MO en Alimentos Azucarados

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
MICROORGANISMOS RESPONSABLES DE ALTERACIONES

EN ALIMENTOS ALTAMENTE AZUCARADOS
TESIS DOCTORAL
ESPERANZA CASAS ALCANTARILLA

MARZO 1999
23246
DIOLIOrECA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
MICROORGANISMOS RESPONSABLES DE ALTERACIONES

EN ALIMENTOS ALTAMENTE AZUCARADOS
Memoria presentada por

ESPERANZA CASAS ALCANTARILLA
para optar al grado de
1119DIIUHUU3U
s309 ssO7~
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
Doctor en Ciencias Biolgicas
)C 12- U*S2 11-o

Esperanza Casas
y0 B0 la Directora del trabajo
{AAh
-Ni
Dra. M~ Jos Valderrama Conde
MARZO 1999
Este trabajo ha sido financiado gracias a la ayuda recibida de la Comisin Interministerial de
Ciencia y Tecnologa, y los proyectos MR CT 93 08030 (europeo) y DGICYT UE 96-0018
(Comunidad de Madrid).
INDICE
Pgina
1.- INTRODUCCIN
1.1.- Levaduras contaminantes de alimentos 2
1.2.- Alimentos altamente azucarados y microorganismos osmotolerantes 4
1.2.1.- Adaptacin de las levaduras a altas concentacione~ de azcar 7
1.3.- Los sorbatos como conservantes 10
1.3.1.- Mecanismos de actividad antimicrobiana del sorbato 11
1.3.1.1.- Alteraciones morfolgicas 12
1.3.1.2.- Alteraciones en la funcin metablica 12
1.3.2.- Resistencia de los microorganismos al sorbato 14
1.3.3.- Aplicaciones del sorbato 19
1.4.- Identificacin de levaduras 20
1.4.1.- Esporulacin 23
II.- OBJETIVOS DEL TRABAJO 27
30
III.- MATERIAL Y MTODOS
31
111.1.- Muestras y alteraciones
35
111.2.- Alsamiento de microorganismos
38
111.3.- Mantenimiento de las cepas
38
111.4.- Identificacin de levaduras
42
111.4.1.- Esporulacin
44
111.5.- Identificacin de hongos filamentosos
45
111.5.1.- Identificacin de Aspergillus
46
111.5.2.- Identificacin de Penicilliunz
48
111.6.- Reproduccin de las alteraciones
48
111.6.1.- Reproduccin del olor a petrleot
111.6.2.- Reproduccin de las licuefacciones puntuales 48
111.6.2.1.- Reproduccin in siw 48
111.6.2.2.- Reproduccin en medios experimentales 48
111.7.- Estudio del mecanismo de licuefaccin 49
1
111.8.- Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) del cido srbico 50
111.9.- Caracterizacin del compuesto responsable del olor a
petrleo 51
111.9.1.- Identificacin de 1,3-pentadieno 51
111.9.2.- Cuantificacin de la produccin de pentadieno a partir de sorbato . 53
111.9.2.1.- Cuantificacin de sorbato en los medios 54
111.9.2.1.1.- Extraccin y preparacin de las muestras 54
111.9.2.1.2.- Condiciones de HPLC 55
111.9.2.1.3.- Cuantificacin de sorbato 56
111.9.2.1.4.- Estudio de recuperacin 56
111.9.2.2.- Cuantificacin de pentadieno en los medios 56
111.9.2.3.- Determinacin de biomasa 58
111.10.- Prueba estandarizada para la reproduccin del olor a petrleo 58
IV.- RESULTADOS 60
IV. 1.- Microorganismos aislados e identificacin .. . 61
IV. 1.1.- Levaduras 61
IV.l.2.- Hongos filamentosos 76
IV.2.- Esporulacin en cepas representativas 86
IV.3.- Reproduccin de las alteraciones 90
IV.3.l.- Reproduccin del olor a petrleo yio gas 90
IV.3.2.- Reproduccin de las licuefacciones puntuales 93
IV.3.2.1.- Reproduccin iii situ 94
IV.3.2.2.- Reproduccin en medios experimentales 94
IV.4.- CMI de cido srbico para cepas seleccionadas 97
IV.5.- Identificacin del compuesto responsable del olor a tpetrleo 97
IV.6.- Cuantificacin de pentadieno producido a partir de sorbato 105
IV.6.l.- Cuantificacin de sorbato 105
IV.6.l.l.- Recuperacin de sorbato en los medios sin inocular 106
IV.6. 1.2.- Determinacin de sorbato en los medios inculados 108
IV.6.2.- Cuantificacin de pentadieno 110
IV.6.3.- Recuentos celulares 112
11
V.- DISCUSIN 114
V.l.- Caracterizacin de microorganismos aislados 115
V.l.1.- Levaduras 115
V.1.2.- Hongos filamentosos 127
V.2.- Esporulacin 131
V.3.- Reproduccin de las alteraciones 138
V.3.1.- Reproduccin del olor a petrleo y/o gas 138
V.3.2.- Reproduccin de las licuefacciones puntuales .... 143
V.4.- CMI de cido srbico para cepas seleccionadas 146
V.5.- Identificacin de pentadieno como compuesto responsable del olor
a petrleo 148
u V.5.1.- Cuantificacin de sorbato

