Tipos de tinciones (tincin gram)

Hola a todos, estos das os voy a explicar las tcnicas de tincin ms utilizadas en los
laboratorios de nalisis clnicos en el rea de microbiologa empezamos con la tincin
GRAM.

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la

desarroll en 1844.

La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio

bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su
utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio
de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana
(cocos,bacilos,positivos,negativos, etc) se basan justamente en la tincin de GRAM.

Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con

calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada
durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol
etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg.
Lavar y secar.

Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo
no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos
morfologicos distintos de bacterias).

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las

diferencias contitutivas en la estructura de su pared. La pared de la clula bacteriana
sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica.
El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La
pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas
de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared
de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por
otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est
rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y
lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano.

Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias

fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con
algn detalle la tincin de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el
porqu de su funcionamiento.

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de
cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para
quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas
como las gramnegativas, estn teidas de azul.

El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El

ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2
entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De
nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la
misma situacin.

Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona,

sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos
(grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La
diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la
decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de
bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y
disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la
membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de
peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se
decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas
(tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste
deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las
molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro
de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava
azules, pero las gramnegativas son incoloras.

Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de

contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina
bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas,
mientras que las grampositivas permanecen azules.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por
s solo tiene poca afinidad con las clulas.

2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las
clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un
clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.

3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo

cristal violeta - yodo.

El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos

organismos son ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir,
unas veces grampositivos y otras gramnegativos.
1 INTRODUCCIN

2 PAREDES DE LAS EUBACTERIAS

2.1 EL PEPTIDOGLUCANO: COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA

2.1.1 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA BSICAS DEL

PEPTIDOGLUCANO

2.1.2 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS

2.1.3 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM-POSITIVAS

2.2 RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIN EN EL

PEPTIDOGLUCANO

2.3 OTROS COMPONENTES DE LA PARED CELULAR DE BACTERIAS

GRAM-POSITIVAS: LA MATRIZ

2.4 PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS CIDO ALCOHOL

RESISTENTES

2.5 LA PARED DE BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS

2.5.1 LA MEMBRANA EXTERNA DE BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS

2.5.1.1 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA

EXTERNA

2.5.1.1.1 Fosfolpidos (FL)

2.5.1.1.2 Lipopolisacrido (LPS)

2.5.1.1.3 La lipoprotena (LPP, lipoprotena de Braun)

2.5.1.1.4 Protenas de la membrana externa

2.5.1.2 PAPELES Y FUNCIONES DE LA MEMBRANA EXTERNA

2.5.2 EL ESPACIO PERIPLSMICO

3 PAREDES DE LAS ARQUEAS

BIBLIOGRAFA
1 INTRODUCCIN

La mayor parte de los procariotas posee una pared celular (P.C.) rgida rodeando al
protoplasto. Las excepciones son los micoplasmas (dentro del dominio Bacteria) y algunas
arqueas, como Thermoplasma.

Al microscopio electrnico se puede observar como una capa en ntimo contacto con la
membrana citoplsmica, con un espesor que oscila entre 10 y 80 nm (segn especies) -frente a
los 8 nm de la membrana celular- , y con una estructura ms o menos compleja, segn los
tipos bacterianos.

a) Las paredes celulares ms frecuentes en eubacterias siguen dos modelos alternativos

que, como veremos comparten un componente comn: paredes de tipo Gram-positivo
o de tipo Gram-negativo.

b) Unas pocas eubacterias (como las del gn. Planctomyces) poseen paredes a base de
protenas.

c) Las Arqueas poseen paredes diferentes a las de eubacterias y se pueden agrupar en

diversos tipos.

El grueso de este captulo est dedicado al estudio de las paredes Gram-positivas y Gram-
negativas, con sus principales variantes, pero finalizaremos con una alusin a los principales
modelos de paredes arqueanas.

Aunque el alumno realizar en prcticas de labororatorio la tincin de Gram, vamos a

explicarla aqu brevemente. La tincin de Gram es la ms importante entre las tinciones
llamadas diferenciales (aquellas que no tien de la misma manera a todos los tipos de
bacterias). Resumiendo, esta tincin consta de varios pasos:

1. Imaginemos un frotis
en porta de vidrio con
una muestra de varios
tipos de bacterias, que
se han fijado por calor.
En la primera fase, esta
preparacin de trata
con un primer colorante
llamado violeta cristal o
violeta de genciana.

2. A continuacin se
aade una solucin de
lugol (yodo-ioduro), que
acta como
mordiente, formando
 una laca relativamente
resistente con el
violeta. En este
momento todas las
bacterias estn teidas
de color violeta.
3. Ahora realizamos una
descoloracin
diferencial con etanol o
una mezcla de etanol y
acetona. Lo que ocurre
es que algunas
bacterias (las que
llamaremos Gram-
negativas) pierden el
color violeta (quedaran
prctimante
transparentes al
microscopio), mientras
que otras (las Gram-
positivas) resisten el
tratamiento, y retienen
el colorante violeta.

