AVALIAO DA EXATIDO E DA PRECISO DE MTODOS DE

ANLISE DE RESDUOS DE PESTICIDAS MEDIANTE ENSAIOS DE

RECUPERAO

NATILENE MESQUITA BRITO *

OZELITO POSSIDNIO DE AMARANTE JUNIOR **
LUCIANA POLESE ***
TERESA CRISTINA RODRIGUES DOS SANTOS ****
MARIA LCIA RIBEIRO *****

Discute-se a importncia da exatido e da preciso na

validao de mtodos de anlise de resduos de pesticidas.
So apresentados, mediante dois estudos de casos, os
principais processos para a avaliao da exatido. Nos casos
relatados foram obtidas recuperaes entre 80 e 104% e
coeficiente de variao entre 2,81 e 12,74%, ambos
enquadrados na faixa recomendada pela Association of
Official Analytical Chemists (AOAC) para os nveis de
concentrao investigados. Os estudos evidenciaram que,
os ensaios de recuperao so adequados para a avaliao
dos critrios de exatido e preciso para as mesmas
matrizes.

PALAVRAS-CHAVE: MTODOS DE ANLISE-VALIDAO; PESTICIDAS-ANLISE.

1 INTRODUO

O desenvolvimento de mtodos constitui etapa extremamente

relevante na rea de anlise de resduos de pesticidas. A investigao
deve sempre incluir a validao do mtodo desenvolvido e no apenas
sua otimizao, principalmente quando envolve sua aplicao em
determinado tipo de matriz e no apenas estudos com solues padro
(1). A validao de mtodos analticos tem sido discutida em diversos

* Mestrando em Qumica, Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho

(UNESP), Araraquara SP. (e-mail: natibrit@posgrad.iq.unesp.br).
** Mestrando em Qumica Analtica, Universidade Federal do Maranho (UFMA), So
Lus, MA.
*** Doutora em Qumica, Instituto de Qumica, UNESP, Araraquara SP.
**** Professora, Doutora em Qumica Analtica, Departamento de Tecnologia Qumica,
CCET, UFMA, So Lus - MA.
***** Professora, Doutora, Instituto de Qumica, UNESP, Araraquara SP.

Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, p. 155-168, jan./dez. 2002

trabalhos na literatura (2-11). O enfoque dado na avaliao de mtodos
analticos varia em funo da rea de aplicao, da concentrao do
analito, do objetivo do estudo e da natureza do mtodo (12-17).
O processo de validao consiste na avaliao de diversos
critrios, ou seja, seletividade, linearidade, grfico analtico, sensibilidade,
limites de deteco e quantificao, exatido, preciso e consistncia
dos dados gerados (18). Dentre os critrios citados, a exatido e a preciso
so considerados os mais relevantes porque permitem estimar os erros e
variaes embutidos nos resultados analticos. A exatido pode ser
estimada pelo clculo do erro absoluto e relativo e a preciso pelas medidas
de disperso, como desvio-padro, varincia e coeficiente de variao,
entre outras (3). A preciso costuma ser expressa como repetitividade,
preciso intermediria ou reprodutividade (1). A repetitividade constitui a
preciso estudada no mesmo laboratrio, em pequeno intervalo de tempo
(mesmo dia, analista e equipamento). A preciso intermediria expressa
pela variao entre resultados obtidos em dias diferentes pelo mesmo
laboratrio. A reprodutividade estudada entre diferentes laboratrios,
em diversas localidades do mundo (18), utilizando o mesmo conjunto de
amostras.
Em anlise de resduos de pesticidas a validao do mtodo
ocorre, usualmente, por meio de ensaios de recuperao (19), uma vez
que esse processo gera todas as informaes necessrias para a avaliao
do procedimento analtico (18). Alm disto, so realizados no prprio
laboratrio, sem necessidade de obteno de materiais de referncia
certificados (MRC), adeso de outros laboratrios ou existncia prvia de
mtodos validados para o analito e a matriz em estudo (18).
Para determinar os parmetros indispensveis validao so
necessrias amostras contendo o analito de interesse em concentraes
conhecidas. Essas amostras, no estudo de resduos de pesticidas, so
obtidas adicionando-se os compostos a serem analisados na amostra
controle, tambm chamada amostra testemunha.
Denomina-se nvel de fortificao a concentrao em que o analito
adicionado na amostra controle. A escolha do nvel de fortificao depende
do propsito do estudo a ser realizado. Em anlise de resduos de
pesticidas em alimentos toma-se como base os Limites Mximos de
Resduos (LMR), estabelecidos pela legislao nacional e internacional
para cada analito e matriz. O procedimento de fortificao realizado in
vitro pode no reproduzir a amostra em que o analito est quimicamente
ligado aos constituintes da matriz. Assim sendo, na adio do analito
amostra deve-se considerar alguns fatores, tais como: tipo de matriz,
tempo de fortificao e volume de soluo padro do pesticida.
A recuperao consiste na relao percentual entre a
concentrao determinada mediante aplicao do procedimento analtico

