A cromatografia liquida de alta eficincia (CLAE) o mais novo e importante membro

de uma famlia inteira de tcnicas de separao. O seu emprego em vrios laboratrios

considerado atualmente indispensvel. Vrios nomes tm sido utilizados para denominar
esta nova tcnica e cromatografia liquida: alta velocidade, alta presso alto desempenho,
alta resoluo e alta eficincia. O nome mais aceito, utilizado em portugus
cromatografia de alta eficincia. A CLAE utiliza instrumentos muito sofisticados que
podem ser totalmente automatizados. um tipo de cromatografia liquida que emprega
pequenas colunas, recheadas de matrias especialmente preparados e uma fase mvel que
eluida sob altas presses. Ela tem capacidade de realizar separaes e anlises
quantitativas de uma grande quantidade de compostos presente em vrios tipos de
amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e
sensibilidade.
Somente a partir dos anos 70 se conseguiu um avano considervel de cromatografia
liquida moderna que at ento era considerada subdesenvolvida, apesar de que um dos
primeiros experimentos sobre a cromatografia, no incio do sculo, foi do tipo que hoje
chamada de cromatografia liquida clssica. O avano foi gradual e atingiu o atual nvel
de sofisticao que a CLAE apresenta, devido ao revolucionrio desenvolvimento
tecnolgico da pratica deste tipo de cromatografia.
Desde 1968 tornou-se possvel rechear colunas com partculas de pequeno tamanho,
necessrias para alta resoluo e, tambm, adquirir equipamentos que funcionam nas altas
presses necessrias para obter uma boa velocidade na eluio.
Nos ltimos dozes anos ocorreu o desenvolvimento de vrios detectores
espectrofotomtrico que operam em comprimentos de onda varivel at 190 nm e houve
um aumento a utilizao dos detectores por fluorescncia, eletroqumicos e por influncia
induzida por laser, bem como acoplamento com o espectrmetro de massas. Com estes
tornou-se possvel a deteco da maioria compostos e a anlise de traos em a ostras
complexas, como sangue, unira, solo, alimentos, petrleo, etc. Recentes
desenvolvimentos em instrumentao controlada por microprocessadores tambm tem
trazido grandes melhoras na eficincia dos equipamentos. Hoje em dia so comuns
estudos com partculas pequenas, a execuo da CLAE com fase reserva e,
particularmente, o uso de equipamentos para uma perfeita eluio com o gradiente, bem
como de mtodos especiais, tais como a formao de pares inicos. Como resultado,
dificuldades anteriores ou separaes impossveis de compostos como corantes polares,
ismeros, drogas bsicas e seus metabolitos so agora uma mera rotina.
Atualmente, a CLAE ainda objeto de novos avanos que nos faz prever em que o futuro
muito prximo o seu emprego ser ainda mais amplo, com uso analtico de colunas com
microdimentro ou ainda a utilizao de colunas enorme (30 x 50 cm) que separam at
quilogramas da amostra.

Cromatografia liquida de alta eficincia e cromatografia liquida clssica

Figura 1 ilustra as diferenas entre cromatografia liquida de alta eficincia (CLAE) e
cromatografia liquida clssica (CLC)

