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Revista CENIC Ciencias Qumicas, Vol. 36, No. 2, 2005.

Validacin de un mtodo analtico por HPLC


para la cuantificacin del principio activo en tabletas
de Controfilina-200

Jiovanna Contreras Roura, Yunaysi Jardnes Leyva,* Magdalena Fonseca** y Belinda guila.**

Lab. Farmacocintica-HPLC, *Lab. Polmeros, Dpto. Polmeros, ** Lab. Analtica, Dpto. Procesos Biotecnolgicos, Centro
Nacional de Investigaciones Cientficas, Avenida 25 y 158, Cubanacn, Playa, Apartado Postal 6412 6414, Ciudad de La
Habana, Cuba.

Recibido: 19 de noviembre de 2003. Aceptado: 16 de septiembre de 2004.

Palabras clave: teofilina, acetaminofen, Controfilina-200, Cromatografa Lquida de Alta Resolucin, validacin.
Key words: theophylline, acetaminophen, Controfilina-200, HPLC & validation.

RESUMEN. Se presenta un mtodo analtico rpido y sencillo para la cuantifica- posterior aplicacin en la industria
cin de teofilina en tabletas de accin sostenida (Controfilina-200) por Cromato- farmacutica.
grafa Lquida de Alta Resolucin (HPLC). La fase mvil consisti en una mezcla El objetivo de este trabajo fue
acetonitrilo-agua destilada pH 4 (9 : 91) y deteccin a 273 nm . En este trabajo se presentar los resultados correspon-
presentan los resultados correspondientes a la especificidad, linealidad, exacti- dientes a la validacin del mtodo
tud, precisin (repetibilidad y precisin intermedia), estabilidad de la muestra y analtico. Los parmetros de valida-
robustez del mtodo. El mtodo desarrollado es lineal en el intervalo de con- cin evaluados fueron: especifici-
centracin seleccionado (50 a 120 % de la concentracin terica) con un coeficiente dad, linealidad, exactitud, precisin
de correlacin mayor a 0,999. Es exacto porque se obtuvieron porcentajes de reco-
(repetibilidad y precisin interme-
brado mayores al 90 %. Es preciso porque se obtuvieron coeficientes de variacin
dia), estabilidad de la muestra y ro-
menores al 1 %. Es robusto porque no es sensible a pequeas modificaciones. Es
especfico para la teofilina y se demostr adems, que las muestras permanecen
bustez.
estables durante 24 h . MATERIALES Y METODOS
Reactivos
ABSTRACT. A rapid and simplified high-performance liquid chromatographic Teofilina monohidratada (estndar
(HPLC) method is presented for the determination of theophylline in sustained
referencia del Centro de Investiga-
release tablets (Controfilina-200). The mobile phase consists of acetonitrile-dis-
ciones y Desarrollo de Medicamen-
tilled water pH 4 in the 9 : 91 (v/v) ratio. This paper presents specificity, linearity,
accuracy, precision, sample stability and ruggedness data. The calibration curve
tos, Ciudad de La Habana y aceta-
showed excellent linearity over the range of concentration examined (50-120 %). minofen (empleado como estndar
Correlation coefficient (r) of calibration curve was calculated 0.999. The method interno) (estndar referencia del
was precise because it found coefficients of variation less than 1 %. The assay Centro de Investigaciones y Desa-
recovery was more than 90 %. The stability of the sample during 24 h was good. rrollo de Medicamentos. Teofilina
The method is specific for theophylline. monohidratada (materia prima valo-
rada). Acetaminofen (materia prima
valorada). Tabletas Controfilina-200
(lote industrial, Laboratorios Medsol,
INTRODUCCION te discutible. Diferencias entre dis- Ciudad de La Habana). Aceto -
Cualquier mtodo analtico que tintas formas farmacuticas, tipo y nitrilo, cido actico glacial, cido
se desarrolle debe validarse, es de- calidad de las materias primas em- clorhdrico, hidrxido de sodio, pe-
cir, se debe confirmar y documen- pleadas por cada fabricante, hacen rxido de hidrgeno y sulfato de