V.5.2.- Produccin de pentadieno
155
156
V.5.3.- Recuentos celulares 157
V.6.- Prueba estandarizada 159
u VI.- CONCLUSIONES 160
VII.-BIBLIOGRAFLA. 163
VIII.- APNDICES 178
E Apndice 1.- Medios de cultivo

Apndice II.- Nombres actuales de levaduras
179
188
3
u
u 111
u
u
L- INTRODUCCiN
u
u
L- Introduccin
1.1.- Levaduras contaminantes de alimentos
Aunque las levaduras son conocidas fundamentalmente por sus beneficios, tales
como la tradicional aplicacin en la fabricacin del vino, la cerVeza o el pan, su papel
como agentes responsables del deterioro en alimentos ofrece en la actualidad un amplio
campo de estudio. Las levaduras son capaces de crecer en un variado conjunto de alimentos
bajo determinadas condiciones, lo que puede llegar a suponer importantes prdidas
econmicas en ciertos sectores industriales. Entre estas condiciones que favorecen -e
incluso seleccionan- el crecimiento de las levaduras, destacan cuatro factores que pueden
actuar de forma sinrgica: baja actividad de agua (a~) -es decir, cantidad de agua del
alimento disponible para la actividad metablica de los microorganismos-, bajo pH, bajas
temperaturas y la presencia, normalmente por adicin, de agentes antibacterianos (Tudor
y Board, 1993). De esta forma, aquellos alimentos que posean una o ms de estas
caractersticas sern susceptibles de contaminacin y deterioro por levaduras.
As, se conocen alteraciones debidas a levaduras contaminantes en alimentos como

zumos de frutas y refrescos, bebidas alcohlicas, alimentos altamente azucarados, verduras,
alimentos fermentados o conservados en cido, productos lcteos y de panadera, o carnes
y pescados (Fleet, 1992; Deak y Beuchat, 1996). Las principales especies de levadura
asociadas con el deterioro de estos productos se especifican en la Tabla 1.
Respecto a la alteracin producida por levaduras, una primera manifestacin puede

ser la formacin de biomasa, que es especialmente evidente cuando la levadura es
pigmentada, como es el caso de Rhodotorula spp.; en lquidos, la aparicin de biomasa se
detecta por la aparicin de turbidez. Cuando la presencia de biomasa queda enmascarada
por el propio alimento, la alteracin puede deberse a los productos del metabolismo de las
levaduras; entre stos, cabe destacar la formacin de gas -CO2-, que distorsiona la forma
de los envases y/o los propios productos, y la aparicin de diversos olores y sabores de
fondo, provocados por la formacin de alcoholes, cidos orgnicos y steres (Fleet, 1992;
Tudor y Board, 1993).
2
U Introduccin
Tabla 1.- Principales especies de levaduras responsables de deterioro, por orden

alfabtico, y alimentos de los que se han aislado
Especie de levadura Alimentos alterados