Na CLC o recheio da coluna utilizado geralmente uma vez s, porque parte da amostra
usualmente se adsorve de uma forma irreversvel. O enchimento da coluna (etapa 1 da
figura 1) deve ser repetido para cada separao e isto representa um desperdcio enorme
de material e mo de obra. A aplicao da amostra da CLC (etapa 2), para ser feita
corretamente, requer alguma habilidade e tempo por parte do operador. A vazo de
eluente na CLC (etapa 3) promovida pela ao da gravidade e as fraes individuais da
amostra so coletadas manualmente ou atravs de um detector de fraes. Desde que as
fraes. Desde que as separaes tpicas com CLC requerem vrias horas, o tempo gasto
nesta operao tedioso. Deteco e qualificao (etapa 4) so realizadas por analises
manual das fraes, individualmente. Normalmente, o numer de fraes coletadas muito
grande e seu processamento requer muito tempo e esforo. Em geral, se emprega alguma
tcnica auxiliar, tal como, espectrofotometria, ou anlise qumica, ou, simplesmente, um
registro gravimtrico, para dosar cada um dos componentes da amostra nas fraes
coletadas. Finalmente, os resultados so registrados em forma de um cromatograma
(etapa 5): um grfico de concentrao da amostra versus o nmero da frao.
Na CLAE emprega-se uma coluna fechada, reaproveitvel (etapa 1 da figura 1); portanto,
at centenas de separaes individuais podem ser realizadas com a mesma coluna, se bem
que em alguns casos necessrio regener-la aps algumas separaes. Desde que o custo
de uma coluna individual pode ser distribudo por um grande nmero de amostras,
possvel utilizar colunas com recheios de alta resoluo, porm, mais caros e necessitando
mais tempo em um enchimento cuidadoso da coluna para obter melhores resultados. Estas
colunas so muito mais eficazes, mas oferecem uma grande resistncia a vazo da fase
mvel, ou seja, ele sofre uma grande perda de carga. Por esta razo necessrio empregar
sistemas e bomba de alta presso (at 400 bars) que fazem a fase mvel migrar a uma
velocidade razovel atravs da coluna. A vazo da fase mvel (etapa 3) controlada
facilmente, resultando em operaes mais reprodutveis, que tornam a analises executadas
pela CLAE mais precisas. Uma injeo precisa da amostra (etapa 2) conseguida
rapidamente, usando uma microsseringa (para injeo com presso de at 50 bar) ou uma
vlvula de injeo (para injeo a alta presso). Vrios tipos de detectores, que podem ser
colocados na sada da coluna (etapa 4), proporcionam um registro continuo da
composio do efluente. O que permite obter um cromatograma similar aos obtidos em
cromatografia gasosa e que se utiliza para identificar e quantificar os componentes das
amostras.
Separaes repetitivas, isto, separaes feitas rotineiramente pela CLAE, podem ser
reduzidas a uma injeo da amostra e anotaes dos dados finais, mesmo que a fase mvel
precise ser trocada para cada nova aplicao. Sendo assim, a CLAE mais conveniente e
menos depende do operador do que a CLC. A deteco continua e com grande
reprodutibilidade na CLAE eleva ambas analises, qualitativas e quantitativas, a um alto
nvel de exatido e preciso. A anlise quantitativa pela CLAE pode atingir uma preciso
superior a +/- 0,5%. Finalmente, separaes em escala preparativa de miligramas de
amostras so relativamente fceis. As mltiplas vantagens da CLAE fizeram desta tcnica
analtica uma das mais procuradas atualmente.

Cromatografia gasosa e cromatografia liquida de alta frequncia

Atualmente, a cromatografia gasosa (CG) uma tcnica amplamente difundida e mais

utilizada do que a CLAE. Tendo em vista o nmero de pessoas familiarizadas com ela,
conveniente compar-la com a CLAE. As principais caractersticas de ambas as tcnicas
esto resumidas na tabela 2. Na CG necessrio que a amostra seja suficiente voltil, a
fim de que possa passar atravs da coluna na forma de vapor, e estvel termicamente para
no se decompor nas condies da separao. Pode-se aumentar a sua volatilidade,
aumentando a temperatura de trabalho, que em o seu limite mximo pratico de
aproximadamente 400C devido a fase estacionaria, detectores, etc. Por isso somente os
gases e cerca de 20% dos compostos orgnicos conhecidos podem ser analisados por CG,
sem modificaes nas estruturas dos compostos para aumentar a sua volatilidade.
Figura 2.

Independente da limitao da volatilidade ou estabilidade trmica a CLAE requer

somente que a amostra seja solvel na fase mvel. Assim, a CLAE um mtodo ideal
para a separao de espcies inicas ou macromolculas de interesse biolgico e produtos
naturais lbeis bem como uma imensa variedade de outros compostos de alta massa
molecular e/ou baixa estabilidade trmica (tabela 3).

Tabela 3.
 Separaes difceis so, frequentemente, desenvolvidas mais facilmente pela CLAE do
que pela CG sendo que a CLAE:
Possui duas fases cromatogrficas de interao seletiva com as molculas da
amostra, versus somente uma em CG.
Possui uma maior variedade em possveis mecanismos de separao.
Permite a separao de compostos termicamente instveis a baixas temperaturas.
Os mtodos de deteco utilizados em CG so mais rpidos e sensveis, a aparelhagem
mais fcil de ser manipuladas e em geral mais barata. A CLAE no to sensvel e nem
to rpida, mas seu campo de aplicao mais amplo enquanto o instrumento
consideravelmente mais caro. No obstante, possvel prever que, conforme aumente o
volume de vendas, reduzir-se-o os custos.
Conclui-se que realmente no existem competies entre CLAE e a CG, porque estas
duas tcnicas se complementam e geralmente analisam diferentes tipos de amostra.