4. Finalmente, tratamos
el porta con un
segundo colorante
(colorante de
contraste): se trata de
un colorante de color
rojo o rosa, como la
fucsina o la safranina.
Este colorante tie
ahora a las bacterias
previamente
descoloradas por el
etanol. Por lo tanto, el
resultado en la
observacin al
microscopio es que las
bacterias Gram-
positivas se ven de
color violeta, y las
Gram-negativas de
color rosa o rojo.
Como veremos enseguida, esta diferencia de comportamiento ante la tincin de Gram refleja
el hecho de que ambos tipos de eubacterias poseen dos tipos estructuralmente diferentes de
pared celular, aunque ambas posean en comn la posesin de peptidoglucano. A continuacin
estudiaremos con cierto detalle la pared celular de eubacterias.

2 PAREDES DE LAS EUBACTERIAS

Consisten en un
esqueleto macromolecular
rgido, llamado
peptidoglucano (=
mucopptido o murena), que

en Gram-positivas se
encuentra inmerso en
una matriz aninica de
polmeros azucarados;
y en Gram-negativas est
rodeada por una
membrana externa, e
inmersa en un espacio
periplsmico.

Comenzaremos abordando esa macrolcula tan peculiar llamada peptidoglucano, para

despus estudiar globalmente y por separado la pared de Gram-positivas y Gram-negativas,
con algunas variantes que se pueden presentar.

2.1 EL PEPTIDOGLUCANO: COMPOSICIN QUMICA Y

ESTRUCTURA

En las bacterias Gram-positivas el peptidoglucano representa el componente

mayoritario de la pared celular (50-80% en peso), mientras que en Gram-negativas supone
slo del 1 al 10%.

2.1.1 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA BSICAS DEL

PEPTIDOGLUCANO

Est formado por repeticiones de una unidad disacardica fundamental unida a su vez a
un tetrapptido. Distintas cadenas (formadas por el esqueleto de azcares) se unen entre s
por determinados enlaces peptdicos entre tetraptidos de cadenas diferentes. Veamos todo
ello en su concrecin qumica:

La unidad disacardica repetitiva: consiste en N-acetilglucosamina (NAG) unida por enlace

(14) a N-acetilmurmico (NAM). Obsrvese que el NAM es el 3-O-D-lactil-ter de la NAG (o
sea, se deriva de unir el cido D-lctico con el OH del C-3 de la NAG).
 Las distintas unidades disacardicas se van uniendo entre s por enlaces (14) entre el
NAM de una unidad y la NAG de la siguiente. Este enlace es susceptible a la rotura catalizada
por el enzima lisozima. El nmero de repeticiones (n) puede oscilar entre 10 y 100.

La cadena tetrapeptdica: Desde el grupo carboxilo de cada cido NAM, y mediante un enlace
amido, se encuentra unido el tetrapptido. Un tetrapptido tpico de muchas bacterias es:

L-alanina---D-glutmico---meso-diaminopimlico---D-alanina

Obsrvese la alternancia de aminocidos D y L en el tetrapptido.

La estructura global: Las distintas cadenas polisacardicas, con sus respectivos tetrapptidos,
se unen entre s por medio de puentes o enlaces peptdicos, entre un aminocido de una
cadena (p. ej., el aminocido n3, como el meso-DAP del ejemplo) y otro aminocido de una
cadena adyacente (la D-ala terminal). De este modo, la estructura global es una sola
macromolcula gigante que envuelve al protoplasto, formando un sculo rgido, a modo de
tejido continuo, que tiene el volumen y la forma de la bacteria respectiva.
 En bacterias Gram-negativas este sculo est formado por una sola capa (o unas
pocas) de cadenas de PG.
En Gram-positivas existen varias capas (hay varios niveles de PG).

A continuacin describiremos por separado el PG de Gram-positivas y Gram-negativas,

dando indicaciones de sus principales variantes.

2.1.2 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM-

NEGATIVAS

En la mayor parte de Gram-negativas el peptidoglucano corresponde a la composicin y

estructura que acabamos de describir. Sin embargo, en las espiroquetas, el diaminocido en
posicin 3, en vez de ser meso-DAP, est sustituido por la L-ornitina (que tambin es un
diaminocido).

El enlace entre cadenas polisacardicas se realiza normalmente mediante unin

peptdica directa entre el grupo carboxilo de la D-ala terminal y el grupo -amino del meso-
DAP. Ahora bien, en este enlace participan solamente el 50% de los tetrapptidos. Los dems
pptidos no participan en enlaces, y entre estos ltimos se encuentran incluso dipptidos y
tripptidos.