Salmueras, carnes fermentadas y curadas, zumo de
Debaryomyces hansenii
naranja, leche, helado, nata, queso, yogur, pan, marisco
Dekkera intermedia Cerveza, vino, refrescos, yogur
Issarchenkia orientalis Leche, queso, yogur, salsa de tomate
Kloeckera apiculata Tomates, higos, cerezas en lata, yogur
Pichia membranzfaciens Salmuera de aceitunas, conservas en vinagre, salsa de

tomate, queso, carnes
Rhodotorula spp. Frutas tratadas trmicamente, nata, mantequilla, helado,

yogur, pan, carnes, marisco
Saccharomyces cerevisiae Refrescos, zumos de frutas, queso, yogur, pan
Saccharomyces exiguus Refrescos, carnes, marisco, chucrut
Schizosaccharomyces pombe Jarabes de azcar
Zygosaccharomyces bailii, Zumos concentrados y jarabes de fruta, vino, salsa de

Zygosaccharomyces bispo rus tomate, mayonesa, pan
Zygosaccharomyces rouxii Jarabes concentrados, zumos de fruta, rellenos de

pastelera, mazapn, ciruelas e higos, mayonesa, marisco
Modificado de Tudor y Board (1993>.
3
L- Introduccin
.2.- Alimentos altamente azucarados y microor2anismos osniotolerantes
Los productos altamente azucarados se incluyen dentro de un amplio grupo de

alimentos que se denominan de humedad intermedia, conocidos por sus siglas en ingls
como IMFs (Intermediate Moisture Foods) (Tilbury, 1976; Deak y Beuchat, 1996). Se
consideran alimentos de humedad intermedia a aqullos que poseen un contenido en agua
entre 15 y 20% y una a~ con valores entre 0,60 y 0,85. Este tnnino engloba a muchos
alimentos sometidos a la adicin de azcar o sal, secado o curado, tratamientos que
conducen a una mejor conservacin de los productos, debido al hecho bien conocido de que
disminuyendo la a~ mediante secado o adicin de solutos, se puede retardar e incluso
inhibir el crecimiento microbiano. La Tabla 2 muestra algunos grupos de alimentos
azucarados incluidos como alimentos de humedad intermedia atendiendo a las
caractersticas de humedad y a.~ previamente descritas.
Tabla 2.- Principales productos azucarados de humedad intermedia, junto con su

humedad y su actividad de agua
Actividad
Humedad
Tipo de producto Ejemplos de agua (av)
(% p/p)
Azcares, jarabes, Azcar sin refinar 0,4-0,7 0,60-0,75
conservas Jarabes de azcares;
azcar invertido 20-36 0,70-0,86
Miel, compota, mermelada 20-35 0,63-0,80
Concentrados de zumos Zumo de frambuesa 35 0,79-0,80
de frutas Zumo de naranja 35 0,80-0,84
Zumo de manzana 0,71-0,75
Productos de confitera Caramelos y toifees 8 0,60-0,65
y repostera Mazapn 15-17 0,67-0,80
Cerezas glaseadas 30 0,75
Pasteles de frutas 20-28 0,73-0,83
Chocolate Relleno de chocolate 0,64
Frutas desecadas Ciruelas, higos 20 0,68
Dtiles 12-25 0,60-0,65
- datos no especificados.
Modificado de Tilbury (1976), Jermini et al. (1987) y Tudor y Board (1993).
4
L Introduccin
-
En relacin con los valores consignados en esta tabla, se deduce que en los
alimentos de humedad intermedia no es posible, en trminos generales, el crecimiento
bacteriano, ya que ste se inhibe cuando la a~ se encuentra por debajo de 0,85 (Tilhury,
1976; ICMSF, 1991). Asimismo, la mayora de levaduras y mohos son tambin inhibidos
a estos valores de a,~, pero algunas especies pueden tolerar altas concentraciones de solutos
(El Halouat y Debevere, 1997).
Las levaduras resistentes a elevadas concentraciones de azcar se denominan, en

general, levaduras osniotolerantes. Para su definicin, se han utilizado diversos trminos
como osmofiicas osmotoflicas, osmotolerantes, osmotodricas, osmotrficas,
xeroflicas o xerotolerantes (Tilbury, 1976; Jermini a aL, 1987; Deak y Beuchat, 1996).
Sin embargo, el trmino levadura osmoflica se considera in?preciso segn algunos
autores, ya que estas cepas no requieren necesariamente para su supervivencia una baja ~
y la presin osmtica no es un factor fisiolgico de estas levaduras :(Tilbury, 1976; Jermini
et al., 1987; Deak y Beuchat, 1996). As, y aunque el trmino xerotolerantes propuesto
por Anand y Brown en 1968 se considera el ms adecuado, la denominacin ms frecuente
es la de levaduras osmotolerantes, reservndose el trmino xerotolerantes para especies de
hongos filamentosos capaces de crecer a baja a~.
De igual forma, se han propuesto diferentes clasificaciones de acuerdo con la