As vantagens e as limitaes da CLAE

Como toda tcnica, a CLAE tem algumas limitaes as quais, junto com as suas vantagens
e alguns comentrios, so citados na tabela 4. Examinando de uma maneira geral, nota-
se que as limitaes da CLAE no tm impedido o aproveitamento adequado de suas
vantagens e por isso, a tcnica tem sido cada vez mais empregada.
Tabela 4

As tcnicas da CLAE

H cinco tipos diferentes de fases estacionarias, que implicam em cinco mecanismos

diferentes de realizar a CLAE. Mediante a simples troca de coluna e fases mvel
possvel utilizar cada um deles.
Vrios problemas em separao por cromatografia podem ser resolvidos por mais de um
mtodo. Outros podem somente ser tratados por mtodo especifico. A seguir sero citadas
algumas noes gerais sobre os mecanismos da CLAE e as classes de compostos onde
eles so mais empregados; para problemas mais especficos a literatura deve ser
consultada.

Cromatografia liquido - solido ou por adsoro

O mecanismo de separao da cromatografia liquido-solido (CLS), ou por adsoro, se

baseia na competio que existe entre molculas da amostra e as da fase mvel em ocupar
os stios ativos na superfcie de um solido (fase estacionaria). O equilbrio :
 Para que a molcula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionaria, primeiro uma
molcula da fase mvel deve ser deslocada da superfcie. Se se assumir que o adsorvente
possui uma superfcie polar (por ex.: slica ou alumnio), grupos apolares (por ex.:
hidrocarbonetos) tero pouca afinidade por esta superfcie e no iro deslocar a molcula
da fase mvel; por isso, no sero retidos. Grupos funcionais polares capazes de forma
pontes de hidrognio tero fortes afinidades pela superfcie e sero fortemente retidos.
Molculas polarizveis (por ex.: molculas aromticas) iro apresentar interaes dipolo
induzido-dipolo com a superfcie do adsorvente e, portanto, tambm sero retidas; o grau
de reteno depende da polarizao de cada molcula ou grupo funcional.
importante que as partculas da fase estacionaria apresentem uma grande rea de
superfcie, isto , um grande numero de stios ativos. A atividade da superfcie de muitos
slidos (incluindo a slica alumina) se encontra com frequncia afet5ada epla reteno de
certas molculas de alta polaridade, como lcoois, fenis, agua, etc. e, devido a eles, em
determinadas ocasies, difcil reproduzir s resultados obtidos nas analises, porque as
propriedades da superfcie sofrem mudanas. Em consequncia, a superfcie da slica
empregada na CLAE habitualmente submetida a determinados processos de desativao
com o propsito de diminuir a reteno de molculas muito polares e, assim, se mantem
a superfcie em condies uniformes, o que contribuir para melhorar a reprodutibilidade
das anlises.
Muitas vezes, devido a uma forte adsoro ou reteno de alguns componentes da amostra
no sdio ativo, necessrio aumentar a polaridade da fase mvel de uma maneira
constante e uniforme, como o que se consegue um incremento da solubilidade dos
componentes da amostra na fase mvel. A esta variao d-se o nome de aluio por
gradiente ou programao da fase mvel.
Devido a vasta literatura em cromatografia em camada delgada, cujos resultados podem
ser transferidos quase diretamente para a CLS, possvel prever as retenes da amostra
nesta coluna. Por causa da simplicidade e flexibilidade da cromatografia em camada
delgada, muitas vezes mais conveniente, para estabelecer a melhor combinao de fase
estacionaria e fase mvel, usar esta tcnica antes e transferir as condies de separao
para a CLAE, onde pode ser utilizada a sua maior eficincia.
Compostos diferentes em tipo qumico ou nmero de grupos funcionais so facilmente
separados por CLS; por exemplo, cidos graxos, lcoois, alcaloides, aminas,
antioxidantes, barbitricos, corantes, esteroides, fenis, lipdeos, vitaminas, etc.

Cromatografia liquido-liquido ou por partio

A cromatografia liquido-liquido (CLL) foi desenvolvida por MARTIN e SYNGE em

1941 para separao de vrios aminocidos, usando uma fase estacionaria de agua em
slica e clorofrmio como fase mvel. O mecanismo de separao neste tipo de
cromatografia, ou mecanismo de distribuio como tambm chamado, baseia-se nas
diferentes solubilidades eu apresentam os componentes da amostra na fase mvel e na
fase estacionaria. Ento, os componentes mais solveis na fase estacionariam so
seletivamente retidos por ela, enquanto os menos solveis so transportados mais
rapidamente pela fase mvel.
A CLL utilizada para compostos levemente polares, cujas massas moleculares so
inferiores a 200. O maior inconveniente desta tcnica e a solubilidade da fase estacionaria
na fase mvel, o que rapidamente deterioraria a coluna, levando a no reprodutivamente
nas separaes repetitivas. Isto pode ser resolvido de duas maneiras. A primeira
saturando a fase mvel com a fase estacionaria por meio de uma pr-coluna, colocada
antes do injetor, que contenha uma alta percentagem da fase estacionaria. A segunda
utilizando materiais que contenham a fase estacionaria quimicamente ligada a um suporte
solido, tcnica a ser descrita na prxima seo. Esta segunda maneira que possibilita a
execuo de uma programao da fase mvel.