156 Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, jan./dez. 2002

e o nvel de fortificao. Os valores de recuperao considerados
adequados so estabelecidos em funo da concentrao do analito (20),
conforme mostra a Tabela 1. Entretanto, de acordo com a rea de pesquisa
os valores aceitos podem variar. Essas diferenas podem ser observadas,
at na mesma rea, como no caso da anlise de resduos de pesticidas
em que diferentes fontes estabelecem intervalo de aceitao de 70 a
120% (19), 80 a 110% (20) e 70 a 130% (21).

TABELA 1 - RECUPERAO DO ANALITO EM FUNO DA

CONCENTRAO (35)

Concentra o do analito (%) Intervalo de Recupera o Aceito (%)

> 10 98-102
>1 97-103
> 0,1 95-105
> 0,01 90-107
> 0,001 - > 0,00001 80-110
> 0,000001 60-115
> 0,0000001 40-120

A preciso costuma ser estimada em estudos intra-laboratoriais

(repetitividade e preciso intermediria), usando-se os ensaios de
recuperao, mediante clculo dos coeficientes de variao (CV) (22).
Em anlise de resduos de pesticidas considera-se que o mtodo preciso
quando os coeficientes de variao apresentam-se menores que 20%
(18). Isto deve-se, tambm, aos baixos nveis de concentrao
determinados.
O objetivo deste trabalho foi apresentar e discutir dois modos
diferentes de avaliar os ensaios de recuperao em anlise de resduos
de pesticidas, mediante estudo de casos. No primeiro, foram utilizados
dados descritos na literatura para a anlise de pesticidas organoclorados
(OC) e organofosforados (OF) em amostras de gua de coco por
cromatografia a gs (CG) (23). No segundo caso foram estudados
resultados de anlise por cromatografia a lquido de alta eficincia (CLAE)
do herbicida cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) e seu produto de
degradao, o 2,4-diclorofenol (2,4-DCF), em amostras de solo (24). As
estruturas qumicas dos compostos estudados so apresentadas na
Figura 1.

Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, jan./dez. 2002 157

FIGURA 1 FRMULA ESTRUTURAL DOS COMPOSTOS ESTUDADOS

Cl Cl Cl
Cl Cl Cl
Cl O Cl O Cl O
Cl SO Cl S O Cl SO 2
O O O
Cl Cl Cl
Cl Cl Cl

-Endosulfan -Endosulfan Sulfato de Endosulfan

O O
O Cl
Cl
O P N SCCl 3 Cl SO 2 Cl

O Cl O Cl
Cl

Triclorfon Captan Tetradifon

S O
O
O S
(CH 3O) 2P O H O P S
C C OP (OCH 2CH 3)2
O O2N
CH 3 CONHCH 3
O
O
(E)

Monocrotof s Malation Paration-metil

2,4-D 2,4-DCF

2 ESTUDOS DE CASO: ENSAIO DE RECUPERAO DE PESTICIDAS

O clculo da recuperao para amostras fortificadas pode ser

realizado computando-se as recuperaes individuais para cada nvel de
fortificao do analito (i), avaliando-se a recuperao por meio de sua
mdia (ii), ou analisando-se em 5 nveis a regresso linear da concentrao
obtida e a concentrao de fortificao (iii) (22). Para ilustrar os itens i e
iii foram usados dados da literatura para o clculo das recuperaes
individuais de cada nvel para organoclorados (OC) e organofosforados
(OF), analisados por CG e de 2,4-D e 2,4-DCF analisados por CLAE.

2.1 CASO 1: RESULTADOS OBTIDOS NA ANLISE DE OC E OF EM

GUA DE COCO POR CG

Para avaliar a abrangncia da exatido foram estudados trs nveis

158 Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, jan./dez. 2002

 de fortificao e, para cada nvel, efetuadas no mnimo cinco determinaes
(23). Os valores de recuperao obtidos para os pesticidas em estudo
so apresentados na Tabela 2 e esto enquadrados nos limites (entre 70
e 120%) descritos na literatura para resduos de pesticidas.

