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gametos f1 macho
gametos f1
1/2A 1/2a
hembra
F2:
1/4AA 2/4Aa 1/4aa (codominante)
3/4A- 1/4aa (A dominante)
F2: AA 1/4 Aa 2/4 aa 1/4 (codominante)
A- 3/4 aa 1/4 (A dominante)
No se puede distinguir AA o Aa
AA Aa aa AA Aa aa
Dominante Co-dominante
Tipos de marcadores genticos
1. Marcadores morfolgicos (Efecto combinado de
muchos genes y el ambiente).
1 2 M 1 2 M
Polimorfismo
Marcadores moleculares
Cualquier seal o traza molecular que nos permite estudiar un caracter
(Fenotipo) o gen (Genotipo) asociado a este, y de herencia mendeliana
(Marcador Gentico) y detectada como secuencias de ADN o protenas
Deteccin de variabilidad a nivel de secuencias de ADN.
Fuentes de origen de MM
1. ADN cromosmico (genmico)
ADN codificante
ADN no codificante
ADN altamente repetido
2. ADN extracromosmico
ADN mitocondrial
ADN de cloroplastos
AFLP RAPD SSR
Procedimientos Generales en el uso de MM:
1. Extraccin de DNA
2. Generacin de polimorfismo
Enzimas de restriccin
Reaccin PCR
Combinacin de los 2 anteriores (enzimas de
restriccin y PCR)
3. Electroforesis (horizontal, y/o vertical)
4. Deteccin de los fragmentos
Sondas marcadas
Bromuro de etidio, UV
Quimioluminiscencia
tincion en plata
5. Autoradiografa y/o fotografia
6. Evaluacin de los fragmentos
7. Anlisis estadstico
Aislamiento de DNA
Moler hojas
+ cloroformo Transferir sobrenadante
Eliminar isopropanol,
Disolver en H20, TE
DNA
Proteina/polisacaridos
CTAB
Pst I
ADN
Iniciadores (Primers): Es una secuencia corta de cido
desoxirribonucletido (ADN) que se ancla a una hebra del
ADN molde. El cual se requiere para la sntesis de ADN in
vitro (reaccin de polimerizacin), ya que la ADN polimerasa
solo no es capaz de iniciar la polimerizacin de ADN .
RAPD 10-mer Set A RAPD 10-mer Set B
Tube A-01 5'-CAGGCCCTTC-3' Tube B-01 5'-GTTTCGCTCC-3'
Tube A-02 5'-TGCCGAGCTG-3' Tube B-02 5'-TGATCCCTGG-3'
Tube A-03 5'-AGTCAGCCAC-3' Tube B-03 5'-CATCCCCCTG-3'
Tube A-04 5'-AATCGGGCTG-3' Tube B-04 5'-GGACTGGAGT-3'
Tube A-05 5'-AGGGGTCTTG-3' Tube B-05 5'-TGCGCCCTTC-3'
Tube A-06 5'-GGTCCCTGAC-3' Tube B-06 5'-TGCTCTGCCC-3'
Tube A-07 5'-GAAACGGGTG-3' Tube B-07 5'-GGTGACGCAG-3'
Tube A-08 5'-GTGACGTAGG-3' Tube B-08 5'-GTCCACACGG-3'
Tube A-09 5'-GGGTAACGCC-3' Tube B-09 5'-TGGGGGACTC-3'
Tube A-10 5'-GTGATCGCAG-3' Tube B-10 5'-CTGCTGGGAC-3'
Tube A-11 5'-CAATCGCCGT-3' Tube B-11 5'-GTAGACCCGT-3'
Tube A-12 5'-TCGGCGATAG-3' Tube B-12 5'-CCTTGACGCA-3'
Tube A-13 5'-CAGCACCCAC-3' Tube B-13 5'-TTCCCCCGCT-3'
Tube A-14 5'-TCTGTGCTGG-3' Tube B-14 5'-TCCGCTCTGG-3'
Tube A-15 5'-TTCCGAACCC-3' Tube B-15 5'-GGAGGGTGTT-3'
Tube A-16 5'-AGCCAGCGAA-3' Tube B-16 5'-TTTGCCCGGA-3'
Tube A-17 5'-GACCGCTTGT-3' Tube B-17 5'-AGGGAACGAG-3'
Tube A-18 5'-AGGTGACCGT-3' Tube B-18 5'-CCACAGCAGT-3'
Tube A-19 5'-CAAACGTCGG-3' Tube B-19 5'-ACCCCCGAAG-3'
Tube A-20 5'-GTTGCGATCC-3' Tube B-20 5'-GGACCCTTAC-3'
La reaccin en cadena de la Polimerasa (Polymerase
Chain Reaction - PCR): Es una tcnica in vitro de
amplificacin enzimtica del ADN. Mediante el cual
se obtiene millones de copias de secuencias
especficas del genoma de un organismo.
