TALLER DE RECUPERACION BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

1. Puede realizarse un ensayo in vitro de replicacin de ADN?, la respuesta es

SI. Se realiza a travs de una estrategia que se denomina REACCION EN
CADENA DE LA POLIMERASA (PCR siglas en ingls) considerada una
herramienta bsica en el laboratorio de biologa molecular y en gentica
a) Qu elementos son imprescindibles en esta reaccin?
R// La PCR requiere de una enzima ADN polimerasa denominada Taq polimerasa,
Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla de unos
20 nucletidos de longitud, un ADN molde y nucletidos (los bloques bsicos del
ADN).
b) Qu principios/propiedades bsicas del ADN y de la enzima ADN polimerasa
son fundamento de la PCR?
R//
La ADN polimerasa se llama Taq polimerasa, por la bacteria tolerante al
calor de la que se aisl (Thermus aquaticus). T. aquaticus vive en aguas
termales y fuentes hidrotermales
Su ADN polimerasa es muy termoestable y su mayor actividad se presenta
cerca de los 70C (temperatura a la que la ADN polimerasa de ser humano
o de E. coli no funcionara).
La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad trmica.
Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para
desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas.
c) Compare las fases-procesos de desnaturalizacin, hibridacin, y extensin de la
PCR con la replicacin in vivo en eucariotas Qu principales diferencias
observa?
R// La replicacin del ADN se lleva a cabo mediante enzimas conocidas como
ADN polimerasas dirigidas por ADN o simplemente ADN polimerasas. Estos
enzimas utilizan ADN monohebra con cebador y van incorporando los nucletidos
por complementariedad.
Para ello se necesita:
Desoxirribonucletidos 5' trifosfato (dATP, dTTP, dCTP, dGTP.)
Iones Mg2+
ADN patrn cebador, es decir, un ADN de doble hebra parcialmente desdoblado.
La hebra a rellenar se llama cebador.
Los segmentos de ADN en replicacin se llaman replicones. En eucariotas se
forman muchos replicones. Cada replicn tiene un punto de origen (0), donde se
inicia la replicacin, y dos puntos de terminacin (T), uno a cada lado del origen,
en los que acaba ese replicn y se encuentra el adyacente.
Las molculas ADN doble hlice lineal tienen problemas para replicar sus
extremos (telmeros), ya que las ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al
que ir aadiendo nucletidos. Uno de los extremos de cada hlice (el extremo 5')
se puede copiar sin problemas debido a que viene cebado desde atrs, sin
embargo, el extremo contrario (extremo 3') no podra replicarse ya que no puede
ser cebado desde atrs. Como consecuencia quedara un corto segmento al final
sin copiarse y se ira acortando el ADN por ese extremo en cada ronda de
replicacin. Este proceso se asocia a los procesos de envejecimiento y muerte
celular. Las secuencias perdidas de los telmeros pueden ser replicadas aunque
no exista el ADN molde mediante una enzima llamada telomerasa, la telomerasa
es una reversotranscriptasa que elabora ADN a partir de un molde de ARN. La
telomerasa porta su propio molde de ARN complementario a las secuencias
repetitivas de los telmeros como parte de su complejo enzimtico.
d) Puede haber errores de copiado durante la PCR? Explique brevemente
R// Si, puesto que las ADN polimerasas no son 100% fieles. Estos errores son
reparados en un alto porcentaje de las veces. Cuando los errores escapan los
mecanismos de reparacin ocurren cambios en la secuencia del ADN:
Mutaciones. Las mutaciones tambin pueden ocurrir por fenmenos post
replicacin (mutgenos fsicos, qumicos, etc.)
e) Adems de los errores en el copiado del ADN molde durante la replicacin,
puede haber otros eventos que daen la estructura/secuencia del ADN nuclear.
Qu mecanismos de reparacin del ADN conoce en eucariotas? Explique
brevemente cmo se relaciona el concepto de replicacin semiconservativa y
mecanismos de reparacin del ADN nuclear.
