FACULDADE DE ARTES, CINCIAS, LETRAS EEDUCA-

O DE PRESIDENTE PRUDENTE FACLEPP

CURSO DE CINCIAS BIOLGICAS - BACHARELADO

TCNICAS LABORATORIAIS DE PCR E ELETROFORESE

NATHLIA CAETANO TAGLIATI

Presidente Prudente SP
2017
 SUMRIO

PCR

NATHLIA CAETANO TAGLIATI........................................................................................... 1

1.1 HISTRIA E EVOLUO DA TCNICA ........................................................................... 13

1.2 PRINCPIO CIENTFICO ................................................................................................ 14

1.3 CARACTERSTICAS ...................................................................................................... 15

1.4 APLICAO ................................................................................................................ 18

1.5 VARIAES DA TCNICA ............................................................................................ 19

1.5.1 RT-PCR ..................................................................................................................................................... 19
1.5.2 Nested-PCR .............................................................................................................................................. 19
1.5.3 PCR multiplex ........................................................................................................................................... 19
1.5.4 PCR a partir de primers randmicos ........................................................................................................ 20
1.5.5 PCR em Tempo Real ................................................................................................................................. 20

ELETROFORESE

2.1 HISTRIA E EVOLUO DA TCNICA ........................................................................... 21

2.2 PRINCPIO CIENTFICO ................................................................................................ 24

2.3 CARACTERSTICAS ...................................................................................................... 26

2.4 APLICAO ................................................................................................................ 28

2.5 VARIAES DA TCNICA ............................................................................................ 29

2.5.1 Eletroforese de zona ................................................................................................................................ 29
2.5.2 Eletroforese capilar .................................................................................................................................. 29
2.5.3 Acetato de Celulose ................................................................................................................................. 30
2.5.4 Gel de gar .............................................................................................................................................. 31
2.5.5 Gel de Poliacrilamida ............................................................................................................................... 31
2.5.6 Focalizao Isoeltrica ............................................................................................................................. 32
2.5.7 Eletroforese na veterinria ...................................................................................................................... 33

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................................ 34

1.1 HISTRIA E EVOLUO DA TCNICA

A gentica molecular evoluiu por meio da PCR, a qual permite a rpida

clonagem e a anlise do DNA (KOCH & MICHELSEN DE ANDRADE, 2008). Trata-se
de uma tcnica bastante flexvel, a qual permite uma srie de modificaes que pos-
sibilitam o seu emprego na anlise de uma grande variedade de amostras (CASTE-
LANI & DUARTE, 2011). O surgimento da PCR (Reao em Cadeia da Polimerase),
nos meados dos anos 80, revolucionou completamente o diagnstico laboratorial, tor-
nando-o mais gil, sensvel e especfico (ROCHA, 2008).
Nos experimentos iniciais de PCR, utilizou-se a enzima de DNA polime-
rase de E. Coli, cuja temperatura de polimerizao de 37C. Ela era adicionada ma-
nualmente a cada ciclo de amplificao, mas era destruda toda vez que a temperatura
era elevada para 95C para promover a desnaturao do DNA molde.
O passo decisivo para a expanso da PCR se deu pelo desenvolvimento
da tcnica em 1985, por Saiki et al. Logo aps, Mullis et al. (1987) aperfeioaram-na
introduzindo o conceito de primer ou iniciador e o uso de uma enzima termoestvel
(taq DNA Polimerase), a qual isolada de uma bactria que vive em fontes termais,
conhecida como Thermus aquaticus. Esta enzima possui a propriedade de se manter
estvel em temperaturas altas facilitando a realizao da tcnica.
O impacto deste mtodo foi enorme, pois possibilitou facilidade, rapidez,
versatilidade na manipulao de cidos nuclicos, o que tornou a tcnica poderosa e
imprescindvel em grande parte dos procedimentos realizados atualmente. utilizada,
por exemplo, na realizao de seqenciamento, como diagnstico de doenas, detec-
o de mutaes pontuais, entre outros.
A PCR, nos dias atuais, considerada uma das tcnicas de biologia mo-
lecular de grande importncia revolucionria (LORENZ, 2012; RAJENDRAN MA-
HEASWARI, JAISHREE TUKARAM KSHIRSAGAR, 2016; TYRRELL, 1997). Seu cri-
ador, Mullis (1983), em 1993 recebeu o prmio Nobel em qumica pela descoberta
(MULLIS, 1990) e desde ento, esta metodologia vem sendo amplamente aplicada
em diversas reas; so exemplos: identificao de polimorfismo, genotipagem, detec-
o de microrganismos, doenas genticas, entre outras (AGNE et al., 2009; CAR-
NEIRO et al., 2013; MILLER, 2007; NOVAIS; PIRES-ALVES, 2004; TIBAYRENC et
al., 2002).