tar que los resultados por l produ- necesario validar la metodologa cobre (reactivo, BDH). Agua desti-
cidos son confiables. Con relacin a para cada producto en particular. lada. Metanol comercial (bides-
los productos farmacuticos, los La valoracin de tabletas de tilado).
mtodos codificados en la USP 1 teofilina de accin sostenida no apa-
(Farmacopea de los Estados Unidos rece desarrollada en las ediciones Equipos
de Amrica) se consideran vlidos de la USP, solamente aparece para Balanza analtica Sartorius BP
y el nico requerimiento es el cum- cpsulas de accin sostenida. Debi- 221S (0,1 mg a 200 g; Germany). Ba-
plimiento de la prueba de adecua- do a esto, se desarroll un mtodo lanza analtica Mettler AT-250 (0,1 a
cin indicada en cada monografa. analtico por HPLC para la valora- 0,01 mg, Suiza). Potenciometro
Es importante destacar que la vali- cin de este tipo de formulacin, la Philips (PW 9420, The Netherlands).
dez de estos mtodos es ampliamen- cual, se requiere validar para su Estufa MEMMERT (25 a 200 oC, Ger-
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many). Cromatgrafo lquido equi- 20 mL . Se pipete 5 mL de la diso- analito de inters ni con el tiempo
pado con bomba isocrtica 2150 lucin filtrada y se transfirieron de retencin correspondiente al
LKB. Inyector Rheodyne 7725i (loop cuantitativamente a un volum- estndar interno.
20 L). Detector UV, Merck-Hitachi trico de 50 mL . Se enras con fase B) es capaz de detectar nica-
L-7400 acoplado a computadora. mvil. mente al analito o en su defecto,
Para la adquisicin y procesamien- separarlo de sus impurezas y(o) pro-
to de los cromatogramas, se emple Parmetros a validar. Procedi- ductos de degradacin, si aparecen
el programa EZChrom Chromato- miento estadstico de los resulta- durante la degradacin artificial.
graphy Data System Versin 6.7, dos y criterios de aceptacin para Linealidad
Konick Instruments, Inc. cada parmetro Se prepararon tres curvas de ca-
Especificidad libracin con cinco concentraciones
Condiciones cromatogrficas Para determinar la especifici- correspondientes al: 50, 80, 100, 120
Se emple como fase mvil una dad, se evalu la influencia de las y 150 % de la concentracin terica.
mezcla acetonitrilo-agua destilada sustancias auxiliares empleadas en Se analiz cada una tres veces y con
(9 : 91) y se ajust a pH 4 con cido la formulacin en la determinacin. los resultados, se realizaron los an-
actico glacial. Se emple una colum- Tambin se evalu la influencia de lisis siguientes: regresin lineal,
na Lichrospher 100 RP-18; 5 m, 125 posibles productos de degrada- prueba de linealidad y prueba de
X 4 mm (Merck). Se trabaj a un flu- cin del principio activo y(o) pla- proporcionalidad.
jo de 1 mL/min y se emple detec- cebo, correspondiente a la formula- El mtodo es lineal en el inter-
cin UV a 273 nm . cin, para lo cual, fueron sometidos valo de concentracin evaluado si se
a degradacin artificial. obtienen los resultados siguientes: 6-9
Programas de cmputo A) Evaluacin de la influencia Anlisis de regresin lineal: co-
En el procesamiento estadstico del placebo y(o) sustancias auxilia- eficiente de correlacin (r) 0,99
de los resultados se emplearon los res y de determinacin (r2) 0,98.
programas siguientes: Statistica 5.1, Para su determinacin, se pre- Prueba de linealidad: coeficien-
Excel y Statgraphics 5.0. par una muestra con una mezcla te de variacin de los factores res-
de las sustancias auxiliares emplea- puesta (CVf) 5 % y la desviacin
PARTE EXPERIMENTAL das en la elaboracin de las table- de la pendiente (Sb) < 2 %.
Procedimiento para la preparacin tas de Controfilina-200 en la misma Prueba de proporcionalidad: in-