tolerancia a distintas concentraciones de azcar. Por ejemplo, Windisch et aL (1978a)
establecen las siguientes categoras: levaduras osmotolerantes, si crecen en 2 40% (p/v)
de glucosa; no osmotolerantes si crecen slo en 2% (plv) de glucosa; y osmoflicas si
crecen en 60% (p/v) de azcar. Recientemente, Taing ok y Hashinaga (1997) diferencian
tres tipos de levaduras de acuerdo con la tolerancia a distintas concentraciones de azcar:
de tolerancia fuerte, si no crecen bien en YMA (Yeast Morphology Agar, con 1% de
glucosa, ver Apndice 1) y su crecimiento es mximo en 30 40% (p/p) de glucosa; de
tolerancia moderada, si crecen bien en YMA as como en 10 20% de glucosa; y de
tolerancia dbil, si su crecimiento mximo es en YMA o en concentraciones de glucosa
menores del 10%, y el crecimiento disminuye a medida que se incrementa la concentracin
de azcar.
5
L Introduccin
-
El problema fundamental de la contaminacin por levaduras osmotolerantes de los

productos altamente azucarados no es sanitario, ya que entre stas no se encuentran
especies patgenas, sino que consiste en el deterioro 4e los mismos (Tilbury, 1976); as,
se han descrito alteraciones en alimentos como miel, zumos de frutas concentrados,
melazas, jarabes, mermeladas, productos de repostera, etc. (Golden. y Beuchat, 1990; Deak
y Beuchat, 1996; Talng ok y Hashinaga, 1997). De hecho, las levaduras causan con
frecuencia grandes prdidas econmicas en las industrias productras de estos alimentos.
La fermentacin de los productos ricos en azcar es la causa ms comn del deterioro
(Tudor y Board, 1993). Los productos que han sufrido este tipo de deterioro adquieren
turbidez (si son lquidos) y el contenido slido se reduce -efectq que se describir con
detalle en el apartado de Discusin-, apareciendo adems un intenso aroma alcohlico; si
el producto est contenido en algn recipiente hermticamente crrado, ste se hinchar
debido a la produccin de CO2 (Jermini et al., 1987; Fleet, 1992; El Halouat y Debevere,
1996). En estos alimentos, pueden desarrollarse poblaciones de levaduras de hasta l06~l09

clulas/g (Fleet, 1992). Ingram, ya en 1957, estableci que cualquier sustrato rico en azcar
invariablemente enriquece levaduras osmotolerantes a menos que se mantengan condiciones
de higiene muy estrictas (Tudor y Board, 1993). En la industria, adems de estas
condiciones de higiene, deben adoptarse controles de rutina tanto para materias primas
como durante el procesado del alimento, para detectar la contaminacin cuando sta se
encuentra todava en bajos niveles y evitar as el deterioro final de los productos (Jermini
et al., 1987).
La mayora de las levaduras osmotolerantes implicadas en el deterioro de productos

azucarados (a,,~ entre 0,80 y 0,85) pertenecen al gnero Zygosaccharomyces (Tokuoka e
Ishitani, 1991; Deak y Beuchat, 1996; El Halouaty Debevere, 1997). De entre ellas, la ms
frecuentemente aislada es Zygosaccharomyces rouxii, conocida por su tolerancia a elevadas
concentraciones de solutos, principalmente azcares, aunque tambin NaC (Onishi, 1963;
Restaino et aL, 1983; Golden y Beuchat, 1990; Fleet, 1992; Tudor y Board, 1993; El
Halouat y Debevere, 1996; Praphailong y Fleet, 1997). Algunas cepas del gnero
Zygosaccharomyces toleran una a~ de 0,65 (Tokuoka e Ishitani, 1991); cuando otras
condiciones extrnsecas son ptimas, Z. rouxii puede crecer a un valor de a.~ de 0,62
(Restaino a aL, 1983; ICMSF, 1991; Tokuoka e Ishitani, 1991), aunque la a~ ptima para
6
L- Introduccin
su crecimiento es de 0,95 (Deak y Beuchat, 1996). Otras especies de Zygosaccharornyces