13
1.2 PRINCPIO CIENTFICO

A PCR uma tcnica altamente sensvel, por meio da qual, pequenas

quantidades de sequncias de DNA ou RNA especficas podem ser enzimaticamente
amplificadas at que sejam obtidas milhes de cpias da sequncia alvo (KONEMAN
et al., 2001). Caracteriza-se por reaes in vitro de amplificao do DNA, em que
ocorre uma replicao exponencial do DNA alvo na presena de oligonucleotdeos
sintticos (dNTP), primers e enzimas estveis a elevadas temperaturas (HILLER,
2010). Para permitir tal amplificao seletiva, alguma informao prvia a respeito das
sequncias-alvo necessria. Essa informao utilizada para desenhar dois oligo-
nucleotdeos iniciadores (primers), os quais so especficos para a sequncia-alvo e
apresentam, em mdia, de 15 a 25 nucleotdeos de extenso (KOCH & MICHELSEN
DE ANDRADE, 2008).
Os primers so adicionados ao DNA-molde desnaturado, ocorrendo as-
sim a ligao especfica s sequncias de DNA complementares ao stio-alvo, flan-
queando e delimitando a regio a ser analisada. Na presena de uma concentrao
adequada da DNA-polimerase termoestvel e dos quatro desoxirribonucleosdeos tri-
fosfatos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), iniciada a sntese de novas fitas de DNA, que
so complementares a cada uma das fitas de DNA do segmento-alvo (STRACHAN et
al., 2002).

14
1.3 CARACTERSTICAS

A PCR consiste na deteco e amplificao invitro de regies especfi-

cas de cidos nuclicos (DNA ou cDNA) (TYRRELL, 1997). O desenvolvimento desta
tcnica dependente dos seguintes reagentes e aparelho: amostra, primers, dNTPs,
Taq polimerase, MgCl2, tampo da PCR e de um termociclador (AGNE et al., 2009;
NOVAIS; PIRES-ALVES, 2004; SANTOS et al., 2014).
A amostra est relacionada a fonte do material que deseja-se amplificar,
podendo ser sangue, biopsia de qualquer tecido, cabelo, unha, lquidos corpreos,
entre outros. Os primers (pelo menos um par) so responsveis pela identificao do
local correto (exemplo gene) do material a ser amplificado; os dNTPs (desoxirribonu-
cleotdeos fosfatados) so responsveis pela sntese de novas cpias do material a
ser amplificado; a Taq polimerase sintetiza as novas cadeias de DNA ou cDNA; o
MgCl2 e o tampo da PCR colaboram com a atividade da polimerase; e o termociclador
responsvel pelas alteraes das temperaturas que levam a desnaturao da mo-
lcula de DNA ou cDNA, ao anelamento dos primers, e ao alongamento/extenso das
novas cadeias de DNA (SANTOS et al., 2014), conforme ilustrado na figura 1.

Figura 1. Componentes e etapas envolvidas durante a PCR que ocorrem no termociclador. Fonte:
Adaptador de http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/35-genetic-modificatio-
nand/pcr.html.

15
 O tubo com todos os reagentes e a amostra encaminhado a um apa-
relho conhecido como termociclador. Este aparelho composto por um bloco capaz
de aquecer e resfriar de acordo com o sentido da corrente eltrica aplicada. O termo-
ciclador divide a reao de PCR em trs etapas, que so: desnaturao, anelamento
e extenso (SANTOS et al., 2014). A desnaturao caracterizada pelo aumento da
temperatura (91 a 95C) com a finalidade de romper as pontes de hidrognio e, assim
permitir a abertura da dupla fita. O anelamento est relacionado com a ligao dos
primes na regio especfica que se deseja amplificar e caracterizada pelo abaixa-
mento da temperatura (55 a 62C). Esta temperatura est diretamente relacionada
com a composio dos primers. A terceira etapa, a extenso, envolve a ativao da
Taq Polimerase (72C) e subsequentemente a sntese das novas cadeias (NASCI-
MENTO; SUAREZ; PINHAL, 2010), conforme ilustrado na figura 2 e 3. Estas altera-
es de temperatura ocorrem em torno de 30 a 40 vezes e so chamadas de ciclo
(NOVAIS; PIRES-ALVES, 2004).

Figura 2. Etapas da PCR. Fonte: Adaptado dehttps://monitoriadegenetica.files.word-

press.com/2014/09/pcr.jpg.

16
Figura 3. Etapas da PCR. Fonte: Bruces, ALBERTS,, JOHSON, Alexander, LEWIS, Julian, ROBERTS,
Keith, WALTER, Peter, and RAFF, Martin. Biologia Molecular da Celula, 5 edio. ArtMed, 2011. pg
545.