de las muestras, disolucin de re- proporcin en que ellas se encuen- tercepto (a) no es significativa-
ferencia y disolucin del estndar tran en la tableta. La preparacin mente diferente de cero si texp.
interno para la valoracin del pro- de la muestra se realiz segn el ttabla [0,05, f (n 1)].
ducto terminado procedimiento descrito.
Preparacin de la disolucin de B) Degradacin artificial del Precisin
referencia (0,05 mg/mL) principio activo A) Repetibilidad
Se pesaron 50 mg de teofilina La teofilina es un frmaco muy Se prepararon cinco rplicas a
monohidratada y se transfirieron estable y no se conoce ningn com- las concentraciones correspondien-
cuantitativamente a un volumtrico puesto o producto de degradacin tes al 70, 100 y 115 % de la concen-
de 100 mL . Se aadieron 70 mL me- de l.2-5 Debido a esto, se someti la tracin terica. Se analiz tres ve-
tanol y se agit hasta completa di- materia prima y las tabletas; as ces cada una y el porcentaje de prin-
solucin. Se aadieron 4 mL de la como el placebo, a degradacin ar- cipio activo (PA) en las muestras se
disolucin correspondiente al es- tificial teniendo en cuenta los facto- determin a partir de la ecuacin si-
tndar interno y se enras con fase res siguientes: temperatura (100 oC, guiente (1):
mvil. Se pipetearon 5 mL de esta 10 d), luz solar (10 d), humedad re-
disolucin, se transfiri cuantitati- lativa (90 %, 10 d), hidrlisis cida Am Ps Bh Pp F
PA = 0,909
vamente a un volumtrico de 50 mL (HCL 1 mol/L, reflujo 1 h), hidrli- As Pm D
y se enras con fase mvil. sis bsica (NaOH 1 mol/L, reflujo
Preparacin de la disolucin del 1 h) y oxidacin (H2O2 1 %, 10 d). donde:
estndar interno (1 mg/mL) Todas las muestras fueron ana- Am relacin entre el rea corres-
Se pesaron 100 mg de acetami- lizadas por triplicado. Se registra- pondiente al analito y el estndar
nofen y se transfirieron cuantitati- ron todos los tiempos de retencin interno en las muestras.
vamente a un volumtrico de 100 mL . durante 10 min y se compararon As relacin entre el rea corres-
Se enras con metanol. con los correspondientes a la diso- pondiente al analito y el estndar in-
Preparacin de las muestras lucin de referencia. Las muestras terno en la disolucin de referencia.
Se determin el peso promedio degradadas tambin fueron evalua- Ps peso del patrn (mg).
de 20 tabletas y se trituraron para das empleando la Cromatografa de Bh base hidratada del patrn.
lograr homogeneidad. Se pes el Capa Delgada (CCD) reportada para Pp peso promedio (mg).
equivalente a 50 mg de teofilina la teofilina (materia prima) en la BP- Pm peso de la muestra (mg).
monohidratada, de polvo de tableta 98 y(o) BP-2000 con vistas a detec- D dosis (mg).
y se transfirieron cuantitativamen- tar si experiment degradacin por F factor de dilucin.
te a un volumtrico de 100 mL . Se alguna de las vas de degradacin Se realiz la prueba G con vistas
aadieron 70 mL metanol y se agit evaluadas. a determinar si existan diferencias
mecnicamente durante 5 min . Se El mtodo se considera espec- significativas entre las dispersiones
aadiern 4 mL de la disolucin co- fico si:6-9 obtenidas.
rrespondiente al estndar interno y A) no aparecen nuevas seales B) Precisin intermedia
se enras con fase mvil. Se dej en el cromatograma y(o) de apare- Para evaluar la precisin inter-
reposar durante 10 min . Se filtr la cer, no deben interferir con el tiem- media, participaron tres analistas
disolucin, desechando los primeros po de retencin correspondiente al que ejecutaron el procedimiento
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propuesto sobre la misma muestra Tabla 1. Factores a evaluar para determinar la robustez del mtodo.
en el mismo laboratorio durante
tres das consecutivos. Cada analis- Factores a evaluar Nivel alto (A, B, C) Nivel bajo (a, b, c)