ciclos, consta de 3 pasos:
1. Denaturacin: es una denaturacin termal de la
muestra de ADN, a 94- 95C.
2. Anclaje de iniciadores (Renaturacin): la
temperatura de la mezcla es enfriada hasta los 35-
60C.
3. Sntesis (polimerizacin): La temperatura es elevada
a 70 - 85 C, la temperatura ptima (72C)
Los componentes de amplificacin para la reaccin
PCR son:
primers sintticos, que son regiones
complementarias a las cadenas opuestas
que flanquean a la regin de ADN blanco
que se desea amplificar.
Una secuencia blanco en una muestra de
ADN
Una enzima, la ADN Polimerasa
termoestable que pueda resistir altas
temperaturas de calentamiento (95 C a
ms).
Los cuatro deoxiribonucletidos (dNTPs).
Un buffer para darle las condiciones
adecuadas al sistema en conjunto.
2x-2x, x= nmero ciclos
Preparacin de gel para electroforesis
Electroforesis: Es el movimiento de una partcula cargada
(ion) en un campo elctrico. El movimiento se realiza en
medio lquido que est sostenida por sustancia slida inerte,
como papel o gel semislido.
Sistema de marcadores DNA
probe
*******
Basados en hibridacin DNA
RFLP, VNTR,
oligonucleotide fingerprinting
ATTAGTCTTACCTAGGAATCGATT
Basados en secuenciamiento TAATCAGAATGGATCCTTAGCTAA
EST, SNP,
DNA microarray
Alta resolucion:
Al nivel de par de bases
Baja resolucion:
Al nivel de fragmentos
de restriccion o
fragmentos amplificados
RFLP
RAPD
AFLP
SCAR
CAPS
SSR
i-SSR
RFLP
DNA genmico
Papel toalla
Electroforesis en
geles de agarosa Membrana
Gel
Esponja
Southern Blot
Perfil de polimorfismo
obtenido Hibridacin Membrana con
con sonda DNA transferido
RFLP
Esta tcnica se vale de la capacidad que tienen las enzimas de restriccin para
poder reconocer secuencias especificas a lo largo del genoma, de modo que una
mutacin puntual dentro del sitio de restriccin resultar en la prdida o ganancia
de una secuencia de reconocimiento, dando origen a un fragmento de restriccin
de diferente longitud a la del original.
Las mutaciones causadas por una insercin, delecin o inversiones en el DNA
tambin llevan a variacin en la longitud de los fragmentos de restriccin.
Los fragmentos del genoma generados por las enzimas de restriccin son
separados en un gel de agarosa para luego ser transferidos a un soporte slido
que puede ser una membrana de nylon o nitrocelulosa.
La transferencia de los fragmentos de DNA desde la matriz de agarosa hasta la
membrana se realiza por capilaridad.
Una vez que se encuentran en el soporte slido, el DNA digerido y separado,
puede ser hibridizado con una sonda (DNA de una sola hebra) que debe estar
marcada para su fcil deteccin.
La sonda se hibridar en el lugar donde encuentre la zona complementaria a su
secuencia. Para hacer visible el lugar donde se ha hibridado la sonda, sta debe
tener algn tipo de seal (marcaje)
Obtencin de marcadores
RFLP.