El resultado es una capa simple de PG (de 1 nm de espesor), a modo de malla floja, y con
grandes poros (los huecos dejados por las zonas donde no hay enlace peptdicos). Ello
explica el comportamiento de las bacterias Gram-negativas en la tincin de Gram: al aadir el
alcohol, se produce una deshidratacin que tiende a contraer la estructura del PG, pero los
poros son grandes y por ellos sale el primer colorante (el violeta de genciana). El ulterior
tratamiento de la preparacin con el colorante de contraste (fuchsina o safranina) tie a estas
bacterias de rojo.
2.1.3 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM-POSITIVAS

Es ms variado que el de Gram-negativas, sobre todo en funcin de ciertas variantes en

la composicin del tetrapptido y del tipo de enlaces entre los tetrapptidos.

Variantes en composicin del tetrapptido:

En bacterias Corineformes:

el grupo -CO- en a del D-glu (2) puede estar amidado o unido a una glicina
(Gly);
el aa (1) puede ser Gly o L-Ser, en lugar de la L-ala;
el hidroxilo en 6 del NAM puede estar acetilado, lo que hace que el PG de estas
bacterias sea resistente a la lisozima.
Muchas bacterias Gram-positivas carecen de meso-DAP (3), y en su lugar
puede existir:

LL-DAP
L-diaminobutrico (DAB)
L-lisina
L-homoserina
L-ornitina
Modalidades de uniones interpeptdicas:

enlace directo entre la D-ala(4) y el -NH2 libre del diaminocido en (3)

enlace D-ala(4)--X--diaminocido(3), donde X representa un puente, que puede
consistir en:

un solo aminocido: L-ala, o D-iso-Asn

un pptido corto:

{L-ala--L-ala}
{L-ala}3
{L-ala}3 -- L-ornitina
{Gly}5
enlace D-ala(4) ---{mismo tetrapptido}--- diaminocido (3)
enlace entre D-ala(4) y el D-glu(2) (y no el aa en 3), por medio de un pptido en
el que debe de existir obligatoriamente un diaminocido (p. ej., D-lys, D-
ornitina).

Desde el punto de vista estructural, el PG de Gram-positivas se caracteriza por la

existencia de mltiples capas, existiendo entrecruzamientos tanto entre cadenas adyacentes
en el mismo nivel como entre niveles distintos. El resultado es una red tridimensional gruesa
(hasta 50 capas en algunos Bacillus), y ms compacta que en Gram-negativas. De todas formas,
el grado de compacidad vara entre especies, y depende de:

n de NAM que contengan tetraptidos que participen en entrecruzamientos;

longitud del puente peptdico
Ello condiciona a su vez la intensidad de la gram-positividad en la tincin de Gram.

2.2 RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIN EN EL

PEPTIDOGLUCANO

La arquitectura molecular del sculo de murena est an sujeta a debate. Sin embargo,
uno de los modelos recientes ms aceptado se podra resumir de la siguiente manera:

Los resultados de difraccin de rayos X parecen indicar que las unidades

disacardicas de las cadenas estn giradas unas respecto de otras, formando una
estructura helicoidal de orden 4 o 5. A resultas de ello, los pptidos protruyen
alternativamente: hacia arriba, a la izquierda, hacia abajo, a la derecha, y vuelta a
empezar, etc. Esta organizacin permite que una cadena de PG se pueda unir con
cadenas cercanas de su mismo nivel, as como con cadenas por encima y por
debajo de su nivel, formando un perfecto entramado tridimensional (al menos en las
Gram-positivas).
La orientacin de las cadenas azucaradas en relacin con la superficie celular an
est debatida. Parece que se disponen casi paralelas a la superficie celular, con
una tendencia a una forma espiral por encima de la membrana citoplsmica. Si
consideramos una bacteria de forma bacilar, esta espiral cerrada se dispone
siguiendo el permetro circular (y no siguiendo el eje longitudinal). Los grupos
tetrapeptdicos salen perpendicularmente de los NAM, en sentido vertical hacia la
membrana. Sin embargo, cuando dos tetraptidos de un nivel se unen entre s,
forman un puente casi horizontal, formando ngulos de unos 90o repecto de los
esqueletos carbonados, y siguiendo el eje longitudinal de la clula.

Esta estructura confiere una serie de importantes propiedades:

1) Gran rigidez, que contrarresta las fuerzas osmticas a que est sometido el protoplasto
(aguanta presiones de unas 5 a 15 atmsferas). Esta rigidez depende de:

a) el grado de entrecruzamiento;

b) el hecho de que el enlace (1 4) es muy compacto. La alternancia regular entre

anillos piransicos de NAG y de NAM genera uno de los polisacridos ms estables
desde el punto de vista termodinmico, que recuerda en su estilo a la quitina y a la
celulosa;

c) la alternancia en el tetrapptido, de aminocidos en configuraciones D y L supone una

factor adicional que confiere an ms fuerza estructural, y adems permite que todas
las cadenas laterales de estos aminocidos se dispongan hacia el mismo lado,
facilitando la formacin de puentes de H.

2) Pero, al mismo tiempo, la estructura permite una notable flexibilidad. Ello colabora, junto
con su rigidez, a soportar variaciones amplias de la tensin osmtica del protoplasto.
3) Condiciona la forma celular. Aunque la qumica del PG, por s misma, no determina la
forma, es su disposicin espacial la responsable principal de esta forma.

