PROBLEMAS MS FRECUENTES Y POSIBLES SOLUCIONES

NO SE PRODUCE REACCIN O STA DECAE POCO DESPUS DE COMENZAR

Posible causa Posible solucin

No hay ADN o hay menos del necesario Aumentar la cantidad de ADN
No hay cebador o la concentracin es inferior a la Aumentar la concentracin o cantidad de
necesaria. El primer puede estar degradado cebador. Cambiar la alcuota.
El cebador no encuentra el sitio de hibridacin Cambiar el cebador. Asegurarse del diseo
El ADN presenta contaminacin Volver a preparar el ADN
El cebador est mal diseado o la temperatura de Redisear el cebador
melting no es la adecuada
El sitio de unin del cebador en el vector se ha Volver a clonar en el vector
perdido o daado. Durante la clonacin pueden
crearse artefactos con una delecin cerca del sitio de
insercin del ADN a clonar o deleciones que eliminan
la secuencia del primer del vector.
En los productos de PCR puede que los amplificados Cambiar de cebador
no sean el producto de la amplificacin con los dos
cebadores. Si el amplificado se genera a partir de uno
de los dos primers slo se obtendr secuencia con
ste. Este efecto se puede producir cuando se utilizan
para secuenciar los mismos primer que se han
utilizado en la amplificacin del ADN molde y alguno
de ellos no funciona correctamente.

SEAL DE BAJA INTENSIDAD. UNIN DBIL DEL CEBADOR

Posible causa Posible solucin
Mala calidad del ADN Volver a purificar el ADN
ADN presenta estructura secundaria en el sitio de Cambiar de cebador
hibridacin del cebador
La concentracin del ADN inferior a la necesaria Aumentar la concentracin
El cebador utilizado en la secuenciacin no es el Cambiar el cebador
adecuado:
- Estructura secundaria (afecta ms en extremo 3)
- Tm del cebador demasiado baja (muy corto, poco
contenido GC, etc)
EL CROMATOGRAMA ES CORRECTO PERO PRESENTA MUCHO RUIDO DE FONDO
Posible causa
Existe un sitio secundario de unin del cebador que
da lugar a picos extra
La cantidad de ADN es insuficiente y la seal es
demasiado baja
El ADN presenta contaminacin
La PCR no fue especifica y existen amplicones
contaminantes en la muestra
Cebador mal purificado o degradado
Fragmento de PCR mal purificado
Posible solucin
Intentar eliminar aadiendo DMSO en la
secuenciacin o cambiar de cebador
Aumentar la cantidad de ADN
Purificar el ADN
Cambiar de cebador
Cambiar de cebador o purificar
Eliminar los cebadores de la amplificacin
EL CROMATOGRAMA PRESENTA DOS SECUENCIAS SUPERPUESTAS

Posible causa Posible solucin

El cebador tiene varias dianas Cambiar de cebador
Primer drimer: Esto puede ocurrir cuando los primers Volver a purificar el producto de PCR
empleados en la amplificacin forman dmeros y
estn presentes en la reaccin de secuenciacin
debido a una mala purificacin del producto. Cuando
termina la secuencia de los dmeros la lectura es
correcta.
Cebador degenerado Cambiar de cebador
ADN subclonado existiendo dos sitios diana para el Secuenciar con otro cebador
cebador universal utilizado.
Posible causa Posible solucin
PCR inespecfica: diana del cebador en ambos Cambiar de cebador
extremos, es decir, amplicn inespecfico generado
por un solo cebador
Hay ms de un ADN molde en la muestra Repreparar el ADN

Comprobar, si se ha arrastrado polinker durante la subclonacin porque esto implicara que el/los
cebadores universales tienen sitio de hibridacin duplicado y no se pueden utilizar en la secuenciacin de
esa muestra. Asegurarse de que se parte de una nica colonia o que no es PCR mltiple con
amplificaciones secundarias inespecficas.
- Primer Drimer