O ciclo inteiro e entao reiniciado, os produtos do primeiro ciclo de repli-

cacao sao entao desnaturados, hibridizados e novamente replicados com DNA poli-
merase. O procedimento e repetido muitas vezes ate que o nivel desejado de amplifi-
cacao seja obtido. Na pratica, a amplificacao efetiva do DNA requer de 20 a 30 ciclos
de reacao, com os produtos de cada ciclo servindo como DNA-molde para o proximo
dando origem ao termo reacao em cadeia da polimerase.
Como cada etapa da reacao ocorre em uma temperatura especifica, a
reacao pode ser controlada. E utilizado um termociclador para determinar a tempera-
tura e o tempo de cada etapa, bem como o numero de ciclos de replicacao. A deteccao
do produto de amplificacao normalmente e feita em eletroforese em gel de agarose,
que e corado com brometo de etidio, permitindo a visualizacao direta do DNA pesqui-
sado. Hoje, existem termocicladores que, alem de amplificar o DNA, permitem a sua
deteccao chamada PCR em tempo real (qPCR).
17
1.4 APLICAO

Desde a introduo da tcnica de PCR, rpidos avanos nas tcnicas de

gentica molecular tm revolucionado a prtica da patologia, anatomia e anlises cl-
nicas. As tcnicas moleculares so agora aplicveis a todas as reas do laboratrio
clnico. Na anatomia patolgica, apesar das anlises morfolgicas ainda serem a prin-
cipal ferramenta de trabalho, resultados dos estudos de gentica molecular tm inte-
grado, cada vez mais, os diagnsticos nas anlises cirrgicas (MOLINA; TOBO,
2004).
As reas de aplicao podem ser divididas em mdicas, forenses, pes-
quisa e comerciais:
Diagnsticos de doenas infecciosas: bactrias, vrus, fungos, protozo-
rios;
Quantificao de DNA ou RNA viral/clula hospedeira;
Diagnstico de mutaes gnicas;
Diagnstico de doenas genticas;
Estudo da expresso gnica: deteco e quantificao de RNA em dife-
rentes tipos celulares ao longo do desenvolvimento;
Engenharia gentica;
Diagnstico de paternidade;
Medicina Forense;
Sequenciamento de DNA;
Tipagem de tecidos;
Clonagem;
Deteco de OGMs.

18
1.5 VARIAES DA TCNICA

Entre as principais tcnicas resultantes de modificaes da reao em

cadeia da polimerase, podemos citar o RT-PCR, nested PCR, multiplex PCR, PCR a
partir de primers randmicos e PCR em tempo real. (MOLINA & TOBO, 2004)

1.5.1 RT-PCR

A tcnica de RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) baseia-se na ampli-

ficao de DNA obtido por meio da transcrio reversa de RNA. Atravs da enzima
Transcriptase Reversa (RT), o RNA convertido em DNA complementar (DNAc), que
posteriormente amplificado por PCR. Esta metodologia pode ser utilizada na anlise
de expresso de genes de virulncia e/ou produo de toxinas em alimentos, pois
amplifica o RNA viral (CASTELANI & DUARTE, 2011).

1.5.2 Nested-PCR

O nested-PCR emprega uma segunda etapa de amplificao com um

par de primers internos aos utilizados na primeira etapa e visa aumentar a sensibili-
dade e especificidade do mtodo (MOLINA & TOBO, 2004).

1.5.3 PCR multiplex

A PCR-multiplex uma reao de amplificao desenhada para detectar

mltiplas sequncias-alvo em uma mesma amostra (MOLINA & TOBO, 2004). Trata-
se de uma variao da PCR tradicional e tem sido empregada de maneira crescente
nos ltimos anos. Baseia-se na utilizao de mais de um par de primers na mesma
reao, o que torna possvel a amplificao simultnea de mais de uma sequncia de
DNA e a identificao de mais de uma espcie bacteriana atravs da mesma PCR
(CASTELANI & DUARTE, 2011).

19
1.5.4 PCR a partir de primers randmicos

PCR a partir de primers randmicos utiliza sequncias curtas de oligo-

nucleotdeos para amplificar regies repetitivas do DNA genmico e bastante em-
pregado em estudos epidemiolgicos (MOLINA & TOBO, 2004). um mtodo rpido
que exige pequenas quantidades de DNA e simples e sensvel, possibilitando a an-
lise rpida de um elevado nmero de estirpes. Pode ser utilizado com sucesso na
diferenciao de estirpes que possuam grande heterogeneidade dentro dos operons
do rRNA. Entretanto, o poder discriminatrio deste mtodo geralmente no to bom
quanto o de REP-PCR e RAPD, devido essencialmente pequena poro do genoma
examinada (CASTELANI & DUARTE, 2011).

1.5.5 PCR em Tempo Real

A reao de PCR tradicional fornece caractersticas qualitativas, o que

limita a tcnica para estudos quantitativos (CASTELANI & DUARTE, 2011). A PCR
em tempo real permite que a amplificao e a deteco ocorram simultaneamente em
um sistema fechado, sendo necessrio um termociclador que possua sistema de mo-
nitoramento de emisso de fluorescncia. (MOLINA & TOBO, 2004). Durante a rea-
o, o acmulo de amplicons detectado em "tempo real" para cada ciclo, por meio
da excitao de fluorocromos que marcam sondas sequncia especficas ou primers
usados na reao. O uso de transcrio reversa associada a PCR em tempo real tor-
nou a quantificao de mRNA mais simples e precisa. A PCR em tempo real requer
uma plataforma de instrumentao que contm um termociclador acoplado a um sis-
tema tico para a excitao da fluorescncia e captura da emisso, alm de um com-
putador para aquisio de resultados e anlise final da reao (CASTELANI & DU-
ARTE, 2011). Esta tcnica empregada para quantificao de amostras, como para
testes de carga viral e monitoramento de doena residual mnima (MOLINA & TOBO,
2004)