son menos osmotolerantes y se aslan con menor frecuencia de alimentos azucarados. En
la Tabla 3 se han recogido adems otras levaduras aisladas de este tipo de productos.
Tabla 3.- Principales levaduras osmotolerantes asociadas con el deterioro de alimentos

altamente azucarados
Levadura MCG* (% p/p) Alimento

Zygosacharomyces rouxii 60 Miel, jarabes, zumos concentrados,
melazas, pasas; azcar, mazapn.
confitera
Zygosaccharomyces bailii 50 Concentrados de frutas, melazas,

frutas desecadas
Zygosaccharomyces bisporus 50 Mermelada, jarabes, azcar sin

refinar, melazas
Candida lactis-condensi 57 Fruta confitada, frutas desecadas,

azcar refinado
Torulaspora delbrueckii 75 Miel, fruta confitada, azcar sin
refinar, melazas, pasas
Debaryomyces hansenii 50 Mermelada, jarabe, azcar sin
refinar, confitera
Schizosaccharomyces 50 Miel, bombones, melazas, fruta
octosporus desecada
Schizosaccharomyces pombe 50 Pasas, azcar de caa, melazas
Pichia anomala 50 Mermelada, pasas, frutas desecadas,
confitera, melazas
* Mxima concentracin de glucosa tolerada para el crecimiento.
Adaptado de Tilbury (1976), Rose y Harrison (1993) y Deak y Beuchat (1996).
1.2.1- Adaptacin de las levaduras a altas concentraciones de azcar
Las elevadas concentraciones de solutos en el medio conducen a la plasmolisis

celular, recesin de la membrana citoplasmtica respecto de la pard celular, y una posible
7
L Introduccin
-
reduccin en el tamao de poro (Golden y Beuchat, 1992a). Por ejmplo, en cerevisiae,

la exposicin a condiciones hiperosmticas provoca una rpida reduccin en el volumen
interno celular debido al eflujo de agua (Myers a al., 1977), as como un incremento en
el grosor de la pared celular y la formacin de proyecciones irregulares de la membrana
hacia el citoplasma, cambios que revierten al ser cultivadas las c~lulas en medio lquido
con mayor (Golden y Beuchat, 1992a).
Las levaduras tolerantes a altas concentraciones de azcar presentan una serie de

propiedades fisiolgicas que les permiten la adaptacin y supervivenpia en tales condiciones
de reducida. La fundamental es su capacidad de acumular eh su interior alcoholes
polihidricos (polioles) como arabitol, manitol, arabinitol o glicen9 (Fleet, 1992; Deak y
Beuchat, 1996; Myers et aL, 1997; Praphailong y Fleet, 1997>. Estos polioles estn
implicados en la osmorregulacin, y funcionan como solutos compatibles, es decir,
sustancias que, acumuladas en niveles altos, protegen a las enzimas intracelulares frente a
la inhibicin e inactivacin provocados por el estrs o el choque osmticos (Brown y
Simpson, 1972). Al compensar la diferencia de presin osmtic a ambos lados de la
membrana, la capacidad metablica de estas levaduras no es afectada (Myers a aL, 1997).
S. cerevisiae tambin produce elevadas concentraciones de glicerol en respuesta a entornos
de baja ~pero es incapaz de retenerlo intracelularmente, y se acumula en el medio
extracelular. El proceso es energticamente desfavorable, restringiex1do la capacidad de esta
especie para tolerar entomos de muy baja ~por lo que en general no se la considera
osmotolerante (Fleet, 1992).
Las levaduras osmotolerantes, sin embargo, son capaces de sintetizar y retener