ta prepar cuatro rplicas de la Fase mvil (pH) 5,0 4,0
muestra correspondiente al 100 %; Flujo (mL/min) 1,2 1,0
cada una de las cuales fue analiza-
das cada una tres veces. Para eva- Fase mvil (composicin) 9 % acetonitrilo 8 % acetonitrilo
luar si las concentraciones no in-
fluan en los resultados, se realiz
la prueba G para los obtenidos en
los diferentes das y analistas. centracin una vez preparada (tiem- ra interferir en la determinacin
El mtodo es preciso si todos los po 0) y almacenada a temperatura o cuantificacin del principio ac-
coeficientes de variacin (CV) 1,5 % ambiente durante el intervalo de tivo.
para cada nivel de concentracin y tiempo evaluado, es decir, si texp. ttabla en el estudio de degradacin arti-
si Gexp. Gtab. (0,05; f, m).6-9 (0,05; n 1) y(o) p > 0,05 (ANOVA). ficial de muestras correspondien-
te a la teofilina materia prima y
Exactitud Robustez tabletas hubo una disminucin
Para determinar la exactitud se Para determinar la robustez, se significativa en su concentracin
empleo el mtodo de los placebos prepar la muestra a la concentra- cuando fueron sometidas a oxi-
cargados. Para ello, se prepararon cin terica del 100 %, y se evalu dacin, hidrlisis bsica y cida.
cinco rplicas a las concentraciones la influencia de tres factores que pu- Para los otros factores evaluados,
de: 50, 75, 100 y 125 % de la terica y dieran incidir en los resultados (Ta- no hubo diferencias significati-
se analiz cada una tres veces. Se bla 1) empleando el diseo de You- vas en los resultados correspon-
realiz la prueba G con vistas a ve- den-Steiner.10 dientes a las muestras degrada-
rificar la no influencia del factor de Para decidir si un parmetro in- das y no degradadas.
concentracin y la prueba t Student flua significativamente sobre el las tabletas de Controfilina-200 se
(0,05; n 1) para verificar que no resultado, se compar la diferencia afectan a la temperatura de 100 oC .
existan diferencias significativas obtenida para el cambio efectuado Esta combinacin de sustancias
entre el porcentaje de recobrado sobre l con el producto de S (des- (teofilina, poviac y estearato de
promedio y el 100 % de recobrado. viacin estndar correspondiente al magnesio) a esa temperatura ori-
Tambin se realiz el anlisis de re- ensayo de precisin (repetibilidad) gina la formacin de producto(s) de
gresin lineal entre los porcentajes y la raz cuadrada de dos, es decir, si degradacin de caractersticas
de concentracin calculada contra ms polares (Rf = 0,31) que la
VX > Sx 2
los de concentracin aadidos. teofilina (0,40).
El mtodo es exacto si se obtie- existe diferencia significativa y vi- la hidrlisis cida (HCL 1 mol/L)
nen porcentajes de recobrados en- ceversa.10 De aparecer diferencias degrada la teofilina (materia pri-
tre un 98 y 102 %; si el coeficiente entre las variantes propuestas, se ma y tabletas de Controfilina-200)
de variacin total para el recobrado sealaran los factores que deberan a compuesto(s) de caractersticas
(CVRtotal) es 2 %; y si los resultados permanecer inalterados para obte- muy polares (Rf = 0,00).
del anlisis de regresin lineal cum- ner resultados satisfactorios con el debido a las variaciones obteni-
plen con los criterios de aceptacin mtodo analtico que se propona. das en la concentracin en algu-
para la linealidad.6-9 El mtodo analtico se conside- nas de las muestras sometidas a
ra robusto si la concentracin de la degradacin artificial y los resul-
Estabilidad de las muestras muestra no vara al analizarla intro- tados obtenidos en la CCD, se
Para su determinacin, se evalu duciendo pequeos cambios en el puede sospechar de la existencia
a la concentracin terica del 100 %. mtodo.6-10 de posibles productos de degra-