Caractersticas das fases moveis usadas em CLAE

As principais caractersticas que deve apresentar toda fase mvel para ser til na CLAE
so:
Ser de alto grau de pureza ou de fcil purificao
Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes
No decompor ou dissolver a fase estacionaria
Ter baixa viscosidade
Ser compatvel com o tipo de detector utilizado
Ter polaridade adequada para permitir uma separao conveniente dos
componentes da amostra.

A fase mvel deve ter alta pureza, como um solvente de grau cromatogrfico, permitindo
realizar anlise de alta sensibilidade com detectores por fluorescncia ou por absorbncia
no ultravioleta, onde as impurezas da fase mvel podem absorver e diminuir a
sensibilidade do detector para os componentes da amostra. Quando possvel, escolher
uma fase mvel de fcil purificao que permita a aquisio de solventes com menor grau
de pureza e, consequentemente, de menor custo.
importante que a amostra seja solvel na fase mvel e no sofra decomposio, para
que possa ser transportada atravs da coluna sem que seus componentes se modifiquem.
Quando possvel, o solvente da amostra a prpria fase mvel ou um dos seus
componentes, para que ela no sofra precipitao no injetor ou na coluna, o que provocara
queda de resoluo na separao.
Quando se utilizar cromatografia liquido-liquido, a fase mvel pode dissolver a fase
estacionaria. Para ver isto, satura-se a fase mvel com a fase estacionaria atravs de algum
tratamento antes de sua introduo no equipamento ou mediante o uso de uma pre-coluna
cheia de algum suporte solido contendo uma alta porcentagem da mesma fase estacionaria
liquida. Por esta pr-coluna faz-se passar a fase mvel entes dela entrar no injetor e. assim,
quem perde a fase estacionaria a pr-coluna.

Caractersticas das fases estacionarias usadas em CLAE

Alumina, celulose, slica gel e zeolita, que so os materiais usados tradicionalmente na

cromatografia liquida clssica, so muito pouco usadas na CLAE por que as suas
partculas tm forma irregular, so muito grandes e dificilmente se consegue reproduzir
os resultados da analise devido a facilidade que estes materiais apresentam em mudar as
suas propriedades.
A CLAE os matrias ideais so aqueles que, em menor tempo possvel, tem a mxima
capacidade de amostra, do a melhor resoluo na separao da mistura, so de fcil
introduo na coluna, produzem pequena queda de presso e que sejam de baixo custo.
Estes materiais ideias ainda no existem ainda e, em determinadas circunstancias, se
justifica sacrifica algumas vantagens para se conseguir outras. As dimenses das
partculas dos materiais empregados so pequenas e muitas vezes estas partculas tem
forma regular que contribui para uniformidade do enchimento da coluna. Uma outra
caracterstica da partcula, que tambm importante para uniformidade, e a de ter uma
faixa de variao de dimetros bem pequena. Alguns destes materiais so completamente
porosos e outros peliculares (superficialmente porosos), ambos podendo conter fases
quimicamente ligadas a sua superfcie.
Considerando as suas propriedades fsicas, os recheios para a CLAE podem ser
classificados de acordo com os seguintes aspectos.
Solidos rgidos, semi-rigidos ou no rgidos
Partculas porosas ou peculiares
Partculas esfricas ou irregulares
Partculas com diferentes dimetros

Detectores usados em CLAE

Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para a CLAE, baseando-se em uma
destas solues. Um detector ideal para a CLAE seria aquele com as seguintes
caractersticas:

Alta sensibilidade e baixo limite de deteco

Resposta rpida a todos os solutos
Insensibilidade a mudanas na temperatura e na vazo da fase mvel
Resposta independente da fase mvel
Pequena contribuio ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do
detector
Resposta que aumente linearmente com a quantidade de soluto
No destruio do soluto
Segurana e convenincia para uso
Informao qualitativa do pico desejado
Infelizmente, no existe um detector que apresente todas estas propriedades, a no ser que
seja desenvolvido.