glicerol, incluso algunas poseen bombas para la captacin activa de glicerol del medio
(Myers et al., 1997). Esta concentracin intracelular de glicerol parece estar regulada por
la externa mediante una ATPasa de membrana (Deak y Beuchat, 1996). La acumulacin
de este polialcohol puede ser afectada por el tipo de soluto que provoca el descenso de a~
(Golden y Beuchat, 1992a), como sucede con la produccin de otro poliol, el D-arabitol,
por parte de Z rouxii, que es favorecida por elevadas concentraciqnes de glucosa pero no
de sacarosa (Golden y Beuchat, 1990; Tokuoka e Ishitani, 1991); esta especificidad de
soluto ser mencionada de nuevo ms adelante. La capacidad de produccin de polioles por
8
L Introduccin
-
Z rouxii y otras levaduras osmotolerantes puede ser aprovechada industrialmente para la

obtencin de glicerol, arabitol o eritritol (Windisch, 1969; Taing qk y Hashinaga, 1997).
Otros factores implicados en la resistencia a elevadas concentraciones de soluto son

la composicin alterada de la pared y membrana celulares (Praphailong et al., 1997). Puesto
que los polioles atraviesan con facilidad las membranas biolgicas, en presencia de baja a~
deben existir variaciones estructurales y/o funcionales en la mismas que les confiera menor
permeabilidad al glicerol (Hocking, 1993). Un posible mecanismo es un cambio en la
composicin de los fosfolipidos de la membrana, concretamente dl grado de insaturacin
de los cidos grasos, ya que a medida que aumenta este grado de insaturacin aumenta
tambin la fluidez de la membrana, y por tanto su penneabilidad. Por otra parte, la
composicin en esteroles tambin influye notablemente en la permeabilidad de la
membrana, de manera que la incorporacin de colesterol en las membranas las convierte
en menos permeables a pequeas molculas orgnicas como son los polioles. Aquellos
cambios en la composicin de la membrana que disminuyan la fluidez y permeabilidad de
la misma podran por tanto facilitar la acumulacin intracelular de polioles en los
microorganismos osmotolerantes (Hocking, 1993).
Restaino et al. (1983) sostienen que la a~ ptima para una levadura osmotolerante
est fuertemente influida por el preacondicionamiento, es decir,la exposicin previa y
continuada a elevadas concentraciones de azcar. En este sentido, Tokuoka e Ishitani
(1991) y Deak y Beuchat (1996) tambin afirman que la adaptaci al entorno afecta a la
osmotolerancia de las clulas de levadura, pues tras la preincubacin en presencia de
elevadas concentraciones de un azcar, las levaduras son capaces d crecer posteriormente
en medios con menor a.,, es decir, con mayor concentracin de este mismo azcar. Por
tanto, cabe de nuevo hacer mencin a la especificidad de soluto, no slo en el
preacondicionamiento, sino tambin en la supervivencia de las levaduras en medios con
muy baja ~As, Tokuoka e Ishitani (1991) encuentran que las clulas de levaduras de
diferentes especies sobrevivan incluso por debajo de la mnima para el crecimiento
cuando el medio contena sacarosa, aunque moran si tena glucosa o fructosa; asimismo,
la accin de la sacarosa disminua la mnima para el crecimiento tanto en cepas que
asimilaban la sacarosa como en las que no.
9
L Introduccin
-
1.3.- Los sorbatos como conservantes
El cido srbico o cido 2,4-hexadienoico (CH3-CH=CH-CH=CH-COOH) se incluye
dentro de un conjunto de compuestos ampliamente utilizados como antimicrobianos, cuyas

caractersticas comunes comprenden el ser cidos dbiles, de cadena corta y lipoflicos
(Sofos, 1989). Adems del cido srbico, se encuentran otros cids como el benzoico, el
actico y el propinico, entre otros, junto con sus sales. Las sales sdica, potsica y clcica
son mucho ms solubles que la forma cida, prcticamente insoluble en agua (Liewen y
Mart, 1985a; Sofos y Busta, 1993; Deak y Beuchat, 1996).
El cido srbico y sus sales, conocidos como sorbatos, se consideran fungistticos

porque sn eficaces principalmente frente a mohos y levaduras; la accin inhibitoria de los
sorbatos frente a bacterias es menos intensa, afecta a un menor nmero de especies y sus
mecanismos estn menos estudiados (Sofos, 1989).
Los cidos dbiles poseen la capacidad de penetrar en su forma protonada a travs