La muestra se analiz por triplica- dacin; con caractersticas muy
do, durante 24 h a diferentes inter- RESULTADOS Y DISCUSION polares que la teofilina (Rf < 0,40)
valos (0, 3, 6 y 24 h). El almacena- Especificidad y(o) que no absorban a la longi-
miento de las muestras se realiz a Los resultados en la evaluacin tud de onda de trabajo (273 nm)
la temperatura ambiente ( 25 oC). de la especificidad (Tabla 2 y 3) del que hace imposible su determi-
Se determin el porcentaje de prin- mtodo permiten afirmar que el nacin con el mtodo analtico
cipio activo para cada intervalo de analtico evaluado es especfico evaluado; quedando, por lo tan-
tiempo. Se realiz la prueba t para la teofilina, ya sea para mues- to, demostrado que el mtodo es
Student (0,05; n 1) para compro- tras sin degradar como para mues- especfico tambin para las mues-
bar si existan diferencias significa- tras degradadas. Por lo tanto, pue- tras degradadas.
tivas entre las concentraciones ob- de emplearse para la valoracin de
tenidas a las 3, 6 y 24 h con relacin las tabletas de Controfilina-200; as Linealidad
a la concentracin obtenida a tiem- como en los estudios de estabilidad. Los resultados (Tabla 4, 5 y figu-
po 0 h y(o) anlisis de varianza De acuerdo con los resultados se ra 1) permiten afirmar que el mtodo
(ANOVA) para verificar que no exis- puede afirmar que: es lineal en el intervalo de concentra-
tan diferencias significativas en la el mtodo es especfico para la cin evaluado porque se obtuvieron
concentracin de las muestras du- cuantificacin de la teofilina en coeficientes de correlacin (r) 0,99
rante el intervalo de tiempo evalua- polvo de tableta (Controfilina- y coeficientes de determinacin (r2)
do. 200) porque las sustancias auxi- 0,98. Los interceptos no fueron
Las muestras permanecen esta- liares (poviac y estearato de significativamente diferentes de
bles durante 24 h si no aparecen magnesio) no aportan ninguna cero y el coeficiente de variacin
cambios significativos en su con- seal cromatogrfica que pudie- total de los factores de respuesta
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(CVf) 5 % y la desviacin estndar se obtuvo un coeficiente de variacin contra el aadido, se cumpli con
de la pendiente (Sb) < 2 %. total (CVtotal) 2 %; y adems, la prue- los criterios de aceptacin para la
ba de Cochram demostr que no exis- linealidad.
Precisin ten diferencias significativas entre La figura 2 muestra los resulta-
A) Repetibilidad. las dispersiones obtenidas en porcen- dos del anlisis de la regresin lineal
El mtodo analtico cumple con taje de contenido de concentracin. de los porcentajes de concentracin
el criterio de aceptacin correspon- calculado contra los de concentra-
diente a la repetibilidad, porque Exactitud cin aadida. La ecuacin de la rec-
para los tres niveles de concentra- Los resultados (Tabla 8 y figura 2) ta obtenida fue
cin evaluados, se obtuvieron coefi- permiten afirmar que el mtodo es
y = 1,000 x + 0,104
cientes de variacin (CV) 1,5 % (Ta- exacto porque se obtuvieron por-
bla 6). centajes de recobrados del 99 % (% con un coeficiente de correlacin (r)
B) Precisin intermedia. R = 98 a 102 %) para cada nivel de de 0,999 y un coeficiente de deter-
Los resultados indican (Tabla 7) concentracin y el coeficiente de minacin (r2) de 0,999. El intercepto
que el mtodo es preciso, indepen- variacin total recobrado fue 0,16 % de la recta no fue significativamen-
dientemente del da en que se rea- (CVRtotal 2). Adems, al evaluar es- te diferente de cero (texp= 0,50 ttabla
lice el anlisis y de la experiencia tadsticamente el grfico de porcen- (0,05,3) = 3,182) y pendiente no sig-
del analista que lo ejecute; porque taje de principio activo calculado nificativa de uno.