2.3 OTROS COMPONENTES DE LA PARED CELULAR DE

BACTERIAS GRAM-POSITIVAS: LA MATRIZ

Como ya dijimos, el PG de las bacterias Gram-positivas se encuentra inmerso en una

matriz, que puede representar hasta el 50% del peso de la pared celular, y que est constituida
por largos polmeros denominados cidos teicoicos, pudiendo existir tambin (o en su lugar)
los cidos teicurnicos y los lipoteicoicos. Estos componentes llegan a sobresalir de la
superficie celular y suministran especificidad antignica.

cidos teicoicos:

Estn presentes en muchas bacterias Gram-positivas, pero no en todas. Son polmeros

de hasta 30 unidades de glicerol-fosfato o ribitol-fosfato, unidas entre s por enlaces
fosfodister, en los que la mayora de los grupos -OH estn sustituidos por -H, azcares,
aminoazcares o D-alanina.

Los cidos teicoicos estn unidos covalentemente al peptidoglucano, concretamente al -

OH en posicin 6 del NAM, a travs de una unidad de enlace, variable segn las especies. (Por
ejemplo, en una especie de Micrococcus, el elemento de enlace consiste en {glicerol-P}3 --NAG-
P).

cidos teicurnicos:

Ciertas bacterias Gram-positivas, cuando se someten a un rgimen de limitacin de

fosfato son incapaces de sintetizar cidos teicoicos, pero en su lugar producen cidos
teicurnicos. Los teicurnicos consisten en polmeros aninicos formados por la alternancia de
cidos urnicos (que tienen grupos -COOH libres) y aminozcares como la N-acetil-
galactosamina.
cidos lipoteicoicos:

Estn presentes en todas las bacterias Gram-positivas, aun en condiciones de carencia

de fosfato. Se trata simplemente de cidos glicerol-teicoicos que se encuentran unidos a la
membrana citoplsmica, concretamente se unen por enlace fosfodister con glucolpidos de
membrana, mientras que el otro extremo de la cadena queda expuesto al exterior.

En Streptococcus pyogenes las cadenas de lipoteicoicos se encuentran asociadas con la

llamada protena M, originando una microfibrillas que sobresalen notablemente hacia el
exterior celular (observables a microscopio electrnico), y que facilitan la unin a las clulas de
animales en que parasitan estas bacterias.

Funciones de los polmeros de la matriz:

Parece ser que su papel principal es suministrar una carga neta negativa a la pared
celular, lo que permite captar cationes divalentes (p. ej., Mg++), que a su vez se
necesitan para muchas actividades enzimticas de la membrana citoplsmica o del
espacio periplsmico, que participan de la morfognesis y divisin de la pared
celular.
Como ya dijimos, los cidos teicoicos y teicurnicos son buenos antgenos. Cuando
no estn cubiertos por estructuras ms externas (como cpsulas), constituyen el
antgeno somtico O de las bacterias Gram-positivas.
Finalmente, en algunas bacterias, sumistran, junto con el PG, receptores
especficos para la adsorcin de ciertos bacterifagos.

2.4 PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS CIDO ALCOHOL

RESISTENTES

Determinadas bacterias Gram-positivas (corineformes, Nocardia y, en especial

Mycobacterium) presentan una pared celular muy compleja, con abundancia de lpidos (algo
excepcional entre las Gram-positivas).

Estas bacterias no se tien con los colorantes normales, pero una vez que se han teido
con fucsina (forzando mediante calentamiento de la preparacin), tienen resistencia a
decolorarse por una mezcla de cido clorhdrico al 3% en etanol de 96o. Por ello se denominan
como bacterias cido-alcohol resistentes. Esta propiedad depende esencialmente de la
presencia, en su pared celular de unos lpidos llamados cidos miclicos.

Qumicamente, esta pared celular consiste en un esqueleto formado por dos tipos de
polmeros, unidos covalentemente entre s:

un peptidoglucano especial (la diferencia ms importante es que en vez de N-acetil

murmico existe N-glucolil-murmico);
un arabinogalactano de gran peso molecular.
Ambos polmeros se encuentran enlazados a travs de fosfodister entre una
unidad de murmico y una de las arabinosas. Pero a su vez, este esqueleto se une
covalentemente a los cidos miclicos.
 Los cidos miclicos son -hidroxicidos grasos ramificados en a , cuya
longitud de cadena es grande (desde C78 a C91 en Mycobacterium). Estn unidos al
esqueleto de la P.C. de forma uniforme, a travs de enlaces con los -OH en 5 de las
unidades de arabinosa.

Por lo tanto, el esqueleto de la P.C. de estas bacterias consiste en:

peptidoglucano---arabinogalactano---cidos miclicos.