TABELA 2 - RECUPERAES PERCENTUAIS E COEFICIENTES DE

VARIAO DOS COMPOSTOS ORGANOCLORADOS (OC)
E ORGANOFOSFORADOS (OF) ANALISADOS POR CG

P e s ticid a s C la s s e n N ve l R e c u p e ra o t cal S CV %
m g /K g M d ia (% )
-E n d o su lfa n OC 6 0 ,0 1 95 -2 ,4 5 4 ,6 4 ,8
6 0 ,0 5 81 -3 ,5 8 1 1 ,9 1 4 ,6
8 0 ,1 91 -3 ,5 5 6 ,7 7 ,4
-E n d o su lfa n OC 6 0 ,0 1 99 -0 ,5 5 4 ,0 4 ,1
8 0 ,0 5 85 -3 ,5 8 8 ,0 1 0 ,1
8 0 ,1 94 -2 ,7 0 5 ,9 6 ,2
C a p ta n OC 6 0 ,1 91 -2 ,5 4 7 ,9 8 ,7
6 0 ,5 99 -0 ,5 0 4 ,4 4 ,4
6 1 104 3 ,0 5 2 ,9 2 ,8
M a la tio n OF 5 0 ,5 93 -1 ,5 6 8 ,9 9 ,6
5 1 ,0 104 4 ,1 4 1 ,9 1 ,8
6 2 ,0 99 -0 ,9 5 2 ,4 2 ,4
M o n o cro to f s OF 5 0 ,5 90 -2 ,4 6 8 ,1 9 ,0
5 1 ,0 95 -0 ,9 2 1 0 ,9 1 1 ,5
6 2 ,0 95 -1 ,8 7 6 ,0 6 ,3
P a ra tio n -m e til OF 5 0 ,5 97 -0 ,7 3 8 ,2 8 ,5
5 1 ,0 103 1 ,0 2 5 ,9 5 ,7
6 2 ,0 99 -1 ,5 5 1 ,4 1 ,4
S u lfa to d e OC 6 0 ,0 1 95 -1 ,4 2 7 ,9 8 ,3
E n d o su lfa n 6 0 ,0 5 83 -4 ,5 0 1 0 ,0 1 2 ,0
8 0 ,1 94 -2 ,8 2 5 ,6 6 ,0
T e tra d ifo n OC 5 0 ,5 80 -3 ,9 2 1 0 ,1 9 1 2 ,7 4
5 1 ,0 84 -3 ,8 1 8 ,3 8 9 ,9 7
6 2 ,0 97 -2 ,0 8 3 ,2 2 3 ,3 2
T riclo rfo n OF 5 0 ,5 80 -4 ,5 7 8 ,7 5 1 0 ,6 3
5 1 ,0 85 -3 ,4 6 8 ,5 9 1 0 ,1 0
6 2 ,0 98 -1 ,5 9 2 ,8 1 2 ,8 7

n = nmero de anlises; S = Varincia; CV = Coeficiente de Variao; t4,99% = 4,6041,

t5,99% = 4,0321, t7,99% = 3,4995.
Fonte: BRITO et al., 2002 (23).

Para confirmar a exatido do mtodo, os resultados foram

submetidos ao teste de hiptese, sendo estabelecida como hiptese nula
(H0): Rec. = 100% e como hiptese alternativa (H1): Rec. 100%. O teste
t aplicado, com 99% de confiana e n-1 graus de liberdade, apresentou
valores calculados entre os intervalos estabelecidos pelo valor tabelado.

Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, jan./dez. 2002 159

Deste modo, no se poderia afirmar a existncia de diferenas significativas
entre as recuperaes obtidas e o valor esperado (100%), considerando
-se que o mtodo proposto fosse suficientemente exato. Utilizou-se, assim,
a equao:

t calculado =
(Re c 100 ) Eq. 1
s
n

na qual:

Re c a recuperao mdia;
100 a recuperao desejada;
s o desvio-padro das recuperaes;
n o nmero de replicatas (grau de liberdade igual a n para este estudo).