Tabla 2. Resultados correspondientes al estudio de especificidad del mtodo (Anlisis cualitativo).

Observaciones HPLC CCD


tr (min), (n = 3) Rf
tr1 tr2 tr3 RfTEO. Rfx
Influencia Blanco
placebo Disolucin referencia 3,49 0,05 4,42 0,08
Placebo
Blanco
Muestras Materia prima 3,53 0,00 4,52 0,00 0,41
sin degradar Tableta 3,53 0,00 4,52 0,00 0,39
Placebo 0,96
Blanco
Termlisis Materia prima 3,51 0,01 4,46 0,01 0,41
Tableta 3,50 0,00 4,45 0,00 0,40 0,31
Placebo 0,96
Humedad Blanco
relativa Materia prima 3,53 0,00 4,52 0,00 0,41
(90 %) Tableta 3,53 0,00 4,50 0,00 0,39
Placebo 0,94
Blanco
Fotlisis Materia prima 3,52 0,00 4,49 0,01 0,41
(luz solar) Tableta 3,52 0,00 4,50 0,00 0,39
Placebo 0,94
Blanco
Hidrlisis Materia prima 3,48 0,00 4,40 0,00 0,40 0,00
cida Tableta 3,47 0,00 4,40 0,00 0,39 0,00
Placebo
Blanco 6,76 0,00
Hidrlisis Materia prima 3,48 0,01 4,39 0,01 6,76 0,00 0,39
bsica Tableta 3,48 0,00 4,40 0,00 6,76 0,00 0,39
Placebo 6,76 0,00
Blanco
Oxidacin Materia prima 3,47 0,00 4,38 0,00 0,39
Tableta 3,47 0,00 4,38 0,00 0,39
Placebo

tr Tiempo de retencin. tr 1 Acetominofen (estndar interno). tr2 Teofilina monohidratada (analito). Rf Factor de retencin.
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Tabla 3. Resultados correspondientes al estudio de especificidad del mtodo


(anlisis cuantitativo).

Degradacin artificial C (%)


Materia prima Controfilina-200
Humedad relativa (90 %) 97,06 102,06
Luz solar 97,65 103,60
Termlisis (100 oC) 107,65 94,33
Hidrlisis cida (HCL 1 mol/L) 65,88 73,19
Hidrlisis bsica (NaOH 1 mol/L) 46,47 51,03
Oxidacin (H2O2 1 %) 35,29 31,96
Muestras sin degradar 98,23 100,01

Tabla 4. Resultados anlisis de regresin lineal y de la prueba de proporcionalidad.

Magnitud Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva promedio


r 0,999 0,999 0,999 0,999
r2
0,999 0,999 0,999 0,998
a 0,015 0,010 0,012 0,006
texp. t (0,05; 3) 2,23 3,18 1,33 3,18 1,48 3,18 0,95 3,18
Significin intercepto NS NS NS NS
b 0,009 9 0,009 6 0,010 0 0,009 9
Sb 0,000 1 0,000 1 0,000 1 0,000 1

r Coeficiente de correlacin. r2 Coeficiente de determinacin. a Intercepto. b Pendiente. Sb Desviacin estndar de la


pendiente. NS No significativo.

Tabla 5. Resultados de la prueba de linealidad.

Magnitud f
Curva
1 2 3
XS 0,009 7 0,000 1 0,009 8 0,000 1 0,009 9 0,000 2
texp. ttabla (0,05; 4) 0,87 2,78 1,31 2,78 1,76 2,78
p > 0,05 no signif. p = 0,41 p = 0,23 p = 0,11
CVf (%) 1,34 0,86 1,89
Xtotal S 0,009 8 0,000 2
CVtotal (%) 1,54

f Factores respuesta. X Media. S Desviacin estndar. CVf Coeficiente de variacin de los factores
respuesta.

