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Procedimientos en Microbiologa Clnica

Recomendaciones de la Sociedad Espaola de


Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica

Diagnstico
Recogida, microbiolgico
transporte de
y procesamiento
1b
57 la infeccin
general por el virus
de las muestras
papiloma de humano
en el del
Microbiologa
laboratorio

Coordinadora
Editores Coordinador
Coordinadora Autores

Emilia Cercenado Mansilla


Emilia Cercenado Mansilla Mara IsabelMateos
Mara Luisa Snchez Romero
Lindemann Juan Luisa
Mara M. Garca-Lechuz Moya
Mateos Lindemann
Rafael Cantn Moreno Juan Jos Gonzlez Lpez
Rafael Cantn Moreno Sonia Prez-Castro
Nieves Orta Mira
Mara Isabel Snchez Romero
Mara Teresa Prez-Gracia
Manuel Rodrguez-Iglesias
ISBN: 978-84-697-4782-7

EDITORES:
Emilia Cercenado Mansilla. Servicio de Microbiologa. Hospital General Universitario Gregorio Maran. Madrid.
Rafael Cantn Moreno, Servicio de Microbiologa. Hospital Universitario Ramn y Cajal e Instituto Ramn y Cajal de
Investigacin Sanitaria (IRYCIS). Madrid.

SUGERENCIA DE CITACIN:

Garca-Lechuz Moya JM, Gonzlez Lpez JJ, Orta Mira N, Snchez Romero MI. Recogida, transpor-
te y procesamiento general de las muestras en el Laboratorio de Microbiologa. 2017. 1b. Snchez Ro-
mero MI (coordinadora). Procedimientos en Microbiologa Clnica. Cercenado Mansilla E, Cantn More-
no R (editores). Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica (SEIMC). 2017.

AVISO:
Reservados todos los derechos. Los documentos SEIMC o cualquiera de sus partes no podrn ser reproducidos, al-
macenados, trasmitidos, distribuidos, comunicados pblicamente o transformados mediante ningn medio o sistema
sin la previa autorizacin de sus responsables, salvo excepcin prevista por la ley. Cualquier publicacin secundaria
debe referenciarse incluyendo Este documento ha sido elaborado por la SEIMC (Sociedad Espaola de Enferme-
dades Infecciosas y Microbiologa Clnica) y su contenido puede encontrase en la pgina web www.seimc.org
Procedimientos en Microbiologa Clnica

Recomendaciones de la Sociedad Espaola de


Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica

Editores:
Emilia Cercenado Mansilla
Rafael Cantn Moreno

1b . Recogida, transporte y procesamiento


general de las muestras en el
laboratorio de Microbiologa.2017

Coordinadora:
Mara Isabel Snchez Romero1

Autores:
Juan Manuel Garca-Lechuz Moya2

Juan Jos Gonzlez Lpez3

Nieves Orta Mira4

Mara Isabel Snchez Romero1

1
Servicio de Microbiologa, Hospital Universitario Puerta de Hierro Majadahonda (Madrid), 2Servicio de Microbiologa,
Hospital Miguel Servet (Zaragoza), 3Servicio de Microbiologa, Hospital Vall dHebron (Barcelona), 4Servicio de
Microbiologa, Hospital Francesc de Borja, Ganda (Valencia)
NDICE DEL DOCUMENTO CIENTFICO
1 Introduccin.......... ...................................................................................................................................6

2 Consideraciones generales................................................................................................................6

2.1. Muestras clnicas recomendadas................................................................................................................6


2.2. Envases utilizados.......................................................................................................................6

3 Recogida de muestras.............................................................................................................................8

3.1 Recogida de muestras para estudio por mtodos convencionales y automatizados........................8


3.2 Recogida de muestras para estudio mediante tcnicas rpidas.......................................................8

4 Conservacin de las muestras hasta su procesamiento.........................................................................14


DOCUMENTO
4.1 Medios disponibles, temperatura y tiempo......................................................................................14

5 Transporte..............................................................................................................................................14

5.1 Regulaciones para el transporte internacional de sustancias infecciosas........................................20


5.2 Regulaciones locales y nacionales para el transporte de sustancias infecciosas...........................20
5.3 Clasificacin de las sustancias infecciosas para el transporte........................................................21
5.4 Preparacin de envos para su transporte......................................................................................21

6 Recepcin en el laboratorio/Servicio de Microbiologa..........................................................................26

6.1 Requisitos para su registro..............................................................................................................26


6.2 Incidencias y criterios de rechazo...................................................................................................26

7 Aparatos y materiales............................................................................................................................27

8 Medios de cultivo y reactivos.................................................................................................................27

9 Procesamiento de las muestras.............................................................................................................32

9.1 Mtodos convencionales: cultivo.....................................................................................................33


9.1.1 Fase de pretratamiento de la muestra........................................................................................33
9.1.2 Inoculacin en los medios de cultivo...........................................................................................33
9.1.3 Preparacin de las extensiones...................................................................................................34
9.1.4 Incubacin...................................................................................................................................34
9.2 Siembra automatizada. Automatizacin del laboratorio de Microbiologa........................................35
9.3 Tcnicas rpidas..............................................................................................................................36
9.3.1 Examen directo o tinciones.........................................................................................................36
9.3.2 Basadas en reacciones antgeno-anticuerpo.................................................................................37
9.3.2.1 Inmunocromatografa..........................................................................................................37
9.3.2.2 Enzimoinmunoanlisis.........................................................................................................37
9.3.3 Tcnicas moleculares..................................................................................................................38

10 Almacenamiento de las muestras tras su procesamiento.....................................................................39

11 Recogida y transporte de muestras con sospecha de microorganismos con gran relevancia en salud
pblica ..................................................................................................................................................40

12 Bibliografa.............................................................................................................................................42

4
DOCUMENTOS TCNICOS

1. PNT-RTPM-01. Procedimiento general de recogida, transporte y procesamiento de las muestras en el


laboratorio de Microbiologa

2. PNT-RTPM-02. Recogida y transporte de muestras para deteccin de microorganismos con gran re-
levancia en la salud pblica

DOCUMENTO

NDICE DEL DOCUMENTO CIENTFICO


1.

5.

DOCUMENTO TCNICO

1.

5
DOCUMENTO CIENTFICO

1. INTRODUCCIN
El proceso diagnstico en Microbiologa se inicia con microbilogos y los clnicos responsables del paciente,
la toma de la muestra y finaliza con la emisin de los participando activamente en el proceso diagnstico.
resultados. En la fase preanaltica se realizan las tareas
de toma de muestras, transporte y registro en el siste- 2.1. MUESTRAS CLNICAS RECOMENDA-
ma informtico del laboratorio; en la fase analtica las DAS
muestras se procesan, analizan y se obtienen los resul-
tados y por ltimo, en la postanaltica, se realiza la val- En la tabla 1 se resumen el tipo de muestras clnicas
idacin de los resultados y la emisin de los informes. ms adecuadas para el diagnstico microbiolgico de
Los facultativos peticionarios necesitan que los los procesos infecciosos ms habituales.
resultados proporcionados por el laboratorio En general, cada muestra debe ir acompaada de
de Microbiologa sean precisos, significativos y su correspondiente peticin, ya sea en forma de
clnicamente relevantes. Para proporcionar ese nivel de volante de solicitud o mediante peticin electrnica.
calidad, el laboratorio requiere que todas las muestras Debe contener la informacin suficiente para que las
microbiolgicas sean correctamente seleccionadas, muestras se procesen e interpreten sus resultados
recogidas y transportadas, ya que esto permite convenientemente. Toda solicitud analtica debera
optimizar su anlisis e interpretacin. contener los siguientes puntos: filiacin y datos
administrativos/demogrficos del paciente (nombre y
La incorporacin de mtodos rpidos de diagnstico y
apellidos, nmero de historia clnica y de identificacin
la automatizacin del laboratorio de Microbiologa no ha
personal, fecha de nacimiento y sexo), nombre y
sido una labor sencilla. Se han ido desarrollando equipos
apellidos del mdico peticionario, servicio solicitante,
automatizados que siembran una amplia variedad de
datos clnicos relevantes, datos referentes a la muestra
muestras en formato lquido. A esta automatizacin
(tipo y localizacin anatmica), teraputica seguida,
se han unido las tcnicas de diagnstico rpido de
tipos de pruebas a solicitar, as como el nmero de
tipo inmunolgico, de deteccin de antgenos vricos,
peticin identificativo de la muestra o el localizador de
bacterianos, fngicos o parasitarios, la incorporacin
la misma (solicitud electrnica). El empleo de sistemas
de las tcnicas de biologa molecular y la protemica.
informticos adecuados es imprescindible para que
El presente procedimiento pretende servir de gua todas las tareas diagnsticas puedan desarrollarse
y ayuda en las actividades que comprenden la fase adecuadamente.
preanaltica y el comienzo de la fase analtica del
diagnstico microbiolgico, actualizando y ampliando 2.2. ENVASES UTILIZADOS
el anterior procedimiento de la SEIMC de recogida,
transporte y procesamiento general de las muestras en
el laboratorio de Microbiologa (ao 2003). Hay una gran variedad de envases en los que se
pueden recoger las muestras microbiolgicas, siendo
una caracterstica comn a todos ellos que sean
2. CONSIDERACIONES GENERALES estriles y con cierre a prueba de fugas. Los tubos
empleados pueden no contener ningn medio (tubos
La Microbiologa Clnica es una disciplina interpretativa secos), llevar una esponja impregnada en medio lquido
cada da ms compleja. A pesar de la automatizacin en el fondo del tubo que mantiene la humedad, ir con
del laboratorio y de la incorporacin de pruebas de medio de transporte en gel o en medio lquido (vlido
diagnstico rpido, la interpretacin de los resultados para estaciones de trabajo automatizadas).
microbiolgicos depende, en gran medida, de la calidad
Las torundas pueden ser de diferentes materiales: al-
de las muestras recibidas para su estudio. Por lo tanto,
es necesaria una adecuada gestin de las muestras godn (contiene cidos grasos que son inhibidores), al-
para conseguir un ptimo diagnstico en Microbiologa. ginato clcico (txico para virus y puede inhibir tcnicas
de PCR (reaccin en cadena de la polimerasa)), da-
crn, rayn o nylon, y pueden tener la superficie de ab-
El sndrome clnico y los posibles agentes etiolgicos sorcin lisa o ser flocadas (permiten una buena absor-
implicados condicionan no slo el tipo de muestra a
cin de la muestra y elucin en el medio de transporte).
enviar sino tambin su procedimiento de obtencin,
Adems, el mango puede ser rgido de madera (puede
transporte, conservacin y procesamiento. Igualmente,
la informacin clnica, es la que permite al laboratorio interferir con las tcnicas de microbiologa molecular,
aplicar las tcnicas diagnsticas disponibles de inactivar a virus e interferir en pruebas de identificacin
manera ms eficiente. Por ello, es fundamental de Ureaplasma spp.), de aluminio o de plstico (rgidos
que exista una estrecha comunicacin entre los o flexibles).

6
Proceso infeccioso
(sospecha o diagnstico clnico)
(sospecha o diagnstico clnico)
DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 1. Muestras clnicas recomendadas para los estudios microbiolgicos ms habituales.

Proceso Infeccioso Tipo de muestra para estudios Comentarios


(sospecha o diagnstico microbiolgicos
clnico)
Abscesos Aspirado del absceso Cerebral, intraperitoneal o visceral, pulmonar
Artritis Lquido sinovial
Bacteriemia Hemocultivos
Sangre con EDTA Posibilidad de deteccin directa mediante
tcnicas de Microbiologa Molecular
Bronquiolitis Aspirado/lavado nasofarngeo
Cervicitis Exudado endocervical
Colecistitis Lquido biliar
Conjuntivitis Exudado conjuntival Ambos ojos
Diarrea Heces, aspirado duodenal Torunda rectal, solo en casos seleccionados
Encefalitis LCR
Empiema pulmonar Lquido pleural
Endocarditis Hemocultivos, vlvula, verruga
Endoftalmitis Lquido intraocular
Faringoamigdalitis Exudado farngeo o periamigdalar
Gripe Exudado nasofarngeo
Aspirado y lavado nasofarngeo,
broncoaspirado, lavado broncoalveolar y
biopsias transbronquial, pulmonar o pleural
Infeccin del catter Catter, frotis pericatter o conexin del Sospecha de bacteriemia asociada a catter
catter obtener hemocultivos
Infecciones asociadas al Lquido amnitico, placenta
parto o puerperio
(corioamnionitis)
Infecciones de piel y partes Aspirados, biopsias y exudados de las Si es posible NO utilizar torunda
blandas (impetigo, lesiones realizados preferiblemente con
foliculitis, erisipela, celulitis, jeringa
lceras, infecciones
gangrenosas, abscesos
cutneos, heridas y
quemaduras)
Infecciones protsicas Vlvulas, marcapasos, prtesis y material Contenedores estriles para sonicar
(dispositivos varios) de osteosntesis
Infeccin respiratoria vrica Aspirado / lavado nasofarngeo
(Virus respiratorio sincitial, Exudado nasofarngeo
Adenovirus) broncoaspirado, lavado broncoalveolar y
biopsias transbronquial, pulmonar o pleural
Infeccin urinaria Orina (miccin media) Inapropiadas: orina de la bolsa de sondaje y las
Puncin suprapbica puntas de sonda vesical
Orina de sonda permanente (puncin) Para anaerobios solo vlida la puncin
Bolsas de orina o sondaje vesical (nios) suprapbica
Infeccin por VPH Cepillado de crvix
Meningitis LCR
Hemocultivos
Neumona Esputo, aspirado traqueal, broncoaspirado, Inapropiadas: muestras de saliva o secreciones
lavado broncoalveolar y biopsias orofarngeas
transbronquial, pulmonar o pleural
Hemocultivos
Otitis externa Exudado tico (odo externo)
Otitis media Muestra de timpanocentesis
Osteomielitis Biopsia sea o exudado de la lesin
Pericarditis Lquido pericrdico
Peritonitis Lquido peritoneal
Prostatitis Secrecin prosttica y orina pre y post-
masaje prosttico
Queratitis Raspado corneal
Sinusitis Aspirado sinusal o biopsia No vlido el exudado nasal
Tosferina Aspirado / lavado nasofarngeo
Exudado nasofarngeo
lceras genitales Raspado/exudado de la lcera
Uretritis Exudado uretral
Orina
Vulvovaginitis Exudado vaginal

LCR (lquido cefalorraqudeo), EDTA (cido etilendiaminotetraactico), VPH (Virus del papiloma humano)

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DOCUMENTO CIENTFICO

El tamao y la forma de la torunda variar en funcin de alginato clcico o con bastn de madera).
del tipo y localizacin de la muestra a tomar (para tomas
uretrales o nasofarngeas se emplear un torunda fina). El empleo de medio de transporte para virus durante
Existen torundas con sistemas de transporte especficos la recogida de las muestras depende en gran medida
para anaerobios. Por tanto, cada tipo de muestra va a de la propia muestra; las muestras lquidas como
requerir un contenedor diferente para una adecuada sangre, LCR, orina y lavado broncoalveolar (LBA) no
recogida y conservacin hasta el momento de su lo suelen requerir, por lo que deben ser transportadas
procesamiento. y procesadas prestando especial atencin a la
temperatura ptima y los tiempos de almacenamiento.
Respecto al medio de transporte, puede tratarse de Para una mayor recuperacin de los virus, se recomienda
medios generales para grupos de microorganismos recoger las muestras durante los tres primeros das del
(aerobios, anaerobios, dermatofitos) o especficos cuadro infeccioso. En la tabla 3 se describe el tipo de
(Regan-Lowe para Bordetella spp.), medios de transporte envase, volumen y procedimiento de obtencin, de los
de virus universal para cultivo y tcnicas de deteccin distintos tipos de muestras. Adems de lo indicado en
de cidos nucleicos o medios de transporte para este procedimiento, en los diferentes procedimientos
conservacin de clulas y medio para conservacin de especficos de la SEIMC se puede encontrar
cidos nucleicos (medios en base alcohol), entre otros. informacin ms detallada para cada tipo de muestra.
Se pueden emplear tambin frascos de hemocultivos,
tubos y frascos con cierre de rosca, tubos de vaco
3.1.RECOGIDA DE MUESTRAS PARA ESTU-
(con o sin aditivos) y jeringas. En la tabla 2 se resumen
los envases que ms frecuentemente se pueden DIO POR MTODOS CONVENCIONALES Y
emplear para la recogida y transporte de las muestras. AUTOMATIZADOS

3. RECOGIDA DE MUESTRAS La recogida de las muestras para estudios


microbiolgicos puede variar en funcin de si stas
van a procesarse mediante mtodos convencionales
o mediante mtodos automatizados. En los ltimos
La idoneidad de las muestras enviadas depende aos se han ido incorporando nuevas estaciones
del cumplimiento de una serie de medidas o de trabajo automatizadas que pueden mejorar la
reglas referentes al procedimiento de obtencin, eficiencia del flujo de trabajo y la estandarizacin de
cantidad enviada y transporte rpido y adecuado la siembra. Estos sistemas automatizados pueden
al laboratorio. Las consecuencias de una muestra realizar el cultivo a partir de muestras lquidas
mal tomada, mal conservada o mal transportada, directamente o en medios lquidos de transporte.
pueden suponer un fracaso en el aislamiento
del agente etiolgico o el aislamiento de posibles
microorganismos contaminantes que pueden 3.2. RECOGIDA DE MUESTRAS PARA ESTU-
generar tratamientos innecesarios o inadecuados. DIO MEDIANTE TCNICAS RPIDAS
Puesto que una gran parte de las determinaciones en Aunque el cultivo es uno de los mtodos ms
Microbiologa se basan en la capacidad de crecimiento empleados para el diagnstico de las enfermedades
de los microorganismos, las condiciones de recogida infecciosas, tambin se dispone de otras tcnicas,
y transporte han de asegurar en todo momento cuya principal caracterstica es la rapidez. Las
su viabilidad. El laboratorio de Microbiologa debe tcnicas de diagnstico rpido permiten, entre otras,
elaborar un manual claro y conciso con las normas la deteccin de antgenos, de cidos nucleicos y de
de recogida y transporte de muestras. Dicho manual la respuesta inmunolgica. Las pruebas rpidas ms
debe distribuirse en controles de enfermera, consultas empleadas son la inmunofluorescencia, la aglutinacin,
y dems dependencias hospitalarias y ambulatorias la inmunocromatografa, el enzimoinmunoensayo
en las que se atienda a los pacientes. En caso de y las tcnicas de microbiologa molecular (PCR en
existir dudas sobre la idoneidad de las muestras o su tiempo real y PCR multiplex). Mediante estas ltimas
recoleccin, se debe contactar siempre con el Servicio se puede detectar un agente infeccioso aislado o
de Microbiologa antes de proceder a su recogida. varios de forma simultnea (bacterias, virus, hongos,
parsitos), incluso genes de resistencia a antibiticos,
De forma general, la toma de muestras para estudio en un tiempo corto, con escasa manipulacin y
de bacterias y de hongos (excepto lquidos estriles preparacin de las muestras y con resultados precisos.
o muestras quirrgicas) se puede realizar con
torundas con medio de transporte en gel o liquido Los paneles que hay diseados actualmente y
(para estudios automatizados) y la toma de muestras comercializados basados en tcnicas de PCR
para estudio de virus se puede realizar con torundas abarcan los agentes etiolgicos ms frecuentes
de algodn, dacrn, rayn o nylon con bastn de de sndromes concretos. Estas tcnicas pueden
aluminio o plstico (no se deben aceptar torundas presentar unos requerimientos especficos (incluido

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 2. Recipientes y sistemas de recogida y transporte de muestras microbiolgicas.

Recipientes y sistemas de recogida Comentarios


y transporte
Bolsas de anaerobiosis Bolsa impermeable en cuyo interior se introduce un catalizador y un generador de
hidrgeno y CO2
Capilares estriles para tiles para visualizar parsitos (Trypanosoma spp.)
microhematocrito
Cepillo en medio de transporte Evitar recoger muestras con sangre
lquido para el Virus del papiloma o
frasco de citologa lquida
Contenedores estriles de boca Para orina, esputos, broncoaspirados, lavados broncoalveolares, heces, biopsias
ancha grandes, tejidos, dispositivos (catteres, prtesis, marcapasos), etc.
Contenedores estriles de boca Lquidos estriles, catter telescopado, biopsias pequeas, aspirados de abscesos
estrecha y heridas
Frascos de hemocultivos para Para sangre y cultivo de otros lquidos estriles
sistemas de incubacin (peritoneal, articular, etc.)
automatizada Tipos: aerobios, anaerobios, peditricos, micobacterias y hongos
Frascos lisis-centrifugacin Empleados principalmente en bacteriemia/ fungemia
Jeringa para la obtencin de Para aspirado de absceso, vescula, colecciones, etc. Se emplean cuando no se
aspirados dispone de ninguno de los sistemas anteriores para estudio de bacterias
anaerobias, o bien cuando la cantidad de muestra es mnima. Para ello hay que
eliminar el aire y cerrar con un tapn estril desechando la aguja
MTV y UTM (con o sin torunda) til para virus
El universal tambin para PCR de Chlamydia spp., Ureaplasma spp. y Mycoplasma
spp.
Placas de Petri estriles til para escamas cutneas, pelos y uas
Torundas de alginato clcico En Bordetella spp. se pueden emplear para cultivo, pero no se recomiendan para
PCR. Puede inhibir tcnicas de PCR y ser txicas para virus
Torundas de algodn No recomendables para Chlamydia spp., Bordetella spp. y Neisseria gonorrhoeae
Torundas en medio de Cary-Blair Para enteropatgenos en heces.
Tambin disponibles con agar lquido (permite automatizacin)
Torundas de dacrn, rayon o No interfieren con las tcnicas de PCR, tiles para virus
nylon
Torundas de mango flexible til para tomas nasofarngeas
Tubos estriles con conservante Contienen cido brico-formiato de sodio (estabilizante del crecimiento)
(de vaco o de rosca con esponja) Para cultivo bacteriolgico de orina. til en automatizacin
Tubos estriles con fijador Para bsqueda de parsitos en heces.
Tipos de fijadores: SAF, PVA, MIF, fijadores ecolgicos, etc.
Torundas con medio en gel de Para bacterias aerobias y anaerobias facultativas
Stuart o Amies
Torunda con medio Amies con Para transporte de Neisseria gonorrhoeae
carbn
Torunda (flocada o no) con medio Muestras de exudados. Se puede emplear en automatizacin.
lquido de transporte (Amies) Para bacterias aerobias, microorganismos exigentes, bacterias anaerobias y PCR
Tubos estriles de vaco con Con EDTA, citrato, heparina o con aditivos que impiden degradacin de ARN
aditivos
Tubos estriles de vaco con gel Para la obtencin de suero
separador
Tubos con medio lquido con Muestras nasofarngeas (permite cultivo Bordetella spp.) o genitales. Se pueden
torundas especiales: emplear en automatizacin. Para bacterias aerobias, microorganismos exigentes,
uretral y nasal bacterias anaerobias y PCR
Viales y tubos con atmsfera Contienen un medio de transporte semislido con un agente reductor y un
anaerobia indicador. Cualquier coloracin azul de dicho medio indica exposicin al aire

Abreviaturas: SAF (acetato sdico-formalina), PVA (polivinil-alcohol), MIF (mertiolato-ioduro-formalina), MTV (medio de transporte para
virus), UTM (medio transporte de virus universal), EDTA (cido etilendiaminotetraactico).

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 3. Consideraciones sobre la toma de las muestras


TIPO DE ENVASE VOLUMEN PROCEDIMIENTO COMENTARIOS
MUESTRA

Abscesos Contenedor estril El que se pueda Puncin-aspiracin Cerebral, intraperitoneal o visceral, pulmonar
obtener Ciruga
Jeringa de
extraccin con
cambio de aguja
Catteres, Contenedor estril 2 a 4 cm distales Extraccin asptica del
frotis (catter) (porcin catter
intravascular)
pericatter y de Torunda con MT Frotando la piel o
la conexin (frotis) introduciendo la torunda en
el orificio de la conexin
Lquidos Contenedor estril 1-5 ml aerobios y Puncin percutnea Enviar un pequeo volumen en frasco estril
estriles anaerobios para Gram
MT para anaerobios
(articular, biliar, 10 ml hongos
amnitico, Jeringa estril 10 ml
dilisis micobacterias
peritoneal) Frasco hemocultivos
Prtesis, Contenedor estril Ciruga abierta
vlvulas
cardiacas y
otros
dispositivos
Tejidos y Contenedor estril Mximo tejido Puncin-aspiracin Para micobacterias y Helicobacter pylori
biopsias posible, evitando Punch o ciruga abierta aadir unas gotas de agua destilada
MT para anaerobios
zonas necrticas
MT para virus No enviar las muestras envueltas en gasas
Muestras gastrointestinales
Aspirado Contenedor estril Sonda nasogstrica Giardia spp. y Strongyloides spp.
duodenal endoscopia o cpsula
Biopsia de Contenedor estril Tcnica endoscpica Sospecha de CMV y otros Virus herpes en
esfago MT para virus
Biopsia Contenedor estril 3-4 fragmentos Tcnica endoscpica Aadir gotas de suero fisiolgico para evitar
gstrica desecacin
Biopsia Contenedor estril Tcnica endoscpica Giardia spp.
intestino Cryptosporidium spp.
delgado Microsporidium spp.
Biopsia rectal Contenedor estril Tcnica endoscpica Entamoeba histolytica
Heces Contenedor estril Heces lquidas Elegir la porcin que
>5 ml presente sangre, moco o
Medio Cary-Blair
Heces formes pus
Frascos con fijador >2 g
parasitolgico No til para cultivo de larvas
Jugo gstrico Contenedor estril Sonda nasogstrica Neutralizar con carbonato sdico
Muestras genitourinarias y de Infecciones de transmisin sexual
Orina Contenedor estril 1 ml bacterias Miccin media Antigenos urinarios (Legionella spp. y S.
5-10 ml para Puncin suprapbica pneumoniae)
Tubo estril con antgenos Orina de 24 h PCR (Chlamydia spp. y N. gonorrhoeae)
cido brico urinarios y virus Puncin a travs de la Parsitos (Schistosoma haematobium)
10-20 ml hongos, sonda permanente pinzada Virus (Adenovirus, CMV, Virus BK)
micobacterias y Bolsa colectora (nios)
PCR
100 ml u orina de
24 h para
parsitos
Exudado Torunda con MT en Fondo de saco vaginal Para cultivo bacteriano 2 torundas (una para
vaginal gel o lquido posterior (usar espculo) estudio microscpico)
(siembra
automatizada)
Exudado Torunda con MT en Recoger la muestra con Para cultivo bacteriano 2 torundas (una para
endocervical gel o lquido espculo. estudio microscpico)
(siembra
automatizada y Retirar el exceso de moco
PCR) y rotar en endocervix
Torunda en MT con
carbn
(N. gonorrhoeae)
Torunda con MT
para virus (PCR,
virus, Chlamydia
spp., Mycoplasma
spp. y Ureaplasma
spp.)