de la membrana celular; una vez en el citoplasma, que posee un pH cercano a la
neutralidad, se disocian, y la liberacin de protones provoca una acidificacin intracelular
(Warth, 1989; Cheng y Piper, 1994; Neves et aL, 1994; Deak ~ Beuchat, 1996). Esta
acidificacin intracelular es probablemente el aspecto ms significativo de la actividad
antimicrobiana de estos compuestos, ya que conducira a la detencin del crecimiento (Cole
y Keenan, 1987; Neves a al., 1994; Holyoak et al., 1996).
La actividad antimicrobiana del sorbato depende pues de la presencia del cido sin
disociar (Skirdal y Eklund, 1993; Wind y Restaino, 1995; Deak y Beuchat, 1996; Malfeito
Ferreira et aL, 1997a), forma capaz de atravesar la membrana plasmtica. Una vez en el
citosol, la disociacin requiere que el pH intracelular sea superior al externo, de ah que
la accin del cido srbico sea dependiente del pH del medio (Liewen y Marth, 1985a;
Sofos, 1989; Kinderlerer y Hatton, 1990; Deak et aL, 1992). Tanto la penetracin del cido
en la clula como la inhibicin del crecimiento aumentan con la acidificacin del medio
(Tilbury, 1976; Sofos, 1989; Cheng y Piper, 1994; Praphailong y Fleet, 1996), segn el pH
lo
1.- Introduccin
se aproxima a la constante de disociacin del cido: pK~ = pH 4,76, valor al cual el 50%
del cido srbico est en su forma sin disociar (Liewen y Marth, 1985a; Sofos, 1989). A
pH muy bajo, se necesitan concentraciones muy bajas de sorbato para inhibir a los
microorganismos. Segn refieren Liewen y Marth (1985a), el lmite superior de pH para
la actividad antimicrobiana del sorbato es de 6,0-6,5.
A pesar de que se considera que el efecto antimicrobiano del sorbato depende de

la molcula sin disociar, la forma aninica puede contribuir hasta cierto grado a la
inhibicin (Neves et aL, 1994; Deak y Beuchat, 1996; El Halouat y Debevere, 1996).
Eklund (1983), mediante un modelo matemtico, concluy que el cido disociado tena
efecto inhibitorio, aunque 10-600 veces menor que el de la forma sin disociar, y Sofos y
Busta (1993) calculan, para el sorbato potsico, un potencial antimicrobiano del 74%
respecto al cido srbico; a valores de pH por encima de 6,0, ms del 50% de la inhibicin
del crecimiento correspondera a la forma disociada. En Candida vlida, aproximadamente
la misma concentracin de cido srbico sin disociar, junto con una elevada proporcin de
anin sorbato, era ms inhibitoria que el cido srbico presente principalmente en su forma
sin disociar (Deak et al., 1992). Tambin se ha demostrado actividad antimicrobiana de la
forma disociada, dependiendo del microorganismo, en Candida albicans, y en ciertas
especies de bacterias -Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli- y de mohos -Peicillium chrvsogenurn.
Cladosporium cladosporloides y Ulocladium atrum- (Skirdal y Eklund, 1993).
A valores de pH por encima de 6,0, la acidificacin en el i~iterior celular no puede

explicar la inhibicin del crecimiento, por lo que debe estar implicado ms de un
mecanismo de inhibicin (Liewen y Marth, 1985a; Sofos, 1989).
1.3.1.- Mecanismos de actividad antimicrobiana del sorbato
No se conocen con certeza los mecanismos implicados en la inhibicin del

crecimiento provocada por los cidos dbiles, y se considera que debe haber ms de uno.
Algunos efectos sern debidos a la acidificacin del citoplasma, que interfiere con procesos
metablicos, y otros se relacionarn con las propiedades estructurales de los conservantes.
11
1.- Introduccin
El mecanismo global de inhibicin puede adems diferir en bacterias, mohos y

levaduras (Liewen y Marth, 1985a). As, el efecto inhibitorio del sorbato sobre las bacterias
parece residir en la prolongacin de la fase de latencia por retraso en el comienzo de la
fase de crecimiento logartmico, sin influencia apreciable sobre la tasa de crecimiento
(Sofos, 1989). En mohos, y especialmente en levaduras, los efectos del sorbato estudiados,
revisados por Liewen y Marth (1985a), Sofos (1989), Sofos y Busta (1993) y Deak y
Beuchat (1996) son los siguientes:
1.3.1.1- Alteraciones morfolgicas como variaciones en el tamao y forma celulares,