RAPD
Random Amplified
Polymorphic DNA
+
Los RAPDs son marcadores dominantes
A A 1 2 3
1
A a
2 AA Aa aa
a a
3
Ventajas
Requiere baja cantidad de DNA
Facil de obtener
Aplicabilidad a cualquier genoma
Bajo costo
Desventajas
Problemas de reproducibilidad
Presencia de homoplasia en las bandas
Nivel de informacin limitada debido a su
naturaleza dominante (no se puede diferenciar un
heterocigoto de un homocigoto, el locus se reduce
a un solo alelo)
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Reaccion PCR
Primers deben encontrar
secuencias
complementarias entre
200 2500 pb
Tincion (bromuro de
etidium)
RAPD
Reaccion PCR
Electroforesis
Tincin y visualizacin de los fragmentos de amplificaci
Polimorfismo con la
tcnica RAPD
AFLPs
Amplified Fragment
Length Polymorphism
Metodologa de obtencin de Marcadores AFLP
ADN Genmico
Eco RI Mse I
Digestin
Eco adapter Mse adapter
Ligacin
Eco primer
N
PCR1:Preamplificacin
N
Mse primer
Eco primer
Pcr2:Amplificacin NNN
selectiva
NNN
Mse primer
Electroforesis
Autoradiografa
Tincin Nitrato de plata
Principios de la tcnica AFLP
GAATTC TTAA
1. Digestin del
ADN Genmico
CTTAAG AATT
Eco RI Mse I
AATTCN NTTA
TTAAGN NAAT
Primer EcoRI+1(E+1): 5-GACTGCGTACCAATTCN Primer Msel+1 (M+1): 5-GATGAGTCCTGAGTAAN
5 T 3. Amplificacin preselectiva
AATTCN NTTA
TTAAGN NAAT
G 5
AATTCTNN NNCTTA
TTAAGANN NNGAAT
4. Amplificacin selectiva
5 TTG
AATTCTNN NNCTTA
TTAAGANN NNGAAT
AGG 5
AATTCTTG TCCTTA
TTAAGAAC AGGAAT
Polimorfismo en
Arracacha, segn la
combiancin de los
iniciadres E-AAC/M-CTT.
Ventajas
Reproducibles
Elevado nmero de bandas obtenidas por gel
No se necesita informacin previa para su
desarrollo (sondas o iniciadores especficos)
Desventajas
Microsatlites
STR - Short Tandem Repeat
STMS - Sequence Tagged Microsatelite Site
SSLP - Simple Sequence Length Polymorphism
Que son microsatlites?
Fragmentos de ADN formados por unidades repetitivas
de secuencia simple.
Estas unidades o motivos se componen de 1 a 6 pares
de bases y su grado de repeticin es relativamente bajo.
Se utilizan un par de iniciadores (20 pb aprox) para su
amplificacin
Microsatlite
......CAGCCCGTAAATGTATCCATCATTAGCTTTCGATAAAGACCATCT C TCTCTCTC TCT CTC TCTCTC T CT CTGTGAAACCCAGTTGAATTAGAATTTTGAATTT......
......GTCGGGCATTTACATAGGTAGTAATCGAAAGCTATTTCTGGTAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACACTTTGGGTCAACTTAATCTTAAAACTTAAA......