Cepillado de Cepillo en MT
especial o citologa
crvix lquida (Virus del
papiloma humano)

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 3 Continuacin

TIPO DE ENVASE VOLUMEN PROCEDIMIENTO COMENTARIOS


MUESTRA

Exudado Torunda con MT o Recoger la muestra SIN Antes de cualquier manipulacin vaginal
vagino-rectal medio Todd-Hewit espculo en vagina
(cribado selectivo
embarazadas) Rotar contra las criptas
Caldo Granada rectales
Endometrio y Contenedor estril y Fragmentos Durante la cesrea o va
productos de la MT para anaerobios sospechosos de transcervical
concepcin infeccin
Exudado uretral Torunda en MT en Recoger la muestra como Para cultivo bacteriano 2 torundas (una para
gel (bacterias y mnimo 1-2 horas despus estudio microscpico)
hongos) o lquido de la ltima miccin
(PCR y siembra
automatizada)

Torunda en MT con
carbn
(N. gonorrhoeae)

Torunda en MT para
virus (PCR, virus,
Chlamydia spp.,
Mycoplasma spp. y
Ureaplasma spp.)
Exudado balano Torunda con MT Recoger del surco
prepucial balanoprepucial
Exudado rectal Torunda en MT con Rotar repetidamente
carbn (criptas)
(N. gonorrhoeae)
Secrecin Contenedor estril Ms de 1 ml Tras masaje prosttico o Acompaar este estudio de orina pre y post
prosttica o en eyaculacin masaje prosttico
su defecto
semen
lcera genital, Torunda con MT en Limpiar la lesin con suero
chancro, gel o MT para virus salino y presionar la base
adenopatas para recoger fluido
Muestras sistema nervioso central
LCR Contenedor estril El que se pueda Extraccin asptica tras Aspecto ms turbio o el extrado en segundo
obtener puncin lumbar lugar
1 ml para cultivo de Derivaciones externas
bacterias, serologa y Derivaciones internas
biologa molecular

2 ml para hongos,
micobacterias virus y
parsitos
Muestras oculares
Exudado Torunda con MT en Frotar la conjuntiva tarsal y Humedecer la torunda con suero fisiolgico
conjuntival gel o MT para virus frnix Ambos ojos
Raspado Envase estril Inoculacin directa de la Oftalmlogo Para deteccin de amebas emplear envase
corneal muestra sobre los estril
MT de virus medios de cultivo
Humor vtreo Frasco estril Volumen de muestra Oftalmlogo
muy limitado, priorizar
Jeringa de aspiracin los estudios

MT para virus
Aparato Torunda con MT Aspirar el exudado
lagrimal purulento o dacriocistotomia
MT para anaerobios
Jeringa aspiracin
Muestras ticas
Odo externo Torundas con MT Canal auditivo externo
Odo interno Frasco estril Timpanocentesis Hacer la toma antes de instilacin de
anestsicos locales, colirios o antibiticos; o al
MT para anaerobios
menos 4 horas desde la ltima administracin
Jeringa de aspiracin
Muestras de piel y tejidos blandos
Abscesos Contenedor estril Extraccin de la muestra Para cultivo bacteriano 2 torundas (una para
abiertos, MT anaerobios con jeringa o en su defecto estudio microscpico)
heridas y con torunda
quemaduras Jeringa de aspiracin
Ulceras Contenedor estril Extraccin de la muestra
cutneas con jeringa o en su defecto
MT anaerobios
con torunda
Jeringa de aspiracin

11
DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 3 Continuacin

TIPO DE ENVASE VOLUMEN PROCEDIMIENTO COMENTARIOS


MUESTRA

Abscesos Contenedor estril 1 ml Puncin aspiracin


cerrados
MT anaerobios
Jeringa de aspiracin
Vesculas Torunda seca Aspirar lquido de las
mucocutneas vesculas
MT para virus Romper la vescula y frotar
el fondo con torunda
Raspado de Contenedor estril Se puede inocular
piel, pelo y uas directamente en los medios
Placa de Petri estril de cultivo
Muestras del tracto respiratorio superior
Mucosa oral Torunda con MT Enjuagarse previamente la
normal y/o virus boca con agua
Exudado nasal Torunda con MT gel En las 2 fosas nasales
o lquido (siembra
automatizada)

Tubo seco (PCR)


Exudado Torunda con MT gel Utilizar depresor lingual Evitar tocar la vula, labios o lengua
farngeo (cultivo bacteriano)

Torunda sin medio


(deteccin
antignica)

Torunda con MT
virus
Exudado / Torunda flexible con 0.5-1 ml Introducir la torunda en la No comer 2 horas antes
Aspirado o sin MT (gel o parte posterior de
nasofarngeo lquido) nasofaringe por va nasal Para Bordetella spp. inocular inmediatamente

Torunda con MT Aspirar las secreciones


virus mediante un sistema de
aspiracin
Contenedor estril
Senos Contenedor estril 1 y 10 ml Puncin aspirativa sinusal
paranasales con MT para
anaerobios

Jeringa de aspiracin
Muestras de tracto respiratorio inferior
Esputo Contenedor estril 3-5 ml hongos y Primer esputo de la maana Parsitos (Ascaris lumbricoides y uncinarias o
espontneo bacterias previo enjuague de la boca huevos de Paragonimus westermani,
2 ml (Pneumocystis con agua. Echinococcus spp., Strongyloides spp. )
jirovecii)
5-10 ml para Nebulizacin con aerosol Especificar cultivo de Legionella spp.
micobacterias
Esputo 3-5 ml para
inducido parsitos
Aspirado Contenedor estril Aspiracin a travs del tubo
traqueal endotraqueal
BAS Contenedor estril Fibrobroncoscopio
LBA Contenedor estril 10-100 ml Fibrobroncoscopio
Cepillado Contenedor estril Fibrobroncoscopio Aadir 1 ml de suero fisiolgico estril
bronquial
Biopsia Contenedor estril Fibrobroncoscopio Aadir 1 ml de suero fisiolgico estril o agua
transbronquial estril para micobacterias
Lquido pleural Contenedor estril El que se pueda Toracocentesis
obtener
MT para anaerobios

Frascos
hemocultivos

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 3 Continuacin

TIPO DE ENVASE VOLUMEN PROCEDIMIENTO COMENTARIOS


MUESTRA

Biopsia Contenedor estril La mayor cantidad Puncin transtorcica Aadir agua estril si se solicitan micobacterias
pulmonar y posible de tejido (PAAF)
pleural MT para anaerobios
Sangre y mdula sea
Hemocultivos Frascos 8-10 ml por frasco Extraccin forma asptica, 2-3 extracciones
hemocultivos distintos lugares de Endocarditis y FOD 3 extracciones
1-3 ml peditricos venopuncin BAC (1 dispositivo / 1 sangre perifrica)
Tubos de lisis
centrifugacin Sin tiempo de espera
Extensiones Tubo de vaco con 3-5 ml Venopuncin previa
sanguneas anticoagulante desinfeccin
(parsitos) (EDTA)
Serologa Tubo de vaco con 5 ml adultos Venopuncin previa
gel separador de desinfeccin
suero 3-5 ml nios

Tubo con EDTA para


plasma
Pruebas de Tubo de vaco con Depender de la Venopuncin previa Se puede realizar en sangre total (Plasmodium
deteccin de gel separador de determinacin y la desinfeccin spp.) o en suero (Cryptococcus neoformans)
antgenos suero tcnica empleada

Tubo con EDTA para


plasma
Pruebas de Tubos de vaco con Depender de la Venopuncin previa No emplear tubos con heparina
deteccin de EDTA determinacin y la desinfeccin
cidos tcnica empleada
nucleicos Con cido ctrico
especialmente 5-10 ml
formulados

Tubos especializados
Medula sea Tubo con EDTA 1 ml como mnimo Puncin-aspiracin
(para biologa
molecular)

Frascos de
hemocultivos
(bacterias, hongos y
micobacterias)

Tubo con heparina


(Leishmania spp.)

Abreviaturas: CMV (citomegalovirus), PAAF (puncin aspiracin con aguja fina), FOD (fiebre de origen desconocido), BAS (broncoaspirado),
LBA (lavado broncoalveolar), EDTA (cido etilendiaminotetraactico), LCR (lquido cefalorraqudeo), MT (medio de transporte), BAC (bacte-
riemia asociada a catter)

13
DOCUMENTO CIENTFICO

el sistema de transporte y conservacin de la muestras de hemocultivos, LCR, exudados y


muestra) que dependern de la tcnica disponible lquidos biolgicos.
en cada laboratorio, adems tambin pueden diferir
en el nmero de microorganismos que detectan. Existen bacterias que son especialmente sensibles a
las condiciones ambientales: Shigella spp., Neisseria
Se dispone, por ejemplo, de paneles comercializados gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Haemophilus
para diagnstico de infecciones respiratorias a partir influenzae, Streptococcus pneumoniae y las bacterias
de muestras de aspirado o exudado nasofarngeo, anaerobias. La deteccin fiable de estas especies
infecciones gastrointestinales a partir de heces frescas requiere un procesamiento inmediato. Se deben entregar
o en medio Cary-Blair, bacteriemia a partir de sangre en el laboratorio pequeos volmenes de lquido (1 ml)
directa con EDTA o en medios especiales o de frasco o tejido (1 cm) antes de 15-30 minutos tras su recogida,
de hemocultivo positivo, de infecciones menngeas para evitar la evaporacin, el secado y la exposicin a las
a partir de LCR, infecciones de transmisin sexual a condiciones ambientales. Para el traslado de muestras
partir de exudado uretral, cervical u orina, entre otros. que se van a procesar fuera del hospital o del centro
sanitario donde se han recogido, independientemente
Tambin estn disponibles tcnicas de PCR para el de la distancia y el vehculo utilizado, se debe seguir la
diagnstico rpido del estado de portador, como puede normativa sobre transporte de sustancias infecciosas
ser la deteccin de Staphylococcus aureus y de que se desarrollar en el apartado 5 de este documento
Streptococcus agalactiae a partir de torunda seca o con cientfico. En la tabla 5 se detallan, para las muestras ms
medio lquido. frecuentes, los envases aconsejados para la recogida de
la muestra segn la determinacin solicitada, as como
Cada prueba de deteccin molecular se podr el tiempo y la temperatura ms adecuados para su
realizar en unas muestras concretas, presentando transporte y conservacin hasta su procesamiento.
requerimientos especficos que diferirn en funcin de
la tcnica empleada, por lo que el sistema de recogida
y las condiciones de conservacin podrn variar
5. TRANSPORTE
dependiendo de las especificaciones del fabricante. En
El transporte de muestras de material biolgico dentro de
la tabla 4 se muestran las pruebas rpidas disponibles
un hospital o centro, de un centro de salud a un hospital,
en funcin de la localizacin del proceso infeccioso y
de un laboratorio a otro, de un hospital a otro dentro de
del tipo de muestra recomendable para su realizacin.
la misma ciudad o a otra ciudad, se deben gestionar por
el propio hospital, por el servicio de salud o por cualquier
4. CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS organizacin de transportes o agencia que haya sido
autorizada. En el caso de que una muestra, sea o no
HASTA SU PROCESAMIENTO
infecciosa, se deba transportar dentro o fuera de un
determinado pas, sta debe remitirse correctamente
4.1 MEDIOS DISPONIBLES, TEMPERATURA empaquetada y etiquetada para preservar la integridad
Y TIEMPO del material a transportar y para proteger a quienes
intervengan en el transporte.

De forma general, las muestras recogidas para estudios Cada pas cuenta con su propia normativa para el
microbiolgicos deben enviarse lo ms rpidamente transporte, la importacin y exportacin de muestras
posible al laboratorio/Servicio de Microbiologa. Se biolgicas y es responsabilidad del remitente asegurar
podrn transportar a temperatura ambiente si no se la correcta clasificacin, empaquetado, etiquetado y
demora su envo tras su obtencin, aunque algunas documentacin del transporte de sustancias infecciosas.
requerirn hielo para su transporte. En el caso de que
no puedan transportarse inmediatamente, se podrn Espaa ha adoptado las recomendaciones descritas
seguir las siguientes recomendaciones generales, por Naciones Unidas en lo relativo al transporte de
aunque con excepciones: sustancias infecciosas. Parte de la informacin que se
incluye en este captulo se reproduce de lo expuesto en
a) para estudios de microbiologa molecular, virus las guas sobre la reglamentacin relativa al transporte
o micobacterias, refrigerar las muestras (2-8C); de sustancias infecciosas de los aos 2013-2014 y de
los aos 2015-2016 publicadas por la Organizacin
b) tambin pueden refrigerarse las muestras de Mundial de la Salud.
orina, heces, las de origen respiratorio y algunos
tipos de exudados y lquidos biolgicos (segn la Estas guas se basan en las Recomendaciones relativas al
peticin); y Transporte de Mercancas Peligrosas de la Organizacin
de las Naciones Unidas.
c) se conservarn a temperatura ambiente las

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 4. Principales tipos de muestra empleadas para el diagnstico con pruebas rpidas

Localizacin proceso Microorganismo/s Tcnicas posibles Tipo de muestra


infeccioso implicado/s

Enfermedades sistema Chlamydia trachomatis/ TAAN Uretral, endocervical, orina


genitourinario e ITS Neisseria gonorrhoeae
Mycoplasma genitalium, TAAN Uretral, endocervical
Ureaplasma spp.
Virus herpes simple IF Lesin cutnea
Virus del papiloma humano TAAN Endocervical
Treponema pallidum Campo oscuro Muestra directa lesin
RPR / VDRL Suero / LCR
Enfermedades sistema Haemophilus influenzae Aglutinacin Muestra respiratoria, lquido
respiratorio pleural
Streptococcus pneumoniae IC, Aglutinacin, Orina, lquido pleural
TAAN Muestra respiratoria
Legionella pneumophila IC, EIA Orina, lquido pleural
IF, TAAN Muestra respiratoria
Chlamydia pneumoniae TAAN Muestra respiratoria
Mycoplasma pneumoniae
Bordetella pertussis IF, TAAN Exudado / aspirado
nasofarngeo
Streptococcus pyogenes IC Exudado farngeo
Lesiones cutneas, lquidos
estriles
Mycobacterium tuberculosis Tincin AAR, TAAN Muestra respiratoria
Virus de la gripe IF, IC, EIA, TAAN Aspirado-Exudado
nasofarngeo
Virus respiratorio sincitial IF, IC, EIA, TAAN Muestra respiratoria
(aspirado-exudado
nasofarngeo)
Adenovirus IF, IC, TAAN Muestra respiratoria
(aspirado-exudado
nasofarngeo, farngeo)
Virus parainfluenza 1,2,3 IF, TAAN Muestra respiratoria
(aspirado-exudado
nasofarngeo)
Virus varicela-zoster IF, TAAN Muestra respiratoria
CMV IF, TAAN Muestra respiratoria
Aspergillus spp. Inmunodifusin, EIA, Suero, galactomanano en
TAAN muestra respiratoria (mejor
LBA)
Pneumocystis jirovecii IF, tincin, TAAN Muestra respiratoria
Enfermedades Sistema Haemophilus influenzae Aglutinacin, EIA, LCR, orina
Nervioso Central tipo b TAAN LCR
Neisseria meningitidis Aglutinacin, EIA, LCR, orina
TAAN LCR
Streptococcus agalactiae Aglutinacin, EIA, LCR, orina
TAAN LCR
Listeria spp. Aglutinacin, EIA, LCR, orina
TAAN LCR
Escherichia coli Aglutinacin, EIA, LCR, orina
TAAN LCR
Streptococcus pneumoniae IC, Aglutinacin, EIA, LCR, orina
PCR LCR
Enterovirus TAAN LCR
Cryptococcus neoformans y Inmunodifusin, EIA, LCR, suero
Crytococcus gattii aglutinacin.
Tinta china LCR
Infecciones sistema Clostridium difficile EIA, IC, TAAN Heces
digestivo Salmonella spp., Shigella spp. TAAN Heces
Helicobacter pylori IC, EIA, Heces
TAAN Biopsia gstrica
Rotavirus/Adenovirus/ Aglutinacin, IC, EIA, Heces
Norovirus/Astrovirus TAAN
Norovirus IC, EIA, TAAN Heces
Astrovirus EIA, TAAN Heces
Cryptosporidium parvum IF, IC, EIA, Tincin AAR, Heces
TAAN
Giardia lamblia IF, IC, EIA, TAAN Heces
Entamoeba histolytica EIA, IC, TAAN Heces, absceso
Infecciones en sangre o Brucella spp. Aglutinacin Suero
mdula sea Bacteriemia TAAN Sangre con EDTA
Candida spp. Aglutinacin, EIA Suero
Leishmania spp. Tincin, TAAN Sangre, mdula sea
Aglutinacin Orina
Plasmodium spp. Tincin, gota gruesa, IC, Sangre con EDTA
TAAN

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 4 Continuacin

Localizacin proceso Microorganismo/s Tcnicas posibles Tipo de muestra


infeccioso implicado/s
Trypanosoma cruzi IC, EIA Suero
VIH IC, EIA Suero, plasma
Virus hepatitis B (AgHBs) IC, EIA Suero, plasma
CMV IF, TAAN Suero, plasma, orina
Virus Epstein Barr Aglutinacin, EIA, IC Suero, plasma
Infecciones en piel y Virus herpes simple IF Lesin cutnea, tejido
mucosas Virus varicela zoster IF Lesiones cutneas
Dermatofitos IC Muestras ungueales
Estudio de portador S. agalactiae TAAN Exudado vagino-rectal
S. aureus TAAN Exudado nasal, farngeo
Bacterias productoras de TAAN Exudado rectal
carbapenemasas

Abreviaturas: ITS (infeccin de transmisin sexual), IF (inmunofluorescencia), TAAN (tcnicas de amplificacin de cidos
nucleicos), IC (inmunocromatografa), EIA (enzimoinmunoensayo), LCR (lquido cefalorraqudeo), AAR (cido alcohol
resistencia), VIH (virus inmunodeficiencia humana), CMV (Citomegalovirus), AgHBs (Antgeno de superficie del Virus de
la hepatitis B)

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 5. Conservacin de las principales muestras empleadas en el diagnstico microbiolgico


Muestra Determinacin Envase Transporte Conservacin
Tiempo, Tiempo,
Temperatura Temperatura
Sangre Hemocultivo Frascos de hemocultivos 2 h, TA 24 h, TA
Serologa Tubo de suero 2-4 h, TA <24 h, 2-8C
Tubo de plasma (no vlido si hay >24 h, -20C
que inactivar) o -70C
Cargas virales Tubo plasma (nunca 2 h, TA 72h, -20C
heparina) >72h, -70C
Virus Tubo plasma 2 h, TA
Deteccin cidos nucleicos Tubo sangre con EDTA 2 h, TA
Parsitos Sangre con EDTA 1h, TA 2-8C
Mdula sea Bacterias/Hongos/Micobacterias Tubo estril con anticoagulante, 2 h, TA 24 h, TA
frascos hemocultivos
Parsitos (Leishmania spp.) Tubo estril con 2 h, TA
anticoagulante (heparina)
Deteccin cidos nucleicos Tubo sangre con EDTA 2 h, TA
Virus Tubo estril con 24 h, 2-8C >24h, -70C
anticoagulante
Catter intravenoso Bacterias/Hongos Frasco estril 15 min, TA 24 h, 2-8C
Lquido Bacterias Frasco estril 15 min, TA 24 h, 35C
cefalorraqudeo
Micobacterias Frasco estril 2 h, TA 24 h, 2-8C
Hongos Frasco estril 2 h, TA 24 h, 35C
Virus Frasco estril 15 min, TA o 2-8C 24 h, 2-8C
Serologa Frasco estril 2 h, TA 24 h, 2-8C
Parsitos Frasco estril 15 min, TA
Deteccin cidos nucleicos Frasco estril 2 h, TA 24 h, 2-8C
Otros lquidos Bacterias Frasco estril, tubo con medio 15 min, TA 24 h, 2-8C
estriles: abdominal, anaerobios, frascos de muestra en frasco
amnitico, pleural, hemocultivo, de hemocultivos TA
asctico, biliar, jeringa sin aire
articular, sinovial, Hongos Frasco estril 2 h, TA 24 h, TA
pericrdico
Micobacterias Frasco estril 2 h, TA 24 h, 2-8C
Virus Frasco estril, tubo con MT para 15 min, TA o 2-8C 24 h, 2-8C
virus
Parsitos Frasco estril 15 min, TA 24 h, TA
Deteccin cidos nucleicos Frasco estril 2 h, TA 24 h, 2-8C
Abscesos abiertos Bacterias Frasco estril, torunda con MT 2 h, TA 24 h, 2-8C
/ heridas
/quemaduras Hongos Frasco estril, torunda con MT 2 h, TA 24 h, TA
Virus Torunda seca o con MT de virus 24 h, 2-8C. >24 h, -70C
Transferir a MT de virus
Abscesos cerrados Bacterias Frasco con medio para 2 h, TA 24 h, 2-8C
anaerobios, jeringa muestra en frasco
aspiracin (sin aguja) de hemocultivos TA
Hongos Frasco estril, jeringa 2 h, TA 24 h, TA
aspiracin (sin aguja)
Virus Jeringa (sin aguja) o en MT de 24 h, 2-8C. >24 h, -70C
virus Transferir a MT de virus
Biopsias/tejidos Bacterias / Hongos Frasco estril, frasco con MT para 15 min, TA 24 h, 2-8C
anaerobios
Micobacterias Frasco estril 15 min, TA 24 h, 2-8C
Virus / cidos nucleicos Frasco estril, frasco con MT de 24 h, 2-8C. >24 h, -70C
virus Transferir a MT de virus
Orina Bacterias / Hongos Frasco estril 1 h, TA 24 h, 2-8C
Tubo con conservante 24 h, TA
(conservante)
Virus (cultivo o deteccin cidos Frasco estril o con MT de virus 24 h, 2-8C
nucleicos)
Antgenos urinarios Frasco estril 2 h, TA <24h, TA
>24 h, 2-8C
>14 d, -20C

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 5 Continuacin

Muestra Determinacin Envase Transporte Conservacin


Tiempo, Tiempo,
Temperatura Temperatura
Mycoplasma spp. y Ureaplasma Frasco estril Inocular en MT 8 h, TA
spp. especfico 36 h, 2-8C
Leptospira spp. Frasco estril 1 h, TA
Parsitos Frasco estril 2 h, TA
Orina (primera Deteccin por PCR de: Frasco estril o con MT 2 h, TA (hasta 2 das, <5 das, 2-8C
miccin) Chlamydia trachomatis, especfico dependiendo del
Neisseria gonorrhoeae medio)
Orina Bacterias Frasco estril o con MT para 2 h, TA 24 h, 2-8C
suprapbica anaerobios
Genital: Bacterias / Hongos Frasco estril 2 h, TA 24 h, TA
secrecin
prosttica
Genital: Virus del papiloma humano Cepillo con medio especial o Dependiendo del
cervical citologa lquida medio, hasta 2-3
semanas a TA
Genital: Bacterias Torunda con medio de 2 h, TA 24 h, TA
cervical, transporte
uretral, Inoculacin directa en medios
rectal de cultivo (Neisseria
gonorrhoeae)
Genital: Chlamydia trachomatis MT especial Cultivo: inoculacin
cervical, (cultivo, PCR) inmediata
uretral
torunda seca (fluorescencia, PCR: dependiendo del
PCR) medio hasta 2 das, TA
Mycoplasma hominis Torunda dacrn o similar Inocular en MT 8 h, TA
Ureaplasma urealyticum especfico 36 h, 2-8C
Genital: Bacterias / Hongos / Parsitos Torunda con MT 2 h, TA 24 h, TA
vaginal Torunda seca para Gram
Medio especial para
Trichomonas vaginalis y
levaduras
Genital: Streptococcus agalactiae Torunda con MT 2 h, TA <24h 2-8C
vagino-rectal
Genital: lcera Virus Torunda seca y transferir a MT 24 h, 2-8C >24 h, -70C
de virus
Treponema pallidum Campo oscuro Visualizacin inmediata
Genital: Bacterias MT para anaerobios 2 h, TA 24 h, 2-8C
endometrio,
productos
concepcin
Heces Bacterias Frasco estril 2 h, TA 24 h, 2-8C
MT Cary-Blair 24 h, TA (Cary-Blair) 48 h, 2-8C o TA
(gel o lquido) (Cary-Blair)
Clostridium difficile Frasco estril 1 h, TA 48 h, 2-8C (cultivo)
1-24 h, 2-8C <72 h, 4-8C
>24 h, 2-8C o -20C (citotoxina)
>72 h, -70C
(citotoxina)
Parsitos Tubo con fijador Indefinido, TA Indefinido, TA
(SAF/MIF/PVA, ecolgico, etc.)
Virus Frasco estril (transferir a 24 h, 2-8C
medio de virus)
Pruebas rpidas deteccin Frasco estril o Cary-Blair 2 h, TA >2 y <48 h, 2-8C
antgenos
Heces/Rectal Virus Torunda seca y transferir a MT 24 h, 2-8C
de virus
Bacterias Torunda con medio 24 h, TA 48 h, 2-8C o TA
Cary-Blair
Aspirado Bacterias / Hongos Frasco estril 2 h, 2-8C 24 h, 2-8C
gstrico Micobacterias Frasco estril 15 min, TA o 24 h, 2-8C
neutralizar en
1 h

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 5 Continuacin
Muestra Determinacin Envase Transporte Conservacin
Tiempo, Tiempo,
Temperatura Temperatura
Portadores: Bacterias / Hongos Torunda con MT 2 h, TA 24 h, TA o 2-
Farngeo / nasal 8C
/ rectal / axilar /
inguinal /
perineal
Conjuntival Bacterias / Hongos Torunda con MT 2 h, TA 24 h, TA

Inoculacin directa en medios de 15 min, TA


cultivo
Raspado Bacterias / Hongos Inoculacin directa en medios de 15 min, TA 24 h, TA
corneal cultivo
Aspirado Bacterias / Hongos Frasco estril, inoculacin directa en 15 min, TA 24 h, TA
lquido vtreo medios de cultivo
Ocular Virus Torunda sin medio o aspirado y 24 h, 2-8C
transferir a MT de virus
Odo externo Bacterias / Hongos Torunda con MT 2 h, TA 24 h, 2-8C
Odo interno Bacterias / Hongos Torunda con MT 2 h, TA 24 h, TA
frasco estril
MT de anaerobios
TRS: Oral Bacterias / Hongos Torunda con MT 2 h, TA 24 h, TA
Virus Torunda seca y transferir a MT virus 24 h, 2-8C >24 h, -70C
TRS: Nasal Bacterias / Hongos Torunda con MT 2 h, TA 24 h, TA
TRS: Exudado / Bacterias Torunda con MT 2 h, TA 24 h, TA
Aspirado Bordetella pertussis Aspirado en frasco estril Inmediato, 2-8C
nasofarngeo Torunda seca: Inocular
inmediatamente en medios
especiales
Virus / deteccin cidos Frasco estril y transferir a MT de 2 h, 2-8C o TA >2 h y <5 das,
nucleicos virus 2-8C
>5 das, -70C
TRS: Farngeo Bacterias / Hongos Torunda en MT 2 h, TA 24 h, TA
Antgeno S. pyogenes Torunda seca 2 h, TA 72 h, 2-8C
Virus / deteccin cidos Torunda seca y transferir a MT virus 2 h, 2-8C o TA >2 h y <5 d, 2-
nucleicos inmediatamente 8C
>5 das, -70C
TRS: Sinusal Bacterias / Hongos Frasco estril o en MT para 15 min, TA 24 h, TA
anaerobios
Muestras del Bacterias / Micobacterias / Frasco estril 2 h, TA 24 h, 2-8C
Tracto Hongos / Parsitos
Respiratorio Virus / deteccin cidos Frasco estril y transferir a MT virus 2 h, TA >2 h y <5 d, 2-
Inferior1 nucleicos inmediatamente 8C
>5 das, -70C
Piel, pelo y Hongos Frasco estril o inoculacin directa en 4 h, TA 24 h, TA
uas medios de cultivo
Oxiuros y Parsitos Test de Graham Frasco estril o 2 h, TA
parsitos frasco con agua o suero o fijador
macroscpicos