Aceita-se a hiptese nula quando o valor absoluto de tcalculado for

menor que o valor tabelado de t (18). A utilizao de intervalo de confiana
amplo (99% de confiana) mostrou-se indicada, uma vez que o estudo foi
realizado em nveis de concentrao na ordem de g/L. O uso de intervalo
mais restrito (90 ou 95%) aumentaria a probabilidade de ocorrer erro tipo
falso negativo, isto , poder-se-ia rejeitar resultado que na realidade
verdadeiro (18).
Para o estudo de preciso, os coeficientes de variao (obtidos a
partir dos valores referentes ao ensaio de recuperao) so considerados
adequados quando iguais ou inferiores a 20%, conforme recomendado
por THIER e ZEUMER (19). Como todos os valores de CV mostraram-se
inferiores ao estabelecido, o mtodo proposto foi considerado preciso.

2.2 CASO 2: RESULTADOS OBTIDOS NA ANLISE DE 2,4-D E 2,4-

DCF EM SOLOS POR CLAE

Os resultados de recuperao e os respectivos CV obtidos na

anlise de 2,4-D e 2,4-DCF em solos so apresentados na Tabela 3.
Observou-se que os valores obtidos para todos os nveis de fortificao
enquadraram-se na faixa estabelecida para a anlise de resduos de
pesticidas (18). Adicionalmente, aplicou-se o teste de hipteses com a
finalidade de demonstrar a inexistncia de diferena significativa entre os
valores obtidos e o esperado (100%). Para este estudo foram estabelecidas
as hipteses nula e alternativa como no caso anterior.

160 Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, jan./dez. 2002

 Com 99% de confiana e 4 graus de liberdade a hiptese nula
aceita e no se pode afirmar se h diferena significativa entre os valores
obtidos e o esperado. Utilizando intervalo de probabilidade mais restrito
(95% de confiana) quatro dos nveis para 2,4-D e dois para 2,4-DCF
apresentaram valores absolutos de t superiores ao valor tabelado,
rejeitando-se nesse nvel de confiana a hiptese nula. Esses resultados
confirmam o que foi citado anteriormente com relao ao intervalo de
confiana em funo do nvel de concentrao. Assim, os valores
encontrados no podem ser considerados significativamente diferentes
do valor desejado.

TABELA 3 - RECUPERAES PERCENTUAIS E COEFICIENTES DE

VARIAO OBTIDOS NA ANLISE DE 2,4-D E 2,4-DCF
POR CLAE

Composto N vel de Recupera o Desvio-padr o n CV t calculado*

fortifica o (%) (%)
(mg/Kg)

4,0 89 6,2 5 7,0 -3,97

3,0 95 4,3 5 4,5 -2,60
2,4-D 2,0 98 2,6 5 2,6 -1,72
1,0 104 3,1 5 3,0 2,88
0,1 111 5,6 5 5,0 4,39

4,0 101 3,5 5 3,4 0,64

3,0 99 4,1 5 4,1 -0,54
2,4-DCF 2,0 98 2,9 5 3,0 -1,54
1,0 96 2,9 5 3,0 -3,08
0,1 95 3,8 5 4,0 -2,94

* Para n = 5, t95% = 2,78 e t99% = 4,60 (11); CV = Coeficiente de Variao.

Fonte: AMARANTE Jr. et al. , 2002 (24).

Os desvios-padro relacionados a cada nvel de fortificao so

apresentados na Figura 2. Observou-se para o 2,4-D tendncia do desvio-
padro em diminuir no centro do intervalo de trabalho, sugerindo que as
concentraes extremas aproximaram-se do limite de linearidade do
mtodo. Para o 2,4-DCF os desvios-padro de todos os nveis
apresentaram-se similares, com exceo do nvel de fortificao de
3,0 mg/kg. Tal efeito pode sugerir erros analticos.

Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, jan./dez. 2002 161

FIGURA 2 - RESULTADOS DE RECUPERAO EM FUNO DO NVEL
DE FORTIFICAO E SEUS RESPECTIVOS DESVIOS-
PADRO

Outro parmetro de validao pode ser analisado pelos dados de

recuperao, ou seja, a seletividade do mtodo. Nesse caso, avalia-se a
correlao entre a concentrao obtida e a concentrao de fortificao
(12). Pode-se realizar teste de hiptese, comparando os valores do
coeficiente linear (c0) e coeficiente angular (c1) com os valores esperados
(zero e um, respectivamente). Neste estudo, considerou-se n 2 graus
de liberdade, usando-se as equaes:

162 Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, jan./dez. 2002

 c0 0 c1 1
Eq. 2 t= Eq. 3 t =
sc0 s c1
n2 n2

Nas quais:

t o t calculado;
c0 o coeficiente linear;
c1 o coeficiente angular;
sc1 o desvio-padro do coeficiente angular;
sc0 o desvio-padro do coeficiente linear (18).