Pero aparte de este esqueleto complejo, la P.C. de las bacterias cido-alcohol

resistentes exhibe una variedad de lpidos:

1) Glucolpidos:

a) Micolatos de trehalosa: dos unidades de trehalosa unidas entre s por enlace

(11), y en donde los grupos 6 y 6 estn unidos con cidos miclicos.
Constituyen el llamado factor de crecimiento en cuerdas, debido a que son
responsables de la agregacin de los individuos bacterianos en forma de
cuerdas.

b) Sulfolpidos de trehalosa: estn localizados en la periferia de la P.C., y

parecen ser impartantes factores de virulencia. En Mycobacterium
tuberculosis (el bacilo de la tuberculosis) estos sulfolpidos de trehalosa
funcionan como evasinas, es decir, facilitan el que la bacteria escape a la
accin de los macrfagos inhibiendo la fusin del fagosoma con el lisosoma, lo
cual puede explicar el hecho de que estosmicroorganismos tengan xito como
parsitos intracelulares.

c) Micsidos: Localizados en la periferia, consisten en la unin por enlace ster

entre cidos miclicos y azcares (incluyendo cidos urnicos, desoxiosas,
aminozcares, etc.).

2) Ceras: Unin de cidos miclicos con ftioceroles (alcoholes ramificados de alto

peso molecular: C30 - C34).

El alto contenido en lpidos confiere una serie de propiedades a estas bacterias (aparte
de la cido-alcohol resistencia ya citada):

aspecto y consistencia crea de sus colonias;

crecen formando grumos en medios lquidos;
gran impermeabilidad de la P.C., que a su vez condiciona una gran resistencia a la
desecacin y gran resistencia a sustancias antibacterianas (detergentes, oxidantes,
cidos, bases, etc).

2.5 LA PARED DE BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS

La pared de las bacterias Gram-negativas es estructuralmente ms compleja que la de

Gram-positivas, cosa que se puede comprobar al observar un corte transversal al microscopio
electrnico: por encima de la membrana citoplsmica y hasta el exterior se pueden apreciar 5
capas, alternndose las claras (L2, L5) y las oscuras (ms densas a los electrones: L1, L3, L4).

La capa densa L4 corresponde al peptidoglucano (ya estudiado), que se encuentra

inmerso en la capa clara L5, que consiste en un espacio periplsmico, limitado entre la
membrana citoplsmica y una membrana externa. La delgada capa de peptidoglucano no
constituye ms del 5-10% de la pared. A continuacin estudiaremos la peculiar membrana
externa de las bacterias Gram-negativas y el espacio periplsmico.

2.5.1 LA MEMBRANA EXTERNA DE BACTERIAS GRAM-

NEGATIVAS

Se trata de una estructura de bicapa lipdica exclusiva de las bacterias Gram-negativas.

Como otras bicapas lipdicas, consta de una doble capa de lpidos, junto con protenas de
matriz (estas ltimas atravesando total o parcialmente la bicapa). Por supuesto, en la bicapa
lipdica, los grupos polares quedan hacia afuera, mientras que los hidrfobos tienden al
interior.

Ahora bien, la composicin qumica y la disposicin de los elementos de esta membrana

externa son muy distintos a los de una membrana tpica:

la bicapa es altamente asimtrica:

en la capa externa existe un 60% de protenas y un 40% de una macromolcula
exclusiva de esta membrana externa: el lipopolisacrido (LPS);
en la capa interna no hay LPS, existiendo fosfolpidos (FL), lipoprotenas (LPP) y
otras protenas.

El conjunto es un mosaico fluido que permite el desplazamiento lateral de los fosfolpidos, del
LPS, y de las protenas, pero no de las lipoprotenas unidas covalentemente al peptidoglucano.
Sin embargo, esta fluidez es menor que la de la membrana citoplsmica.

2.5.1.1 COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA

EXTERNA

La membrana externa se encuentra unida con el peptidoglucano subyacente a travs de

distintos componentes y tipos de enlaces:

enlaces inicos, mediados por cationes divalentes, entre distintas protenas de la

membrana externa y el PG;
enlaces hidrfobos entre fosfolpidos y protenas de la capa interior de la
membrana externa con el PG;
enlaces covalentes entre algunas molculas de lipoprotena y el PG.

Parece ser que la membrana externa est en contacto directo con la plasmtica en numerosos
puntos, denominados zonas de adhesin. Puede que se trate de regiones en las que produzca
una autntica fusin entre estos dos tipos de membrana, facilitando quiz el transporte de
ciertas sustancias desde el exterior al interior celular.
Estudiaremos a continuacin los componentes de la membrana externa, aludiendo a su
composicin qumica, estructura y funciones.

2.5.1.1.1 Fosfolpidos (FL)

Se localizan en la lmina interna de la m. ext. La composicin en fosfolpidos es similar a

la de la membrana citoplsmica, con un ligero enriquecimiento en fosfatidil-etanolamina.