OBTENCION DE MICROSATELITES
http://www.personal.psu.edu/faculty/j/e/jec16/Image02.htm
Tipos de SSR
n, m y r = nmero de
Perfectos: (CA)n repeticiones del
Imperfectos: (CA)n CCA (CA)m motivo
Compuestas: (CA)n (TG)m
Compuesta interrumpido: (CA)n TG-(TG)m
Compleja: (CA)n TG-(TG)m (TA)r
1000 pb
1. Reaccin
PCR, con dos 100 pb
iniciadores F1 F2 F3 F4 F5
M P1 P2 1 2 3 4 5 6
stop 1 2 3
especificos para
4 5 6
7 8 9
Gene Amp enter 0 ce
IBT
un locus SSR
I I
I
II II
II
Huamani, 2008 III III
III
PCR en P1, 3 y 6 PCR en P2, 2 y 5 PCR en 1 y 4
DNA individuo 1 AT12
ATATATATATATATATATATATAT
Regin
Regin
conservada
Conservada
Iniciador 1
Iniciador 2
ATATATATATATATATAT
DNA individuo 2 AT9
Los SSR son marcadores codominantes
1
1 2 3 4 5
5
Extrategias de desarrollo de iniciadores SSR
Idiotipo
Biologia
Tecnologia
Mtodos de
Tiempo mejoramiento
Materiales Objetivos
Presupuesto
Contexto:
Agronomico
Industrial
Ganancia
Alimenticio
gentica
Poblaciones naturales, social
variedades nativas,
Fases sucesivas en la creacin de una
nueva variedad
1. Gestion de recursos genticos
2. Cambios en los genotipos
3. Seleccin (seleccin estabilizadora),
4. Multiplicacin del genotipo mejorado
Seleccin asistida por marcadores moleculares
Molecular assisted selection (MAS)
Es la seleccin indirecta por la presencia o
ausencia de un fenotipo o componente fenotpico
deseado, basado en la secuencia o patrones de
banda de los marcadores moleculares ubicadas
dentro o cerca de genes que controlan el fenotipo.
La secuencia polimorfico o patron de banda del
marcador molecular es indicativo de la presencia o
ausencia de un gen especfico o segmento
cromosomal que es conocido y que lleva un alelo
deseado.
Capel et al. (2000)
Molecular assisted selection (MAS)
Es la posibilidad de disponer de marcadores
ligadas a los genes implicados en la variacion de
los caracteres seleccionados.
MAS tiene los siguientes objetivos:
Dirigir las recombinaciones para acumular en
un mismo genotipo los genes o segmentos
cromosomicos favorables
Facilitar la seleccin (seleccin eficaz)
Aspectos a considerar en MAS
F1 AB
X duplicacion
X
F1xBB X X
X
X
BC1F1 F2 RIL DH
Retrocruza: BC1F1
Poblacion segregante filial 2: F2
Lineas endogamicas recombinantes: RILs
Lineas de haploides duplicados: DH
Determinacin del orden
Ejemplo: Par Frecuencia de
Recombinacin
---- -------------
A-B 0.1
B-C 0.1
A-C 0.2
A B C
+----------+----------+
<- 0.1 -> <- 0.1 ->
<- 0.2 ->
M1 M2 M3 M1 M3 M2 M2 M1 M3
33 Marcador 2
30 20 15 20 30 15
Gebhart (2004)
Determinacion de sexo en
plantas
Phoenix dactylifera L
Ubicacion taxonomica:
Family:Palmaceae
Sub-family: Coryphyoideae
Tribe:Phoeniceae
Genus: Phoenix
El genero Phoenix, presenta ~ 12 especies, incluida
CONVERTIR LOS MARCADORES AFLP A SCAR
Secuenciar el fragmento y elaborar iniciadores especificos
SCAR
Sequence-characterized amplified regions
Aplicaciones
Bsqueda de co-dominancia
Seleccin asistida
Anlisis de asociacin
Aplicabilidad de marcadores PVY-LB
para mejoramiento
Objectivos:
Identificacin de clones con el gen Ry adg y Rysto para
inmunidad a PVY.
Identificacin de clones con genes R dem o R blb o QTLs (que
gobiernen un alto porcentaje de la resistencia observada) para
resistencia rancha (tizn).
Material vegetal
Se analiz en total 61 clones, mas 5 controles:
36 clones avanzados resistentes y/o
tolerantes a TT y PVY:
poblacin B3
poblacin LTVR
hibridos somaticos
S. circaeifolium
S. phureja
Clon 618
x CIP-761030
(6b.25; 6b.39)
F1
plantulas (~300)
Extraccion de DNA
PCR (amplificacion del marcador de interes)
Electroforesis
Visualizacion de DNA
Evaluacion de polimorfismo (lectura de geles)
Caracterizacin de cultivares
Pureza gentica de cultivares
Identificacin de variedades