Abreviaturas: TA (temperatura ambiente), SAF (acetato sdico-formalina), PVA (polivinil-alcohol), MIF (mertiolato-ioduro-formalina), TRS:
tracto respiratorio superior, TRI: tracto respiratorio inferior, MT (medio de transporte).
1Tracto Respiratorio Inferior incluye: esputo, esputo inducido, aspirado traqueal, aspirado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado
telescopado y puncin transtorcica aspirativa con aguja ultrafina

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DOCUMENTO CIENTFICO

- Para el transporte por va postal, el manual del correo


5.1 REGULACIONES PARA EL TRANSPOR- postal (Letter post manual) publicado por la Unin
TE INTERNACIONAL DE SUSTANCIAS IN- Postal Universal (UPU) refleja las recomendaciones de
FECCIOSAS las Naciones Unidas utilizando las disposiciones de la
OACI como base para los envos.
Las normas internacionales para el transporte de sus-
tancias infecciosas a travs de cualquier medio de 5.2 REGULACIONES LOCALES Y NACIO-
transporte estn basadas en las Recomendaciones del NALES PARA EL TRANSPORTE DE SUS-
Comit de Expertos de las Naciones Unidas para el TANCIAS INFECCIOSAS
Transporte de Artculos Peligrosos (UNCETDG).
Los principios en los que se basa un transporte seguro
a nivel nacional o local son los mismos que se aplican
Estas recomendaciones se presentan en forma de
para el transporte internacional y la finalidad es que la
reglamentacin modelo. La Reglamentacin Modelo
de las Naciones Unidas queda reflejada en la legislacin muestra no tenga ninguna posibilidad de salir del em-
internacional por medio de los siguientes reglamentos balaje en las circunstancias normales de transporte. En
internacionales de transporte. Espaa el Real Decreto 65/2006, de 30 de enero, es-
tablece los requisitos para la importacin y exportacin
- Para el transporte areo, la reglamentacin de muestras biolgicas y la Orden SAS/3166/2009, de
internacional jurdicamente vinculante son las 16 de noviembre, sustituye los anexos del Real Decreto
Instrucciones Tcnicas para el Transporte sin riesgos de 2006. Para la importacin/exportacin de muestras
de Mercancas Peligrosas por Va Area publicadas biolgicas dentro del Espacio Aduanero comunitario, la
por la Organizacin de Aviacin Civil Internacional instruccin tcnica de la Subdireccin General de San-
(OACI). La Asociacin Internacional de Transporte
idad Exterior de 10 de enero de 2012 pone de manifie-
Areo (IATA) publica unas normas sobre artculos
sto que no es necesaria la autorizacin por parte del
peligrosos (Dangerous Goods Regulations, DGR) que
incorporan las disposiciones de la OACI y pueden Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad.
aadir restricciones adicionales. Las normas de la OACI Cuando el laboratorio requiera enviar muestras a un
se aplican en todos los vuelos internacionales. En los centro externo el cual se encuentredentro de la Unin
vuelos nacionales, las autoridades de aviacin civil de Europea (UE),la normativa actual establece que el en-
cada pas aplican la normativa nacional pertinente, que vo solamente debe cumplir con la normativa reflejada
normalmente se basa en las disposiciones de la OACI, para los procedimientos de recogida, embalaje, eti-
pero puede presentar variaciones. Las variaciones de quetado y envo, no siendo necesario ningn documen-
carcter estatal y las debidas al operador se publican en to para que el paquete pueda salir del pas.
las instrucciones tcnicas de la OACI y en las normas
sobre artculos peligrosos de la IATA. Si el laboratorio se encuentrafuera de la UE,el promo-
- Para el transporte por ferrocarril en pases de Europa, tor tiene dos opciones entre las que elegir.
Oriente Medio y Norte de frica se aplica el Reglamento
relativo al Transporte Internacional de Mercancas - Solicitar la inscripcin voluntaria en el registro de
Peligrosas por Ferrocarril (RID). El RID tambin se importadores y exportadores de muestras biolgicas
aplica en el transporte interior en la Unin Europea, aportando un documento firmado y sellado por el labo-
segn lo estipulado en la Directiva 2008/68/EC del ratorio de origen a laDireccin General de Salud Pbli-
Consejo Europeo. ca, Calidad e Innovacin, donde se identifique el en-
vo, sus cualidades y los posibles riesgos para la salud
- Para el transporte por carretera, el Acuerdo Europeo
en caso de que existieran, y la aprobacin del ensayo
sobre Transporte Internacional de Mercancas
por parte de la Agencia Espaola de Medicamentos y
Peligrosas por Carretera (ADR) se aplica en 48 pases.
Este acuerdo se aplica tambin en el transporte interior Productos Sanitarios (AEMPS). Cuando toda la docu-
de la Unin Europea, segn lo estipulado en la Directiva mentacin ha sido validada, se emite un certificado vi-
2008/68/EC del Consejo Europeo. gente para 5 aos que se incluir junto con el envo de
muestras y que permitir que las muestras salgan de
- Para el transporte martimo, el Cdigo Internacional Espaa y entren en el pas de destino.
Martimo de Mercancas Peligrosas publicado por la
- Solicitar unalicencia de importacin y exportacinoc-
Organizacin Martima Internacional (OMI) es
asional de muestras biolgicas.Para ello debe cumpli-
de cumplimiento obligado para todas las partes
mentarse un documento, firmarse y sellarse, donde se
contratantes en el convenio internacional para la
contemple el contenido del envo, sus caractersticas y
seguridad de la vida humana en el mar (SOLAS).

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DOCUMENTO CIENTFICO

los riesgos que puedan existir para la salud. Adems,el Categora B: Sustancia infecciosa que no cumple los cri-
promotor debe enviar unadeclaracin escritaen la que terios para su inclusin en la categora A. Las sustancias
se realice una descripcin de los objetivos del anlisis infecciosas de la categora B se asignarn al UN 3373.
de esas muestras biolgicas, la responsabilidad de que
sern usadas y destruidas correctamente y la especifi- Exenciones: Las muestras que no estn sujetas a la
cacin de que no se trata de muestras que posean fines reglamentacin sobre transporte de mercancas peligro-
comerciales. Por ltimo, se incluir tambin un modelo sas son las siguientes:
de despacho cumplimentado que deber revisar y ges-
tionar el inspector aduanero. - Las muestras que no contengan sustancias infeccio-
Una vez que se ha comprobado toda la documentacin, sas o que no sea probable que causen enfermedades
se emitir una autorizacin para aceptar o rechazar en seres humanos o animales a menos que cumplan los
laimportacin o exportacin de las muestras biolgi- criterios para su inclusin en otra clase.
casque ser remitida al interesado y al punto fronterizo - Las sustancias que contengan microorganismos que no
que se haya solicitado. nicamente podrnautorizarse sean patgenos en seres humanos o animales, a menos
despachos aduaneros en los recintos aduaneros y que cumplan los criterios para su inclusin en otra clase.
puntos fronterizos. Para poder autorizar la salida de las - Aquellas sustancias en las que los patgenos pre-
muestras el interesado debe presentar la autorizacin sentes se hayan neutralizado o inactivado de tal manera
firmada del titular de la Direccin General de Salud que no supongan riesgos para la salud.
Pblica, Calidad e Innovacin, adems del despacho - Las muestras ambientales (incluidas las muestras de
previamente firmado por el inspector en el servicio de alimentos y de agua) que se considere que no presen-
Sanidad Exterior que corresponda. tan riesgos apreciables de infeccin.
- Las gotas de sangre seca, tomadas depositando una
5.3 CLASIFICACIN DE LAS SUSTANCIAS de ellas sobre un material absorbente, o las muestras
INFECCIOSAS PARA EL TRANSPORTE para deteccin de sangre en materias fecales.
- La sangre recogida para transfusiones o para prepa-
A las mercancas peligrosas se les asignan los nmer- racin de productos sanguneos, y los productos san-
os UN y en funcin de su clasificacin de peligrosidad guneos y los tejidos y rganos destinados a trasplante.
y de su composicin se les atribuye las designaciones - Las muestras de pacientes que presenten un riesgo
oficiales de transporte que les corresponden. Las des- mnimo de contener agentes patgenos si se trans-
ignaciones oficiales de transporte se utilizan por tan- portan en un embalaje/envasado diseado para evitar
to para identificar claramente al artculo o sustancia cualquier fuga y en el que figure la indicacin Exempt
peligrosos. Las sustancias infecciosas se clasifican human specimen (muestra humana exenta). El emba-
con arreglo a la divisin 6.2 y se asignan a los nmeros laje/envasado de este tipo de muestras deber cumplir
UN 2814, UN 2900, UN 3291 o UN 3373, segn corre- el sistema bsico de envasado triple que se muestra en
sponda. As, las sustancias infecciosas se dividen en el apartado 5.4.1
las siguientes categoras:
5.4 PREPARACIN DE ENVOS PARA SU
Categora A: Sustancia infecciosa que se transporta en TRANSPORTE
una forma que, al exponerse a ella, es capaz de causar
una incapacidad permanente, poner en peligro la vida o Los requisitos de envasado, etiquetado y docu-
constituir una enfermedad mortal para seres humanos mentacin de muestras infecciosas actualmente vigen-
o animales previamente sanos. Corresponden por tanto tes, estn determinados por el UNCETDG y se reco-
a esta categora los patgenos pertenecientes al grupo gen en las instrucciones de embalaje/envasado P620 y
de riesgo 4, incluyendo los agentes identificados como P650. Estos requisitos estn establecidos en funcin de
patgenos nuevos o emergentes o las sustancias so- si la muestra infecciosa pertenece a la categora A (UN
bre las que haya dudas acerca de si cumplen o no los 2814 y UN2900) o a la categora B (UN 3373), respectiv-
criterios de inclusin en esta categora. Todas aquellas amente. Es importante tener adems en cuenta que las
sustancias que pertenezcan a la categora A y puedan lneas areas internacionales prohben estrictamente
causar enfermedad en seres humanos y en animales se que los pasajeros lleven sustancias infecciosas de las
asignarn al UN 2814. Aquellas que solo causen enfer- categoras A o B como equipaje de mano y que trans-
medad a animales se les asignar al UN 2900. porten estos materiales en valijas diplomticas.

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5.4.1. Sistema bsico de envasado triple:

El sistema bsico de envasado tripe se deber utilizar


para transportar todas las sustancias infecciosas. Este
sistema de transporte comprende tres capas (Figura 1):

Recipiente primario. Se trata del recipiente primario a


prueba de filtraciones y estanco que contiene la mues-
tra. Este recipiente se debe envolver en material ab-
sorbente con capacidad para absorber todo el fluido en
caso de rotura o fuga.

Recipiente secundario. Recipiente resistente, estanco,


a prueba de filtraciones que encierra y protege el re- Figura 1. Ejemplo de sistema de embalaje triple para
cipiente primario. Se pueden colocar varios recipientes el embalaje y etiquetado de sustancias infecciosas
primarios envueltos en un recipiente secundario, pero de categora A (tomado de la Gua OMS 2015)
se deber usar suficiente material absorbente para ab-
sorber todo el fluido en caso de rotura o fuga. Para el transporte por superficie no se establece una
cantidad mxima por paquete. Los lmites por paquete
para el transporte areo 50 ml o 50 g en aviones
Recipiente exterior. Los recipientes secundarios se
de pasajeros y 4 litros o 4 kg en aviones de carga.
colocan en envases exteriores de transporte provistos
con un material amortiguador adecuado. Los recipien- Todo recipiente primario cuya capacidad supere
tes exteriores protegen el contenido de los elementos los 50 ml deber contar con una indicacin de la
exteriores, como daos fsicos, mientras el bulto se en- orientacin correcta en el embalaje exterior que
cuentra en trnsito. Ninguna de las caras del recipiente permita mantener las tapas en la parte superior.
exterior tendr dimensiones inferiores a 10 10 cm. Se fijarn sendas etiquetas de orientacin (flechas
acompaadas de la indicacin UP) (ARRIBA)
Cada envase preparado para su transporte deber en dos lados opuestos del embalaje exterior.
estar correctamente marcado y etiquetado e ir acom- Marcado: En los paquetes que contengan el mate-
paado de los documentos de envo pertinentes. A con- rial a transportar se representan marcas que pro-
tinuacin, se describen los requisitos relativos a estos porcionan informacin acerca de su contenido, la
aspectos. naturaleza del peligro que suponen, as como las
normas de embalaje aplicadas. Las marcas de los
5.4.2. Requisitos de envasado, marcado, eti- envases se ubicarn de tal forma que sean clara-
quetado y documentacin correspondiente a mente visibles y que no las cubra ninguna otra et-
las sustancias infecciosas de categora A. iqueta o marca. Cada paquete mostrar la sigui-
ente informacin en el embalaje exterior:
Envasado: Las sustancias infecciosas de la categora o el nombre y la direccin del expedidor (re-
A solamente pueden ser transportadas en envases que mitente, consignador)
cumplan las especificaciones correspondientes a la o el nmero de telfono de una persona re-
clase 6.2 de Naciones Unidas y la Instruccin de en- sponsable e informada acerca del envo
vasado P620 (figura 1 y ver transporte en el documen- o el nombre y la direccin del destinatario
to tcnico PNT-RTPM-02). Esto asegura que se han (consignatario)
superado pruebas estrictas de resistencia. El embala-
je exterior debe llevar la marca de embalaje tipificada o el nmero UN seguido de la designacin ofi-
cial de transporte [UN 2814 INFECTIOUS
de Naciones Unidas, que certifica la superacin por el SUBSTANCES AFFECTING HUMANS
envasado de las pruebas de resistencia a satisfaccin (SUSTANCIAS INFECCIOSAS QUE AFEC-
de la autoridad competente. La marca de las Naciones TAN AL SER HUMANO) o UN 2900 IN-
Unidas en s misma no indica que el envase haya sido FECTIOUS SUBSTANCES AFFECTING
sometido a pruebas, y los usuarios del mismo deberan ANIMALS (SUSTANCIAS INFECCIOSAS
QUE AFECTAN A LOS ANIMALES), segn
consultar a sus proveedores si el envase preparado proceda]. No es necesario mostrar los nom-
para su expedicin cumple este requisito. bres tcnicos en el embalaje.

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DOCUMENTO CIENTFICO

o requisitos relativos a la temperatura de al- para sustancias infecciosas de categora A o la marca


macenamiento (optativo) mostrada en la figura 9 para sustancias infecciosas de
o cuando se utilice hielo seco o nitrgeno categora B).
lquido: el nombre tcnico del refrigerante,
el nmero UN pertinente y la cantidad neta. Nombre: gas no inflamable ni txico

Etiquetado: Existen dos tipos de etiquetas: a) et- Dimensiones mnimas: 100 100
iquetas de peligro, con forma de cuadrado orien- mm (embalajes pequeos: 50 50
tado en un ngulo de 45 (romboides), requeridas mm)
para la mayora de las mercancas peligrosas de N. de etiquetas por paquete: 1
todas las clases; b) etiquetas de manipulacin, de
diversas formas, requeridas, ya sea aisladas o junto Color: verde y blanco o verde y
con las etiquetas de peligro, para algunas mercan- negro
cas peligrosas. Se fijarn al exterior de todos los
paquetes destinados a la expedicin de mercan- Figura 4. Etiqueta de peligro para nitrgeno lquido; las
cas peligrosas (excepto los sujetos a exenciones sustancias empaquetadas en nitrgeno lquido debern
especficas) una o ms etiquetas de peligros espe- llevar esta etiqueta adems de la etiqueta de peligro
cficos. Las etiquetas de peligro mostradas en las principal (por ejemplo, la etiqueta que se muestra en
figuras 2 a 6 se utilizan para sustancias infecciosas la figura 2 para sustancias infecciosas de categora
de categora A: A o la marca mostrada en la figura 9 para sustancias
infecciosas de categora B).
Nombre: sustancia infecciosa
Nombre: lquido crigeno
Dimensiones mnimas: 100 100
mm (embalajes pequeos: 50x50 Dimensiones mnimas: Standard
mm) A7: 74 105 mm
N. de etiquetas por paquete: 1 n. de etiquetas por paquete: 1
Color: blanco y negro Color: verde y blanco
Se mostrar la expresin Figura 5. Etiqueta de manipulacin para lquidos
INFECTIOUS SUBSTANCE criognicos; en el transporte areo, cuando se utilicen
(SUSTANCIA INFECCIOSA). En lquidos crigenos (gases licuados a temperaturas muy
algunos pases se exige incluir bajas), deber adherirse esta etiqueta a los recipientes
la siguiente declaracin: Si el o frascos termoaislados utilizados como embalaje/
paquete sufre daos o fugas, envase exterior adems de las etiquetas o marcas
notifquelo inmediatamente a las mostradas en las figuras 3, y 10, segn proceda.
autoridades de salud pblica.
Nombre: Etiqueta de orientacin
Figura 2. Etiqueta de peligro para sustancias
Dimensiones mnimas: Norma A7:
infecciosas de categora A y para microorganismos y 74 105 mm
organismos modificados genticamente que se ajustan
a la definicin de sustancia infecciosa de categora A N. por paquete: 2, en lados
opuestos
Nombre: sustancias peligrosas mis-
Color: blanco y negro o blanco y rojo
celneas
Dimensiones mnimas: 100 100 Pueden tambin mostrarse en
mm (embalajes pequeos: 50x50 la tapa superior del paquete las
mm) expresiones THIS SIDE UP
(ESTE LADO HACIA ARRIBA) o
N. de etiquetas por paquete: 1 THIS END UP (ESTE EXTREMO
HACIA ARRIBA).
Color: blanco y negro
Figura 6. Etiqueta de orientacin para indicar la
Figura 3. Etiqueta de peligro para determinados posicin de los cierres de los recipientes primarios;
microorganismos y organismos modificados para el transporte areo de sustancias infecciosas
genticamente no infecciosos (UN 3245) y para lquidas de la categora A en cantidades que superen
dixido de carbono slido (hielo seco) (UN 1845); las los 50 ml por recipiente primario, se deber adherir
sustancias empaquetadas en hielo seco debern llevar esta etiqueta en dos lados opuestos del paquete con
esta etiqueta adems de la etiqueta de peligro principal las flechas indicando la orientacin correcta, adems
(por ejemplo, la etiqueta que se muestra en la figura 2 de la etiqueta que se muestra en la figura 3.

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DOCUMENTO CIENTFICO

Documentacin: Para el envo de embalajes que Figura 7. Ejemplo de declaracin de mercancas


contengan sustancias infecciosas de categora A peligrosas cumplimentada por el remitente.
se requieren los siguientes documentos de ex-
pedicin:

o Elaborados y firmados por el remitente:


para transporte areo habr que
adjuntar una declaracin de mer-
cancas peligrosas del expedidor
(vase el ejemplo de la figura 7)

una lista de empaque (o de em-


barque) o factura proforma en la
que se indique la direccin del des-
tinatario, el nmero de paquetes y
una descripcin de su contenido,
indicando su peso y valor (Nota:
para el transporte internacional, si
el contenido se proporciona gratis
deber indicarse un valor mnimo,
para fines aduaneros).
un permiso o declaracin (o ambos)
de importacin o exportacin, o am-
bos, si fuera preciso

o Documentos que debe cumplimentar el re- 5.4.3 Requisitos de envasado, marcado, eti-
mitente o su agente: quetado y documentacin correspondiente a
un conocimiento de embarque las sustancias infecciosas de categora B.
areo, para el transporte areo, o
documentos equivalentes, para los Envasado: se aplica el sistema de envasado
envos por carretera, tren y mar. bsico triple, incluso para el transporte local por
superficie. No obstante, no es necesario aportar
Adems de los documentos sealados, en las documentos relativos a los anlisis. El envasado
mercancas asignadas a los nmeros UN 2814 y UN debe cumplir plenamente los requisitos de la In-
2900 se incluir una relacin del contenido entre el struccin P650 (figura 8 y ver transporte en doc-
envase secundario y el envase exterior. Tambin, a umento tcnico RTPM 01).
efectos de la documentacin, la designacin oficial de
transporte se complementar con el nombre tcnico. Para el transporte por superficie no se es-
No es necesario que el nombre tcnico aparezca tablece una cantidad mxima por paquete.
en el embalaje. Cuando no se conozca la sustancia Para el transporte areo:
infecciosa que va a transportarse, pero se sospeche
que cumple los criterios para su inclusin en la o ningn recipiente primario tendr un
categora A y la asignacin a los nmeros UN 2814 o contenido mayor que 1 litro y el en-
UN 2900, la indicacin sustancia infecciosa de la que vase exterior no debe contener ms
se sospecha que pertenece a la categora A, deber de 4 litros (para lquidos)
figurar en el documento de transporte entre parntesis,
a continuacin de la designacin oficial de transporte o excepto si contiene partes del cuer-
en el documento de transporte, pero no en envase po, rganos o cuerpos enteros, el
exterior. envase exterior no debe contener
mas de 4kg

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DOCUMENTO CIENTFICO

al menos 6 mm. Para el transporte


areo, los lados del cuadrado
medirn al menos 50 mm.

Color: no se especifica,
siempre que la marca est expues-
ta sobre la superficie exterior del
embalaje exterior sobre un fondo
de color que contraste con el de la
marca y que sea claramente visible
y legible.

Se mostrarn junto a la marca


las palabras BIOLOGICAL SUB-
STANCE, CATEGORY B (SUS-
TANCIA BIOLGICA, CATEGORA
B) en letras con una altura de por
Figura 8. Ejemplo de sistema de envasado triple para
lo menos 6 mm.
el embalaje y etiquetado de sustancias infecciosas de
categora B (tomado de las guas OMS 2015-2016).
Figura 9. Marca para sustancias infecciosas de
Si se cumplen todos los requisitos establecidos categora B (tomado de OMS 2015-2016).
en la Instruccin de envasado P650, no
se establecen requisitos de transporte Para el transporte areo:
adicionales. La Instruccin P650 comprende
todos los requisitos necesarios para el envo de o Cuando se utiliza hielo seco (dixido
sustancias infecciosas de categora B. de carbono slido), se aplicar la eti-
queta de la figura 3.
Marcado: En los paquetes que contengan sus-
tancias infecciosas de categora B deber expo- o Para lquidos crigenos se aadirn
nerse la siguiente informacin: tambin las etiquetas de las figuras 4
y 5.
o para transporte areo: el nombre, la
direccin y el nmero de telfono del Documentacin: Para el transporte de material
expedidor (remitente, consignador) infeccioso perteneciente a la categora B no se
requieren documentos de mercancas peligro-
o para transporte areo: el nmero de sas. El remitente debe incluir los siguientes doc-
telfono de una persona responsable umentos:
e informada acerca del envo
o para envos internacionales: una lista
o el nombre, la direccin y el nmero de de empaque (o de embarque) o factu-
telfono del destinatario (consignatar- ra proforma en la que se indiquen las
io) direcciones del expedidor y del des-
o la designacin oficial de transporte tinatario, el nmero de paquetes y la
(BIOLOGICAL SUBSTANCE, CATE- descripcin de su contenido, indicando
GORY B o SUSTANCIA BIOLGICA, su peso y valor (si los productos envia-
CATEGORA B) junto a la marca rom- dos son gratuitos, deber aparecer la
boide mostrada en la figura 9 declaracin sin valor comercial)
o requisitos relativos a la temperatu- o un permiso o declaracin de import-
ra de almacenamiento (optativo). acin o exportacin, o ambos, si fuera
preciso.
Para los envos de sustancias infecciosas de categora El expedidor o agente deber cumplimentar la
B se utiliza la marca que se muestra en la figura 9. siguiente informacin:
Dimensiones mnimas: la o un conocimiento de embarque areo,
anchura de la lnea que delimita el para el transporte areo, o documen-
cuadrado ser al menos 2 mm y la tos equivalentes, para los envos por
altura de las letras y nmeros ser carretera, tren y mar.

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DOCUMENTO CIENTFICO

6. RECEPCIN EN EL LABORATORIO DE 6.2 INCIDENCIAS Y CRITERIOS DE RECHA-


MICROBIOLOGA ZO

6.1 REQUISITOS PARA SU REGISTRO Cualquier incidencia aparecida en relacin al


incumplimiento de alguno de los requisitos necesarios
En el proceso de recepcin de las muestras en el para la aceptacin de una muestra deber ser
laboratorio, se deben comprobar una serie de aspectos registrada. En ese registro de incidencias deber figurar
que permitan determinar si la muestra cumple los la fecha en la se recibe la muestra, su identificacin,
requisitos de calidad necesarios para ser procesada. De el tipo de muestra, el servicio solicitante, la persona
no ser as, los resultados de los estudios microbiolgicos que la detecta, la descripcin del tipo de incidencia,
realizados pueden verse afectados negativamente, lo que si se ha podido resolver o no, y en caso afirmativo, la
puede conllevar a la no deteccin del agente etiolgico forma en la que se ha resuelto. Las incidencias ms
o a la deteccin de microorganismos contaminantes, es frecuentes en la llegada de una muestra al laboratorio
decir, que no sean los responsables de la enfermedad, de Microbiologa, las acciones a realizar y los criterios
lo que podra conllevar a la instauracin de tratamientos de rechazo ante cada caso son las siguientes:
inadecuados o innecesarios.
- Identificacin incorrecta: no se aceptar una muestra
As, en el proceso de recepcin de la muestra clnica sin identificar, mal identificada o en la que no coincidan
se requiere: el nmero de peticin con la de la muestra. En cualquier
caso, se contactar con el mdico peticionario
Una correcta identificacin de la muestra: este hacindole conocer la necesidad de que procedan a
hecho es indispensable para poder establecer la correcta identificacin de la muestra. Si se puede
una correspondencia inequvoca entre el con- recoger otra muestra, se solicitar nuevamente.
tenedor en el que se encuentra la muestra re- Dependiendo de la importancia de la muestra, se
puede optar a llevar a cabo su procesamiento antes de
cibida, la muestra que contiene y el paciente al
la correcta identificacin, con el objeto de que no se
cual pertenece. deteriore la misma.
Que el tipo de muestra recibido sea adecuado
para los estudios solicitados. - Muestras derramadas: no se aceptarn muestras
claramente derramadas y se proceder como en el
Que el volumen o cantidad de muestra sea el caso anterior solicitando una nueva muestra. En el caso
necesario para poder llevar a cabo los estudios de no ser posible la recogida de una nueva muestra, se
debe desinfectar externamente el envase o trasvasar
microbiolgicos previstos.
la muestra a un contenedor estril. En este caso, se
Que la muestra se haya transportado en el indicar en el informe de resultados que la muestra
estaba derramada y que los resultados deben ser
contenedor adecuado y en las condiciones de
interpretados con la debida precaucin.
transporte y conservacin necesarios para que
su viabilidad no se vea afectada. - Transporte/conservacin inadecuados: si no se
Tras evaluar la idoneidad y adecuacin de la muestra a cumplen los requisitos para el transporte de muestras
en el contenedor adecuado y en las condiciones
la peticin recibida (en tipo y volumen suficiente para las
necesarias (tabla 5), se solicitar una nueva muestra.
peticiones de pruebas solicitadas), esta es etiquetada y
En el caso de muestras que no se puedan volver a
se introducen los datos en el sistema informtico del recoger (por ejemplo, muestras quirrgicas), se puede
laboratorio junto con la informacin proporcionada en el optar por procesarlas informando por escrito al servicio
volante o se activa la peticin electrnica, estableciendo solicitante de la incidencia en la recogida/transporte
un emparejamiento muestra-solicitud de pruebas con de la muestra y alertando de que los resultados
los datos de etiquetado del propio laboratorio. Es un obtenidos deben ser interpretados con la precaucin
hecho conocido que de un mismo paciente se pueden correspondiente. En el caso de que el transporte
enviar varias muestras y que de una misma muestra deficiente invalide totalmente el estudio microbiolgico
se pueden solicitar varias pruebas y todas deben ser (por ejemplo, muestras en formol), no se aceptarn
caracterizadas por separado (con fecha y nmero). estas muestras y se informar al servicio solicitante de
la inadecuacin de la misma.