Os resultados referentes a este estudo so apresentados na Figura

3 e Tabela 4.

FIGURA 3 - LINEARIDADE DA RELAO ENTRE A CONCENTRAO

RECUPERADA E A CONCENTRAO DE FORTIFICAO

2 ,4 -D C F y = 1 ,0 1 0 5 x - 0 ,0 3 6 2
2
L in e a r id a d e R = 0 ,9 9 9 6
2 ,4 -D y = 0 ,8 8 7 7 x + 0 ,1 1 1 1
2
R = 0 ,9 9 5 9
5

4
re cu p e rad a
C o n ce n tra

( m g /L )

0
0 1 2 3 4 5
C o n c e n t r a o d e f o r t if ic a o ( m g /L )

Observou-se, pelos coeficientes de correlao, que a relao entre

as concentraes de fortificao e os valores recuperados

Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, jan./dez. 2002 163

suficientemente linear, para assegurar o intervalo de trabalho escolhido.
Entretanto, para averiguar o efeito dos compostos presentes na matriz
necessrio observar os valores dos coeficientes linear e angular. A hiptese
nula foi aceita (Tabela 4) para ambos os coeficientes, com 99% de confiana
e 3 graus de liberdade (tanto para 2,4-D e 2,4-DCF). Desta forma, no se
pode dizer que existam diferenas significativas entre os coeficientes e
os valores esperados, indicando que os componentes da amostra no
interferiram na determinao dos compostos de interesse.

TABELA 4 - RESULTADOS REFERENTES AO ESTUDO DA

LINEARIDADE ENTRE A CONCENTRAO RECUPERADA
E A CONCENTRAO DE FORTIFICAO

c0 c1 t calculado
0 ,00 9 4 0 ,97 3 5 c 0 : 3,0 5
0 ,13 1 1 0 ,86 2 9
2 ,4 -D 0 ,11 9 4 0 ,86 6 3 c 1 : -3 ,71
0 ,12 0 2 0 ,88 1 4
0 ,18 7 1 0 ,82 5 7
M d ia 0 ,11 3 44 0 ,88 1 96
D e s vio 0 ,06 4 50 4 0 ,05 5 12 2
-0 ,02 3 7 1 ,01 3 6 c 0 : -2 ,07
-0 ,07 0 1 1 ,04 9 6
2 ,4 -D C F 0 ,00 8 5 0 ,96 5 5 c 1 : 0,5 6
-0 ,04 0 6 1 ,00 8 8
-0 ,05 6 3 1 ,01 1 2
M d ia -0 ,03 6 44 1 ,00 9 74
D e s vio 0 ,03 0 52 3 0 ,02 9 84 9

(99%) = 5,8409; t (95%) = 3,1825.

3 CONCLUSO

A validao de mtodos analticos necessria para o

reconhecimento das limitaes e confiabilidade dos resultados obtidos.

164 Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, jan./dez. 2002

O uso de mtodos validados essencial para obteno de resultados
confiveis que possam ser satisfatoriamente interpretados. A exatido e
a preciso so as chaves do processo de validao de mtodos analticos.
Diferentes procedimentos podem ser adotados para a avaliao da
exatido, sendo os ensaios de recuperao os mais empregados por no
dependerem de fatores externos para serem realizados.
Nos casos relatados foram obtidas recuperao entre 80 e 104%
e Coeficientes de Variao entre 2,81 e 12,74%, ambos enquadrados na
faixa recomendada pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC)
para os nveis de concentrao investigados. Os estudos evidenciaram
que os ensaios de recuperao so adequados para a avaliao dos
critrios de exatido e preciso, para as mesmas matrizes.

Abstract

EVALUATION OF METHODS ACCURACY AND PRECISION FOR ANALYSIS OF

PESTICIDES RESIDUES THROUGH RECUPERATION ASSAYS
The importance of accuracy and precision in the methods validation of pesticides residues
analysis is discussed. The main processes for accuracy evaluation are presented
through two case studies. In the cited cases, recoveries were obtained between 80 and
104% and variation coefficient between 2,81 and 12,74% both in the range recommended
by AOAC for the concentration levels investigated. The studies evidenced that the
recovery assays were adequate for the evaluation of the accuracy and precision
criteria for the same matrix.
KEY-WORDS:METHODS OF ANALYSIS-VALIDATION, ANALYSIS, PESTICIDES.

REFERNCIAS

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