Estabilidad de las muestras Robustez puede ser empleado para la valora-


Los resultados (Tabla 9) del es- Los resultados (Tabla 10 y 11) cin del principio activo en las ta-
tudio de estabilidad de las mues- permiten afirmar que el mtodo es bletas de Controfilina-200; as como
tras permiten afirmar que estas robusto porque en los cuatro ensa- en los estudios de estabilidad de las
permanecen estables durante 24 h yos realizados no se encontraron tabletas. Es lineal, preciso y exacto
a temperatura ambiente; porque diferencias para cada parmetro en los intervalos de concentracin
no aparecieron cambios significa- evaluado. evaluados y cumple con los crite-
tivos en la concentracin de la rios de aceptacin establecidos
muestra. Este resultado es impor- CONCLUSIONES para estos parmetros. El estudio
tante para la Industria Farmacu- El mtodo analtico propuesto de estabilidad de las muestras de-
tica, donde el nmero de muestras para la cuantificacin del principio mostr que permanecen estables
a analizar es muy grande y el in- activo en las tabletas de teofilina de durante 24 h. Es robusto porque no
tervalo de tiempo transcurrido accin sostenida (Controfilina-200) es sensible a pequeos cambios o
entre el primer anlisis y el lti- es especfico para muestras degra- modificaciones en el mtodo, que
mo es grande. dadas y sin degradar; por lo que pudieran surgir de imprevisto.
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2
y = 0,010 x - 0,006 , r = 0,999 , r = 0,999
1,6

1,4

1,2

1,0
R

0,8

0,6

Regression
0,4
45 55 65 75 85 95 105 115 125 135 145 155 95% confid.

Concentracin (%)

Fig. 1. Curva de calibracin promedio (n = 3) obtenida en la determinacin de la linealidad del mtodo.

Tabla 6. Resultados de la repetibilidad del mtodo.

Estadgrafos Nivel bajo Nivel medio Nivel alto


70 % 100 % 115 %
XS 70,68 0,69 101,80 0,68 117,30 0,60
S2 0,47 0,46 0,36
CV (%) 0,97 0,67 0,51
Gexp. Gtabla (0,05; 4,3) 0,36 0,63

X Media. S Desviacin estndar. S 2 Varianza. CV Coeficiente de variacin (%).

Tabla 7. Resultados correspondientes a la precisin intermedia.

Das 100 (%) (n = 4) Estadgrafos


Analista (n = 12)
1 2 3
1 99,96 0,57 100,24 0,57 99,41 0,30 X = 99,87 0,57
CV(%) = 0,58
2 99,81 0,50 99,51 0,00 99,40 0,25 X = 99,57 0,34
CV(%) = 0,34
3 99,50 0,02 100,05 0,03 100,14 0,19 X = 99,90 0,31
CV(%) = 0,31
Estadgrafos X = 99,76 0,44 X = 99,93 0,44 X = 99,65 0,43 Xtotal = 99,78 0,44
(n = 12) CV(%) = 0,44 CV(%) = 0,44 CV(%) = 0,43 CVtotal = 0,44
Gexp. (d) = 0,60 Gexp. (analistas) = 0,32 Gtabla (0,05; 11,3) = 0,60

X Media desviacin estndar. CV Coeficiente de variacin (%).

AGRADECIMIENTOS sion, Easton: Mack Printing, 1420- 5. Connors K.A. Chemical Stability of
A Elsa Daz, Juan Luis Bentez, 1421, 2002. Pharmaceuticals. A Handbook for
Mireya Lpez, Alberto Suzarte, 2. Martindale W. The Complete Drug Ref- Pharmacists. Second edition, New
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San Miguel, Marquiza Sabln y Car-
1100-1105, 1999. de Mtodos Analticos. Sesin Catalana
men Fonticella por la colaboracin 3. Farmacia Prctica de Remigton. de la Asociacin Espaola de Farma-
y asesora brindada, que hicieron Segunda Edicin en Espaol. Edicin cuticos de la Industria, Comisin de
posible la realizacin del trabajo. Revolucionaria, 1423-1428, 1974. Normas de Buena Fabricacin y Con-
BIBLIOGRAFIA 4. Clarke S. Isolation and Identification trol de la Calidad, 1-94, 1989.
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States of America, Twenty-Fifth Revi- 1986. nities. CPMP Working Party on Qual-
79
Revista CENIC Ciencias Qumicas, Vol. 36, No. 2, 2005.