20
2.1 HISTRIA E EVOLUO DA TCNICA

O termo proteina origina-se da palavra grega proteos, que significa

essencial e foi utilizado pela primeira vez em 1839, quando Mulder notou que essa
substncia estava presente tanto na matria animal quanto vegetal. Panum conseguiu
em 1851 separar uma frao de protena usando uma tcnica de precipitao com
acido acetico, que posteriormente, em 1862, foi denominada de globulina por Schi-
midt. Kuhne foi o primeiro cientista a conseguir separar duas fraes proteicas, utili-
zando o anidro carbnico e o cido actico para fazer a precipitao destas, intitulando
as fraces de paraglobulina e alcalialbuminato, respectivamente. Estas foram de-
nominadas, em seguida, de seroglobulina, por Weil e Hynius. No final do seculo XIX,
Mehu, um qumico francs, desenvolveu alguns mtodos para a medio dos compo-
nentes proteicos no sangue. Ele publicou em 1878, um mtodo para quantificar o que
chamou de albumina ou albuminoides (TORRES FILHO, 2008).
Os fundamentos da eletroforese tm origem nos estudos de Michaelis,
no ano de 1909, quando este percebeu que protenas se moviam quando submetidas
a um campo eltrico, podendo ser separadas em fraes. Por anos, alguns cientistas
como Sverdberg e Scott (1924), Sverdberg e Tiselius (1926) e Theorell (1935) traba-
lharam para aperfeioar a tcnica (BURTIS & ASHWOOD, 2001). Entretanto, a base
para a eletroforese de protenas utilizada nos dias de hoje foi fundamentada em um
mtodo desenvolvido em 1937 pelo bioqumico sueco Arne Tiselius, ganhador do pr-
mio Nobel. Seu trabalho cientfico relatava o fracionamento das protenas sricas por
eletroforese, realizada na poca em equipamentos similares aos de baterias de auto-
mveis, onde as separaes das fraes ocorriam em meio lquido. Esse tipo de ele-
troforese foi denominado de eletroforese de fase liquida e foi introduzida como meio
de auxlio ao diagnstico clnico. Porm, por ser de aplicao difcil e onerosa, ficou
restrita a rea cientfica em apenas algumas instituies de pesquisas (TISELIUS,
1937).
Em 1949, Linus Pauling e colaboradores publicaram na revista Science
o fracionamento eletrofortico da hemoglobina S usando a eletroforese em papel filtro.
Apesar de precisar de 12 a 18 horas para fracionar protenas, essa tcnica foi empre-
gada no uso laboratorial para anlises especficas nos estudos de protenas sricas,
lipoprotenas e hemoglobinas (PAULING et al., 1949). Entretanto, a tcnica tinha a
desvantagem de ter baixa reprodutibilidade. Somava-se a isso que o papel utilizado,
21
por no ser transparente, dificultava a quantificao das fraes proteicas (LANDERS,
2008).
Um modelo revolucionrio para a poca foi desenvolvido pelos imunolo-
gistas franceses Curtis Willians e Pierre Grabar, em 1953. A tcnica permitia a sepa-
rao das fraes proteicas a partir da precipitao dos anticorpos. Foi nomeada de
imunoeletroforese e destacava-se das outras tcnicas por utilizar uma fina pelcula de
gel de gar espalhado sobre lminas de vidro como suporte. Esse mtodo foi aperfei-
oado para outros tipos de protenas como enzimas, lipoprotenas e hemoglobinas,
permitindo quantificao por densitometria, apresentando excelente reprodutibili-
dade e sensibilidade, alm de um curto tempo de quatro horas para a corrida eletrofo-
rtica. Entretanto, problemas com o grau de impureza do gel de agarose estavam
interferindo nos resultados. Este fato possibilitou, a partir de 1970, a padronizao de
mtodos industriais para a purificao do gel de agarose (NAOUM, 2012).
A descoberta do gel de agarose proporcionou avanos da tcnica de
eletroforese. Vrios tipos de amostras como soro, plasma, lquor ou hemolisado de
hemoglobinas eram utilizados para o exame, e isso no mesmo suporte de gel, o que
tornava a tcnica mais prtica e vivel na rotina laboratorial. A avaliao quantitativa
das fraes foi favorecida com o desenvolvimento desta tcnica e o uso de densit-
metro. A utilizao do gel de agarose estimulou ainda a elaborao de outros tipos de
gis, como o gel de amido (1955) e o de acrilamida (1959). Destes, apenas o gel de
acrilamida foi adaptado e melhorado. O gel de amido caiu em desuso por dificultar a
corrida eletrofortica, j que levava cerca de 15 horas, alm de necessitar de refrige-
rao (JEPPSON et al., 1979).
A partir do gel de acrilamida foi desenvolvido o gel de poliacrilamida, que
nada mais que uma polimerizao vinlica da acrilamida e da bisacrilamida. O resul-
tado dessa reao um gel com caractersticas fsicas ideais para uma eletroforese
altamente seletiva, como densidade, elasticidade, transparncia e tamanho dos poros.
Mesmo apresentando esse alto grau de resoluo, o uso dessa tcnica economica-
mente dispendioso para a rotina de anlises de amostras, sendo mais utilizado em
pesquisas cientficas (NAOUM, 2012).
Graham e Grunbaum, buscando desenvolver tcnicas mais prticas para
a realizao da eletroforese na rotina laboratorial criaram, em 1963, o mtodo para
fracionamento de protenas e enzimas utilizando como suporte o acetato de celulose.