Si el producto de PCR no est purificado o en la purificacin no se ha eliminado totalmente los restos de

primer que no se utilizaron en la amplificacin, se pueden formar dmeros de primer que actan como
molde en la reaccin de secuenciacin. Esto genera lecturas superpuestas. El rango o longitud de la
superposicin depender del tamao del molde contaminante.
 - En el caso de productos de PCR: la mezcla de lecturas comienza desde el principio. Si a partir de
las 20-60 pb la mezcla desaparece es indicativo de primer drimer.
- En el caso de un clon mltiple: la mezcla de lecturas comienza a partir de las 30-90 pb, es decir,
la lectura de ambas colonias coincide solo en el vector. Una vez comienza el inserto, si son
distintos, se mezclan las lecturas.
Ejemplo: la reaccin comienza de forma normal pero existe doble lectura a partir de un determinado
punto (30-90 pb aprox.)
- Insercin/Delecin

La reaccin comienza de forma normal pero existe doble lectura a partir de un determinado punto (ms
de 150 pb aprox.).
Posible causa Posible solucin
Regin heterocigtica para ese fragmento Digestin para eliminarlo
Mutaciones frame shift

EL CROMATOGRAMA PRESENTA DOS SECUENCIAS SUPERPUESTAS A LOS POCOS

NUCLEOTIDOS DE COMIENZO DE LECTURA

Posible causa Posible solucin

Mezcla de insertos en el mismo vector Reanalizar el plsmido
Mezcla de DNAs moldes Purificacin de DNA o producto de PCR

El cebador es correcto y la reaccin de secuenciacin es idnea. Analizar a partir de cuando se produce

la superposicin de secuencias y diagnosticar el posible problema.
LA SECUENCIA PIERDE BRUSCAMENTE LA SEAL Y CAE

Posible causa Posible solucin

Efecto de una estructura secundaria (presencia de Aadir DMSO, secuenciar la cadena
secuencias repetidas, palindrmicas, etc) complementaria, digerir el molde, subclonarlo
y secuenciar los subclones o utilizar un kit
alternativo para las reacciones de
secuenciacin cmo el kit dGTP Big Dye de
ABI.
La cantidad entre el ADN y el cebador no es la Respetar las concentraciones y cantidades
equilibrada indicadas en las tablas de entrega de muestras
Formacin de estructuras en la clonacin que Realizar PCR sobre el clon (cebadores
impiden una correcta secuenciacin universales o propios) y mandar a secuenciar el
amplicn resultante y no el clon
Presencia de compuestos contaminantes en la No resuspender nunca el ADN en solucin
muestra (EDTA, sales, etanol, fenol, etc.) que contenga EDTA
ADN cortado, digerido a ese nivel o finalizacin
de producto de PCR
PRESENCIA DE PICOS SATURADOS Y FUERA DE ESCALA EN EL CROMATOGRAMA

Posible causa Posible solucin

Demasiada cantidad de ADN Reducir la cantidad de ADN
LA SECUENCIA ES NORMAL PERO APARECE UN PICO DE FORMA REPENTINA

Posible causa Posible solucin

Terminadores no incorporados (entre 0-180 pb) Repetir la reaccin de secuenciacin
APARICIN DE UN PICO ANMALO CON LOS COLORES CORRESPONDIENTES A
TODAS LAS BASES

Posible causa Posible solucin

Burbuja producida por el capilar Volver a analizar la muestra o repetir la reaccin
de secuenciacin
APARICIN DE PICOS MUY ABIERTOS CON LA CONSECUENTE PRDIDA DE
RESOLUCIN

Posible causa Posible solucin

Exceso de ADN (capilar) Respetar la cantidad y concentracin de ADN
Presencia de sales o contaminantes en la Volver a purificar la muestra
muestra
Problema del capilar Repetir la secuencia
SECUENCIACIN DE REGIONES RICAS EN GCs, GAs

