.0 7.8 13.4
La incertidumbre combinada(uc) 0.0056
Expandida(U) factor de cobertura 2
(k) 0.150.011
 FIGURA 1. LOS CROMATOGRAMAS DE CLORANFENICOL POR GC-MS/MS
A) MUESTRA EN BLANCO B) MUESTRA MARCADA EN 0.3MG/KG C) 0.03G/KG
 FIGURA 2. LOS CROMATOGRAMAS DE CLORANFENICOL OBTENIDOS POR LCRS
A) MUESTRA EN BLANCO B) MUESTRA MARCADA EN 0.3MG/KG C) ESTANDAR A 0.3MG/KG
 FIGURA 3.- LA FRAGMENTACIN DE CLORANFENICOL

TABLA 3
NIVELES DE CLORANFENICOL DIMETRIDAZOL (mg/kg), DETECTADOS EN MUESTRAS DE
RION DE CERDOS PROCEDIENTES DE GRANJAS EN LOS ESTADOS ARAGUA Y
CARABOBO,
PERIODO OCTUBRE 2010-2011

Aragua Carabobo
Granja Cloranfenicol Dimetridazol Granja Cloranfenicol Dimetridazol
(mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)
1 ND ND 1 4.13 3.47
2 ND ND 2 13.2 4.87
3 ND ND 3 5.87 11.57
4 ND ND 4 22.23 14.43
5 ND ND 5 28.3 8.1
6 ND ND 6 13.8 3.53
7 ND ND 7 ND ND
8 ND ND 8 ND ND
9 ND ND 9 ND ND
10 ND ND
11 ND ND
ND=No Detectable
 TABLA 4
PROMEDIO DE LOS NIVELES DE RESIDUOS DETECTADOS DE CLORANFENICOL Y
DIMETRIDAZOL EN MUESTRAS DE RION DE CERDOS DE ACUERDO A LA REGION DE
PROCEDENCIA (CASOS POSITIVOS)
Cloranfenicol
(mg/kg)
Aragua
Carabobo 14.588 9.3202
ND=No Detectable
Segn Gema Carolina Maniglia en otros
pases como Canad, analizaron muestras de
tejidos recolectados en una sala de matanza,
encontraron en 31 de 279 cerdos muestreados
(11%), residuo de cloranfenicol en rangos desde 1
ppb hasta 5727 ppb. Vsquez y col. Detectaron en
un cuarto muestras de msculos, dos de rin y una
de hgado, niveles de cloranfenicol por encima de
la tolerancia segn la Norma Oficial Mexicana, la
cual es cero, siendo el valor registrado en rin de
cerdo de 0.018g/g. En Venezuela, el uso del
cloranfenicol est prohibido en las especies
animales (bovinos de carnes y de leches, ovinos)
cuyos productos estn destinados al consumo
humano (28).
El uso ilegal de estos frmacos pudiera
estar relacionado, entre otras variables, con el
desconocimiento por parte de los productores de
los efectos que para el consumidor final pueden
acarrear estos frmacos, que en algn tiempo
fueron de uso comn por su efectividad contra las
enfermedades respiratorias (cloranfenicol), y
contra la diarrea mucohemorragica que afecta a
cerdos de crecimiento y engorde conocida como
Disentera Porcina(Dimetridazol) antimicrobianos
que alguna vez fueron de primera eleccin para
combatir estos trastornos de salud en los lechones,
y quizs todava pudiera ser adquiridos en el
mercado por los granjeros (29). Esto confirma que
no existe una adecuada vigilancia toxicolgica con
relacin al manejo delos frmacos en las unidades
de produccin porcina, existiendo una distribucin
y venta irregular de estos productos para ser usados
en animales destinados al consumo humano que los
organismos reguladores oficiales en Venezuela no
estn llevando a cabo programas sistemticos de
vigilancia adecuados con deteccin de residuos en
los alimentos, lo que podra ocasionar, o estar
ocasionando efectos indeseables en la salud
humana causando un problema de salud pblica.
Dimetridazol
(mg/kg)
ND ND
7.6617 4.5544
CONCLUSIONES
Elena del Carmen Briceo-Fereira1*,
Jenner de Jess Guevara-Prez evidenciaron la
presencia de residuos de cloranfenicol y
dimetridazol, en 66.67% del total de granjas
evaluadas del estados Carabobo. El promedio de
los niveles detectados de residuos de cloranfenicol
en las muestras de rin de los cerdos fue superior
a las precedentes del estado de Aragua, donde no
fueron detectables. Elena del Carmen Briceo
observo que aquellas granjas donde se detect
residuos de cloranfenicol, fueron las mismas que se
evidencian residuos de dimetridazol. Los residuos
detectados de cloranfenicol y dimetridazol violan
las normas establecidas por las instituciones
nacionales e internaciones (Codex Alimentarius,
FAO/OMS, FDA, EMEA). TOMASZ
NIEGOCKI, ANDRZEJ POSYNIAK, AND JAN
MUDZKI desarrollaron el procedimiento
previsto para la determinacin de residuos de
cloranfenicol en la leche. La ventaja principal de
los dos mtodos fue que en el GC-MS/MS es
negativo ionizacin qumica es ms selecto de un
electrospray.
RECOMENDACIONES
Efectuar estudios similares en otras
regiones de importancia en productos porcina.
Fortalecer una poltica de control y
farmacovigilancia sistemtica por parte de las
autoridades zoosanitarias nacionales, que abarque
granjas, plantas productoras de alimentos
balanceados, mataderos industriales, industrias
farmacuticas y dems miembros de la cadena
agroindustrial que intervienen.
Analizar las muestras positivas mediantes el uso de
otros mtodos confirmatorios como el HPLC
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