22
Tal tcnica obteve xito no meio cientfico por ser simples, barata e por permitir exce-
lente grau de separao e quantificao das fraes proteicas. O suporte de celulose
foi melhorado, tendo os poros gelatinizados, ficando conhecido como celogel (RI-
CHES & KOHN, 1987).
No incio da dcada de 1960 outra tcnica de eletroforese foi desenvol-
vida usando o gel de gar ou poliacrilamida e uma sustncia chamada de anflito.
Esse novo produto misturado ao gel produzia um gradiente de pH entre os plos po-
sitivo e negativo, criando faixas milimtricas de pH em ordem crescente. Ao se aplicar
amostras que contm diferentes protenas com pHs especficos nesse gel, h uma
reao entre estas protenas com o correspondente anfotrico, levando a precipitao.
Tal mtodo recebeu o nome de eletroforese de isofocalizao, e tem sido empregada
em pesquisas e rotina laboratorial por apresentar alto grau de resoluo no fraciona-
mento proteico (NAOUM, 2012).
Uma das ltimas tcnicas a ser desenvolvida foi a tcnica de eletroforese
capilar, em 1986, por Lauer e Mc Manigill, onde uma corrente eletrosmtica criada
dentro de um tubo capilar conectado a dois reservatrios contendo soluo tampo,
onde um representa o nodo e o outro o ctodo. Sob ao de corrente eltrica a amos-
tra se movimenta no interior do tubo, onde h interao das cargas eltricas das pro-
tenas da amostra com os ons da soluo tampo. Tal processo promove o fraciona-
mento proteico, formando, dentro do tubo, pequenas micelas, posteriormente identifi-
cadas por um detector especfico que registra em grficos a posio e a concentrao
de cada protena. Essa tcnica tem uma vasta aplicao, por fracionar desde molcu-
las pequenas at as mais volumosas e complexas, como protenas e cidos nucleicos,
de forma rpida e eficiente (SPUDEIT et al., 2012).

23
2.2 PRINCPIO CIENTFICO

A eletroforese consiste em empregar uma corrente eltrica contnua para

separar os componentes do sangue, urina, lquor e outras solues. Quanto maior a
corrente, maior ser a velocidade com que as molculas de protenas se movero, j
que os aminocidos que as compem possuem em sua composio cargas eltricas
positivas ou negativas. Dessa maneira, as molculas com carga negativa migram para
o plo positivo, as molculas com carga positiva migram para o plo negativo e as que
apresentam cargas eltricas equilibradas permanecero estticas. As protenas de
menor peso molecular irao migrar mais rapidamente que as de maior peso (OCON-
NELL et al., 2005).
Para a realizao dessa tcnica, necessrio um conjunto de sistemas
formado por um suporte de fracionamento, uma cuba de eletroforese, uma fonte de
voltagem e uma soluo tampo. O suporte pode ser de acetato de celulose, gel de
agarose ou poliacrilamida e tubos capilares. A cuba um equipamento formado por
dois compartimentos preenchidos com soluo tampo, formando os eletrodos, sendo
um positivo e o outro negativo. A fonte de voltagem um aparelho que transforma a
corrente alternada em contnua, podendo ter a intensidade regulada. essa fonte que
determina a polaridade dos compartimentos da cuba. A soluo tampo formada
por gua, sal cido e sal bsico. Tal soluo pode ser cida ou alcalina, sendo espe-
cfica para cada tipo de eletroforese, dada pelo grau de molaridade ou fora inica da
soluo (NAOUM, 2012).
A maioria dos aminocidos apresentam um ponto isoeltrico quase neu-
tro. Entretanto, os polmeros que se ligam a esses aminocidos os transformam em
molculas carregadas negativamente. Por isso, a maioria das solues tampes utili-
zadas no sistema eletrofortico so alcalinas. Como as protenas so estruturas com
diferentes graus de complexidade, o mtodo para fracionamento eletrofortico destas
no o mesmo. Para tal, existem solues tampes especficas para cada tipo de
protena, que so agrupadas, segundo a disposio espacial, em estruturas primria,
secundria, terciria e quaternria (MCPHERSON, 2011). A eletroforese movimenta
ons atravs de um suporte estabelecido. A troca inica entre as partculas proteicas
e os grupos eletricamente carregados que compe o suporte geram um movimento
eltrico de baixa intensidade em direo oposta ao sentido da eletroforese. Esse mo-