2.5.1.1.2 Lipopolisacrido (LPS)

Se trata de una macromolcula exclusiva de la lmina externa de la membrana externa

de bacterias Gram-negativas, responsable de muchas de las propiedades biolgicas de estas
bacterias. Se le conoce tambin con el nombre de endotoxina (toxina termoestable, no
difusible). Se trata de un glucolpido complejo, que podemos considerar compuesto de tres
regiones o dominios:

lpido A, que es la porcin ms proximal, y de carcter hidrofbico;

regin intermedia, llamada oligosacrido medular;
regin distal (cadena lateral especfica, polisacardica) a base de repeticiones de
unos pocos azcares. Es de carcter hidroflico y constituye el antgeno somtico
O de las 6bacterias Gram-negativas.

i) El lpido A: esta regin es prcticamente idntica en todas las bacterias Gram-negativas.

Consiste en un disacrido formado por dos unidades de glucosamina unidas por enlace
(16), pero donde todos los grupos -OH (menos uno) y -NH2 estn sustituidos (unidos a otras
molculas): Obsrvese que

existen 5 (a veces 6) cidos grasos, todos ellos saturados, con predominio de -

hidroximirstico (un cido graso C14).
El -OH original en 4 est sustituido por arabinosamina-fosfato.
El -OH en 1 est sustituido por fosforil-etanolamina (a veces pirofosforil-
etanolamina).

ii) El oligosacrido medular (tambin llamado corazn o ncleo): se une al lpido A a travs del
-OH en 3. Se pueden considerar dos fracciones:

la fraccin del ncleo interno, a base de dos tipos de azcares exclusivos de Gram-
negativas: 2-ceto-3-desoxioctnico (KDO) y L-glicero-D-manoheptosa (Hep). Alguna
de las Hep y alguno de los KDO pueden a su vez estar unidos a fosforil-etanolamina
(o pirofosforil-etanolamina). Esta regin es muy rica en grupos cargados,
especialmente con carga negativa (de los fosfatos y KDO).
La fraccin del ncleo externo est constituida a base de hexosas (glucosa,
galactosa, NAG, y a veces algunas hexosas ms raras).

iii) Cadena lateral especfica: polisacrido repetitivo, que se proyecta hacia el exterior celular,
y que constituye el Ag somtico O de bacterias Gram-negativas. Consiste en la repeticin
(hasta 40 veces) de unidades tri-, tetra- o pentasacardicas (en estos dos ltimos casos uno de
los azcares de cada repeticin queda lateral respecto del esqueleto lineal que forman los
dems).

De todas estas regiones del LPS la nica indispensable para la viabilidad es el lpido A.
Los mutantes incapaces de sintetizar las cadenas laterales o el oligosacrido medular dan
colonias rugosas y estn afectados en distintas propiedades biolgicas, pero pueden
sobrevivir.

PAPELES Y FUNCIONES DEL LPS

1. Papel estructural: el LPS es el componente esencial de la membrana externa. La

porcin hidrofbica (las cadenas de cidos grasos del lpido A) se proyectan hacia el
interior de esta membrana. Precisamente es la estructura del lpido A la principal
responsable de la menor fluidez de dicha membrana, y por lo tanto de la mayor
resistencia fsica. (Obsrvese que, mientras cualquier fosfolpido tiene dos cadenas de
cido graso, el lpido A posee 5 o 6, todas ellas unidas al mismo disacrido, generando
una molcula ms masiva.).

2. A su vez, la propiedad anterior hace que sea menos soluble a detergentes y ms

resistente a disolventes orgnicos.

3. Es menos permeable a muchas molculas hidrofbicas, incluyendo antibiticos,

debido a las largas cadenas laterales hidroflicas.

4. Se une a cationes divalentes (como Mg++ o Zn++), lo que contribuye a la mayor

estabilidad de la membrana externa. Esta presencia de cationes suministra un
ambiente adecuado para muchas funciones de la P.C. (Si aadimos un agente
quelante como el EDTA, o eliminamos el Mg++ y lo sustituimos por Ca++, se produce la
desorganizacin de la membrana externa).

5. Como ya dijimos, el LPS constituye la endotoxina de las bacterias Gram-negativas. La

funcin como endotoxina se debe a la regin del lpido A. Sus propiedades como
endotoxina estn en el origen de muchos sntomas patolgicos propiciados por
patgenos Gram-negativos:

a. pirogenicidad (induccin de fiebre)

 b. hipotensin

c. en casos graves, choque letal, por fallo cardaco

d. actividad necrtica de tejidos.

6. Pero igualmente, tiene efectos beneficiosos: estimula una serie de mecanismos

defensivos del hospedador, incluyendo la activacin del complemento, que puede
ocasionar la lisis de la bacteria, mejora las propiedades de los fagocitos, etc. Es decir, a
pesar del nombre de endotoxina, el LPS no es intrnsecamente txico, sino que su
efecto depende de la respuesta del hospedador. El macrfago es la clula del
hospedador principal responsable de la mediacin de los efectos del LPS, tanto los
positivos como los negativos. El macrfago posee receptores de membrana para
detectar el LPS bacteriano, y en respuesta a l, libera una serie de molculas
mediadoras (citoquinas) que actan a su vez sobre diversas partes del sistema
inmunitario. De hecho, los efectos negativos se deben a comportamientos
incontrolados desencadenados en el propio sistema inmunitario.