R// Esta correccin se realiza por medio de un conjunto de enzimas agrupados en
un complejo multienzimtico que detecta el nucletido mal emparejado, lo elimina
y regenera la secuencia correcta de la siguiente forma:
El aparato de correccin debe reconocer la cadena recin sintetizada, donde se
encuentra el error y diferenciarla de la cadena molde. Ambas cadenas son
complementarias, pero mientras que la cadena molde tienen metiladas las
adeninas de las secuencias GATC, existe un lapso de tiempo durante el cual las
adeninas de estas secuencias en la cadena rplica aparecen sin metilar, y es en
este intervalo cuando acta el complejo multienzimtico y detecta los posibles
errores. 1. La eliminacin se realiza mediante una endonucleasa que corta el
segmento en el lugar donde se encuentra el error. 2. La secuencia correcta se
regenera cuando la ADN polimerasa I rellena el hueco utilizando como molde la
cadena original, y por ltimo una ligasa unir los fragmentos.
Los mecanismos de reparacin nuclear se pueden agrupar en 3 hiptesis:
Hiptesis Conservativa. Propone que, tras la duplicacin quedan, por un
lado, las dos hebras antiguas juntas y, por otro, las dos hebras nuevas
tambin espiralizadas.
La Hiptesis Semiconservativa. En ella se sostiene que, en las dos
molculas de ADN de doble hlice hijas, una de las hebras sera la antigua
y otra la moderna.
La Hiptesis Dispersiva supone que la primitiva molcula de ADN se
fragmenta en multitud de pequeos trozos, copindose stos y reunindose
tanto los fragmentos originales como las copias de modo que las dos
nuevas molculas estn formadas por fragmentos antiguos y nuevos
2) La especificacin del tipo de Cncer en cuestin Carcinoma ductal infiltrante
bilateral de mama, con receptores de estrgeno, progesterona y her2 neu
negativos; en el taller 1 tiene solamente fines ilustrativos; en el taller 3 usar esta
informacin.
a) Teniendo en cuenta que la base biolgica de este caso hace referencia a fallas
en los mecanismos que controlan el crecimiento y la proliferacin celular;
mencione cules son los puntos claves o de chequeo para detener la progresin
del ciclo celular en clulas proliferativas.
R// Inhibidores de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP): la enzima poli (ADP-
ribosa) polimerasa (PARP) repara el dao del ADN en las clulas, incluido el dao
de ADN provocado por los medicamentos de quimioterapia.
Terapias dirigidas al RFCE (receptor del factor de crecimiento epidrmico): otros
tratamientos atacan una protena llamada receptor del factor de crecimiento
epidrmico o RFCE. Gran cantidad de clulas de cncer de mama triple negativo
"sobreexpresan" la RFCE, lo que quiere decir que poseen demasiados RFCE.
Inhibidores del FCEV (factor de crecimiento endotelial vascular): con el fin de
conseguir el oxgeno y los nutrientes necesarios para crecer y propagarse, los
tumores fabrican nuevos vasos sanguneos mediante un proceso denominado
angiognesis
b) Cules son los puntos involucrados especficamente en testear dao/error en
ADN? Cmo se lleva a cabo este fenmeno?
R// La seleccin de los nucletidos por las ADN polimerasas I y III y su actividad
autocorrectora (actividad exonucleasa de correccin de pruebas) constituyen los
principales mecanismos dc prevencin de errores. El uso de cebadores de ARN,
por la incapacidad de los ADN polimerasas de iniciar una nueva cadena, parece
ser que contribuye a incrementar la fidelidad de la copia, pues suelen ser los
primeros nucletidos los que con mayor frecuencia presentan errores de
apareamiento.
c) A qu se denomina genes supresores de tumores?
R// Es un tipo de gen que elabora una protena que se llama protena supresora de
tumores, la cual ayuda a controlar el crecimiento celular.
d) Investigue y mencione el rol/los roles que se les asigna a las siguientes
protenas y en qu compartimentos celulares cumplen esas funciones: p53; RB
(retinoblastoma); BRCA1; BRCA2
p53: Codifica para la protena p53, la cual puede detener la divisin celular e
inducir a las clulas anormales a matarse ellas mismas. Involucrado en una gran
cantidad de cnceres. Se lleva a cabo en el ncleo
RB (retinoblastoma): Codifica para la protena pRB, uno de los principales
controles del ciclo celular. Involucrado en el retinoblastoma y cnceres de hueso,
vejiga, clulas pequeas de pulmn y cncer de mama. Se cumple en el ncleo
celular
BRCA1: Involucrado en cnceres de mama y ovario. La funcin de los genes
BRCA 1 y 2 es reparar el dao celular y mantener el crecimiento regular de las
clulas mamarias.