Posible causa Posible solucin

Formacin de dplex que alteran estabilidad del Usar temperaturas de secuenciacin ms bajas que
cebador la estndar
Composicin nucleotdica (Repeticiones Secuenciar cadena complementaria
dinucletidos GT, GC, GA.) Repetir la secuenciacin con un kit alternativo
Estructura secundaria, efecto de la alta Tm del (dGTP Big Dyes).
tratamiento del ADN Aadir DMSO en la secuenciacin
Cambiar condiciones de PCR: aumentar la t de
desnaturalizacin a 98, el n de ciclos de PCR o la
cantidad de Taq; incluir un paso de pre-
desnaturalizacin de 5 min
Linearizar el vector y secuenciar productos tras
subclonarlos

Cuando se secuencien organismos con un alto contenido GC indicarlo en las tablas que se adjuntan con
la muestras a secuenciar.
Las repeticiones de AG pueden ser problemticas pues la Taq produce una seal dbil de G despus de
A cuando se utilizan terminadores marcados. En este caso conviene secuenciar la cadena complementaria.
PRESENCIA DE MICROSATLITES

Posible causa Posible solucin

Presencia Microsatlites: SSRs, VNTRs, en el caso
de productos de PCR son ms problemticos que
en productos clonados, sobre todo si son de
elevada longitud. Se puede producir el
deslizamiento de la polimerasa y no se puede
obtener secuencia de esa regin.
Secuenciar a partir del plsmido no del producto
de PCR y aadir DMSO en la reaccin de
secuenciacin
Crear delecciones seriadas en esas zonas y
secuenciar

Repeticiones dinucletidos GC Cambios ya recomendados

PRESENCIA DE LARGOS HOMOPOLMEROS

Posible causa Posible solucin

Presencia de poliA/poliT Secuenciar cadena complementaria
Empleando cebador degenerado del tipo T25(A,
G C) si no se conoce la base siguiente a la
regin poliA/poliT o los cebadores individuales
especficos T25A, T25G T25C. La base 3 del
cebador permite anclar este a la secuencia al final
del homopolmero, mejorando los resultados
obtenidos

La polimersa patina dando lugar a una lectura ilegible despus de la regin homopolimrica, aunque
los datos de antes de esa regin sean de buena calidad. Este problema se puede producir en la reaccin
de secuenciacin o en la de amplificacin, aunque en este ltimo caso no son aparentes cuando el
fragmento se visualiza en un gel de agarosa.
Se denominan primer anclado: Son primers que se unen al homopolmero, tipo T25-(N) y que terminan
en una base degenerada para obligar al oligo a pegarse en la posicin 3.

Posible causa Posible solucin

Homopolmero de Gs o Cs (causa
deslizamiento de la polimerasa generndose
una secuencia ilegible)
En los productos de PCRs pueden existir
saltos, problemas que no existen en el material
clonado
Secuenciar cadena complementaria
Usar un cebador ms interno que hibride 20-30
bases antes del homopolmero para forzar a la
polimerasa a pasar sobre l
Realizar deleciones seriadas y secuenciarlas
Secuenciar el material clonado, adems del
amplificado. Si es posible, es mejor verificar la
especificidad de la secuencia a partir de otros
clones
PRIMER N-1

Posible causa Posible solucin

El cebador est compuesto por cadenas Prepara una nueva alcuota del primer
completas (N), pero una proporcin de ellas
contiene una base menos (N-1), esto da lugar a un
cromatograma ilegible, en algunos casos, al tener
picos superpuestos y desfasados. Puede verse una
secuencia sombra (N-1) de menor altura, donde
cada pico sombra es igual que el pico siguiente de
mas altura y/o intensidad de fluorescencia
SOLO TERMINADORES

Posible causa Posible solucin

Aparecen solo los terminadores debido a que la Poner mas cantidad de ADN o de mejor calidad
cantidad de ADN es insuficiente
NO INSERTO

Posible causa Posible solucin

Inserto no clonado correctamente Clonar de nuevo
Falso positivo Seleccionar otra colonia
HETEROCIGOSIS (NO FALLO)