7. El LPS, y concretamente las cadenas laterales constituyen el antgeno somtico O,

cuya especificidad viene determinada por la secuencia repetitiva de azcares. Esta
porcin condiciona la virulencia de las bacterias Gram-negativas patgenas, por lo que
debe de ser esencial en la interaccin hospedador-parsito.

2.5.1.1.3 La lipoprotena (LPP, lipoprotena de Braun)

Su porcin polipeptdica es una pequea protena (7.2 kDa) muy abundante en la

membrana externa, y es la responsable de la unin covalente entre sta y el peptidoglucano.
La protena tiene una configuracin mayoritaria en -hlice, que atraviesa el espacio
periplsmico, y parece que se agrega formando trmeros. Una de las LPP del trmero (por
trmino medio) se une covalentemente con el peptidoglucano.

El aminocido N-terminal es una cistena cuyo grupo sulfhidrilo est unido por enlace
tioter a un diglicrido, y cuyo grupo amino se une por enlace amido con un cido graso (p. ej.,
palmtico). De este modo, la porcin N-terminal de la LPP est embebida en la lmina interna
de la membrana externa.

El aminocido C-terminal es una lisina. Una de cada tres molculas de LPP usa esta Lys
para establecer un enlace peptdico entre su propio grupo -NH2 libre y el -COOH libre del
meso-DAP del PG. Por trmino medio, por cada diez unidades disacardicas del PG, existe un
enlace covalente con la LPP.

La principal (y probablemente nica) funcin de la lipopprotena es meramente

estructural: estabilizar el complejo entre peptidoglucano y membrana externa. Esta unin es
tan fuerte que permite aislar la membrana externa y el peptidoglucano como una unidad.

2.5.1.1.4 Protenas de la membrana externa

 Estn intercaladas en esta membrana, participando en la estabilizacin de la
arquitectura tridimensional, interaccionando unas con otras y con los lpidos. Entre ellas, las
ms importantes son las porinas.

Las porinas son protenas de unos 35 kDa, que se agregan formando

trmeros con canales interiores, y que atraviesan la membrana de parte a
parte. Su funcin es permitir el paso de sustancias a travs de dichos canales
interiores, siempre que su peso molecular sea compatible con el tamao de los
canales (suelen ser molculas entre 500 y 700 dalton). En las enterobacterias,
las porinas colaboran en la proteccin contra las sales biliares que existen en
el ecosistema intestinal donde pasan parte de su vida.

Existen otras protenas minoritarias parecidas a porinas, que actan como canales
especficos que permiten el paso de ciertas molculas: vitamina B12, quelatos de Fe,
nuclesidos, maltodextrinas, etc. Algunas de ellas sirven simultneamente como receptores de
fagos.

2.5.1.2 PAPELES Y FUNCIONES DE LA MEMBRANA EXTERNA

1) Acta como tamiz molecular, que permite la difusin nicamente de molculas

relativamente pequeas. Esto supone una proteccin frente a muchos agentes
antibacterianos: colorantes, cidos biliares, antibiticos, enzimas (p. ej., la lisozima, que
podra alcanzar y atacar al PG). Recurdese que las porinas slo permiten el paso de
sustancias hidroflicas por debajo del tamao especificado por el dimetro de los canales.

2) Condiciona propiedades de superficie:

a) grado de humedad (humectabilidad)

b) adhesividad

c) carga elctrica.

3) Es la estructura donde se fijan los componentes del complemento (sistema defensivo de

los animales superiores que conduce a la insercin, en la membrana externa, de una serie
de protenas llamadas complejo de ataque a la membrana, que agujerea dicha membrana
y ocasiona la lisis de la bacteria).

4) Ciertas protenas y cadenas laterales del LPS pueden ser lugares de adsorcin (receptores
especficos) de fagos y bacteriocinas.

5) Punto de anclaje del anillo externo (L) del corpsculo basal de los flagelos.

2.5.2 EL ESPACIO PERIPLSMICO

Entre la membrana externa y la membrana citoplsmica existe un compartimento

acuoso baando al peptidoglucano, denominado periplasma o espacio periplsmico. El
volumen de este compartimento puede llegar a representar un 20-40% del volumen celular
total. El contenido del periplasma (el gel periplsmico) incluye:

RNasa y fosfatasa, que digieren molculas que por s mismas no pueden pasar al
citoplasma.
Penicilinasa: degrada penicilina, evitando destruccin de PG
protenas de transporte de nutrientes (p. ej., de maltosa)
protenas de transporte de nutrientes (p. ej., de maltosa)
protenas de unin a estmulos qumicos.
En bacterias desnitrificantes y quimiolitoautotrofas, existen protenas implicadas en
el transporte de electrones.