BRCA2: Gen de cncer de mama 2. Se lleva a cabo en el ncleo, en los
cromosomas.
Usted solicita que le realicen a la paciente, un estudio molecular para la bsqueda
de mutaciones en los genes que codifican para las protenas BRCA1/BRCA2, ya
que es conocido que algunas variantes genticas en esos genes incrementan el
riesgo de desarrollar Cncer de mama/Cncer de Ovario. Los genes BRCA1 y
BRCA2 son definidos como genes supresores de tumores que intervienen en la
reparacin del ADN por recombinacin homloga. La protena BRCA1 tambin
interviene en el control del ciclo celular, remodelacin de la cromatina y muerte
celular programada, puede cumplir con diferentes funciones en asocindose a
distintas protenas.
e) Explique brevemente en qu consiste la reparacin de ADN por recombinacin
homloga. Recuerda algn otro proceso celular, distinto al proceso de
reparacin, que tambin involucre a la recombinacin homloga?
R// Es un tipo de reparacin que se realiza en el ADN cuando ste sufre un dao o
rotura. Algunos factores ambientales, como la radiacin de alta energa, pueden
causar roturas en la doble cadena del ADN (rompen un cromosoma en dos). En la
recombinacin homloga, se utiliza la informacin del cromosoma homlogo que
coincide con la del daado (o de una cromtida hermana si el ADN se ha copiado)
para reparar la fragmentacin. En este proceso se acercan los dos cromosomas
homlogos y se utiliza la regin sin daos del homlogo o la cromtida como
molde para sustituir la regin daada del cromosoma roto.
Un proceso celular de recombinacin homloga es el apareamiento de dos hebras
de DNA homlogo que es la iniciacin de la recombinacin y ocurre en la meiosis
despus de la replicacin de los cromosomas.
3) Las protenas transmembrana pueden tener distintas funciones y en base a ello
definirlas como: receptor, canal inico, transportador-carrier, molcula de
adhesividad celular, enzima, marcador de identidad celular, etc.
a) Busque y mencione un ejemplo de cada una de las siguientes categoras:
receptor, canal inico, enzima, molcula de adhesividad clula-clula.
RECEPTOR: El glutamato ionotrpico es un receptor celular de apertura de canal
inico.
CANAL INICO: la protena de canal K que posee un filtro selectivo que permite
el paso de ciertos iones e impide el paso de otros a travs de la membrana.
TRANSPORTADOR CARRIER: protena de transporte de membrana que se une
al soluto y lo transfiere a travs de la membrana por cambios en su conformacin.
MOLCULA DE ADHESIVIDAD CELULAR: la unin entre estas clulas por medio
de las MAC es tambin conocida como adhesin celular.
ENZIMA: La fosfolipasa C, una enzima citoslica que esconde ciertos
fosfolpidosde la hojuela citoslica de la membrana plasmtica
MOLCULA DE ADHESIVIDAD CLULA-CLULA: La -catenina es la mediadora
entre el sistema de adherencia celular y la protena c-erbB2, la cual se encuentra
amplificada en varios tipos de cncer.
b) La cadherina-E (tambin llamada L-CAM) es una protena integral
transmembrana que participa como molcula de adhesin clula-clula calcio
dependiente, se expresa en las clulas que conforman los distintos estados
embrionarios durante las primeras etapas del desarrollo y posteriormente su
expresin es restringida a clulas de tejidos epiteliales. Las cadherinas en su
conjunto, son jerrquicas en la segregacin espacial de los tipos celulares en
distintos tejidos. Mencione los principales procesos involucrados en la sntesis y
direccionamiento de esta protena que formar parte de las protenas de
transmembrana en la membrana plasmtica.
R// La cadherina E es una protena que atraviesa la membrana celular, en el lado
citoplasmtico se une al esqueleto celular de actina mediante otra protena
denominada beta-catenina. En el lado extracelular se une a si misma formando
homodmeros que a su vez se unen a otros homodmeros situados en clulas
adyacentes. Formando as redes de enlaces entre cadherinas. Para que estas
uniones sean estables se necesita la presencia extracelular de una determinada
concentracin de calcio.
c) Ubique en qu compartimentos subcelulares ocurre cada proceso y cmo se
produce el pasaje de compartimento a compartimento.