24
vimento intrnseco denominado eletroendosmose. Esse fenmeno atrasa o desen-
volvimento eletrofortico, elevando a intensidade de calor da eletroforese. No suporte
de celulose, esta desprezvel. Contudo, nos suportes de gar e poliacrilamida, a
eletroendosmose tem importncia significativa e est diretamente ligada a pureza e
qualidade do gel, bem como, da sua espessura. Quanto mais puro e menos ionizvel
o gel, menor ser o efeito eletroendosmtico e quanto mais espesso o gel maior ser
a eletroendosmose (NAOUM, 2012).

25
2.3 CARACTERSTICAS

A eletroforese pode ser usada para separar molculas com base na

carga, tamanho e afinidade de ligao que possuem. A tcnica aplicada principal-
mente para separar e analisar biomolculas, como DNA, RNA, protenas, cidos nu-
cleicos, plasmdeos e fragmentos dessas macromolculas.
A eletroforese de nion ou partculas carregadas negativamente cha-
mada anaforese. A eletroforese de ction ou partculas carregadas positivamente
chamada de cataforese.
Esse processo foi observado pela primeira vez em 1807 por Ferdinand
Frederic Reuss, da Universidade Estadual de Moscou, que notou que as partculas de
argila migraram em guas expostas a um campo eltrico contnuo.
Existem dois fatores principais que controlam a rapidez com que uma
partcula pode se mover e em que direo ela se move. Primeiro, a carga da amos-
tra importante (FIGURA 4). As molculas carregadas negativamente so atradas
para o plo positivo de um campo eltrico, enquanto as positivamente carregadas so
atradas para o plo negativo. Uma espcie neutra pode ser ionizada se o campo for
forte o suficiente. Caso contrrio, no tende a ser afetada.

Figura 04 - Visualizao das bandas. Fonte: http://www.kasvi.com.br/wp-content/uploads/2016/03/ele-

troforese-02-768x642.jpg

26
 O outro fator o tamanho da partcula (FIGURA 5). Pequenos ons e
molculas podem se mover atravs de um gel ou lquido muito mais rapidamente do
que os grandes.

Figura 05 - Migrao dos fragmentos conforme peso molecular e formao das bandas. Fonte:
http://www.kasvi.com.br/wp-content/uploads/2016/03/eletroforese-01-768x476.jpg

Enquanto uma partcula carregada atrada por uma carga oposta em

um campo eltrico, existem outras foras que afetam a forma como uma molcula se
move. A frico e a fora de atraso eletrosttico retardam o progresso das partculas
atravs do fluido ou gel. No caso de eletroforese em gel, a concentrao do gel pode
ser controlada para determinar o tamanho dos poros da matriz de gel, o que influencia
a mobilidade. Um tampo lquido tambm est presente, o que controla o pH do am-
biente.
medida que as molculas so puxadas atravs de um lquido ou gel,
o meio aquece. Isso pode desnaturar as molculas e afetar a taxa de movimento. A
tenso controlada para tentar minimizar o tempo necessrio para separar as mol-
culas, mantendo uma boa separao e mantendo as molculas intactas. s vezes, a
eletroforese realizada na geladeira para ajudar a compensar o calor.

27
2.4 APLICAO

A eletroforese utilizada em inmeros processos de biologia molecular,

entre eles:

I. Cincia forense para comparar o DNA encontrado no local do

crime com o de possveis suspeitos.
II. Gentica teste de paternidade, diferenciao de espcies ou li-
nhagens e engenharia gentica.
III. Microbiologia deteco de diferentes patgenos como vrus,
bactrias e fungos.
IV. Bioqumica deteco da expresso de protenas.

A eletroforese de protena utilizada no diagnstico de processos infla-

matrios, gamopatias e disproteinemias h mais de 50 anos. A realizao da eletro-
forese de protenas tem utilidade nas seguintes situaes clnicas: (KEREN, 1998;
JACOBS, DEMOTT, OXLEY, 2001).
Suspeita de mieloma mltiplo, amiloidose ou outras gamopatias; dorsal-
gia em maiores de 50 anos; presena de osteoporose, presena de le-
ses osteolticas ou hipercalcemia; presena de protena de Bence Jo-
nes; elevao da creatinina; quadros de infeces recorrentes; neuropa-
tia perifrica inexplicvel; insuficincia cardaca refratria; sndrome ne-
frtica; quadros de m-absoro em maiores de 50 anos; quadros de
anemia e hepatoesplenomegalia; avaliao de doena heptica crnica;
pacientes com VHS elevado.