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DOCUMENTO CIENTFICO

- Tipo de muestra no adecuada para el estudio solicitado: La periodicidad de la verificacin de los termmetros
si la muestra remitida no es adecuada para el estudio con el termmetro calibrado debe ser establecida por el
solicitado, no se aceptar y se informar al servicio propio laboratorio.
solicitante de la inadecuacin de la misma, aclarando el
tipo de muestra que se requiere. Existen sistemas automticos para el control de la
temperatura, humedad, presin de CO2, etc., que

7. APARATOS Y MATERIALES controlan de una manera permanente (en intervalos


de 15-20 minutos) los anteriores parmetros con gran
fiabilidad y que utilizan sondas de referencia verificadas
Los equipos habituales convencionales necesarios por organismos certificados. Estos sistemas alertan de
en el procesamiento de una muestra para estudio las desviaciones que se producen de una manera ms
microbiolgico son: cabinas de bioseguridad (varios rpida.
niveles segn tipo de laboratorio), estufas (distintas
temperaturas y atmsferas), congeladores, neveras y Tras la automatizacin del procesamiento serolgico,
centrfugas. De manera peridica (preferiblemente a surgieron nuevos instrumentos de automatizacin parcial
diario) debe controlarse la temperatura (y humedad/ (inoculacin y siembra) entre los aos 1970 y 1990
presin de CO2 si fuera necesario) de cada estufa/ (tipo Isoplater o Inoculab) de alguna forma restringido
nevera/congelador al inicio de la jornada de trabajo con inicialmente a muestras lquidas (orinas o suspensiones
un termmetro situado permanentemente en el centro bacterianas preparadas a mano previamente), sistema
de cada equipo. El termmetro debe permitir la medida de procesamiento de hemocultivos y sistemas semi-
de las temperaturas mxima y mnima alcanzadas. automatizados para el clculo de las concentraciones
Se anotar en la hoja de registro de temperatura mnimas inhibitorias (CMIs) con plataformas tipo Phoenix
de cada aparato y en el caso de temperaturas (Becton-Dickinson), Vitek (bioMrieux) o MicroScan
mnima o mxima fuera del rango de aceptacin, (Beckman-Coulter) y plataformas de diagnstico
se debe anotar la incidencia y realizar las acciones molecular. Recientemente se han comercializado los
oportunas frente a esa variacin. Estas acciones, por procesadores automticos de trabajo todo en uno
un lado, deben asegurar los resultados derivados (etiquetado, agitacin, apertura y cierre del contenedor,
de los cultivos y por otro, corregir esa desviacin. inoculacin, siembra, identificacin y antibiograma)
que pueden conectar con incubadoras en diversas
De una manera genrica se sugieren los siguientes condiciones, trabajar en estaciones conectadas con un
intervalos de aceptacin: procesador central y ofrecer identificacin por imagen
de alta resolucin. Actualmente existen tres plataformas
estufas de 35-37C se acepta una mnima su- automatizadas: WASP (Walk-Away Specimen
perior o igual a 34C y mxima inferior o igual Processor) de Copan, Full Microbiology Lab Automation
a 37,5C (FMLA) de bioMrieux y Kiestra de BD Diagnostics. Las
estufas de 42C se aceptan variaciones entre caractersticas especficas de cada una se resumen en la
40-43C tabla 6 junto con las caractersticas de los procesadores
estufas de 30C se aceptan variaciones entre core de cada sistema.
28-32C


estufas de C02 (5-7%)
neveras el intervalo de tolerancia que se acep-
8. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
ta es generalmente de 2-8C
congeladores -20C y -80C 8.1 MEDIOS DE CULTIVOS

Al sembrar una muestra clnica en un medio de cultivo,


Todos los termmetros utilizados en la medida de las bacterias existentes en la muestra empiezan a
temperaturas de los aparatos se han de verificar mediante multiplicarse y eso permite su deteccin. Los medios
un termmetro de referencia calibrado. Se introducir el de cultivos deben contener los elementos nutritivos
termmetro utilizado para la medicin de la temperatura necesarios para permitir la multiplicacin de las
y el termmetro calibrado en el equipo correspondiente bacterias y segn su consistencia pueden clasificarse en
medios slidos (la mayora de los utilizados) y medios
(nevera, congelador o estufa) durante un mnimo de
lquidos (como caldo tioglicolato (TG), caldo cerebro
15 minutos. Se aceptarn aquellos termmetros cuyos
corazn o Brain Heart infusin (BHI), caldo selenito,
desvos no sobrepasen los lmites establecidos para Roiron o medio Middlebrook). Los medios de cultivo
cada uso concreto.

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DOCUMENTO CIENTFICO

convencionales y cromognicos recomendados para pero en el caso de no tener acceso a estas cepas se
el procesamiento de las muestras ms habituales podrn utilizar cepas aisladas en el propio laboratorio
en bacteriologa se detallan en las tablas 7 y 8. con caractersticas perfectamente definidas.
En general, la mayora de las muestras se inoculan en
medio agar sangre de cordero (AS). Adems, para las 8.2 REACTIVOS
muestras de lquidos normalmente estriles, del tracto
respiratorio y del tracto genital, se aade una placa Los reactivos utilizados en la fase de siembra de las
de agar chocolate (ACH) o agar sangre de caballo. muestras, comprenden aquellos que son necesarios
Normalmente, las muestras de orgenes no estriles para realizar los distintos pasos del procesamiento
se siembran en una placa de agar MacConkey (MCK) como el agua destilada, la solucin salina, la
para seleccionar microorganismos que no forman parte
tinta china, los sistemas generadores de distintas
de la microbiota habitual. Existen medios especficos
atmsferas de incubacin, los reactivos comerciales
para determinados patgenos nosocomiales como S.
aureus resistente a la meticilina (SARM) y adems necesarios para la realizacin de las tcnicas rpidas
se pueden utilizar medios selectivos, especialmente usadas en el laboratorio o los empleados en las
tiles para aislar determinados patgenos del resto de diferentes tinciones realizadas sobre las muestras.
la microbiota como el agar Columbia CNA (colistina-
Los reactivos empleados en la tincin de Gram se
nalidxico) que selecciona microorganismos Gram
positivos inhibiendo la microbiota Gram negativa, o los detallan a continuacin:
medios selectivos para el coprocultivo que contienen
1. Metanol absoluto, guardar en botella de cristal
compuestos inhibitorios para la microbiota normal
no patgena. La mayora de estos medios selectivos mbar o contenedores de plstico
utilizan compuestos orgnicos (sales biliares, selenito,
tetrationato, lauril sulfato de sodio, telurito) y tinturas 2. Violeta cristal
(violeta cristal, eosina, azul de metileno) como txicos
qumicos selectivos sobre determinadas bacterias. 3. Solucin de Iodo lugol
Asimismo, el uso de antibiticos incluidos en el medio
4. Decolorantes lentos: etanol 95% o intermedios:
(colistina, cloranfenicol, gentamicina, etc.), solos o en
combinaciones, facilitan la supresin del crecimiento de alcohol-acetona produce resultados ms consistentes,
un tipo de bacterias o varias (ejemplo: medio Sabouread pero se prefiere el etanol para estudiantes y personal
cloranfenicol con cicloheximida para hongos). menos experto mientras que la acetona es ms rpida
Algunos componentes permiten la diferenciacin de pero restringida a personal experto.
los patgenos de forma especfica segn reacciones
metablicas que se expresan como cambios de pH, y (1) Mezcla alcohol-acetona 50:50 en botella mbar de
en otros casos estas reacciones producen cambios de cristal, etiquetar con caducidad de 1 ao y conservar
color en las colonias crecidas en medios cromognicos. a temperatura ambiente. Ambos son inflamables.
Cada laboratorio debe realizar una vigilancia de la
5. Contratincin: safranina, carbol fuchina o fuchina
calidad de los medios de cultivo que utiliza, tanto de
bsica (0.8, 0.1, o 0.2%)
los preparados en el propio laboratorio (apariencia,
crecimiento/inhibicin, esterilidad) como de los que se
adquieran comercialmente. El laboratorio debe solicitar
Los reactivos pueden preparase de forma casera
al proveedor de medios de cultivo los certificados de los o adquirirlos ya preparados comerciales. Deben
controles de calidad donde deben estar incluidas las usarse botes ms pequeos para decantar los
caractersticas fsicas y qumicas que definen al medio reactivos de las tinciones manuales diarias tanto
de cultivo. Esos certificados deben conservarse en el del cristal violeta como de la safranina, pero
laboratorio. Asimismo, se debern realizar controles deben reponerse mensualmente para evitar la
de calidad a los medios adquiridos comercialmente. formacin de precipitados en los portaobjetos.
Con este control no slo se evala la conformidad del
laboratorio con los medios que adquiere ya preparados, Existen teidores automatizados disponibles en
sino que tambin se evalan las condiciones de el mercado como el RAL stainer (bioMerieux), el
procesamiento, estufas y atmsferas utilizadas. Para el Multistainer de Soria Melguizo o el PolyStainer de
control de los medios se deben utilizar preferentemente Direct Industry que permiten teir entre 20 y 30
cepas de coleccin (ATCC, CECT u otras colecciones) portas a un tiempo de forma eficiente y segura.

28
DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 6. Caractersticas de los sistemas totalmente automatizados del laboratorio de microbiologa


Caracterstica Copan WASP Lab BD Kiestra Total Lab bioMrieux FMLA

Mdulo central inoculacin WASP InoqulA Previ-Isola (*)


Inoculacin integrada en cabina No S S
bioseguridad
Capacidad contenedor placas 378 720 270
Apertura y cierre automatizado S Si No
del contenedor de muestra
Agitacin/vrtex muestra S S No
Centrifugacin muestra S No No
Medios diferentes a usar en 1 m 9-18 (con 2 WASP) 12 (48 con 2 InoqulA) 5
N muestras mximo a cargar 72 288 114
Mtodo de inoculacin Automtico, asa metlica Automtico y manual Automtico
calibrada (1, 10 30 ul) Pipeta Pipeta
reutilizable /
N placas inoculadas a la vez 1 sola placa biplaca con 2 5 placas a la vez 1 sola placa y biplaca
asas
Realiza extensiones para Gram S S No
Inocula caldo en tubo S (tubo Copan) S No
Rendimiento inoculaciones/hora 180 400 180
Inoculacin manual de muestras No S S
especiales
Siembra/patrn siembra Asa metlica reutilizable. Bola magntica en patrn Peine con 16 asas
Patrn estra central y circular por toda la placa plstico desechable
zigzag de izquierda a patrn en espiral
derecha
Ordena placas segn incubacin S S S
Colocacin de discos S de antibiograma o No No
automatizado identificacin (optoquina)
Preparacin de placa de SI SI En desarrollo
MALDITOF
Consumibles Asas reutilizables Puntas pipeta, bolas Peine siembra, puntas
siembra pipeta, apertura/cierre
extra

* Ha cesado su distribucin en Espaa

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 7. Recomendaciones de medios de cultivo y realizacin de Gram para muestras microbiolgicas


Muestras Gram AS ACH MCK TG/BHI Otros

Abscesos X X X X X Medios anaerobios1


Biopsias X X X X X Medios anaerobios1
Biopsia gstrica X X Agar Helicobacter
Catter vascular X
Conexiones/piel X
pericatter
Genitales Vaginal X X X Medios hongos2
Examen en fresco o
Roiron
Embarazadas ver
S. agalactiae
Endocervical X X X Thayer Martin
Uretral X X X X Thayer Martin
Secrecin X X X Thayer Martin
prosttica
Rectal Thayer Martin
Embarazadas ver
S. agalactiae
Heces Caldo selenito
Salmonella-Shigella
o similar
Campylobacter
Sangre ampicilina
Heridas X X X X X Medios anaerobios1
profundas,
mordeduras,
quemaduras,
lceras
Heridas X X X X X Medios anaerobios1
superficiales
Lquidos estriles LCR X X X X
Lquido pleural X X X X BCYE
Medios anaerobios1
Lquidos: X X X X* X Medios anaerobios1
asctico, *para asctico y
peritoneal, peritoneal
pericrdico,
sinovial
Ocular Conjuntival X X
Lquido X X X X X Medios anaerobios1
intraocular
Odo externo X X X
Timpanocentesis X X X X X
Orina (miccin, X X Agar Cled
sondaje)
Orina (puncin X X X X Medios anaerobios1
suprapbica)
Tracto Esputo X X X X
respiratorio Traqueal X X X X
inferior Broncoaspirado X X X X BCYE
Lavado X X X X BCYE
broncoalveolar
Cepillado con X X X X BCYE
telescopado Medios anaerobios1
Tracto Aspirado sinusal X X X X X Medios anaerobios1
respiratorio
superior
Farngeo X Alternativa CNA
Nasal X Agar manitol sal
Microorganismo
Bordetella pertussis Bordet-Gengou
Burkholderia cepacia complex BCSA
Clostridium difficile CCFA
Escherichia coli O157H7 Sorbitol-MCK
Helicobacter pylori Agar Helicobacter
Legionella spp BCYE
Neisseria gonorrhoeae Thayer Martin
Streptococcus agalactiae Agar Granada
Todd-Hewitt
selectivo
Caldo Granada
Vibrio spp TCBS
Yersinia spp CIN
1: medios para anaerobios: agar sangre para anaerobios (Brucella agar), agar feniletanol para anaerobios, agar sangre
lacada-vancomicina-kanamicina (ASKVL), agar Bacteroides bilis esculina (BBE)
2: Agar Sabouread cloranfenicol, CHROM agar Candida
Abreviaturas: AS: Agar sangre; ACH: Agar chocolate; MCK: Agar MacConkey; TG/BHI: Caldo tioglicola-
to infusin cerebro-corazn de buey; BCYE: agar enriquecido para cultivo de Legionella; CNA: agar san-
gre colistina-cido nalidxico; CCFA: agar cicloserina-cefoxitina-fructosa-yema de huevo; TCBS: agar tiosulf-
ato-citrato-sales biliares-sacarosa; CIN: agar cefsulodina-irgasn; BCSA: agar selectivo Burkholderia cepacia

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 8. Medios cromognicos comercializados para aislamiento de diferentes microorganismos


Microorganismo Medio Casa comercial

Acinetobacter spp. CHROMagar Acinetobacter CHROMagar


Candida spp. BD BBL CHROMagar Candida Medium BD
chromID Candida bioMerieux
CandiSelect BioRad
Clostridium difficile chromID C. difficile bioMrieux
Escherichia coli CHROMagar E. coli CHROMagar
BBL CHROMagar E. coli CHROMagar
Chromocult coliform agar ES Merck
Brilliance UTI Agar Oxoid
CHROMagar STEC CHROMagar
chromID CPS bioMrieux
HiCrome UTI Agar Sigma-Aldrich
UriSelect Biorad
E. coli O157:H7 BBL CHROMagar O157 BD
O157:H7 ID agar bioMrieux
Rainbow Agar O157 Biolog
Clolorex O157 Colorex
Enterobacterias productoras de Brilliance ESBL Agar Oxoid
BLEE y algunas especies de CHROMagar CTX CHROMagar
Pseudomonas
CHROMagar ESBL CHROMagar
chromID ESBL bioMrieux
Colorex ESBL Colorex
Enterobacterias resistentes a CHROMagar KPC CHROMagar
carbapenemas chromID CARBA agar bioMrieux
Colorex SuperCarba Colorex
Colorex KPX Colorex
chromID CARBA SMART biomerieux
CRE Brillance Thermo Fisher Scientific
Enterococos resistentes a la CHROMagar VRE CHROMagar
vancomicicina Brilliance VRE Agar Oxoid
chromID VRE bioMrieux
VRESelect Medium BioRad
Colorex VRE Colorex
Listeria spp. CHROMagar Listeria CHROMagar
Listeria monocytogenes International
HiCrome Listeria Agar Base modified Sigma-Aldrich
Pseudomonas spp. CHROMagar Pseudomonas CHROMagar
chromID P. aeruginosa bioMrieux
Salmonella spp. CHROMagar Salmonella CHROMagar
Rainbow Agar Salmonella Biolog
CHROMagar Salmonella Plus CHROMagar
Brilliance Salmonella Agar Oxoid
chromID Salmonella bioMrieux
HiCrome RajHans Medium Sigma-Aldrich
ChromID Salmonella / Hektoen bioMerieux
CHROMagar Staphylococcus CHROMagar
Staphylococcus spp. Brilliance Staph 24 Agar Oxoid
chromID S. aureus bioMrieux
Staphylococcus aureus agar, HiCrome Sigma-Aldrich
S. aureus ID bioMrieux
S. agalactiae CHROMagar StrepB CHROMagar
chromID Strepto B bioMrieux
STREP B SELECT BioRad
BD Group B Streptococcus Differential Agar BD
(Granada) no cromognico
Brilliance GBS agar Oxoid
S. aureus resistente a CHROMagar MRSA CHROMagar
meticilina Brilliance MRSA Agar Oxoid
chromID MRSA bioMrieux
HiCrome MeReSa Agar with methicillin Sigma-Aldrich
MRSASELECT II BioRad
Vibrio spp. chromID Vibrio bioMrieux
CHROMagar Vibrio CHROMagar

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DOCUMENTO CIENTFICO

9. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS El procedimiento de siembra ha tenido muchas


variantes realizadas en funcin del objetivo primordial
del cultivo que es aislar e identificar con la mayor
El laboratorio debe establecer un sistema de rapidez y certeza la presencia de un agente patgeno.
priorizacin en el procesamiento de las muestras, en No todas las muestras se siembran de igual forma,
funcin de criterios previamente definidos (demanda para la mayora se realiza el tipo de siembra en
del clnico, carga asistencial y asistencia continuada). aislamiento, pero para las muestras respiratorias
Esta prioridad se puede establecer en funcin del tipo invasivas o la orina consideradas especiales por
de muestra y del criterio facultativo, aunque en general la necesidad de cuantificar la carga microbiana, se
siempre se deben procesar primero los LCR, las muestras realiza una siembra en recuento. Adems, en la orina
de lquidos y cavidades estriles, las muestras quirrgicas se pueden realizar tcnicas de despistaje de infeccin
y los tests rpidos de deteccin antignica, en este orden. (manuales o automticas basadas en citometra de flujo
A este grupo le siguen muestras con un tiempo limitado de y/o anlisis de imagen) que permiten reducir el nmero
procesamiento como son el cultivo de micobacterias o las de muestras para cultivar con una buena sensibilidad
pruebas para deteccin de cidos nucleicos y las muestras (>95%).
de tejidos o aspirados recientes. Las muestras de heces
deben enviarse en medio de transporte si el procesamiento En el laboratorio se debe someter a la muestra a un
no puede realizarse en un periodo de tiempo entre 30 procesamiento en funcin de sus protocolos de trabajo
minutos y una hora. La lista de procesamiento prioritario y de la informacin que aporta el servicio solicitante
puede ajustarse a las necesidades de los servicios sobre la muestra y el paciente. As el procesamiento
mdicos y quirrgicos asistenciales y tambin en funcin depender de varios factores:
del tipo de laboratorio.
1. Peticin del servicio solicitante
Tabla 9. Ejemplo de lista de priorizacin del 2. Tipo de muestra y su origen anatmico
procesamiento de muestras
3. Tcnica de obtencin

4. Diagnstico del paciente/enfermedad de base


1. Cualquier muestra requerida de forma urgente por
personal mdico (urgencias, UCIs) 4. Motivo de peticin

2. Cultivo de LCR y tincin de Gram 5. Cualquier otra informacin aportada en el


volante de la peticin o peticin electrnica
3. Muestras quirrgicas (intraoperatorias)
Como se ha indicado anteriormente, algunas
4. Pruebas rpidas de deteccin antignica o de cidos muestras se deben procesar inmediatamente a
nucleicos su llegada al laboratorio e inocular en los medios
de cultivo sin demora, ya que un retraso en estos
5. Muestras que requieren tiempos de procesamiento procedimientos puede afectar a la calidad de la misma
especial adicionales y al grado de recuperacin de microorganismos.

6. Muestras respiratorias tomadas por procedimiento Las muestras urgentes, especialmente lquidos
invasivo o despistaje con tincin de Gram estriles, LCR y muestras de quirfano deben
procesarse en 20 minutos tras su recepcin. Las
7. Hemocultivos
muestras de exudados para cultivo de N. gonorrhoeae
8. Muestras de tejido y aspirados sobre todo si se reciben sin medio de transporte
requieren un procesamiento rpido, antes de 20
9. Heces frescas sin medio de transporte (deben minutos, al igual que las muestras de lavados
transferirse a un medio trasporte) broncoalveolares. A continuacin, tienen preferencia
las muestras de biopsias de tejido, abscesos y fluidos
10. Muestras de orina
que se deben procesar en 1 hora tras su recepcin. Las
11. Torundas en medio de transporte muestras de heces frescas (para Shigella spp.) si no
se inoculan en medio de transporte, deben sembrarse
12. Heces en medio de transporte antes de 30 minutos tras su recepcin. Los esputos y
otras muestras respiratorias pueden permanecer 1 hora

32
DOCUMENTO CIENTFICO

a temperatura ambiente y 2 horas si se conservan a identificacin ms rpida y precisa.


4C sin que pierdan viabilidad los microorganismos.
Los hemocultivos pueden mantenerse hasta 4 horas a Dentro del procesamiento de las muestras que llegan al
temperatura ambiente tras su recepcin. Las torundas laboratorio de Microbiologa, podemos establecer 4 fases
con medio se deben procesar antes de 8 horas tras bien diferenciadas: fase de pretratamiento, inoculacin de
su recogida y conservarse la mayora a 4C, de igual los medios de cultivo, preparacin de las extensiones y
modo que los exudados para cultivo de estreptococos finalmente la incubacin, que se deben llevar a cabo en
beta-hemolticos de los grupos A y B; finalmente, las este orden y que se desarrollarn en profundidad en el
muestras de orina pueden conservarse hasta 8 horas documento tcnico PNT-RTPM 01 de este procedimiento.
a 4C tras su recepcin antes de sembrarse. Todas las
muestras deben procesarse en cabinas de bioseguridad, 9.1.1. Fase de pretratamiento de la muestra
segn el nivel de bioseguridad del laboratorio.
No todas las muestras que se procesan necesitan esta
fase. En muestras como orinas o exudados farngeos, su
9.1 MTODOS CONVENCIONALES: CULTI- siembra se hace de manera inmediata sobre los medios de
VO cultivo sin tener que realizar ninguna preparacin previa.
Cuando esta es necesaria, existen distintas tcnicas
La seleccin de los medios para aislamientos primarios como la centrifugacin o la homogenizacin, entre otras,
se convierte en un paso crucial del procesamiento de una que se aplicarn dependiendo del tipo de muestra y de
muestra y de ello depende que se puedan recuperar todos la solicitud realizada. Los detalles de este proceso se
los agentes etiolgicos posibles en la muestra estudiada. incluyen en el documento tcnico PNT-RTPM- 01 de este
Los ms usados son el agar sangre y el agar chocolate procedimiento.
que son medios no selectivos, el agar MacConkey y el
Levine o agar EMB (Eosin-methylene blue) como medios 9.1.2. Inoculacin en los medios de cultivo
selectivos de bacilos Gram negativos y el agar CNA
(con colistina y cido nalidxico) como medio selectivo La calidad de una buena inoculacin y siembra de la
de cocos Gram positivos. Entre los medios lquidos muestra es de suma importancia para conseguir un ptimo
destacamos el caldo de tioglicolato y el BHI (Brain Heart aislamiento de colonias en muestras monomicrobianas y
Infusion). Tanto si se realizan medios preparados en sobre todo en muestras polimicrobianas, para facilitar la
el laboratorio o comerciales, hay que realizar controles rpida identificacin del patgeno y su perfil de sensibilidad
con cepas de referencia para asegurar su eficiencia en antibitica.
la recuperacin de los diferentes patgenos. Los medios
de cultivo recomendados para el procesamiento de las Se aconseja inocular primero los medios menos selectivos
principales muestras se detallan en las tablas 7 y 8 del para evitar que se arrastre alguna sustancia inhibitoria
presente documento. a otro medio. Los medios se seleccionarn segn el
tipo de muestra (tabla 7) y la sospecha diagnstica del
Se deben establecer, controlar y revisar las condiciones posible agente causal a detectar (bacterias, anaerobios,
de almacenamiento (temperatura, humedad, etc.) de hongos). Es necesario procesar primero las muestras
los medios de cultivo. El laboratorio debe establecer la para anaerobios (mejor en campana de anaerobios si se
periodicidad (semanal, mensual, trimestral, etc.) con la dispone). No se deben homogeneizar las muestras que
que debe revisar los materiales almacenados (cantidad, se procesen para hongos, ya que este procedimiento
caducidades, estado general) con el fin de comprobar el altera la viabilidad en el cultivo de determinados hongos
estado de los mismos, verificando su correcta ubicacin no septados, sino cortar en pequeos trozos con la ayuda
en los espacios identificados y definidos para ellos en el de un bistur e inocular directamente sobre los medios de
almacn, as como su aptitud para el uso. cultivo.

Para muestras que deban seguir un procesamiento La siembra manual se realizar utilizando la tcnica de
habitual hacia el cultivo (ms all de las tcnicas rpidas aislamiento para la mayora de las muestras y la tcnica
y de las tcnicas de biologa molecular), el procesamiento de recuento para aquellas que necesitan un contaje de
automatizado y la siembra, acompaados de la mejora colonias (por ejemplo, orina). Opcionalmente en caso de
del examen microscpico, ha reducido tiempo y mejorado inocular placas de exudados farngeos para detectar beta-
la eficiencia de los laboratorios, asociado al uso de la hemlisis, se puede hundir el asa levemente en el agar
espectrometra de masas que permite hoy en da una para dejar al microorganismo en condiciones anaerbicas.

33
DOCUMENTO CIENTFICO

Existen otras estrategias de siembra especficas para - El aislamiento de Campylobacter spp. en heces
recuperar determinados patgenos inoculando estras requiere una temperatura de incubacin de 42C y 35C
de otros (estafilococos para Haemophilus spp. o Listeria (Campylobacter fetus).
spp).
- La temperatura de incubacin de los cultivos para
9.1.3 Preparacin de las extensiones estudio de hongos puede variar desde 28C a 37C, pero
generalmente se incuban a 30C. Sin embargo, cuando se
Los portaobjetos debern estar limpios y desengrasados sospecha una micosis por hongos dimrficos se sugiere
antes de su uso (se puede utilizar una solucin de lavado incubar 2 conjuntos de placas o tubos, uno a temperatura
con etanol al 95%). Son preferibles los que tienen un ambiente (25-28C) y otro a 35-37C.
extremo rugoso para poder identificar o etiquetar la
informacin de la muestra. Las extensiones, as como la 9.1.4.2. Atmsferas de incubacin
siembra, se realizarn en cabina de bioseguridad.