Tabla 8. Resultados correspondientes a la exactitud.

Estadgrafos Porcentaje adicionado


50 75 100 125
Xcalc. S 49,70 0,45 74,68 0,31 99,55 0,57 124,75 0,25
IC [49,02 - 50,38] [73,72 - 75,39] [98,55 - 100,55] [124,20 - 125,30]
Xrecob. S 99,39 0,89 99,57 0,42 99,55 0,57 99,80 0,20
IC [98,05 - 100,73] [98,61 - 100,53] [98,55 - 100,55] [99,36 - 100,24]
texp. calc. t (0,05,4) 1,51 2,77 2,29 2,77 1,76 2,77 2,18 2,77
S2recob. 0,80 0,17 0,32 0,04
CVrecob. (%) 0,90 0,42 0,57 0,20
Gexp. recob. = 0,60 Gtabla (0,05; 4,4) = 0,63
Xtotal recob. (%) = 99,58 0,17 CVtotal recob. (%) = 0,16

Xcalc. Media % calculado. S Desviacin estndar. Xrecob. Media % recobrado. S2recob. Varianza del recobrado.
CVrecob. Coeficiente de variacin recobrado. X total recob. Media total recobrado. CVtotal recob. Coeficiente de varia-
cin total recobrado. IC Intervalo de confianza.

2
y = 1,000 x + 0,104 , r = 0,999 , r = 0,999
129

109
Concentracin calculada (%)

89

69

Regression
49
48 58 68 78 88 98 108 118 128 95% confid.

Concentracin aadida (%)

Fig. 2. Grfico correspondiente a la evaluacin de la exactitud del mtodo.

Tabla 9. Resultados de la estabilidad de las muestras.

n 100 %
0 3 6 24
(h)
1 99,95 99,95 99,95 99,95
2 100,97 100,00 99,98 101,99
3 100,97 100,01 99,95 101,99
X 100,63 99,99 99,96 101,31
S 0,59 0,032 0,017 1,18
CV (%) 0,59 0,032 0,017 1,16
texp. ttabla (0,05; 2) 1,89 4,30 1,97 4,30 0,89 4,30
p (> 0,05) n.s. p = 0,13 p = 0,12 p = 0,42
p (p > 0,05) n.s. 0,18

X Media. S Desviacin estndar. p Probabilidad. n.s No significativo.

80
Revista CENIC Ciencias Qumicas, Vol. 36, No. 2, 2005.

Tabla 10. Resultados de la robustez. Tabla 11. Diferencias calculadas para


cada parmetro.
n Ensayo
Parmetro Diferencia
1 2 3 4
Fase mvil (pH) 0,00
1 100,01 100,01 100,01 100,01
Flujo 0,00
2 99,04 100,01 99,04 100,01
Fase mvil (composicin) 0,00
3 100,01 99,04 100,01 99,04
XS 100,01 0,56 100,01 0,56 100,01 0,56 100,01 0,56
CV (%) 0,56 0,56 0,56 0,56
Procedures: Methodology., Interna-
X Media. S Desviacin estndar. CV Coeficiente de variacin. tional Conference on Harmonization
(ICH), 281, 1-9, 1995.
10. Quattrocchi O.A ., Abelaira de
Andrizzi S.I., Laba R.F. Introduccin
ity of Medicinal Products, Note for Validation of Analytical Procedures: a la HPLC: Aplicacin y prctica. Ed.
Guidance for Analytical Validation, Definitions and Terminology Availabil- Buenos Aires, Argentina, Captulo 12,
August, 1989. ity; Notice. Federal Register, Vol. 60, No. 301-328, 1992.
8. Commission of the European Commu- 40, March, 11259-11262, 1995.
nities (CPMP). International Confer- 9. Commission of the European Commu-
ence on Harmonization; Guideline on nities (CPMP). Validation of Analytical

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