28
2.5 VARIAES DA TCNICA

2.5.1 Eletroforese de zona

Tcnica tradicionalmente utilizada na qual ocorre a migrao das part-

culas como zonas, usualmente em um meio de suporte poroso como acetato de celu-
lose, gel de agarose ou poliacrilamida, aps a amostra ser misturada com uma solu-
o tampo. Isto gera um eletroforetograma que dispe as zonas de protenas com
limites precisos. As zonas de protenas so visualizadas quando o meio de suporte
corado. A seguir, o meio de suporte secado e as protenas quantificadas em um
densitmetro, que converte o padro de bandas em picos. A agarose um polissaca-
rdeo complexo, em geral, livre de grupos ionizados. Apresenta as vantagens de
pouca afinidade por protenas e clareza aps a secagem, permitindo excelente densi-
tometria e eletroforese de alta resoluo (KARCHER, KERN, 2001; LE CARRER).

2.5.2 Eletroforese capilar

A eletroforese capilar uma tcnica que se difere das demais por ser a
nica capaz de separar macromolculas carregadas, utilizando vrios mtodos de se-
parao, como a eletroforese capilar de zona, isotacoforese capilar e eletroforese ca-
pilar em gel. Alm de protenas sricas, essa tcnica permite a determinao de vrias
outras substncias, como hidrocarbonetos, vitaminas, frmacos e cidos orgnicos
(MICKE, 2004).
Dos vrios mtodos existentes na eletroforese capilar para separao
de protenas, a tcnica mais utilizada a eletroforese capilar de zona, por ser simples
e rpida. O fracionamento ocorre pela diferena das velocidades dos ons no campo-
eltrico formado no tubo capilar, que est preenchido com uma soluo tampo. Ao
se introduzir a amostra na extremidade positiva (nodo) do tubo, a diferena de po-
tencial aplicada faz com que os ons da amostra migrem atravs do tubo, com veloci-
dades e sentidos variados. A anlise qualitativa baseia-se na comparao dos tempos
de migrao da soluo padro com os tempos de migrao das substncias da
amostra avaliada. A anlise quantitativa expressa em grficos que expressam os
picos de cada frao separada (SPUDEIT et al., 2012).

29
 O uso da eletroforese capilar ainda restrito j que o equipamento utili-
zado nessa tcnica tem um custo elevado. Contudo, uma tima alternativa para
fracionamento de protenas, por ser rpida (apenas quatro minutos), por oferecer boa
resoluo e eficincia, alm de necessitar de uma pequena quantidade de amostra.
Se a tcnica for toda automatizada, a produtividade aumenta consideravelmente, di-
minuindo o uso de reagentes, gerando baixo custo analtico (CRIVELLENTE et al.,
2008). frequentemente utilizada na anlise dos ons presentes nos alimentos de
origem animal, compostos e fludos biolgicos (MENDES, 2010).

2.5.3 Acetato de Celulose

O acetato de celulose o produto de uma reao da celulose com ani-

drido actico e cido actico, utilizando como catalisador o cido sulfrico. O pesqui-
sador J. Kohn, em 1958, utilizou esse meio para separao e fracionamento de pro-
tenas sricas e observou que o mesmo apresentava algumas caractersticas fsico-
qumicas que facilitavam a corrida eletrofortica. Vantagens como material neutro, ab-
soro uniforme das protenas, microporos homogneos, formao de filmes transpa-
rentes que facilitam a leitura, boas condies de armazenamento por longo perodo e
baixo custo tornam esse meio ideal para uso na rotina laboratorial. Permite o fracio-
namento de protenas, lipoprotenas, hemoglobinas e substncias com baixo peso
molecular como aminocidos, peptdeos e nucleotdeos (NAOUM, 2012).
Esse suporte alm de permitir uma separao proteica rpida e possibi-
lidade de armazenamento prolongado dos filmes corados, apresenta a vantagem ter
um custo relativamente baixo, sendo a tcnica mais facilmente disponvel na rotina
laboratorial. Contudo, o fracionamento proteico limitado, por separar apenas cinco a
sete grupos de protena. Na medicina veterinria esse suporte foi amplamente utili-
zado (HAGIWARA & GERMANO, 1974; FAGLIARI et al., 1998; BORGES et al., 2001),
porm, com desenvolvimento de novas tcnicas que permitem principalmente uma
separao proteica de alta resoluo, essa tcnica caiu em desuso.

30
2.5.4 Gel de gar

O gel de agarose um polissacardeo linear no absorvvel, no fermen-

tvel e atxico, extrado de diversos gneros de algas marinhas. Apresenta em sua
composio diversas substncias como fibras, sais minerais e protenas, que podem
interferir na migrao proteica, principalmente pelo efeito eletroendosmtico. Por isso,
a pureza do gar utilizado que vai determinar o sucesso do fracionamento das pro-
tenas (NAOUM, 2012).
Apresenta ampla capacidade de separao de protenas, por permitir s
protenas de alto peso molecular, movimentao livre, conforme sua carga, produ-
zindo resultado melhor que o suporte de acetato de celulose. O gel pode ser facilmente
preparado no laboratrio, tornando a tcnica prtica e de baixo custo. A concentrao
da agarose varia de 0,5 a 2%, e o que determina o tamanho do poro do gel, de forma
que quanto mais concentrado for a agarose, menor sero os poros do gel. utilizado
tanto na rotina laboratorial quanto em pesquisas cientficas (AZEVEDO, 2003).
Apesar de fracionar as protenas em apenas cinco a sete regies, como
o acetato de celulose, essa a tcnica mais utilizada na rotina laboratorial veterinria,
por apresentar algumas vantagens. Dentre estas, destacam-se a possibilidade de a
tcnica ser automatizada, o que facilita e agiliza a execuo; o tamanho varivel dos
poros, permitindo a separao de diversos tipos de molculas, desde lipoprotenas
cidos nucleicos; e a qualidade da resoluo do fracionamento proteico melhor. A
principal desvantagem da eletroforese em gel de agarose a fragilidade do filme uti-
lizado, necessitando de equipamento caro a fim de preserv-lo (CRON et al., 2010).