Para las extensiones en fresco, se debe preparar una - Aerobiosis, atmsfera rica en oxgeno.
monocapa densa, pero a la vez extendida, de forma
que se pueda ver un texto a travs de ella. Es necesario - Atmsfera enriquecida con 5-7% de CO2 : esta atmsfera
realizar extensiones para tincin de Gram de la mayora habitualmente se consigue con estufas o incubadores
de las muestras respiratorias y exudados de heridas, que tienen una bandeja de humidificacin y controlan
de muestras de orgenes normalmente estriles y de la presin de CO2 con un dispositivo de monitorizacin
muestras de orina y genitales segn peticin. La tincin de que extrae el are de la incubadora en una cmara de
Gram no se debe realizar en muestras nasales, faringo- muestra, determina la concentracin de CO2 e inyecta
amigdalares, heces ni puntas de catter. CO2 puro en la estufa para mantenerlo en los niveles
En caso de muestra insuficiente se priorizar el programados. Tambin se puede obtener esta atmsfera
cultivo sobre la tincin. Se recomienda utilizar portas a travs de reactivos comercializados que se incuban
estriles siempre que sea posible, de lo contrario, el con las placas Petri en jarras de incubacin.
cultivo debe inocularse siempre primero para evitar
contaminaciones de las placas si previamente se ha - Atmsfera microaeroflica para el aislamiento de
utilizado la misma asa sobre un portaobjetos no estril. Campylobacter spp. y Helicobacter pylori: 5% de O2, 10%
Tambin se pueden utilizar pipetas o asas estriles CO2 y 85% de N2. Utilizamos habitualmente los reactivos
desechables para realizar las extensiones sobre el comercializados que generan esta atmsfera para incluir
portaobjetos y poder dar una informacin rpida y en las jarras de incubacin.
precisa. En el caso de lquidos estriles, en especial
el LCR, se recomienda citocentrifugar la muestra para
- Atmsfera de anaerobiosis: esta atmsfera se
preparar las extensiones.
obtiene colocando las placas de Petri en jarras de
incubacin en las que se logra una atmsfera libre de
9.1.4. Incubacin oxgeno por medios qumicos a travs de unos sobres
preparados y comercializados. Existen tambin bolsas
La incubacin de las muestras se realiza en de plstico en las que caben 1-2 placas y la atmsfera
estufas o jarra de incubacin que mantendremos de anaerobiosis tambin se consigue de la misma
a distintas temperaturas y/o atmsferas segn manera. En algunos casos existen estufas semejantes
los microorganismos que pretendemos recuperar. a las convencionales que cierran hermticamente, en
las que puede efectuarse la anaerobiosis con facilidad
mediante dispositivos automticos que extraen el aire y
9.1.4.1. Temperatura lo sustituyen por mezclas gaseosas.

- La mayora de los cultivos bacterianos se incuban a 9.1.4.3. Duracin de la incubacin


35C-37C. Excepciones a estos, son los cultivos de
piel y tejidos blandos, con sospecha de contener M. El tiempo de incubacin depender en gran parte de
marinum, M. ulcerans, M. chelonae y M. haemophilum, las diferentes solicitudes (bacterias, micobacterias,
que crecen a temperaturas ptimas ms bajas. Para hongos, virus) ya que los tiempos de recuperacin de
estas muestras, es necesario cultivar por duplicado los distintos microorganismos pueden ser diferentes. De
en los medios necesarios e incubar a 25C-33C. manera general para el cultivo bacteriolgico ordinario
Los nuevos sistemas de cultivo en medio lquido la mayora de las muestras en el laboratorio se deben
automatizados no permiten la incubacin a temperatu- mantener al menos durante 48 h excepto las muestras
ras temperaturas inferiores a 361 C. de orina que se incuban habitualmente durante 24 h.

34
DOCUMENTO CIENTFICO

Algunas muestras de heridas, lquidos estriles o material que forma parte de la plataforma FMLA de BioMerieux.
protsico hay que mantenerlas en incubacin hasta
7-10 das para recuperar microorganismos de lento - El sembrador InoqulA BD (4 m ancho x 1 m alto)
crecimiento como Propionibacterium spp., e incluso 12 tiene la mayor capacidad, 612 placas y puede cargar
semanas si se sospecha M. ulcerans. En el caso de los 12 tipos de medios diferentes. Es capaz de procesar
cultivos de hongos la duracin variar en funcin de la diferentes tipos de envases de muestras con apertura
sospecha clnica, cuando sta es para los ms habituales y cierre automatizado. Inocula la muestra utilizando
como Candida spp, Aspergillus spp, Cryptococus spp o una pipeta calibrada (con sistema de extraccin de
Fusarium spp, se mantienen durante 7 das, pero algunos burbujas) pero dispone de un modo manual interactivo
hongos dermatofitos y dimrficos (Histoplasma spp) para inocular muestras de tejido, puntas de catter y
requieren periodos ms prolongados y se incuban hasta otras muestras no lquidas o que no se puedan sembrar
3-4 semanas. utilizando el sistema automatizado. El sistema de
siembra por bola magntica permite sembrar hasta 400
9.2. SIEMBRA AUTOMATIZADA. placas en 1 hora en un patrn circular que aprovecha
AUTOMATIZACIN DEL LABORATORIO DE mejor el espacio. Este sistema permite sembrar 5 placas
MICROBIOLOGA simultneamente. El inconveniente es que las bolas se
deben esterilizar antes de reutilizarlas, pero dispone de
El trabajo del laboratorio de Microbiologa es un dispensador automtico de bolas y un contenedor
laborioso y muchas veces se realiza de forma manual de bolas extrable y autoclavable, lo cual requiere un
casi por completo, lo que hace que la calidad dependa mantenimiento manual de rutina algo ms laborioso.
de la experiencia y habilidad de los tcnicos en cada Es capaz de incubar placas en anaerobiosis y posee
uno de los momentos y etapas del procesamiento filtro Hepa interno para eliminar las partculas del aire
microbiolgico de las muestras. Se ha calculado que que puedan contaminar las placas y las muestras.
un 24% del tiempo de los tcnicos en el proceso de
preanaltica se invierte en la inoculacin de las muestras - El sembrador WASP (Copan) ocupa poco
en los medios de cultivo. La propia diversidad de espacio (2 m ancho x 1,1 m fondo x 2 m alto) y consta de
muestras y las distintas pruebas que se pueden solicitar dos robots que funcionan de forma independiente para
sobre ellas, ha complicado la posibilidad de ensamblar recibir la muestra, seleccionar los medios a sembrar
un mismo proceso donde todo encaje y hasta ahora cada muestra, agitar, abrir el contenedor e inocular y
haba imposibilitado los intentos de automatizacin en volver a cerrar y transferir la muestra y el medio inoculado
microbiologa. Desde la aparicin en los aos 1970 de los a una fila de muestras procesadas. Tambin posee
autoinoculadores, actualmente existen varios modelos de un filtro Hepa interno. El sistema lee la etiqueta de la
sembradores automticos capaces de inocular la muestra muestra y reconoce de qu tipo es y etiqueta las placas
y sembrarla, de destapar y tapar los contenedores, de de Petri inoculadas, tambin reconoce el protocolo a
etiquetar las placas a inocular, de inocular medios de utilizar y selecciona el asa conveniente. Utiliza dos
enriquecimiento y de preparar las extensiones a teir. asas metlicas, que mientras una inocula y siembra, la
Las ventajas de utilizar estos procesadores radican otra es incinerada para ser reutilizada, y de este modo
en la mejora de la trazabilidad, la reduccin de errores reduce costes sin riesgo de contaminaciones cruzadas.
humanos en el etiquetado, menos riesgo de accidentes Las asas pueden sembrar hasta 15.000 placas antes
al manipular las muestras, ahorro de tiempo de los de tener que cambiarse. La presencia de un carrusel
tcnicos de laboratorio que pueden dedicarse a otras donde almacena los medios lquidos inoculados y de
actividades, ahorro de tiempo anlisis-resultado, ahorro 4 dispensadores para antibiograma proporciona un
econmico y ventajas al obtener una mayor rapidez en plus de versatilidad y funcionalidad. Su rendimiento se
el diagnstico etiolgico y en el informe de sensibilidad evalu de forma positiva por primera vez en el ao 2009
antibitica para los pacientes. Sin embargo, tambin comparndolo con la siembra manual e igualndose al
hay que contemplar algunas desventajas de estos Inoculab (predecesor del InoqulA).
sistemas automatizados, como son la dependencia de
Merece destacar que existen estudios comparativos
servicios tcnicos, la necesidad de un mantenimiento
recientes de estos dos procesadores entre s y con la
generalmente caro, la posibilidad de contaminaciones no
siembra manual. En estos trabajos, el sistema WASP
deseadas en varias fases del sistema, la limitacin sobre
(con siembra de 1 L y de 10 L) produjo mayores
especies microbianas inusuales o de difcil identificacin
recuentos de colonias que el InoqulA pero el patrn de
y la necesidad de compromiso de todo el personal
siembra del InoqulA result mejor cuando se sembraban
tcnico y facultativo del laboratorio en su funcionamiento.
orinas con recuentos superiores o iguales a 105 UFC/ml,
En el terreno estricto de los procesadores automticos, ya que dejaba las colonias ms separadas y facilitaba
se analizan a continuacin los siguientes: 1) InoquIA, que el aislamiento de colonias sin necesitar de realizar
forma parte de la plataforma BD Kiestra; 2) WASP, que subcultivos en ninguna de las muestras procesadas
forma parte del sistema Copan WASP lab; 3) PREVI Isola, (ahorro de 5,8 euros por reaislamiento). Las diferencias

35
DOCUMENTO CIENTFICO

entre ambos sistemas pueden estar relacionadas con Figura 10. Ejemplos de tcnica de siembra manual y
el modo de inoculacin de ambos: el WASP con asa 1 automatizada (InoquIA BD, WASP Copan)
L penetra a una profundidad fija en el tubo de transporte
dependiendo de su volumen (4-10 ml) y en el InoqulA la
punta de pipeta profundiza 15 mm en la muestra gracias
a un sensor que detecta el menisco de la muestra. En
el trabajo de Croxato y cols. (JCM 2015), inoculando el
mismo volumen (10 L) de orina en medio cromognico y
mediante anlisis de imagen, se confirm la superioridad
de los dos sistemas automatizados respecto a la siembra
manual de muestras de orina con recuentos altos 107-108,
pero no cuando los recuentos eran bajos. Con el InoqulA
se obtuvo un mayor nmero de colonias aisladas que con Modificada de Croxato A. et al. JCM 2015; 53(7):2298-2307
el WASP y hubo que realizar menos subultivos. Ningn
sistema consigui buenos aislamientos en muestras
polimicrobianas para especies bacterianas con recuentos
9.3 TCNICAS RPIDAS
10 veces inferiores a los de la poblacin ms concentrada.
El desarrollo de las tcnicas rpidas en Microbiologa
Tambin se han evaluado y confirmado las ventajas de la
se inici con el propsito de poder acelerar el diagns-
siembra del urocultivo por WASP respecto a la siembra
tico de las enfermedades infecciosas, tratando de su-
manual convencional. En un trabajo de Quiblier y cols.
perar algunos de los inconvenientes, especialmente la
(JCM 2016), la mejor diferenciacin de colonias en
lentitud, de las tcnicas convencionales como el culti-
muestras con recuentos superiores o iguales a 104 o 105
vo. Eso ha hecho que se desarrollen distintos mtodos
ufc/ml se obtena con el patrn de siembra de 27 lneas
diagnsticos que nos permiten ofrecer una informacin
en zig-zag en vez de con el patrn de 11 lneas.
rpida y precisa, con implicacin clnica en la evolucin
En este sistema, el procesador puede unirse al sistema del paciente.
WASP-FLO capaz de introducir y ordenar las muestras
en lotes segn el tipo, y tras la siembra, distribuir las 9.3.1. Examen directo o tinciones
placas sembradas en diferentes incubadoras con su
correcta temperatura y atmsfera de incubacin segn el Las tinciones en Microbiologa son las primeras herra-
protocolo. Adems, del mismo modo que el Kiestra BD, mientas que se utilizan en el laboratorio para el diagns-
este sistema incorpora un sistema ID de identificacin tico de las enfermedades infecciosas. Algunas de estas
presuntiva por anlisis de imagen con video y cmara tcnicas existen en realidad desde el siglo XIX y hoy en
que realiza una fotografa en tiempo 0 y otra tras la da, siguen siendo una parte esencial en el diagnstico
incubacin permitiendo un trabajo sobre las colonias microbiolgico en la prctica totalidad de los labora-
mucho ms rpido, seguro y eficaz. torios de Microbiologa. La tincin de Gram es proba-
blemente la ms utilizada, es un procedimiento rpido
- El sistema PREVI Isola (bioMrieux) (1,7 m (minutos) pero plantea problemas de sensibilidad y es-
ancho x 1,5 m fondo x 0,9 m de alto) acomoda 150 pecificidad, aunque sigue siendo una herramienta muy
placas y 5 tipos de medios diferentes. Siembra mediante valiosa sobre todo realizada por profesionales expertos
un peine aplicador de un solo uso en un patrn nico, y en determinadas muestras (LCR).
abarcando la mayor superficie del agar gracias a sus
16 asas simultneas que permiten una gran separacin
Otras tinciones utilizadas son: la tincin de Zhiel-Neel-
de las colonias en las placas de cultivo. Una gran
sen y la auramina para visualizar bacilos cido alcohol
desventaja es la necesidad de abrir y cerrar los envases
de las muestras manualmente. Actualmente est en resistentes, Giemsa o Field para teir parsitos, o blan-
desarrollo la solucin a este problema, del mismo modo co de calcoflor y plata-metenamina para estudio de
que la posibilidad de inocular la placa de MALDI-TOF hongos. Destacar la utilidad del examen en freso para
directamente y trabajar incorporando el mdulo Vitek2 el diagnstico de Trichomonas vaginalis, el estudio con
de identificacin dentro del sistema FMLA totalmente KOH para visualizar estructuras fngicas, y el estudio
automatizado. No obstante, este sistema ya no se mediante campo oscuro para el diagnstico de Trepo-
comercializa en Espaa. nema pallidum.

36
DOCUMENTO CIENTFICO

9.3.2. Basadas en reacciones antgeno-anti- de falsos positivos: una cifra lo ms cercana al 95% con
cuerpo. parasitemias bajas (200/L) o al 100% con parasitemia
alta (2.000-5.000/ L) y el precio.
Las tcnicas inmunolgicas de deteccin de antgenos
En enero de 2016 se ha publicado la mejora definitiva
se fundamentan en la afinidad antgeno-anticuerpo y
de un test inmunocromatogrfico en tira para
permiten detectar la presencia de microorganismos o
deteccin de dermatofitos en muestras ungueales:
fragmentos de los mismos en las muestras clnicas. Son
el Dermatophyte test strip que utiliza anticuerpos
tcnicas especialmente tiles en aquellos casos en los que
monoclonales especficos frente al polisacrido de la
el microorganismo causal crece lentamente o no crece
pared celular de los dermatofitos (frente a siete especies
en los medios de cultivo. Adems, los resultados de los
de dermatofitos: Trichophyton rubrum, Trichophyton
mismos no se ven alterados por la administracin previa
mentagrophytes, Trichophyton violaceum, Trichophyton
de antimicrobianos. Como inconvenientes principales de
tonsurans, Microsporum gypseum, Microsporum canis
las mismas cabe destacar que no ofrecen informacin
y Epidermophytum floccosum). Este test desarrollado
sobre la sensibilidad del microorganismo detectado a los
en Japn a partir de 2008, presenta una sensibilidad del
antimicrobianos, y que en algunos casos no han alcanzado
98% y una especificidad del 78%. Los primeros trabajos
los niveles de sensibilidad y especificidad deseados.
publicados se realizaron sobre muestras ungueales,
comparando este test con la microscopia directa y
9.3.2.1. Inmunocromatografa. la PCR para resolver discrepancias, y se obtuvo una
concordancia global del 89% (99% concordancia
Sobre una membrana de nitrocelulosa o nylon se positiva / 78,9% concordancia negativa). El test utiliza
encuentran absorbidos en la lnea de reaccin Trichophyton rubrum como control positivo, se puede
anticuerpos frente al antgeno que buscamos y realizar sobre muestras tratadas con antifngicos,
sobre la lnea control estn absorbidos anticuerpos requiere un mnimo de 1 mg de muestra de ua, un
anticonjugado, de forma que cuando la muestra contiene pretratamiento en 250-500 L de buffer de extraccin,
antgeno, este fluye por la membrana quedando y los resultados estn disponibles entre 5 y 30 minutos
retenido en la lnea de reaccin. El conjugado, que del procesamiento (positivo: raya color prpura). El test
tambin es un anticuerpo especfico frente al antgeno no es vlido para tinea peds por los resultados falsos
que se busca, est marcado con una molcula de oro negativos y falsos positivos (Aspergillus spp., Fusarium
coloidal, que tambin fluye por la membrana, y queda spp.) obtenidos previamente.
retenido por el antgeno en la lnea de reaccin y por el
anticuerpo en la lnea control. En el caso de muestras
negativas que no contienen antgeno, el conjugado 9.3.2.2 Enzimoinmunoanlisis (EIA)
queda retenido nicamente en la lnea control. Ests
tcnicas son rpidas, obtenindose resultados en 10-30 Normalmente la deteccin tiene lugar en placas de
minutos. Buen ejemplo de tests inmunocromatogrficos poliestireno, donde los anticuerpos especficos estn
(ICT) son: la deteccin del antgeno (Ag) polisacrido inmovilizados sobre la superficie de los pocillos. Estos
capsular de S. pneumoniae y del antgeno soluble anticuerpos retienen a los antgenos presentes en
del serogrupo 1 de Legionella pneumophila en orina, la muestra y su presencia se revela posteriormente
las tcnicas de deteccin cualitativa simultnea de mediante la utilizacin de anticuerpos tambin
Rotavirus, Adenovirus, Astrovirus y Norovirus en un especficos del antgeno conjugados con enzimas.
mismo test sobre muestras de heces semilquidas (125 Estas enzimas provocan un cambio de color al
mg) o lquidas (125 L), las tcnicas para la deteccin interaccionar con el sustrato especfico. Las enzimas
de Giardia spp. y Criptosporidium spp. igualmente ms utilizadas son la fosfatasa alcalina y la peroxidasa
en heces, las de deteccin de antgeno de grupo A que actan sobre el p-nitrofenil fosfato y el agua
de Streptococcus pygenes, el test de deteccin de oxigenada, respectivamente, de forma que en este tipo
la protena F de fusin del Virus respiratorio sincitial de EIA, a mayor intensidad de color mayor cantidad
(VRS), el de deteccin de Helicobacter pylori (aunque de antgeno fijado al pocillo. Las tcnicas de EIA que
no distingue colonizacin de infeccin), la prueba de tienen como conjugado un anticuerpo marcado con un
deteccin cualitativa de antgenos de Plasmodium spp. istopo radioactivo estn en desuso.
circulantes en sangre venosa, centrada en el antgeno
de la protena rica en histidina II (HRPII) especfica La tcnica de referencia para la deteccin de antgenos
de Plasmodium falciparum y un antgeno panmalrico vricos en muestras respiratorias sigue siendo la
comn a P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae. inmuno-fluorescencia ya sea directa o indirecta. En la
(no detecta P. knowlesii), entre otros. En el caso de actualidad existen tcnicas de EIA y de ICT para los
los sistemas de deteccin de Plasmodium spp., los Virus de la gripe A y B, para el Virus respiratorio
diferentes sistemas presentan porcentajes de deteccin sincitial y para Adenovirus. Los resultados obtenidos
variable segn el grado de parasitemia y la especie, y es mediante ICT son equiparables con los obtenidos con
importante definir cul elegir en funcin de la ausencia las tcnicas de EIA en sensibilidad y especificidad,

37
DOCUMENTO CIENTFICO

sin embargo, la sensibilidad de estas tcnicas con guantes, bata y frecuencia de cambio de los mismos,
respecto a la inmunofluorescencia, es menor. Hoy disponer de pipetas en cada rea, puntas con filtro,
en da se dispone de EIA rpidos de membrana (tipo sistemas automatizados de inoculacin, sistemas
jaboneras) para el diagnstico de las infecciones cerrados de amplificacin y en cada prueba introducir
producidas por Clostridium difficile, detectando el controles negativos y controles de contaminacin, son
antgeno GDH (glutamato deshidrogenasa) solamente los requisitos mnimos para realizar un diagnstico
o simultneamente con las toxinas A y B en muestras molecular con garantas.
fecales. En este ltimo caso se trata de un EIA tipo
sndwich (anticuerpos-biotina forman complejo con el Figura 11. Esquema del flujo de trabajo unidireccional en
antgeno), con deteccin por fluorescencia que emite el laboratorio de Microbiologa Molecular
el complejo estreptavidina-fosfatasa alcalina. Presenta
una sensibilidad 88% y una especificidad del 99,5%.

9.3.3 Basadas en deteccin de cidos


nucleicos
Las tcnicas moleculares (PCR, microarrays y
secuenciacin de cidos nucleicos) estn jugando
actualmente un papel principal en la deteccin e
identificacin de microorganismos patgenos y como Modificado de Leber AL. 2016. Clinical Microbiology Procedures
ayuda en el tratamiento de muchas enfermedades Handbook, vol. 1-3. American Society for Microbiology Washington, D.C
infecciosas. Algunas de las primeras tcnicas desarrolladas
(deteccin directa por sondas de cidos nucleicos)
estn siendo sustituidas por tcnicas de amplificacin Entre las tcnicas de microbiologa molecular, se
de cidos nucleicos y se estn comercializando en han desarrollado tcnicas rpidas de deteccin de
formatos cerrados, automatizados, de fcil manejo, los principales patgenos causantes de infecciones
cercanos al paciente (tipo point of care) y de emisin graves como bacteriemia o meningitis. As, existen
muy rpida de resultados. Cada vez se amplan ms los pruebas de hibridacin de cidos nucleicos que
mens de estas plataformas que abarcan la deteccin mediante sondas identifican los microorganismos
de mltiples agentes y que conducen a una mejora en presentes en los hemocultivos como el panel del
el rendimiento, en los tiempos de respuesta y en el sistema Nanosphere Verigene que es capaz de
coste-efectividad de la aplicacin de esta tecnologa en
detectar 12 bacterias y 3 mecanismos de resistencia
los laboratorios de Microbiologa.
(incluyendo SAMR) con un 90-95% de concordancia
Al mismo tiempo, otros mtodos moleculares adicionales con los hemocultivos pero 40 horas antes. De gran
como los secuenciadores de nueva generacin y las aceptacin en los laboratorios de Microbiologa son los
pruebas basadas en la protemica se han introducido sistemas de PCR a tiempo real (RT-PCR) que utilizan
en el diagnstico microbiolgico y estn acelerando la cebadores especficos y secuencias en sondas para
transicin entre el diagnstico convencional al diagnstico amplificar el ADN diana de mltiples microorganismos.
molecular. La deteccin molecular de patgenos
gastrointestinales o la identificacin por secuenciacin o Entre ellos se incluyen:
la epidemiologa por tipado molecular, son ejemplos de la
aceleracin que se est llevando a cabo en este campo. - el sistema GeneXpert (Cepheid) para deteccin
de M. tuberculosis en muestra respiratoria,
Como en todo laboratorio de diagnstico molecular es diferenciacin de S. aureus sensibles y resistentes
importante asegurar un flujo de trabajo correcto, libre de a la meticilina en hemocultivos y heridas,
amplicones y de contaminaciones cruzadas que puedan deteccin de cepas de C. difficile toxignico/O27
paralizar la emisin de resultados fidedignos (figura 11). en heces, o de la presencia de enterobacterias
Un buen diseo de los espacios y las reas de preparacin productoras de diferentes tipos de carbapenemasas.
de reactivos y almacn (rea 1), preparacin de muestras
(rea 2), amplificacin (rea 3), cuidado en el flujo de - el sistema FilmArray (Biofire) que presenta paneles
trabajo unidireccional (nunca pasar material de la zona de de diagnstico cualitativo de cidos nucleicos para
amplificacin a las zonas limpias 1 y 2) y la atencin a mltiples bacterias, virus y levaduras capaces de
las medidas para evitar y detectar las contaminaciones, producir bacteriemia como Enterococcus spp., Listeria
asegura unos resultados de alta calidad. monocytogenes, S. aureus y otros Staphylococcus
spp., S. agalactiae, S. pneumoniae, S. pyogenes, otros
El uso de cabinas de luz ultravioleta, el uso de estreptococos, Acinetobacter baumannii, Enterobacter

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 10. Resumen de las principales caractersticas de algunos de los sistemas de microbiologa molecular.