El periplasma cumple una funcin de osmorregulacin: El periplasma es una solucin

densa, con alta concentracin de macromolculas, y que participa en la regulacin de la
osmolaridad celular frente a la tonicidad del medio exterior. Para ello, existe en este espacio
periplsmico un oligosacrido derivado de la membrana citoplsmica (ODM, o segn sus
iniciales inglesas, MDO), a base de 10 unidades de -D-glucosa (unidas entre s por enlaces
12) con sustituyentes cidos.

En medios de alta osmolaridad (por ejemplo, en los fluidos corporales), disminuye la

concentracin del oligosacrido.
En ambientes de baja osmolaridad (p. ej., aguas fecales), aumenta mucho la
concentracin de dicha molcula. De este modo, la presin de turgor del protoplasto
se transmite contra el peptidoglucano, que como sabemos ya, es la estructura de la
pared celular. que aguanta las variaciones de presin osmtica.

3 PAREDES DE LAS ARQUEAS

Aunque las arqueas pueden comportarse como Gram-positivas o como Gram-negativas,

no se suele aludir a esto en este dominio de procariotas, ya que sus paredes tienen poco que
ver con las de eubacterias. Exceptuando el gnero Thermoplasma, carente de pared celular, las
dems arqueas poseen, por encima de la membrana citoplsmica, algn tipo de estructura con
funciones de pared celular.

En muchos casos las funciones de pared celular son ejercidas simplemente por una
capa S paracristalina (vase tema 4), a base de disposicin regular de subunidades
idnticas de una protena o glucoprotena (p. ej., Methanococcus, Methanogenium).
Recuerde que en ciertas arqueas de ambientes extremos, esta capa S est
estabilizada por factores de esos ambientes: En el halfilo obligado Halobacterium
las subunidades de glucoprotena se estabilizan por altas concentraciones de in
Na+. En el termoacidfilo Sulfolobus la estabilidad la confieren los bajsimos pH.
En Methanospirillum y en Methanothrix varias clulas, cada una con su capa S, se
encuentran englobadas por una vaina comn, a base de protenas y carbohidratos,
con una estructura a base de anillos paralelos.
En Methanosarcina y Halococcus la capa S se encuentra rodeada de
metanocondroitina, un polmero a base de N-acetil-galactosamina, glucurnico,
 glucosa y manosa. (Esta metanocondroitina es similar al condroitn sulfato presente
en tejido conjuntivo de animales).
Finalmente, los miembros del orden Methanobacteriales poseen una pared de
pseudomurena, un extrao peptidoglucano no basado en NAM. Consiste en un
esqueleto de unidades repetitivas de NAG unidas por enlace (13) con N-acetil-
talosaminournico (NAT, un azcar exclusivo de estos organismos). El grupo -NH2
del NAT va unido a su vez con un tetrapptido, pero en ste slo participan
aminocidos de la serie L. Al igual que en la murena de las eubacterias, las
diversas cadenas se unen entre s por enlaces peptdicos entre el aminocido
terminal (4) de un tetrapptido y el diaminocido (3) de otra cadena.

BIBLIOGRAFA

ARTCULOS DE DIVULGACIN

CASTILLO, F. y otros (2003): El periplasma procariota. Investigacin y Ciencia 321

(junio): 74- 82.

FISCHETTI, V.E. (1991): Protena estreptoccica M. Inv. y Ciencia 179 (agosto):

RIETSCHEL, E.T., H. BRADE (1992): Endotoxinas bacterianas. Inv. y Ciencia 193: 16-
24.

ARTCULOS DE REVISIN

FERGUSON, S.J. (1992): The periplasm. en Prokaryotic structure and function: a new
perspective. Society for General Microbiology & Cambridge University Press, pp.311-
339.

HANCOCK, R.E.W. (1991): Bacterial outer membranes: evolving concepts. ASM news
57: 175-182.

HANCOCH, R.E.W., R. SIEHNEL, N. MARTIN (1990): Outer membrane proteins of

Pseudomonas. Molec. Microbiol. 4: 1069-1075.

NIKAIDO, H. (1996): Outer membrane. En: Escherichia coli and Salmonella

typhimurium. Cellular and molecular biology, 2 edicin (F.C. Neidhart, ed.). American
Society for Microbiology Press. Washington, D.C. (1996), pgs. 7-22.

OLIVER, D.B. (1996): Periplasm. En: Escherichia coli and Salmonella typhimurium.
Cellular and molecular biology, 2 edicin (F.C. Neidhart, ed.). American Society for
Microbiology Press. Washington, D.C. (1996), pgs. 88-103.
PARK, J.T. (1996): The murein sacculus. En: Escherichia coli and Salmonella
typhimurium. Cellular and molecular biology, 2 edicin (F.C. Neidhart, ed.). American
Society for Microbiology Press. Washington, D.C. (1996), pgs. 48-57.

RAETZ, C.R.H. (1990): Biochemistry of endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 59: 129-170.

SCHIRMER, T., J.P. ROSENBUSCH (1991): Prokaryotic and eukaryotic porins. Curr.
Opin. Struct. Biol. 1: 539-545.

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