2.5.5 Gel de Poliacrilamida

O gel de poliacrilamida foi utilizado como meio eletrofortico em 1959

por Raymond e Weintraub para fracionamento de macromolculas. O gel formado
porum processo de polimerizao vinlica da acrilamida, um monmero, e da bisacri-
lamida, tendo a participao de catalizadores, como a riboflavina ou o persulfato de
amnio. A porosidade do gel formado pode ser determinada pela concentrao da
acrilamida, de forma que quanto maior a concentrao desta, menores sero os poros
do gel (NAOUM, 2012).
Esse suporte permite o fracionamento proteico tanto pelo sistema nativo,
que separa as protenas levando em considerao apenas as cargas eltricas
31
(PAGE), quanto pelo sistema desnaturante, que solubiliza as protenas em um tampo
contendo um reagente desnaturante, sendo o SDS (dodecil sulfato de sdio) o mais
empregado. Para isso, a preparao do gel de poliacrilamida pode ser individualizada
para diferentes faixas de peso molecular de substncias que sero processadas, le-
vando em considerao a concentrao do gel, j que poros menores permitem a
passagem de protenas menores. O detergente aninico (SDS) interage com as ca-
deias peptdicas das protenas, promovendo a desnaturao destas, que ficam com
cargas negativa. Assim, a separao ocorre apenas pela diferena de peso molecular,
caracterizando a tcnica conhecida como SDS-PAGE (ECKERSALL, 2008).
Quando comparada com as demais tcnicas, a eletroforese em gel de
poliacrilamida a que apresenta melhor resultado pois possibilita a visualizao de
protenas com concentraes sricas baixas e identificao de 15 a 20 protenas. Ape-
sar disso, o emprego dessa tcnica na rotina laboratorial torna-se invivel devido
dificuldade de execuo da mesma, limitando-se a casos especficos e pesquisas ci-
entficas (RADKTE, 2003).

2.5.6 Focalizao Isoeltrica

Esse tipo de eletroforese usado especificamente para o fracionamento

de substncias moleculares, como protenas e DNA, somente por suas cargas eltri-
cas, permitindo que cada protena migre para o ponto isoeltrico, concentrando-se
nas zonas em que alcanam a posio do pH especfico. Este mtodo caracteriza-se
pelo uso de um suporte de gel (gar ou poliacrilamida) que tenha, adicionado em sua
composio, substncias anfotricas, distribudas em faixas com pH graduais dispos-
tas em zonas estabelecidas entre o nodo e ctodo (NAOUM, 2012).
Aps alguns ajustes desde a criao, a eletroforese por focalizao iso-
eltrica apresenta uma qualidade de fracionamento proteico superior a qualquer outro
tipo de eletroforese. Porm, o alto custo dos materiais e a necessidade de pessoal
especializado para a execuo e interpretao, torna o uso da tcnica apropriado ape-
nas em pesquisas cientficas. mais indicada para rastreamento de hemoglobinopa-
tias (BERTHOLO & MOREIRA, 2006).

32
2.5.7 Eletroforese na veterinria

A eletroforese das protenas sricas um importante mtodo para quan-

tificao de protenas presentes em diversos tipos de amostras, com o objetivo de
auxiliar no diagnstico, prognstico e curso de diversas doenas. Na medicina veteri-
nria, vrias tcnicas tm sido empregadas, sendo as mais utilizadas a eletroforese
em acetato de celulose, em gel de agarose e em gel de poliacrilamida, permitindo a
visualizao de cinco a sete bandas proteicas. A aplicabilidade dessas tcnicas visa
fornecer informaes importantes sobre vrios aspectos (ECKERSALL, 2008).
Geralmente, a eletroforese realizada como exame de triagem, sendo
uma importante ferramenta na clnica veterinria, por fornecer informaes relevantes
sobre o estado geral dos animais, bem como uma avaliao sistmica frente a algum
processo inflamatrio ou infeccioso. Alguns trabalhos comparam a eletroforese das
protenas sricas de animais saudveis e animais com doenas especficas, anali-
sando quais as principais alteraes no traado eletrofortico, constatando a maneira
como o organismo responde injria (VIEIRA, 2009; FRANA et al., 2011; GEROU-
FERRIANI et al., 2011).

33
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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