Comercial Plataforma Tecnologa Capacidad Sistema Nivel automatizacin Carga trabajo Tiempo/manual

Cepheid GeneXpert PCR tiempo real Hasta 6 canales Cerrado A demanda, acceso Variable hasta 16 1 hora
sondas de de deteccin aleatorio mdulos.
deteccin fluorescencia Dilucin previa de la Infinity 48 u 80 <1 por muestra
fluorescentes muestra antes de mdulos
cargar
BD diagnostics BD Max PCR tiempo real Hasta 6 canales Abierto Trabajo por lote Procesa 24 2-5 horas
sondas de de deteccin inocular muestra, muestras 15-30 las 24
deteccin fluorescencia cargar tiras reactivo y simultneamente muestras
fluorescentes cartucho
Nanosphere Verigene PCR mltiple Microarray Cerrado A demanda, acceso Variable, un solo 2-2,5 horas
ms deteccin 400 sondas de aleatorio lector puede 1-2 por muestra
microarrays son captura acomodar 32
sondas en procesos
nanopartculas
BioFire FilmArray Nested PCR en 100 Cerrado A demanda acceso Variable segn n 1 hora
dos etapas micropocillos aleatorio Dilucin analizadores cada 5 de premanual
previa uno-1 CPU
Roche Cobas Amp PCR mltiple Hasta 4 canales Abierto Totalmente Lote de 96 4-5 horas Lote
ms deteccin de deteccin automatizado muestras completo
por sondas fluorescencia muestra-resultado simultneas 96 muestras
fluorecentes
Abbot M2000 PCR mltiple Hasta 4 canales Abierto Totalmente Lote de 96 3-4 horas
ms deteccin de deteccin automatizado muestras 1 h las 96
por sondas fluorescencia muestra-resultado simultneas muestras
fluorecentes

cloacae complex, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, de la tcnicas es inferior a dos horas, se puede utilizar
Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Serratia sobre hemocultivos y lquidos peritoneales y detecta
marcescens, H. influenzae, Neisseria meningitidis, y diferencia diferentes microorganismos segn la
Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, C. fluorescencia (roja, verde, amarilla), entre ellos S. aureus
glabrata, C. krusei, C. parapsilosis complex, y C. de estafilococos coagulasa-negativa, E. faecalis de E.
tropicalis, as como las dianas que codifican mecanismos faecium, C. albicans / C. parapsilosis complex de C.
de resistencia mecA, vanA/vanB, y blaKPC, y un panel tropicalis y C. glabrata/krusei, y E. coli de K. pneumoniae
para diagnstico (deteccin e identificacin simultnea) y P. aeruginosa. En la tabla 10 se resumen las principales
de agentes especficos de meningitis o encefalitis en caractersticas de los sistemas de microbiologa molecular.
LCR como E. coli K1, H. influenzae, L. monocytogenes,
S. agalactiae, S. pneumoniae, N. meningitidis,
Citomegalovirus, Enterovirus, Virus del herpes simple 1 10. ALMACENAMIENTO DE LAS MUES
y 2, Herpesvirus 6, Parechovirus, Virus varicella-zster TRAS TRAS SU PROCESAMIENTO
y Cryptococcus neoformans. Por ltimo, otro sistema
basado en la caracterizacin de cidos nucleicos De forma general, el almacenaje de las muestras
que est mejorando los resultados del uso racional y procesadas debe incluir el tiempo suficiente para
resolver cualquier tipo de reclamacin o poder ampliar
optimizacin del tratamiento de las bacteriemias en
alguna peticin por parte del clnico responsable o del
los hospitales es el PNA-FISH (AdvanDX), tcnica de
microbilogo que est procesando la muestra. La orinas
hibridacin de ARN ribosmico de microorganismos y muestras de heces pueden guardarse entre 2 y 4 das a
especficos con sondas pptidos de cidos nucleicos 4C, al igual que las muestras no estriles. Sin embargo,
(PNA) con deteccin in situ con microscopio de las muestras procedentes de sitios estriles deben
fluorescencia (FISH). La duracin para la realizacin guardarse un mnimo de 7 das a 4C, colocando siempre

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DOCUMENTO CIENTFICO

Tabla 11. Nivel de seguridad requerido para trabajar distintos microrganismos


Nivel de bioseguridad Microorganismos Comentarios

Nivel de bioseguridad 2 Bacillus anthracis* *Manejo de las muestras nivel de


Brucella spp. bioseguridad 2, manejo de los
Yersinia pestis* cultivos nivel 3
Francisella tularensis*
Burkholderia pseudomallei*
Nivel de bioseguridad 3 Virus de la gripe aviar de alta *Manejo de las muestras nivel de
patogenicidad bioseguridad 2, manejo de los
Mycobacterium tuberculosis cultivos nivel 3
Coxiella burnetii
Histoplasma capsulatum
Blastomyces dermatitidis
Coccidioides immitis
Nivel de bioseguridad 4 Virus Ebola
Virus Marburg
Virus Crimea-Congo
Otros virus de fiebres hemorrgicas

las ms antiguas en la gradilla de eliminacin prxima. Las las fiebres hemorrgicas (ver tabla 11). Existen otro grupo
biopsias para determinacin de Helicobacter pylori deben de microorganismos con potencial uso para propsitos
guardarse a-80C y las muestras destinadas a PCR o terroristas que, aunque se trabajaran en laboratorios de
cultivo de virus se deben almacenar de manera preferente seguridad biolgica nivel 3 (Francisella tularensis) o de
a -70 u 80C y en segunda opcin a -20C, teniendo en nivel 2 (Bacillus anthracis y Yersinia pestis), constituyen
cuenta que se produce una degradacin importante de los una amenaza para la sociedad por su repercusin a nivel
cidos nucleicos sobre todo para el RNA. La mayora de de salud pblica y un reto diagnstico para los Servicios
virus RNA son monocatenarios y puede afectar de forma de Microbiologa.
importante los resultados.
Para responder a estos eventos biolgicos el microbilogo
clnico debera estar entrenado y conocer las siguientes
11. RECOGIDA Y TRANSPORTE DE reas:
MUESTRAS CON SOSPECHA DE MI-
CROORGANISMOS CON GRAN RELEVAN- Nivel de bioseguridad de su propio laboratorio
CIA EN SALUD PUBLICA (ver procedimiento SEIMC n 10a (2014): Segu-
ridad en el laboratorio de Microbiologa Clnica).
El fenmeno de la globalizacin representa un problema Principios de recogida de muestras, conserva-
especial para la diseminacin de las enfermedades cin y transporte de estos patgenos
infecciosas y el control de las mismas, constituyendo Criterios para reconocer o sospechar las enfer-
adems un marco idneo que fomenta la introduccin medades emergentes o los intentos de bioterro-
de nuevas amenazas. No debemos olvidar que los rismo
agentes infecciosos pueden trasladarse a cualquier parte Niveles de seguridad para los distintos patge-
de la tierra, de forma natural o intencionada, y que las
nos
consecuencias no se limitan a la posibilidad de producir
Conocimiento de los protocolos de consenso
una elevada morbimortalidad, sino en algunos casos, una
alarma social que repercuten en la actividad normal de la Tiempo, precisin de las pruebas y resultados
sociedad. Conocimiento de la cadena de custodia de estas
muestras en su propia institucin
En algunas de ellas, la elevada mortalidad asociada
a la infeccin y la ausencia, por lo general, de medidas
teraputicas y profilcticas eficaces clasifican a algunos Como las instalaciones de este tipo en nuestro pas
de estos microorganismos en la mxima categora de en el mbito sanitario son excepcionales (slo existe
peligrosidad (grupo 4), ante los que deben adoptarse 1 de nivel de bioseguridad tipo 3), las condiciones
medidas de contencin del mximo nivel a la hora de de bioseguridad deben ser las ms altas de las que
manejar a los pacientes y a las muestras biolgicas disponga el laboratorio o el hospital y que, como
(laboratorios de seguridad biolgica nivel 4), en los que se mnimo, debe incluir instalaciones con presin negativa,
trabajaran patgenos como el Virus de la viruela y los de habitaciones o cabinas de seguridad biolgica de clase

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DOCUMENTO CIENTFICO

II y equipos de proteccin individual (EPIs) adecuados se utilizarn los contenedores correspondientes del
(bata de apertura posterior y capucha o mono con grupo III.
capucha, calzas, pantalla facial, mascarilla FFP3 o FFP2
y dobles guantes), que corresponderan a laboratorios Dentro de las bacterias incluidas en este grupo hay que
de nivel de bioseguridad tipo 2 a los que pertenecen la destacar:
mayora de los laboratorios de Microbiologa Clnica de
los hospitales de nuestro pas. - Bacillus anthracis: es uno de los principales
microorganismos con uso potencial para fines
En estos casos, adems de la informacin habitual bioterroristas y aunque se pueden procesar las
sobre el paciente registrada al obtener la muestra muestras en laboratorios de bioseguridad tipo 2 se
(nombre completo, fecha de nacimiento, direccin, recomienda especialmente evitar procedimientos que
fecha y hora de obtencin de la muestra, etc.), tambin generen aerosoles y efectuar con frecuencia la higiene
se debe registrar la informacin siguiente: sntomas, de manos. Dependiendo del tipo de infeccin que
con su duracin y fecha de inicio, contacto con casos produzca puede presentar diversas manifestaciones
conocidos de infeccin por el patgeno del que se clnicas y por ello las muestras remitidas al laboratorio
sospecha y tipo de contacto (por ejemplo, lactancia pueden ser muy variadas, incluyendo muestras
materna, pareja sexual); antecedentes completos respiratorias, heces, LCR, sangre o lesiones cutneas.
de viaje (fechas, lugares, duracin de la estancia) y No existe transmisin persona a persona y la forma
antecedentes de vacunacin. ms eficaz de dispersin de las esporas parece
ser la aerosolizacin; su adquisicin actual es casi
Previamente a la extraccin de las muestras, se debe exclusivamente por actos de bioterrorismo.
preparar todo el material necesario (recomendable una
lista de comprobacin) y rotular el tubo primario con - Francisella tularensis: es un microorganismo
los datos del paciente. Se debe avisar con anterioridad muy lbil, con alta infectividad y la dispersin
al microbilogo de su envo al laboratorio. Una vez por aerosoles parece la forma ms probable de
extradas, se introducirn en un contenedor a prueba propagacin. Se puede recuperar el microorganismo
de fugas (una bolsa de plstico autosellable y un de mltiples muestras clnicas y tambin es posible el
tubo rgido de mayor tamao provisto de material que diagnstico serolgico (demostrando ttulos elevados
absorba golpes) y remitidas directamente a la zona de anticuerpos especficos en suero), aunque se han
de manipulacin de muestras de laboratorio. No se descrito reacciones cruzadas con Brucella spp, Proteus
debe utilizar nunca el tubo neumtico. Con el fin de spp. y Yersinia spp. Se debe realizar una determinacin
evitar el transporte de la muestra dentro del hospital, serolgica en fase aguda tan pronto como sea posible
el microbilogo se encontrar en las inmediaciones al comienzo de la enfermedad y obtener el segundo
del rea habilitada y de acceso restringido y ser el suero de la fase de convaleciente despus de 14 das.
garante de comprobar que el tubo primario se introduce
aspticamente en el envase secundario y terciario. - Yesinia pestis: la peste neumnica es una entidad
potencialmente devastadora si se utiliza con fines
Las pruebas a realizar en el laboratorio deben limitarse bioterroristas. La transmisin persona a persona a
al mnimo imprescindible y las muestras deben per- travs del aire es posible, siendo extremadamente
manecer, en todo momento, perfectamente identifica- contagiosa.
das y custodiadas por el personal designado del lab- - Burkholderia pseudomallei: causante de la melioidosis
oratorio en un lugar de acceso restringido. La tcnica es otro potencial agente terrorista por la alta mortalidad
microbiolgica a emplear ser escrupulosa, evitando que causa, la frecuencia de recidivas y la dificultad de
riesgos de aerosolizacin, derrames o salpicaduras. En su tratamiento.
caso de centrifugacin manual se deber disponer de
cubetas o rotores hermticamente cerrados, los cuales, Otras enfermedades de etiologa vrica que se han
una vez finalizada la centrifugacin, se abrirn en el incorporado a la lista de patgenos emergentes o
interior de la cabina de bioseguridad. El manipulador agentes bioterroristas potenciales son el Coronavirus
deber estar tranquilo, sin presin, y supervisado por causante del sndrome respiratorio agudo grave
una persona con conocimientos tcnicos. Las muestras (SARS), la gripe por el Virus de la gripe A o la gripe aviar
de los casos confirmados de este tipo de infecciones, y los virus que causan fiebres hemorrgicas, un grupo
en el momento de su eliminacin se deben considerar de virus ARN miembros de las familias Filoviridae (Virus
como residuos sanitarios del grupo III que son aquellos Ebola y Marburg ), Arenaviridae (Virus hemorrgico de
que requieren unas medidas especiales de prevencin, la fiebre de Lassa), Hantavirus y Virus Crimea-congo y
recogida, almacenamiento, transporte y eliminacin Flaviviridae (dengue y fiebre amarilla). El diagnostico
dentro y fuera del centro sanitario. Para su eliminacin requiere instalaciones de alta seguridad biolgica, se

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DOCUMENTO CIENTFICO

realiza mediante tcnicas serolgicas y moleculares, 3. Bourbeau PP, Swartz BL. First evaluation of the WASP, a
as como con microscopia electrnica y cultivos new automated microbiology plating instrument. J Clin Micro-
celulares. En este grupo conviene destacar dos virus: biol 2009; 47:11011106.
- Virus Ebola: es un agente biolgico del grupo 4 y
las muestras se deberan manejar en instalaciones 4. Buchan BW, Ledeboer NA. Emerging Technologies for the
de nivel de bioseguridad 4. Lo mejor es minimizar la Clinical Microbiology Laboratory. Clin Microbiol Rev 2014;
manipulacin de la muestra, por lo cual lo aconsejable 27:783822.
es enviarla al laboratorio de referencia directamente
desde la habitacin del paciente, embalaje incluido. 5. Croxatto A, Dijkstra K, Prodhom G, Greub G. Comparison
La muestra diagnstica fundamental es la sangre of inoculation with the InoqulA and WASP automated sys-
anticoagulada con EDTA, aunque tambin se puede tems with manual inoculation. J Clin Microbiol 2015; 53:2298
utilizar suero o plasma. Conforme la enfermedad 2307
avanza se puede detectar el virus en muchas otras
muestras biolgicas, como vmitos, orina, heces,
6. Croxatto A, Prodhom G, Faverjon S, Rochais Y, Greub
saliva, conjuntiva, semen, exudado vaginal, etc., pero
G. 2016. Automation in clinical bacteriology: what system to
no deben ser consideradas como muestras primarias
choose? Clin Microbiol Infect 2016;22: 217235.
para el diagnstico. El microbilogo debe formar
parte del equipo de profesionales que participarn en
la obtencin, recepcin, embalaje y transporte de la 7. Dauwalder O, Landrieve L, Laurent F, de Montclos M, Van-
muestra que se remita al Centro de Referencia como denesch F, Lina G. Does bacteriology laboratory automation
garante de la ausencia de contaminacin externa de reduce time to results and increase quality management?
los embalajes secundario y exterior. Deber participar Clin Microbiol Infect 2016; 22: 236243.
llevando un doble guante, protector facial completo
(o gafas protectoras), bata impermeable de apertura 8. Ellen Jo Baron J, Michael Miller Melvin P, Weinstein Sandra
trasera y calzas. S, Richter Peter H, Gilligan, Paul Bourbeau Karen C, Carroll
Sue C, Kehl W, Michael Dunne. A guide to utilization of the
- Virus Zika: este virus se ha detectado en sangre
Microbiology Laboratory for diagnosis of infectious diseases:
entera (tambin en suero y plasma), orina, lquidos
cefalorraqudeo y amnitico, semen y saliva. Cada vez 2013. Recommendations by the Infectious Diseases Society
hay ms pruebas de que el virus est presente en la of America (IDSA) and the American Society for Microbiology
orina y el semen durante ms tiempo que en la sangre (ASM). Clin Infect Dis (2013); 57(4):e22-e121
entera o la saliva. Aunque todava se estn recogiendo
datos sobre la duracin de la persistencia del virus 9. Glasson JH, Guthrie LH, Nielsen DJ, Bethell FA. Evalua-
en la saliva, el lquido cefalorraqudeo, el semen y tion of an automated instrument for inoculating and spreading
los productos de la concepcin, en este momento samples onto agar plates. J Clin Microbiol 2008; 46:1281
se recomienda que a los pacientes se les extraigan 1284.
muestras de sangre entera o suero y/u orina. En
situaciones donde hay un aumento del riesgo de virus
10. Greub G, Prodhom G. 2011. Automation in clinical bac-
Zika, Dengue y Chikungunya el uso de tcnicas de RT-
teriology: what system to choose? Clin Microbiol Infect 17:
PCR permite la deteccin simultnea y la diferenciacin
655660.
del ARN de esos virus.

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samples by use of Previ Isola System compared to manual Strip, an immunochromatographic method, to detect tinea
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17. Novak SM, Marlowe EM. Automation in the Clinical Micro- 22. Wakamoto H, Miyamoto M. Development of a new der-
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Procedimiento general de recogida, transporte y


procesamiento de las muestras en el laboratorio
de Microbiologa

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

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EDICIN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

01 Edicin inicial

COPIA REGISTRADA N............................ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologa del Hospital/Centro...........


La informacin en l contenida no podr reproducirse total ni parcialmente sin autorizacin escrita del Re-
sponsable de su elaboracin. Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

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1. PROPSITO Y ALCANCE

En este procedimiento se describen los pasos a seguir de manera general, en la recogida, transporte y poste-
rior procesamiento de las muestras que se reciben en un laboratorio de Microbiologa, con el fin de descartar o
determinar el agente infeccioso responsable del cuadro clnico que origin la solicitud de determinaciones en
dicha muestra.

El alcance incluye a todo el personal de enfermera y/o mdico encargado de la toma de muestras en departa-
mentos hospitalarios, incluyendo servicios de urgencias, bloques mdicos y quirrgicos y consultas externas,
as como a los centros de salud u otras entidades sanitarias en los que desarrolle el diagnstico microbiolgico.

2. FUNDAMENTO

La eleccin de la muestra que se debe enviar para el estudio microbiolgico se basa en 2 premisas fundamentales:
el lugar de la infeccin y la naturaleza del agente infeccioso sospechoso de ser responsable del cuadro clnico que
determina la peticin o el estudio microbiolgico. Para proporcionar el nivel de calidad necesario, el laboratorio re-
quiere que todas las muestras microbiolgicas sean correctamente seleccionadas, recogidas y transportadas, ya que
esto permite optimizar su anlisis e interpretacin.

Todo el trabajo del laboratorio de Microbiologa se convierte en intil, si las muestras clnicas que le llegan para el
diagnstico no son de calidad, es decir, no estn correctamente recogidas y enviadas al laboratorio; por ello el labo-
ratorio de Microbiologa debe poner a disposicin de todos los mdicos/personal sanitario solicitantes un manual de
toma de muestras que facilite este proceso de recogida y transporte.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA

1. Amy L. Leber. 2016. Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol. 1-3, 4th edition. American Society for
Microbiology. Washington, D.C.

2. Guidance on regulations for the transport of infectious substances 20152016. World Health Organization
2015. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/149288/1/WHO_HSE_GCR_2015.2_eng.pdf

3. Jorgensen JH, Pfaller MA, Carroll KC. 2015. Manual of Clinical Microbiology, 11th ed. American Society for
Microbiology. Washington, D.C.

4. Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiologa. Procedi-


mientos en Microbiologa Clnica. Recomendaciones de la SEIMC. Ao 2003. Disponible en www.seimc.org/
documentos/microbiologa

5. Seguridad en el laboratorio de Microbiologa Clnica. Procedimientos en Microbiologa Clnica. Recomenda-


ciones SEIMC. Ao 2014. Disponible en http://www.seimc.org/documentos/microbiologa

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4. MUESTRAS

4.1. CONSIDERACIONES PREVIAS

Es necesario para la recogida de muestras microbiolgicas tener en cuenta que:

1. Antes de recoger la muestra, considerar el riesgo / beneficio de la recogida de sta para el paciente.
2. La toma de la muestra se debe hacer de forma asptica, evitando contaminaciones del personal,
ambientales o del enfermo. Evitar, siempre que sea posible, el contacto de la muestra con microbiota
normal del paciente.
3. Debe recogerse una cantidad suficiente de muestra para asegurar el proceso diagnstico. Enviar
tejido o lquido siempre que sea posible en lugar de una muestra recogida con torunda.
4. Las muestras se deben recoger en contenedores adecuados y hermticos. Cada tipo de muestra
requiere un contenedor diferente, (ver tabla 2 del documento cientfico de este procedimiento SEIMC).
5. Todas las muestras deben ser transportadas lo ms pronto posible al laboratorio de Microbiologa,
preferentemente antes de dos horas.
6. La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso, se ha de recoger del sitio exacto y si-
guiendo las medidas de precaucin universales.
7. La muestra no debe estar en contacto con antispticos o desinfectantes que pueden alterar la viabi-
lidad de los microorganismos.
8. Todas las muestras deben ir adecuadamente identificadas con los datos del paciente (nombre y n-
mero historia clnica o fecha de nacimiento), tipo de muestra, fecha y hora de recogida.
9. Se debe comprobar que en la solicitud, ya sea en volante o electrnica, se incluyen detalles sobre
origen de la muestra, sospecha clnica y terapia antimicrobiana previa, de modo que el laboratorio pueda
determinar el mtodo ms apropiado para procesarla.
10. De ser posible, la toma de la muestra se realizar antes del inicio de la antibioterapia o 48 horas
tras su finalizacin. En el caso de deteccin de anticuerpos, antgenos o cidos nucleicos el tratamiento
antibitico previo es menos definitivo que para el cultivo.
11. Notificar al laboratorio por adelantado si se solicitan pruebas especiales o si se sospecha que exis-
ten patgenos inusuales, incluidos los potenciales agentes de bioterrorismo.
12. Todas las muestras microbiolgicas pueden ser potencialmente peligrosas.

4.2. MOMENTO DE LA TOMA

Habitualmente la muestra para estudio microbiolgico debe obtenerse lo ms pronto posible en relacin al co-
mienzo de la enfermedad infecciosa, excepto en aquellas en las que se busca detectar la huella de la infeccin
en el sistema inmune y es necesario un tiempo determinado para confirmar el diagnstico. En algunos casos es
necesario cumplir unos requisitos fundamentalmente de tiempo, sobre todo si han existido tratamientos previos
(por ejemplo, onicomicosis), para no disminuir la sensibilidad del cultivo. La explicacin sobre la toma de cada
una de las muestras se encuentra detallada en los correspondientes procedimientos de la SEIMC.

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4.3. OBTENCIN DE LA MUESTRA

Respecto a la obtencin de algunos tipos de muestras conviene sealar lo siguiente:

- Muestras recogidas con torundas: son apropiadas cuando el volumen de muestra es limitado (por ejemplo,
heridas de superficie o muestras orofarngeas), cuando no sea posible obtenerlas por otro medio y cuando el
nmero de medios a inocular sea limitado. Se deben recoger cuidadosamente para evitar tocar superficies que
contengan bacterias contaminantes, y se deben rodar o frotar vigorosamente sobre la superficie infectada para
maximizar la adsorcin. Las torundas no se recomiendan para los cultivos anaerobios (poco material, suscep-
tible de ser aireado y en posible contacto con contaminantes) o cultivos de hongos filamentosos.

Para la deteccin de micobacterias, como Mycobacterium marinum, se pueden utilizar, aunque es preferible el
aspirado de fluidos o el tejido. En las lceras de decbito no son muy aconsejables, ya que son ms propensos
a recuperar bacterias colonizantes pudiendo enmascarar al verdadero patgeno. Los torundas flocadas se
han convertido en una valiosa herramienta en la recoleccin de las muestras, permitiendo una liberacin de la
misma de manera ms efectiva.

- Aspirados y fluidos: para los contenidos de abscesos, fluidos corporales y otras colecciones de lquidos por
debajo de la piel, se prefieren los aspirados obtenidos a travs de piel intacta y desinfectada sobre las torun-
das. La piel debe limpiarse a fondo con alcohol al 70% seguida de la desinfeccin con povidona yodada o clor-
hexidina y debe estar completamente seca antes de insertarse la aguja. Si la muestra se recoge con jeringa,
se ha de retirar la utilizada para la extraccin y cambiarla por un tapn estril antes de iniciar su transporte. Si
se sospechan anaerobios, el contenedor de transporte debe ser adecuado.

- Tejidos: el tejido biopsiado se ha de obtener por un especialista usando una tcnica asptica. La piel de la
superficie debe desinfectarse con clorhexidina antes de realizar la incisin. Una vez realizada sta (primera
incisin que puede contener pequeas cantidades de bacterias superficiales), se debe cambiar a un nuevo
bistur. El tejido debe colocarse en un vial de transporte anaerbico, en un frasco estril si no se consideran
anaerobios, o en medio de virus si la sospecha es de infeccin vrica.

- Muestras respiratorias: para la obtencin de muestras no invasivas (esputo), el enfermo previamente se la-
var los dientes con pasta y cepillo, se enjuagar la boca con agua o har grgaras, con el fin de arrastrar la
microbiota colonizadora superficial. A continuacin, hay que obtener el esputo tras una expectoracin profunda
(NO fluido retronasal), preferentemente matinal, siendo til realizar previamente un drenaje postural o fisiotera-
pia respiratoria. De no producirse expectoracin espontnea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones de
suero fisiolgico estril (debe inhalar al menos 25 ml de solucin salina al 3-10%), el que se denomina esputo
inducido. En estos casos tambin es til realizar previamente un drenaje postural o fisioterapia respiratoria. En
pacientes peditricos que no expectoran espontneamente se recoger la muestra por aspiracin tras fisiote-
rapia respiratoria. La dificultad para la obtencin de buenas muestras ha favorecido el desarrollo de tcnicas
rpidas de deteccin de antgenos en orina (Streptococcus pneumoniae y Legionella pneumophila).

- Orina: la primera orina de la maana es la ptima para la mayora de los estudios, ya que las bacterias se han
multiplicado en la vejiga durante varias horas.

- Heces: se prefiere la toma de heces a la de una torunda rectal para las pruebas bacterianas, aunque si no
es posible la obtencin de heces, sta debe ser insertada en recto de forma que alcance material fecal. Las
torundas se deben enviar siempre en medios de transporte para preservar la viabilidad de los patgenos.

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4.4. VOLUMEN DE LA MUESTRA Y NMERO

En general, es mejor usar el mayor volumen de material disponible, aunque si las muestras son demasiado
grandes se puede, por la dificultad de manipulacin de las mismas en el laboratorio, facilitar la contaminacin
de la muestra. El volumen mnimo para inocular una placa o un caldo de enriquecimiento es una gota (0,05
ml) y como norma general, para el cultivo bacteriolgico es necesario al menos 0,5 ml o 0,5 g de material, y se
necesita ms cantidad segn el nmero de peticiones realizadas sobre esa muestra (ver tabla 3 del documento
cientfico). Normalmente se procesa una muestra por cada solicitud, pero existen procesos como la determi-
nacin de micobacterias, la bsqueda de parsitos, las infecciones protsicas, etc en las que es necesario
ampliar el nmero de muestras para tener una mayor rentabilidad y/o una mejor interpretacin de los resultados
del cultivo.

4.5. CONSERVACIN

Existen bacterias especialmente sensibles a las condiciones ambientales y que requieren un procesamien-
to inmediato: Bordetella pertussis, Shigella spp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus
influenzae, Streptococcus pneumoniae y microorganismos anaerobios. Retrasos de ms de 6 horas, incluso
con el uso de medios de transporte adecuados, dan lugar a una prdida de recuperacin de microorganismos
viables. Si las muestras van a tardar en procesarse ms de 6 horas, se deben refrigerar la mayora de ellas.
Volmenes pequeos (<1 ml) o secciones pequeas (<1 cm3) se deben enviar entre los 15-30 primeros mi-
nutos, en estos casos es aconsejable aadir unas gotas de suero salino fisiolgico para evitar la desecacin
de las muestras. Las muestras que se van a procesar solo mediante tcnicas de biologa molecular se deben
refrigerar o mejor congelar a -70C, siempre asegurndose de cumplir las recomendaciones del fabricante de
la tcnica o procedimiento que se vaya a emplear (ver tabla 5 del documento cientfico).

4.6. RECEPCIN DE LA MUESTRA: CRITERIOS DE ACEPTACIN Y RECHAZO

Cada laboratorio de Microbiologa debe disponer de unas normas de recepcin y aceptacin de muestras
para diagnstico microbiolgico que los mdicos solicitantes deben conocer. Dado que toda muestra clnica es
irrepetible, se intentar por todos los medios evitar el rechazo de las mismas, tratando de resolver en la propia
seccin de registro y recepcin de muestras los problemas que pudieran ser causa de rechazo.

De manera general, se rechazarn siempre:


- las muestras no identificadas
- las muestras derramadas
- las que sean inadecuadas para la evaluacin de la enfermedad que se pretende analizar
- las que excedan el nmero mximo aceptado para una evaluacin determinada (por ejemplo, ms de 1 copro-
cultivo de un mismo paciente en un mismo da)

Si las muestras son de muy difcil obtencin slo se rechazarn cuando estn mal identificadas y haya sido
imposible resolver la incidencia; cuando se registren otros tipos de incidencias como una conservacin inade-
cuada (temperatura inapropiada, muestras en medio no apropiado), se procesarn, pero se har constar la
incidencia producida en el informe de resultados: Interpretar los resultados con precaucin: muestra recibida
en condiciones defectuosas.

Las incidencias surgidas en la recogida de la muestra, se deben de informar lo antes posible al servicio solici-
tante con el objeto de que la resolucin sea inmediata y adems quedar anotadas en el registro de incidencias
del plan de calidad del laboratorio.

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Existe la posibilidad, en los laboratorios en los que se dispone de peticin electrnica, de que al registrar una
muestra, se obtengan etiquetas sobreimpresas con la identificacin del paciente, nmero de muestra, tipo de
muestra, servicio solicitante, medios de cultivo a utilizar y el box de trabajo en el que se realizar el procesa-
miento para cada una de las determinaciones a realizar, evitando as los posibles errores producidos por el
registro manual y facilitando la siembra en los medios adecuados. Adems, es posible aadir una o ms de-
terminaciones a una muestra con facilidad, si el mdico peticionario lo solicita o si el microbilogo lo considera
necesario segn la informacin que acompaa a la muestra.