R// En el citoplasma de la clula se ubica la regin intracelular o carboxi-terminal
(C-terminal), esta regin conecta a las cadherinas con los filamentos de actina del
citoesqueleto,
Las lminas de clulas epiteliales como las que revisten el intestino delgado y los
tbulos renales, contienen abundantes cadherinas tipo E en las superficies
laterales del enterocito.
4) Lea el siguiente caso y marque todas aquellas palabras que desconozca su
significado.
Llega a la consulta un nio de 4 aos de edad. Lo traen sus padres porque hace 2
das que presenta fiebre (temperatura axilar 39 C), y tos con mucha
expectoracin. Ellos le cuentan que presenta tos en forma constante desde hace
ya un ao, que lo han internado varias veces por neumonas (infecciones
respiratorias a nivel pulmonar) desde el primer ao de vida; y que tiene
deposiciones claras, con grasa en la materia fecal. Usted observa que el nio est
muy adelgazado, su estatura es baja y al revisarlo presenta signos de compromiso
pulmonar. Procede indicndole la realizacin de radiografas de trax y observa en
ellas signos de mltiples bronquiectasias (dilatacin anormal e irreversible del
rbol bronquial). Le indica el tratamiento antibitico correspondiente y que en 15
das se le realice al nio un estudio especfico que se llama Test del sudor.
a) Busque el significado de las palabras marcadas e informacin sobre el Test del
sudor (ej.: en que consiste, a quien se le realiza, cual es el objetivo del estudio,
que alcance tiene el resultado, etc.)
R// EXPECTORACIN: Expulsin mediante la tos o el carraspeo de las flemas u
otras secreciones formadas en las vas respiratorias.
BRONQUIECTASIA: Afeccin que daa las vas respiratorias de los pulmones y
dificulta la expulsin de mucosidad.
TEST DEL SUDOR: es un procedimiento que se emplea en medicina con la
finalidad de diagnosticar la fibrosis qustica. Consta de 3 fases:
Estimulacin mediante iontoforesis y el empleo de pilocarpina
Recogida del sudor
Anlisis donde se mide la concentracin de cloruro en el sudor.
Un mes despus vuelve la misma familia y le cuenta que al nio le realizaron el
Test del sudor, que el resultado fue positivo, y que luego le indicaron repetir el
mismo test y el resultado fue positivo nuevamente. Usted concluye que el nio
presenta una enfermedad crnica grave que se llama Fibrosis Qustica, usted
sabe que esta entidad se produce por la alteracin de una protena especfica
(protena Cftr)
b) Busque informacin sobre: Fibrosis qustica y sobre la localizacin celular y las
funciones asignadas a la protena Cftr
R// La protena CFTR est formada por 1480 aminocidos. Esta protena est
formada por dos motivos repetidos compuestos cada uno por un dominio
hidroflico que atraviesa la membrana que contiene seis hlices y una regin
hidroflica importante de unin a ATP. Ambos motivos se encuentran unidos por un
dominio citoplasmtico (dominio R) codificado por el exn 13 que contiene varios
residuos cargados y la mayor parte de los lugares de fosforilacin (probablemente
sustratos de las protenquinasas A y/o C).
c) La alteracin de esta protena para el caso de Fibrosis qustica es debida a la
presencia de mutaciones en el gen que la codifica. Busque informacin sobre ello
R// La mayor parte de los defectos moleculares del gen CFTR son mutaciones
puntuales, de las que 42% son con cambio de sentido, 24% son pequeas
inserciones/deleciones con cambio en el marco de lectura, 16% son mutaciones
sin sentido, 16% afectan a regiones de ayuste o splicing y 2% producen la prdida
de un aminocido. Tambin se han descrito algunas deleciones grandes.
Una de las particularidades de CFTR es la presencia de transcritos que muestran
la delecin de uno o ms exones entre los individuos normales. Estos transcritos
se deben a alteraciones en el proceso de ayuste o splicing alternativo de la que la
ms frecuente es la delecin del exn 9 (9-). La presencia o ausencia de este
exn se correlaciona con la presencia de un polimorfismo de la secuencia del
intrn 8 cercano al punto aceptor del splicing (5T, 7T 9T). Si se encuentra la
forma 7T 9T se producira un procesamiento normal en 90% de las molculas de
RNAm, sin embargo la presencia de la forma 5T slo garantiza el procesamiento
normal de entre 10 y 40 % de las molculas de RNAm.