4.7. TRANSPORTE

El tipo de prueba determina la naturaleza del sistema de transporte, pero siempre debe efectuarse lo ms
rpidamente posible desde la obtencin de la muestra. Si el procesamiento no se realiza de inmediato o en
las 2 primeras horas se deben de conservar de forma especfica (ver tabla 5 del documento cientfico de este
procedimiento). En la mayora de los laboratorios, se dispone de un tubo neumtico que facilita el envo de las
muestras desde las distintas unidades asistenciales al laboratorio, siempre y cuando est asegurado el cierre
hermtico de los contendores. Hay muestras que NUNCA se deben enviar a travs de este sistema de trans-
porte y son los frascos de hemocultivos (sangre y lquidos estriles), muestras en jeringa y muestras especial-
mente valiosas por su dificultad de obtencin como el LCR y muestras quirrgicas intraoperatorias.

La mayora de las muestras que se reciben diariamente en un laboratorio de Microbiologa son sustancias
infecciosas de la categora B y designadas UN 3373, stas se pueden transportar a otro hospital en el mbito
regional o nacional siguiendo las Instrucciones de envasado P620 relativa al transporte de sustancias infeccio-
sas 2013-2014 y que se reproduce en el ANEXO 1.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS

Los medios de cultivo habituales se detallan en las tablas 7 y 8 del documento cientfico. Es necesario disponer
de medios de cultivo slidos y lquidos.

Reactivos y productos:
Colorantes para tincin de Gram
Colorantes para tincin de Zhiehl-Neelsen o tincin de auramina
KOH (hidrxido de potasio)
Tinta china
Tincin de calcofluor
Reactivos para la tincin de Giemsa o Field
Lugol
Alcohol 96
Aceite de inmersin
Agua destilada estril
N-acetil cistena
Solucin Ringer-lactato
Solucin salina
Sistemas generadores de atmsfera anaerobia, microaeroflica y con 5%CO2
Reactivos necesarios para la realizacin de tcnicas rpidas

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6. APARATOS Y MATERIAL
Asas calibradas
Pipetas Pasteur estriles
Pipetas calibradas
Puntas de pipeta estriles
Placas de Petri estriles
Portaobjetos y cubreobjetos
Hojas de bistur estriles
Tubos de rosca y/o otros contenedores estriles
Tubos de fondo cnico
Jeringas y agujas desechables
Papel parafilm
Pinzas estriles
Tijeras estriles
Mechero Bunsen
Guantes
Jarras de incubacin (anaerobiosis, microaerofilia, C02)
Gradillas para colocar las muestras
Agitador tipo vrtex
Centrfugas y citocentrfuga
Homogenizadores de muestras o morteros estriles
Sonicador
Stomacher
Contenedores de residuos.
Estufas (de aerobiosis y de CO2)
Neveras y congeladores (almacenaje de placas y reactivos)
Cabina de seguridad biolgica tipo II
Microscopio ptico

Las revisiones, as como cualquier tipo de incidencia, de los aparatos y/o el material, deben estar detalladas
en la hoja de mantenimiento de equipos dentro del plan de calidad del laboratorio y se deben cumplir riguro-
samente.

7. PROCESAMIENTO

El procesamiento de las distintas muestras en Microbiologa conlleva los siguientes pasos: una evaluacin de
la adecuacin de las muestras, una seleccin de medios y una siembra para el aislamiento primario. Durante
todo el procedimiento se debe trabajar en campana de bioseguridad, usando guantes, bata y otro equipo
protector segn el tipo de muestra lo requiera.

A) CULTIVO MEDIANTE MTODOS CONVENCIONALES

7.1 FASE DE PRETRATAMIENTO

7.1.1. Centrifugacin
- Centrifugar todos los lquidos con volumen superior a 1ml a 2.500 rpm durante 15 minutos
- Centrifugar la sangre a 3.500 rpm durante 3-5 minutos para deteccin de antgenos y/o anticuerpos
- Otras tcnicas de concentracin especficas: precipitacin en etanol, ultracentrifugacin selectiva, etc.

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7.1.2. Homogeneizacin muestras (de tejido, abscesos, heridas)

7.1.2.1 Mediante hoja de bistur

- Traspasar la muestra a una placa de Petri estril. Con ayuda de una hoja de bistur desmenuzar el tejido hasta
obtener una consistencia homognea. Seleccionar los bordes de la muestra
- Traspasar la muestra homogenizada a un contenedor estril con ayuda de una pipeta Pasteur

7.1.2.2. Mediante mortero

- Traspasar la muestra al interior de un mortero estril y aadir 1-2 ml de caldo de cultivo


- Con ayuda de la mano del mortero triturar la muestra mediante movimientos rotatorios
- Traspasar la muestra utilizando una pipeta Pasteur estril a un contenedor estril

7.1.2.3. Mediante Stomacher

- Colocar la muestra en el interior de una bolsa de Stomacher y aadir 1-2 ml de caldo de cultivo
- Colocar la bolsa en el interior del Stomacher, dejando unos centmetros de la bolsa sobresalir sobre la tapa
- Cerrar la tapa y conectar el Stomacher durante 1 a 5 minutos
- Desconectar el Stomacher, extraer la bolsa y traspasar su contenido a un contenedor estril

7.1.3. Sonicacin

7.1.3.1. Tcnica de sonicacin del catter para liberar biofilm

A. Colocar la punta del catter en tubo estril con 10 ml de caldo TSB


B. Someter el tubo a ultrasonidos durante 1 minuto a 55.000 Hz y 125 w
C. Agitar en vortex durante 15 segundos
D. Aadir 0,1 ml del caldo a 9,9 ml de solucin salina. Agitar
E. Dejar caer 0,1 ml de caldo y 0,1 ml de la suspensin salina por separado en agar sangre y MaConkey. Di-
fundir con asa estril
F. Incubar durante 48 h en 5% CO2 y contar las colonias

7.1.3.2. Tcnica de procesamiento de prtesis articulares, vlvulas y otros implantes

A. En cabina de bioseguridad, retirar la tapa del envase estril conteniendo la prtesis y aadir 400 ml de so-
lucin estril de Ringer lactato o caldo de enriquecimiento. Para muestras ms pequeas (tornillos, tuercas),
colocar en un tubo estril de 10 ml con tapa de rosca tapa y cubrir con un mximo de 10 ml de solucin o caldo
B. Volver a colocar la tapa en el envase y asegrese de que se enrosca en forma segura
C. Agitar el envase durante 30 segundos con un vrtex de plataforma plana
D. Someter a ultrasonidos durante 5 minutos
E. Agitar durante 30 segundos
F. De forma asptica, extraer una alcuota de 50 ml de lquido de sonicacin de la prtesis en un tubo cnico
de centrfuga. Para muestras ms pequeas, para hacer la alcuota extraer todo el lquido sonicado en un tubo
de centrfuga
G. Centrifugar los tubos a 3.000 rpm durante 15 minutos
H. Desechar 49,5 ml (antes de 15 minutos para evitar la resuspensin del sedimento) dejando 0,5 ml (una

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concentracin de 100 veces) restante con el sedimento


I. Colocar una gota del sedimento sobre un portaobjetos para tincin de Gram
J. Colocar 0,1 ml de sedimento en cada placa a sembrar (agar sangre y agar chocolate)

7.2 SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO

De manera general hay que buscar siempre la parte ms purulenta de la muestra para los cultivos y las exten-
siones y es preferible cultivar grandes volmenes de muestra si hay disponibilidad, que centrifugarlos.

7.2.1. Piezas no triturables

Para muestras con o sobre cuerpos extraos quirrgicos (distintos a las prtesis ortopdicas) si no hay mate-
rial o tejido purulento que extraer, lo mejor es baarlos en caldo de enriquecimiento en un contenedor estril
dejndolos incubar a 35C durante 24 horas y luego realizar subcultivos a los medios necesarios y tincin de
Gram de ese caldo.

7.2.2. Muestras recibidas en jeringas o tubos estriles

- Inocular 2 3 gotas de la muestra en uno de los cuadrantes de la placa de Petri


- Realizar estriamientos de la muestra mediante un asa estril por todos los cuadrantes de la placa
- Inocular unas gotas de la muestra en un caldo de cultivo

7.2.3. Muestras recibidas en torundas (cada vez menos deseable en funcin del tipo de muestra)

Rechazar radicalmente aquellas torundas sin medio de transporte. Si solo se enva una, se introduce en caldo
y se realiza una agitacin y se exprime todo el contenido de la torunda en un contenedor estril. De ah con
una pipeta se inocularn las placas de cultivo y las extensiones. Si se envan dos torundas, utilizar una para
realizar las extensiones para la tincin de Gram y proceder con la otra como a continuacin:

- Hacer rotar la torunda varias veces en uno de los cuadrantes de la placa


- Con un asa estril realizar estras desde la zona de la descarga por el resto de los cuadrantes de las placas
- Introducir la torunda en un caldo de cultivo y exprimirla bien mediante movimientos rotatorios sobre las pare-
des del tubo. Cortar la parte superior y mantener en incubacin una porcin de la misma en el interior del tubo
con caldo de cultivo

7.2.4. Tcnica de Maki para cultivo de catteres intravasculares

- Con la ayuda de un asa o de unas pinzas estriles extraer el catter de su envase


- Si mide ms de 2-4 cm, cortarlo con un bistur hasta esa longitud
- Depositarlo en una placa de agar sangre y rodar desde un extremo al otro de la placa 3-4 veces

7.2.5. Tcnica de rajado de catter silsticos peditricos para cultivo cuantitativo

- Con la ayuda de un bistur estril, sobre una placa de Petri estril, rajar el catter abrindolo por la mitad con
la ayuda de pinzas estriles. Colocarlo en la placa de AS con el interior del catter hacia la superficie del agar,
movindolo de forma circular por toda la placa

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7.2.6. Cultivos semicuantitativos (conexin catteres/piel pericatter)

- Extender la muestra con la torunda seca por toda la placa de agar sangre como si de un cultivo cuantitativo
de orina se tratara

7.2.7. Cultivos cuantitativos (orina, secreciones traqueales, BAS y LBA)


- En el caso de muestras respiratorias fluidas, agitar en vrtex durante unos segundos. Si no se consigue una
buena homogeneizacin, aadir suero salino y agitar en vrtex de nuevo. Indicar en los medios de cultivo la
dilucin aproximada realizada. Tambin se puede utilizar en muestras muy mucosas, acetil-cistena para fluidi-
ficarlas, conociendo bien la dilucin mantenida

- En el caso de la orina sembrar con asa calibrada un volumen adecuado en los medios apropiados, realizando
un cultivo cuantitativo por toda la superficie de la placa. Las muestras de orina obtenidas por miccin media
y de sondaje vesical se deben sembrar en medio de cultivo con asa de 1 L, mientras que las muestras de
orina obtenidas por puncin suprapbica, nefrostoma o cistoscopia deben sembrarse con asa de 10 L para
el recuento consiguiente

7.3 EXTENSIONES

En el diagnstico microbiolgico la realizacin de las extensiones para las tinciones o visin directa, son las
herramientas ms coste-efectivas y ms rpidas para proporcionar informacin til al clnico

7.3.1. Mediante impronta: Piezas de tejido

- Colocar el tejido en una placa de Petri y cortar una porcin con la ayuda de una hoja de bistur
- Con unas pinzas, tomar la pieza cortada y realizar impresiones por la superficie del corte sobre un portaob-
jetos

7.3.2. Extensiones finas: material muy purulento

- Tomar una porcin de la muestra y colocarla sobre un portaobjetos


- Colocar otro portaobjetos sobre la muestra y presionar los dos portaobjetos
- Desplazar el portaobjetos superior sobre el que contiene la muestra hasta separarlos
- Repetir este ltimo paso hasta conseguir una extensin fina. Con papel secante retirar el sobrante

7.3.3. Lquidos, fluidos, LCR y LBA

- Depositar una gota de lquido sobre un portaobjetos (dos si escasa muestra o poco concentrada) y dejar secar
- Citocentrifugar unas gotas de lquido 5-10 min. a velocidad media

7.3.4. Muestras en torundas

- Si hay slo una torunda colocarla sobre un tubo estril y aadir una pequea cantidad de caldo de cultivo
- Agitar en vrtex y exprimir la torunda sobre las paredes del tubo. Del lquido resultante poner una gota sobre
el portaobjetos y dejar secar al aire
- Si hay ms de una torunda, directamente realizar movimientos rotatorios suaves, exprimiendo la torunda
sobre el portaobjetos, evitando romper clulas ni elementos bacterianos

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7.3.5. Muestras de orina

- Colocar una gota o 10 L de orina bien mezclada, no centrifugada sobre el portaobjetos (mejor si son portas-
delimitados con un crculo para localizar la muestra al microscopio). Secar al aire sin extender

7.3.6. Muestras distintas de torundas (exudados o aspirados, esputos)

- Seleccionar la parte ms purulenta del esputo o con rastros de sangre del pus y depositar sobre el portaob-
jetos con ayuda de un asa estril o una pipeta
- Extender la muestra sobre la superficie del portaobjetos creando una delgada pelcula

7.3.7. Material seco o escaso

- Emulsionar la muestra en 0,5 ml de caldo estril. Agitar en vrtex


- Usar una pipeta Pasteur para colocar 1 gota sobre el portaobjetos y extender con la punta de la pipeta

7.3.8. Cultivos en medios lquidos (hemocultivos, tioglicolato)

- Preparar una extensin sobre portaobjetos con pipeta estril


- Utilizar agujas desechables o dispositivos especiales sobre los frascos de hemocultivos para colocar 1 o 2
gotas sobre el portaobjetos
- Extender con asa estril en una delgada pelcula
- En medios con carbn activado, preparar las extensiones como una extensin de sangre perifrica para re-
cuento hematolgico (ver gota fina para malaria)

7.3.9. Extensiones de sangre perifrica.

- Las extensiones de sangre para parsitos deben realizarse sobre portaobjetos de cristal habituales (2,5 cm
ancho x 6 cm largo). Para una optimizacin de la ptica se pueden lavar los portaobjetos con alcohol eliminan-
do los restos de grasa o suciedad antes de realizar las extensiones
- Las extensiones, independientemente de la tincin a usar, se deben teir lo ms pronto posible despus de
que se hayan secado. Si se almacenan sin teir pueden ocasionarse artefactos en la tincin
- La observacin de sangre para descartar malaria se considera una prueba urgente a realizar de forma inme-
diata bajo requerimiento clnico o facultativo y debe informarse su resultado de igual forma. Para su realizacin
ver el procedimiento SEIMC n 35 El laboratorio de microbiologa ante las enfermedades parasitarias impor-
tadas (2009)

7.4 INCUBACIN

Hay que separar todas las placas y caldos inoculados segn el sistema de ordenacin de cada seccin del
laboratorio y colocarlos en funcin de la temperatura y atmsfera requerida para la incubacin. Se debe com-
probar diariamente que la temperatura y el nivel de humedad de las estufas es el adecuado.
Respecto a los medios de cultivo habituales, las placas de agar chocolate se incubarn en atmsfera de CO2 y
las de MacConkey, agar sangre y caldos de enriquecimiento (tioglicolato o BHI) en aerobiosis; las especficas
para estudio de anaerobios en esa atmsfera.

Respecto a microorganismos, las placas para recuperar Campylobacter spp. y H. pylori se incubarn en at
msfera de microaerofilia, Legionella spp. y Bordetella pertussis en aerobiosis y se utilizar una atmsfera
de incubacin con 5-7% CO2, sobre todo para aislamiento de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus

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influenzae, y Neisseria gonorrhoeae. Este tipo de atmsfera tambin puede utilizarse para la incubacin de
muestras respiratorias, genitales y lquidos normalmente estriles, mediante el uso de estufas equipadas,
jarras especiales con sistema de provisin de CO2, con sobres, ampollas o tabletas generadoras de CO2
en jarras de cierre hermtico. Tambin pueden ser opcionales para incubar subcultivos de hemocultivos o
caldos de enriquecimiento, cultivos para Streptococcus agalactiae o difteria, y urocultivos. Respecto a los
medios cromognicos se seguirn las instrucciones del fabricante pero por regla general nunca deben incu-
barse en anaerobiosis y deben conservarse en la oscuridad.

B) CULTIVO MEDIANTE SIEMBRA AUTOMATIZADA

La mayora de los sistemas automatizados procesan muestras lquidas incluyendo torundas en medio de
transporte lquido, exudados, aspirados, lquidos estriles y orinas. Globalmente evitan errores de etiqueta-
do, accidentes laborales, ahorran tiempo y permiten reorganizar el trabajo de los tcnicos del laboratorio. La
mayora de ellos utilizan varios patrones pre-programados de tcnica de siembra, aunque cada laboratorio
tambin puede disear un modelo propio.

El manejo diario del WASP consiste: A primera hora de la maana

1 Inicialmente encendido y puesta en marcha, y comprobacin de conexin al sistema informtico y confir-


macin a travs del panel de control de los siguientes pasos.
2 Hay un tiempo de espera para que el mdulo donde se ubica el esterilizador (de asas) alcance la tem-
peratura adecuada.
3 El sistema realiza un chequeo automtico de todas las funciones y realiza un lavado de asas, una com-
probacin de la tinta de cartucho y limpieza de impresoras (son las que imprimen los portas para la Tincin
de Gram), comprobacin de los lectores de cdigos de barra y de la rueda de insercin de etiquetas.
4 Se carga el carrusel con las placas necesarias segn el tipo de muestra a sembrar, con el agar hacia
abajo.
5 Se cargan las muestras a travs del rack (orinas, coprocultivos y exudados) y el aparato los vehiculiza
hacia el interior para iniciar el procesamiento.

Al terminar (sobre las 5 de la tarde) se vaca el carrusel de placas, se comprueba que no se queda ningn
elemento en el interior del sistema (tapas, portas...) y se cierra el sistema operativo desde la pantalla panel
de control.

En el caso del InoquIA se configuran en el sistema los protocolos de siembra en placa, en tubo o en porta de
cada tipo de nuestra: orina, torunda vaginal, etc., as como el nmero de placas a sembrar por muestra. Una
vez configurado, el sistema aplicar los protocolos correspondientes de manera automtica. A continuacin
hay que cargar el sistema con los distintos tipos de medio a sembrar atemperados y con las muestras a
sembrar en las gradillas configuradas previamente.

Asegurarse que el sistema tiene suficientes esferas magnticas en el contenedor correspondiente as como
puntas de pipeta y pegatinas de cdigos de barra.

El sistema har un chequeo previo de componentes antes de comenzar a trabajar, nos informar con
una alarma si encuentra algn error o falta algn fungible. Las placas una vez sembradas se irn co-
locando automticamente segn el tipo de atmsfera a incubar posteriormente. Se asegura la trazabi-
lidad durante todo el proceso ya que el sistema se conecta al sistema informtico del laboratorio.

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C) TCNICAS RPIDAS
Las diferentes tcnicas de inmunocromatografa y enzimoinmunoanlisis se describen y detallan en el Proce-
dimiento de Microbiologa de la SEIMC n 19: Tcnicas rpidas de deteccin de antgeno (2005), por lo que
a continuacin, slo se indicar el procesamiento general de las muestras para realizacin de tcnicas de
biologa molecular.
Las muestras con solicitud de biologa molecular se deben transferir a la unidad correspondiente y las soli-
citudes sern revisadas y programadas por el responsable tcnico de este rea. La muestra ser alicuotada
en el rea de recepcin de muestras, transfiriendo 0,5-1 ml de la muestra a un tubo de tapn de rosca de 2
ml, debidamente etiquetado, para su envo a la unidad de biologa molecular, haciendo constar en el registro
informtico que la prueba ha sido enviada. La muestra que, por criterio del responsable tcnico, requiera un
procesamiento urgente, ser convenientemente marcada sobre el frasco que contiene la alcuota y se entre-
gar inmediata y directamente al personal de biologa molecular. El resto de alcuotas no urgentes, se pueden
agrupar para trasladarlas en intervalos de 1 hora. Los resultados sern validados por el responsable tcnico
de biologa molecular.

Preparacin de las muestras:


ORINA: centrifugar 8-10 ml de orina durante 15 minutos a 4C y 2500g (centrfuga de 3000 rpm).
Decantar el sobrenadante dejando de 0,5 a 1 ml y enviar al laboratorio de biologa molecular.
HECES: resuspender en tubo de 1,5 ml, 100 mg (100 L) de heces en 900 L de buffer ASL. Agitar
en vrtex durante 2 minutos. Dejar sedimentar 10 minutos a temperatura ambiente. Transferir cuida-
dosamente el sobrenadante (1 ml) a un tubo con tapn de rosca (2 ml). Incubar el tubo 10 min a 70C
MUESTRAS EN MEDIO DE TRANSPORTE DE BACTERIAS: agitar para homogeneizar y enviar 0,5
ml
MUESTRAS EN MEDIO DE CITOLOGIA LIQUIDA: se enviar la muestra original sin manipular y la
peticin
MUESTRAS EN MEDIO DE TRANSPORTE DE VIRUS: homogeneizar la muestra y enviar 0,5 ml
MUESTRAS RESPIRATORIAS:
- lquidas: enviar 0,5 mL de muestra
- mucosas: homogeneizar la muestra, incluyendo si precisa el uso de acetilcistena segn el mismo
protocolo de siembra. Enviar 0,5 ml de muestra
MUESTRAS DE BIOPSIA: Homogeneizar la muestra siguiendo el mismo protocolo de siembra. En-
viar 0,5 ml
LCR y LIQUIDOS BIOLOGICOS: Homogeneizar la muestra y enviar 0,5 ml
PLASMA y/o SUERO: Enviar 0,5 ml de plasma/suero
SANGRE ANTICOAGULADA EDTA: alcuota de 0,5 ml en tubo con tapn de rosca
Los procesamientos de las distintas muestras se harn segn las especificaciones del fabricante para
cada una de las determinaciones solicitadas

8. RESPONSABILIDADES

Deben estar descritas en el manual de calidad del Servicio de Microbiologa y en las fichas de descripcin de
los puestos de trabajo. El procedimiento deber llevarse a cabo por personal tcnico cualificado con un entre-
namiento especfico y la supervisin de las tcnicas deber realizarla el facultativo especialista responsable
de la seccin donde se trabajen dichas muestras.

La toma de muestra, su transporte y conservacin, por parte de los servicios quirrgicos, debe estar asesorada
por los responsables del laboratorio de Microbiologa. El laboratorio de Microbiologa debe elaborar y tener ac-
cesible su cartera de servicios y un Manual de toma de muestras a disposicin de todos los mdicos peticionaros.

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9. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

Antes de manejar muestras biolgicas, todo el personal deber conocer y seguir las normas generales de bi-
oseguridad para trabajar en un laboratorio de Microbiologa, que estarn detalladas en el manual de calidad del
laboratorio o se pueden consultar en el procedimiento nmero 10a de la SEIMC relativo a Seguridad en el Labo-
ratorio de Microbiologa, en el que se detallan los niveles de contencin necesarios para cada microorganismo.
Todos los laboratorios de Microbiologa deberan tener unos protocolos normalizados de trabajo so-
bre la recogida, transporte y procesamiento de las distintas muestras que habitualmente se trabajen en
ese centro, para ser consultados en cualquier momento tanto por el personal tcnico como facultativo.

10. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

El resultado obtenido depende en gran medida de la calidad de la muestra remitida.


Las muestras obtenidas al mismo tiempo de sitios anatmicos diferentes deben considerarse y trabajarse
como muestras diferentes.
En las muestras inoculadas en frascos de hemocultivos no se puede realizar la tincin de Gram.
En algunos tipos de muestras antes de la realizacin del cultivo, se debe valorar la calidad de la muestra
mediante tincin de Gram (criterios de Murray-Washington) para proceder o no a su siembra (esputos).

11. BIBLIOGRAFA

1. Baron EJ, Michael Miller Melvin P, Weinstein Sandra S, Richter Peter H, Gilligan, Paul Bourbeau Karen C, Carroll Sue C, Kehl
W, Michael Dunne. A guide to utilization of the Microbiology Laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2013. Recommen-
dations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM). Clin Infect Dis
2013; 57: e22-e121
2. Guembe M, Martn-Rabadn P, Cruces R, Prez-Granda MJ, Bouza E. Sonicating multi-lumen sliced catheter tips after the
roll-plate technique improves the detection of catheter colonization in adults. J Microbiol Methods 2016; 122: 2022
3. Martn-Rabadn P, Prez-Garca F, Zamora Flores E, Nisa ES, Guembe M, Bouza E. Improved method for the detection of
catheter colonization and catheter-related bacteremia in newborns. Diagn Microbiol Infect Dis 2017; 87:311-314
4. Osmon DR, Berbari EF, Berendt AR, Lew D, Zimmerli W, Steckelberg JM, Rao N, Hanssen A, Wilson WR. Diagnosis and Ma-
nagement of Prosthetic Joint Infection: Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect
Dis 2013; 56:e125.

Anexo 1.

Instruccin de envasado P650

Las sustancias infecciosas de la categora B y designadas UN 3373 se pueden transportar siguiendo las
instrucciones de envasado P620 relativas al transporte de sustancias infecciosas 2013-2014 y que se repro-
duce a continuacin. Las diversas disposiciones mencionadas se exponen en la Reglamentacin Modelo de
las Naciones Unidas.
A. Los envases debern ser de buena calidad, suficientemente fuertes como para resistir los choques y las car-
gas que pueden producirse normalmente durante el transporte, incluido el trasbordo entre distintas unidades
de transporte de mercancas y entre unidades de transporte y almacenes, as como el izado de pals o sobre-
envases para su ulterior manipulacin manual o mecnica. Los envases debern estar fabricados y cerrados
de forma que en las condiciones normales de transporte, no se produzcan mermas debidas a vibraciones o a

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cambios de temperatura, de humedad o de presin.

B. El envase deber comprender los tres elementos siguientes:

i. Un recipiente primario
ii.Un recipiente secundario
iii.Un recipiente exterior de los que, bien el envase secundario, bien el envase exterior, deber ser rgido
Para el transporte en avin, el recipiente exterior deber ser rgido

C. Los recipientes primarios se colocarn en un recipiente secundario de forma tal que, en las condiciones nor-
males de transporte, no puedan romperse, perforarse ni dejar escapar su contenido al recipiente secundario.
Los recipientes secundarios irn sujetos dentro de embalajes exteriores con un material amortiguador apropia-
do. Un derrame del contenido no menoscabar la integridad del material amortiguador ni del envase exterior.

D. Para el transporte, la marca que se muestra a continuacin deber figurar en la superficie exterior del en-
vase exterior sobre un fondo de un color que contraste con ella y que sea fcil de ver y leer. La marca deber
tener forma de cuadrado orientado en un ngulo de 45 (romboide) del que cada lado tendr una longitud de
al menos 50 mm, el grosor de las lneas deber ser al menos de 2 mm y la altura de las letras y cifras deber
ser de al menos de 6 mm. La designacin oficial de transporte, BIOLOGICAL SUBSTANCE, CATEGORY B
(SUSTANCIA BIOLGICA, CATEGORA B), en letras de al menos 6 mm de altura, deber figurar en el envase
exterior al lado de la marca en forma de rombo

E. Al menos una de las superficies del envase exterior deber tener una dimensin mnima de 100 mm 100
mm.

F. El bulto completo deber superar con xito el ensayo de cada descrito la Reglamentacin de la Instruccin
de envasado P650 de UN.

G. Para sustancias lquidas:


a. Los recientes primarios debern ser estancos. Para el transporte areo, estos recipientes no podrn
contener ms de un litro
b. Los recipientes secundarios debern ser estancos
c. Si se introducen varios recipientes primarios frgiles en un mismo recipiente secundario, los recipien-
tes primarios irn envueltos individualmente o separados de manera que se evite todo contacto entre
ellos
d. Se colocar material absorbente entre los recipientes primarios y el recipiente secundario. El material
absorbente se pondr en cantidad suficiente para que pueda absorber la totalidad del contenido de los
recipientes primarios a fin de que el derrame de la sustancia lquida no comprometa la integridad del

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material amortiguador o del recipiente exterior.


e. El recipiente primario o el secundario debern resistir sin derrames una presin interna de 95 kPa
(0,95 bar)
f. Para el transporte areo el recipiente exterior no deber contener ms de 4 litros; en este volumen no
se incluye el hielo, hielo seco o nitrgeno lquido cuando se utilizan para mantener fras las muestras

H. Para sustancias slidas:


a. Los recipientes primarios debern ser a prueba de derrames. Para el transporte areo los recipientes
primarios no debern superar el lmite de peso del recipiente externo
b. El embalaje/envase secundario deber ser a prueba de derrames
c. Si se introducen varios recipientes primarios frgiles en un mismo recipiente secundario, los recipien-
tes primarios irn envueltos individualmente o separados de manera que se evite todo contacto entre
ellos
d. Para el transporte areo, si el recipiente primario contiene partes del cuerpo, rganos o cuerpos ente-
ros, el envase exterior no debe contener ms de 4 kg. En esta masa no se incluye el hielo, hielo seco o
nitrgeno lquido cuando se utilizan para mantener fras las muestras
e. Cuando haya dudas sobre la presencia de lquido residual en el recipiente primario durante el trans-
porte, deber utilizarse un envase adaptado para lquidos, que comprenda material absorbente

I. Muestras refrigeradas o congeladas (hielo y hielo seco):


a. Cuando se use hielo o el hielo seco debern colocarse fuera de los envases secundarios, en el envase
exterior o en un sobreenvase. Se colocarn unos calzos interiores para que los envases secundarios se
mantengan en su posicin inicial cuando el hielo se haya fundido o el hielo seco se haya evaporado. Si
se utiliza hielo, el envase exterior o el sobreenvase habr de ser estanco
b. El recipiente primario y el envase secundario mantendrn su integridad a la temperatura del refrige-
rante usado, as como a las temperaturas y presiones que pudieran producirse si fallara la refrigeracin

J. Cuando los bultos se coloquen en un sobreenvase, la marca de los bultos prescrita por la presente instruc-
cin de envasado deber, o bien ser directamente visibles, o bien reproducirse exterior del sobreenvase.

K. Las sustancias infecciosas adscritas al N UN 3373 que se envasen y marquen de conformidad con esta
instruccin no estarn sujetas a ninguna otra prescripcin del presente Reglamento excepto las siguientes
cuando el transporte sea a travs de un medio areo:

a. en cada bulto debern constar el nombre y la direccin del expedidor y del destinatario (consignatario)
b. deber constar en un documento escrito (como un conocimiento de embarque areo) o en el envase
el nombre y nmero de telfono de una persona responsable
c. la clasificacin debe ser conforme con la disposicin 2.6.3.2 de las Instrucciones Tcnicas de la OACI
d. deben observarse los requisitos de notificacin de incidentes de la disposicin 7.4.4 de las Instruccio-
nes Tcnicas de la OACI (stas hacen referencia a los operadores)
e. deben observarse los requisitos de inspeccin de daos o fugas de las disposiciones 7.3.1.3 y 7.3.1.4
de las Instrucciones Tcnicas de la OACI (stas hacen referencia a los operadores)
f. se prohbe el transporte de sustancias infecciosas por los pasajeros y la tripulacin, ya sea en persona,
como equipaje de mano o en el interior del mismo, o en el equipaje facturado.

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L. Los fabricantes de envases y los distribuidores ulteriores debern proporcionar instrucciones claras sobre
su llenado y cierre al expedidor o a la persona que prepara el embalaje/envase (un paciente, por ejemplo) a fin
de que pueda ser adecuadamente dispuesto para el transporte.

M. En el mismo envase de las sustancias infecciosas de la divisin 6.2 no deber haber otras mercancas
peligrosas, a menos que sean necesarias para mantener la viabilidad de las sustancias infecciosas, para es-
tabilizarlas o para impedir su degradacin, o para neutralizar los peligros que presenten. En cada recipiente
primario que contenga sustancias infecciosas podr envasarse una cantidad mxima de 30 ml de mercancas
peligrosas de las clases 3 (lquidos inflamables), 8 (sustancias corrosivas) 9 (sustancias y objetos peligro-
sos varios). Cuando esas pequeas cantidades de mercancas peligrosas se envasen de conformidad con la
presente instruccin de envasado, no se aplicar ninguna otra prescripcin de la presente Reglamentacin.

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la salud pblica

PNT-RTPM-02
Recogida y transporte de muestras para deteccin de
microorganismos con gran relevancia en la
salud pblica

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Nombre / Firma Fecha Nombre / Firma Fecha

EDICIN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

01 Edicin inicial

COPIA REGISTRADA N............................ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologa del Hospital/Centro...........


La informacin en l contenida no podr reproducirse total ni parcialmente sin autorizacin escrita del Re-
sponsable de su elaboracin. Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

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la salud pblica

1. PROPSITO Y ALCANCE

En este procedimiento se describen los pasos a seguir de manera general, en la recogida, procesamiento
(cuando sea posible) y transporte de las muestras que conllevan sospecha de microorganismos con gran in-
ters y repercusin para la salud pblica, ya sea por ser agentes etiolgicos de enfermedades emergentes o
porque podran ser potencialmente usados en ataques bioterroristas.

El alcance incluye a todo el personal de enfermera y/o mdico encargado de la toma de muestras a estos
pacientes, al personal que transporta las muestras en el hospital y fuera de l y a todo el personal sanitario y
no sanitario que trabaja en los servicios de Microbiologa.

2. FUNDAMENTO

Los patgenos englobados en los dos grupos anteriormente referidos no estn presentes con frecuencia en los pro-
cedimientos diagnsticos habituales de los laboratorios de Microbiologa, por lo que los microbilogos no solemos
estar familiarizados con sus caractersticas ni con la recepcin y manipulacin de las muestras biolgicas potencial-
mente infectadas por ellos.

Aunque existen muchos ms microorganismos que forman parte de las enfermedades emergentes y de posibles
agentes de bioterrorismo, en este procedimiento solo se seala el manejo de las muestras de algunos de ellos
con creciente inters en nuestros das, para que su conocimiento ayude a mantenernos en alerta frente a estos
patgenos. El manejo de estas muestras se realizar en funcin del nivel de bioseguridad del laboratorio, siendo la
seguridad en el manejo de las mismas prioritaria y fundamental. La manipulacin de las muestras solamente debe
ser realizada por personal entrenado y cualificado que se debe encargar adems de la custodia y organizacin del
transporte de las mismas.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA

1. Full versin of Biosafety in Microbiology and Biomedical laboratory (BMBL),5th edition. En: www.cdc.gov/
biosafety/publications/bmb15
2. OMS. Enfermedades epidmicas y pandmicas. Disponibles en: http://who.int/csr/disease/es
3. SEIMC Cdigo: GEGMIC 01, 2014. Preguntas frecuentes sobre la actuacin de los laboratorios de Microbio-
loga en relacin con la infeccin por el Virus Ebola.
4. Sentinel level clinical laboratory protocols for suspected biological threat agents and emerging
infectious diseases En: www.asm.org/index.php/guidelines/sentinel-guielines

4. MUESTRAS
De manera general, en la obtencin de muestras para estudios microbiolgicos siempre se deben cumplir las
precauciones estndar que protegen frente a la mayora de los microorganismos, y slo en aquellas en las que
se sospeche un patgeno que necesite un nivel de bioseguridad tipo 3 o 4, la proteccin para el paciente y
para el personal que realiza la toma se convierte en una prioridad. Es en estos casos, cuando la utilizacin de
los equipos de proteccin personal se convierte en una accin de obligado cumplimiento y la recoleccin y el
manejo de las muestras debe ser realizada nicamente por personal entrenado y con conocimientos tcnicos
sobre estos patgenos.

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4.1. OBTENCIN DE LA MUESTRA Y CONSERVACIN

La obtencin de muestras de algunos de estos microorganismos y sus condiciones de conservacin se detallan


a continuacin en las tablas 1 y 2.

Tabla 1. Muestras y conservacin de bacterias con inters en salud pblica


Microorganismo Muestras Transporte Comentarios

Francisella tularensis Aspirado de ndulos TA Contenedor estril y evitar


linfticos, raspados, Biopsia >2h 2-8C la desecacin
de la lesin, Mdula sea Torunda con medio de
Esputo transporte Amies

Sangre TA Frascos hemocultivos


Suero 2-8C 1 ml suero sin
anticoagulante
Bacillus anthracis Vescula o escara TA Aspirar el fluido o utilizar 2
Heces torundas (dacron)
Esputo, Liquido pleural
LCR Frascos hemocultivos
Sangre (aerobios y anaerobios)
Evitar la desecacin
Tejidos
Burklolderia pseudomallei Sangre TA Frascos hemocultivos
Mdula sea Lisis-centrifugacin
Yersinia pestis Esputo TA; >2h 2-8C Contenedor estril, evitar
Sangre TA la desecacin
Aspirado, biopsia o tejido TA; >2h 2-8C

Abreviaturas: TA (temperatura ambiente), LCR (lquido cefalorraqudeo).

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Tabla 2. Muestras y conservacin de virus con inters en la salud pblica


Microorganismo Muestras Transporte Comentarios

Virus Zika Suero 2-8C Otras muestras posibles:


Orina 48h-7das (-20C) plasma, LCR, lquido
(para diagnstico >7 das (-70C) amnitico y sangre
primario)
Virus de la gripe A y B Torunda nasofarngea o 2-8C Torundas de dacron y
Aspirado nasal (MTV) >72h (-70C) varilla de plstico o
Esputo y LBA aluminio. No usar de
Aspirado endotraqueal algodn.
(pacientes intubados)

Suero 2-8C
Coronavirus Muestras del Tracto 2-8C Muestras respiratorias a
(SARS-CoV) respiratorio: >72h (-70C) partir del da 7 de
(MERS-CoV) -inferior (esputo, LBA) comienzo de los sntomas
-superior
(exudado orofaringeo o
nasafaringeo)
2 tomas con 14 das de
Suero 2-8C diferencia

Para realizar el
Orina y heces 2-8C seguimiento viral
Virus Ebola Sangre anticoagulada con TA Otras muestras: orina,
EDTA >24h 2-8C heces, slica, conjuntiva,
semen, secrecin vaginal,
vmitos

Abreviaturas: TA (temperatura ambiente), LCR (lquido cefalorraqudeo), MTV (medio de transporte para virus),
LBA (lavado broncoalveolar), EDTA (cido etilendiaminotetraactico).

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4.2. TRANSPORTE

Las sustancias infecciosas de la categora A y designadas UN 2814 o UN 2900 solamente pueden ser trans-
portadas en embalajes que cumplen las especificaciones correspondientes a la clase 6.2 de Naciones Unidas
y la Instruccin de embalaje/envasado P620, que se reproduce a continuacin. Las diversas disposiciones
mencionadas se exponen en la Reglamentacin Modelo de las Naciones Unidas.

Se autorizan los siguientes envases, siempre que se respeten las disposiciones especiales de envasado que
figuran a continuacin:
Envases que renan los requisitos del captulo 6.3 y hayan sido aprobados en consecuencia, consistentes en:

a) Envases interiores que comprendan:


i) uno o varios recipientes primarios estancos
ii) un recipiente secundario estanco
iii) salvo en el caso de las sustancias infecciosas slidas, un material absorbente colocado entre el reci-
piente o recipientes primarios y el recipiente secundario, en cantidad suficiente para absorber la totalidad
del contenido; si se colocan varios recipientes primarios frgiles en un solo envase secundario, se envol-
vern individualmente o se separarn entre s para impedir todo contacto entre ellos
b) Un envase exterior rgido
Barriles (1A1, 1A2, 1B1, 1B2, 1N1, 1N2, 1H1, 1H2, 1D, 1G)
Cajas (4A, 4B, 4N, 4C1, 4C2, 4D, 4F, 4G, 4H1, 4H2)
Bidones (3A1, 3A2, 3B1, 3B2, 3H1, 3H2)
La dimensin exterior mnima no ser inferior a 100 mm

Requisitos adicionales:

1. Los envases interiores que contengan sustancias infecciosas no se agruparn con envases interiores que
contengan mercancas que no sean afines. Los bultos completos podrn colocarse en un sobreenvase de con-
formidad con lo dispuesto en 1.2.1 y 5.1.2; ese sobreenvase podr contener hielo seco.
2. No tratndose de envos excepcionales, como rganos enteros que requieran un envase especial, las sus-
tancias infecciosas sern envasadas con arreglo a las siguientes disposiciones:
a) Sustancias expedidas a temperatura ambiente o a una temperatura superior: los recipientes primarios
sern de vidrio, de metal o de plstico. Para asegurar la estanqueidad se utilizarn medios eficaces tales
como termosoldaduras, tapones de faldn o cpsulas metlicas engastadas. Si se utilizan tapones ros-
cados, stos se reforzarn con medios eficaces tales como bandas, cinta adhesiva de parafina o cierres
de fijacin fabricados con tal fin
b) Sustancias expedidas refrigeradas o congeladas: se colocar hielo, hielo seco o cualquier otro pro-
ducto refrigerante alrededor del (de los) recipiente(s) secundario(s) o, en el interior de un sobreenvase
que contenga uno o varios bultos completos marcados segn lo prescrito en 6.3.3. Se colocarn unos
calzos interiores para que el (los) embalaje(s) secundario(s) o los bultos se mantengan en su posicin
inicial cuando el hielo se haya fundido o el hielo seco se haya evaporado. Si se utiliza hielo, el envase
exterior o el sobreenvase habrn de ser estancos. Si se utiliza hielo seco, el envase exterior o el sobre-
embalaje/sobreenvase habrn de permitir la salida del gas carbnico. El recipiente primario y el envase
secundario conservarn su integridad a la temperatura del refrigerante utilizado
c) Sustancias expedidas en nitrgeno lquido. Se utilizarn recipientes primarios de plstico capaces de
soportar temperaturas muy bajas. El envase secundario tambin habr de poder soportar temperaturas

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muy bajas y, en la mayora de los casos, tendr que ajustarse sobre el recipiente primario individual
mente. Se aplicarn asimismo las disposiciones relativas al transporte de nitrgeno lquido. El recipiente
primario y el envase secundario conservarn su integridad a la temperatura del nitrgeno lquido
d) Las sustancias liofilizadas tambin podrn transportarse en recipientes primarios que consistan en
ampollas de vidrio termoselladas o viales de vidrio con tapn de caucho y provistos de un precinto me-
tlico

3. Sea cual fuere la temperatura prevista para la sustancia durante el transporte, el recipiente primario o el
envase secundario habrn de poder resistir, sin que se produzcan fugas, una presin interna que produzca
una diferencia de presin de no menos de 95 kPa y temperaturas de entre 40 C y +55 C (-40 F a +130 F).
4. En el mismo envase de las sustancias infecciosas de la divisin 6.2 no deber haber otras mercancas
peligrosas, a menos que sean necesarias para mantener la viabilidad de las sustancias infecciosas, para es-
tabilizarlas o para impedir su degradacin, o para neutralizar los peligros que presenten. En cada recipiente
primario que contenga sustancias infecciosas podr envasarse una cantidad mxima de 30 ml de mercancas
peligrosas de las clases 3 (lquidos inflamables), 8 (sustancias corrosivas) 9 (sustancias y objetos peligrosos
varios, incluidas sustancias peligrosas para el medio ambiente). Cuando esas pequeas cantidades de mer-
cancas peligrosas de las clases 3, 8 9 se envasen de conformidad con la presente instruccin de envasado,
no se aplicar ninguna otra prescripcin de la presente Reglamentacin.
5. Las autoridades competentes podrn autorizar otros embalajes/envases para el transporte de sustancias de
origen animal, de conformidad con las disposiciones de 4.1.3.7.

Disposiciones especiales de embalaje/envasado

1. Los expedidores de sustancias infecciosas se asegurarn de que los bultos estn preparados de manera
que lleguen a su destino en buenas condiciones y no representen un riesgo para las personas o animales
durante el transporte.
2. Una relacin del contenido situada entre el embalaje/envase secundario y el embalaje/envase exterior.
3. Cuando no se conozcan las sustancias infecciosas que van a transportarse, pero se sospeche que cumplen
los criterios para su inclusin en la categora A, la indicacin sustancia infecciosa de la que se sospecha que
pertenece a la categora A, deber figurar en el documento de transporte del interior del envase exterior, entre
parntesis, a continuacin de la designacin oficial de transporte.
4. Antes de devolver al expedidor un embalaje/envase vaco o de enviarlo a otra parte, ser desinfectado o
esterilizado para neutralizar cualquier posible riesgo y se desprender o borrar cualquier etiqueta o marca que
indique que ha contenido una sustancia infecciosa.

Las instrucciones de envasado y condiciones de transporte para las sustancias infecciosas de la categora B
se describen en el protocolo cientfico y tcnico PNT-RTPM-01.

4.3. REGISTRO

Se proceder de la misma manera que lo descrito para las muestras generales que se detalla en el PNT-
RTPM-01, procurando que todo el proceso lo realice una nica persona cumpliendo de forma estricta en todo
momento las normas de bioseguridad en el laboratorio.

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4.4. CRITERIOS DE ACEPTACIN Y RECHAZO

Se proceder de la misma manera que lo descrito para las muestras generales que se detalla en el PNT-
RTPM-01, procurando que todo el proceso lo realice una nica persona cumpliendo de forma estricta en todo
momento las normas de bioseguridad en el laboratorio.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS

Para bacterias cultivables en laboratorios de bioseguridad tipo II/III


Agar sangre, agar chocolate, agar MacConkey
Agar Thayer-Martin y agar BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract)
Caldo Tioglicolato o BHI (Brain Heart Infusion)
Frascos de hemocultivos
Aceite de inmersin
Reactivos para la tincin de Gram

6. APARATOS Y MATERIAL

Equipos de proteccin individual (bata de apertura posterior y capucha, calzas, mascarilla FFP2 o
FFP3, gafas de montura integral o pantalla facial completa, guantes nitrilo largos o doble guante)
Cabina de seguridad biolgica tipo II/III
Asas calibradas desechables
Pipetas Pasteur estriles
Pipetas calibradas
Puntas de pipeta estriles
Placas de Petri estriles
Portaobjetos y cubreobjetos
Hojas de bistur estriles
Guantes
Contenedores de residuos.
Papel parafilm
Jarras de incubacin
Sistemas generadores de atmsfera de CO2
Estufas (de aerobiosis y de CO2)
Neveras y congeladores (almacenaje de placas y reactivos)
Microscopio ptico
Centrfugas (opcional)
Sistemas automticos hemocultivos (opcional)

7. PROCESAMIENTO

Los laboratorios de Microbiologa en nuestro pas tienen un nivel de bioseguridad tipo 2 (excepto el Centro Na-
cional de Microbiologa que tiene un laboratorio de nivel 3) y el procesamiento de la mayora de los patgenos
que se describen en este procedimiento no difiere del que se realiza con las muestras habituales, siempre que
se sea riguroso con el cumplimiento de las medidas de seguridad en el laboratorio. Se recomiendan las cabinas
de clase II cuando se realizan actividades con un alto potencial de producir aerosoles, que hay que evitar en la

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medida de lo posible. Es de destacar que los rotores de las centrfugas deben estar sellados hermticamente
y que slo se abrirn dentro de las cabinas de bioseguridad y que se debe evitar el uso del vrtex para agitar.

Bacterias:
Para Bacillus anthracis, Burkolderia pseudomallei, Yersinia pestis y Francisella tularensis los medios utilizados
son los convencionales: agar sangre (AS), agar chocolate (CH) y agar MacConkey (McK) y caldos de enrique-
cimiento como tioglicolato o BHI. Para Francisella tularensis adems utilizar placas de Thayer Martin o BCYE
que son medios suplementados con cistena, y caldo de tioglicolato, que tiene que ir suplementado con un 1%
de Isovitalex.
La incubacin de las placas de agar sangre y agar chocolate se realizar a 35C-37C en atmsfera de CO2
y en atmsfera de aerobiosis las placas de MacConkey y el caldo de enriquecimiento. Para Yersinia pestis
hay que sembrar por duplicado los medios de cultivo para poder incubarlos adems a 25-28C. El tiempo de
incubacin para Yersinia pestis es de 5-7dias, y en el caso de Francisella tularensis las muestras de tejido se
mantendrn hasta 7 das y los hemocultivos hasta 10 das, realizando un subcultivo ciego al finalizar el periodo
de incubacin. Durante la incubacin todas las placas deben permanecer selladas y se deben examinar diaria-
mente. Tambin puede realizarse el diagnstico mediante tcnicas serolgicas para Yersinia pestis (deteccin
del antgeno f1) y Francisella tularensis.

Virus:
- Virus Zika: el diagnstico de este virus se realiza mediante mtodos serolgicos y moleculares (RT-PCR) sin
embargo, en la mayora de los pacientes no se detecta ARN del virus despus de la primera semana de la
enfermedad. Por este motivo, el virus se detecta en orina al menos 2 semanas despus del comienzo de los
sntomas. La OMS recomienda las estrategias siguientes para el diagnstico:
Anlisis de cidos nucleicos en pacientes cuyos sntomas hayan comenzado hace menos de 7 das.
Serologa y/o anlisis de cidos nucleicos en pacientes cuyos sntomas hayan comenzado hace 7 das o ms.
La serologa es el mtodo preferido en muestras de pacientes cuyos sntomas hayan comenzado hace ms
de 7 das. Si se utilizan anlisis de cidos nucleicos, los resultados negativos deben interpretarse con cautela,
pues no descartan la infeccin, dado que la viremia disminuye rpidamente 7 das despus del inicio de los sn-
tomas y puede no ser detectada por las pruebas en el lmite inferior de la sensibilidad. Para todas las muestras
distintas de suero hay que obtener a la vez muestras de suero para detectar IgM. El estudio en LCR se har
solo si hay complicaciones neurolgicas. Los laboratorios que utilicen pruebas panflavivricas combinadas con
secuenciacin gnica u otros mtodos moleculares convencionales, como las pruebas mltiples de deteccin
de Flavivirus, deben asegurarse de que las secuencias cebadoras internas hayan sido actualizadas para de-
tectar los linajes recientes del Virus Zika.
Dado que se han documentado coinfecciones por el Virus Zika y otros Arbovirus y teniendo en cuenta la cir-
culacin endmica de Flavivirus, los anlisis para el Virus Zika deberan realizarse junto con anlisis para los
Virus del dengue y la fiebre chikungunya, de forma secuencial.
- Virus Ebola: en la actualidad las muestras se centralizan en el laboratorio de referencia nacional (CNM Ins-
tituto Carlos III). El diagnstico molecular se debe realizar en laboratorios con nivel de contencin tipo 3, ya
que, si bien la tcnica en si misma puede llevarse a cabo en reas de nivel de bioseguridad tipo 2 utilizando
muestras inactivadas, la inactivacin se debe realizar en una zona de bioseguridad tipo 3 o utilizando una ca-
bina de bioseguridad tipo III. El cultivo de virus slo puede hacerse nica y exclusivamente en laboratorios de
nivel de seguridad tipo 4.
- Virus Influenza: el diagnstico mediante tcnicas rpidas de deteccin antignica de gripe es una prctica
habitual de todos los laboratorios de Microbiologa, pero la sensibilidad de estas pruebas varia en relacin a lo
subtipos, obtenindose por ejemplo poca sensibilidad para N1H1 y N5H1. Las pruebas rpidas de deteccin
de antgenos y las pruebas moleculares (RT-PCR) se pueden realizar en una cabina de bioseguridad tipo II y
en laboratorios con nivel de bioseguridad tipo 2. El cultivo proporciona el diagnstico ms especfico, pero ste

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slo puede hacerse en laboratorios con nivel de bioseguridad tipo 3.


- Coronavirus (MERS): para el diagnstico de infeccin por este virus se utilizarn las tcnicas moleculares
(RT-PCR) que detectan ARN vrico en muestras clnicas. Para estudios de vigilancia o de investigacin se
utilizarn los mtodos serolgicos. No se precisan medidas habituales de proteccin para el manejo de este
patgeno, siendo suficientes las precauciones estndar utilizadas de forma habitual.

8. RESPONSABILIDADES

Deben estar descritas en el manual general de organizacin del laboratorio de Microbiologa y en las fichas de
descripcin de los puestos de trabajo. El procedimiento deber llevarse a cabo por personal tcnico cualificado
con un entrenamiento especfico. La supervisin de las tcnicas y de los envos a centros de referencia deber
realizarla siempre un especialista en Microbiologa.

9. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

Si inadvertidamente se procesan muestras con sospecha de patgenos altamente peligrosos en un laboratorio


tipo 2, se sellarn las placas y se pasar la muestra preferiblemente a una zona de bioseguridad tipo 3 o al
rea de micobacterias que suele ser la que presenta mayor nivel de proteccin en todos los laboratorios. Si se
ha utilizado algn material o aparataje, se proceder a la descontaminacin de los mismos, as como de las
superficies de trabajo siguiendo las instrucciones del fabricante o utilizando desinfectantes habituales, la OMS
recomienda una dilucin 1:10 de leja comercial.
Todo el personal del laboratorio sin excepcin deber conocer y seguir las normas generales de bioseguridad
del laboratorio.
Todo el personal tiene que estar entrenado en la utilizacin de los equipos de proteccin individual.
Todos estos patgenos estn incluidos en las enfermedades de declaracin obligatorias (EDO) y se debe co-
municar su sospecha y/o deteccin a las autoridades sanitarias competentes.

10. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Las identificaciones errneas ms frecuentes de Francisella tularensis son Haemophilus influenzae y Aggre-
gatibacter spp.
Algunos de los sistemas automatizados no identifican adecuadamente Yersinia pestis, se puede confundir con
Yersinia pseudotuberculosis, Shigella spp., Salmonella spp., Acinetobacter spp. o Pseudomonas spp.
El fracaso en detectar ARN del Virus Zika no excluye la infeccin por este virus.
No se deben procesar muestras que no sean de pacientes con sintomatologa clnica.

11. BIBLIOGRAFA

1. CDC Laboratory testing for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) en www.cdc.gov/
coronavirus/mers/infection-prevention-control.html
2. CDC Guidance for US Laboratories testing for Zika virus infection. En www.aphl.org/programs/pre4pared-
ness/crisis-management/pages/Zika.aspx
3. Jorgensen JH, Pfaller MA, Carroll KC. 2015. Manual of Clinical Microbiology, 11th ed. American Society for
Microbiology. Washington, D.C.
4. Amy L. Leber. 2016. Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol. 1-3, 4th edition. American Society for
Microbiology Washington, D.C.
5. Prez Sanz JL (Coordinador). Alados JC, Gmez E, Leiva J, Prez-Senz JL, Rojo E. Seguridad en el la-
boratorio de Microbiologa Clnica. Procedimientos en Microbiologa Clnica 10a. SEIMC 2014. Disponible en:
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia

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