aparicin de ncleos irregulares, y mitocondrias desorganizadas en mayor nmero y de
distintos tamaos (Kinderlerer y Hatton, 1990; Golden y Beuchat, 1992a).
1.3.1.2.- Alteraciones en la funcin metablica
A) Inhibicin de sistemas enzimticos, fundamentalmente los implicados en el

metabolismo de la fuente de carbono (Kinderlerer y Hatton, 1990; Golden y Beuchat,
1992a; Burlini a aL, 1993; Cheng y Piper, 1994).
El cido srbico tambin podra desacoplar la fosforilacin oxidativa en la

mitocondria, inhibiendo enzimas celulares (Kinderlerer y Hatton, 1990).
B) Funcin de transporte, inhibiendo el transporte de sustratos a travs de la

membrana celular -azcares, aminocidos, etc.- y el transporte electrnico en la mitocondria
(Kinderlerer y Hatton, 1990; Warth, 1991a; Golden y Beuchat, 1992a), lo que detendra el
crecimiento celular.
Esta inhibicin del transporte podra afectar directamente a enzimas de transporte

(por ejemplo aminocido permeasas), o ser consecuencia de otros fenmenos:
- Disminucin en los niveles de ATP, debido a que la bomba Na~/H~, que se activa
cuando el cido srbico se disocia en el interior celular para intentar mantener el pH
interno, funciona a expensas de la hidrlisis de ATP (Sofos, 1989; Warth, 1991a y b). La
12
L introduccin
-
disminucin en los niveles de ATP sera responsable de la inhibicin en la captacin de

nutrientes. Sin embargo, Burlini et aL (1993) no encuentran descenso en los niveles de ATP
tras la preincubacin de S. cerevisiae en presencia de sorbato y benzoato.
- Neutralizacin de la fuerza protomotriz (FPM), necesaria para el transporte activo

de compuestos como aminocidos y cetocidos. De los dos componentes de la PMF, el
gradiente de protones transmembrana (ApH) y el potencial elctric (~@), la disociacin de
los cidos dbiles en el citosol provoca la disipacin del primero (Eklund, 1980, 1985;
Ronning y Frank, 1987; Stratford y Anslow, 1996).
Segn Eklund (1980, 1985), el paso limitante en la liberacin de protones en el

interior de la clula es la velocidad a la que el cido disociado, cargdo negativamente, sale
al exterior para captar otro protn del entorno de bajo pH y transportarlo al interior celular,
disminuyendo el pH interno y disipando la FPM de la membrana. El cido sin disociar
actuara como un protonforo (Ronning y Frank, 1987). Debido a que Eklund encontr
inhibicin a pH neutro, se ha concluido que la inhibicin tiene dos omponentes, un efecto
inhibitorio especfico de la forma sin disociar sobre la funcin metablica debido a su
estructura (mediante interacciones, enlaces covalentes, etc.), y otro ms general debido a
la acidificacin del citoplasma (Sofos, 1989).
Por ltimo, Ronning y Frank (1987) concluyeron que la actividad como protonforo
del cido srbico induca en bacterias una respuesta reguladora tipo astringente (stryngent
response) responsable de la inhibicin del crecimiento; la concentracin limitante de uno
o ms aminocidos origina el cese de la replicacin celular aunque la clula permanece
viable, estado que revierte cuando la cantidad de aminocidos deja de ser limitante.
Confirmada la idea de que el cido srbico acta sobre la membrana y bloquea la captacin
de aminocidos (Eklund, 1983) por alteracin en la FPM por la actividad protonfora del
cido srbico, se producir una respuesta astringente expresada como inhibicin del
crecimiento. Como este sistema de regulacin afecta a diversas rutas metablicas, el
mecanismo de la respuesta astringente explicara la inhibicin pot sorbato de numerosos
sistemas enzimticos (Sofos, 1989).
13
L- Introduccin
1.3.2.- Resistencia de los microorganismos al sorbato
A pesar de la presencia de conservantes, la preservacin de los alimentos no est

garantizada. En primer lugar, son generalmente inefectivos cuando los niveles de
microorganismos contaminantes son elevados (Kinderlerer y Hatton, 1990); en segundo
lugar, existen microorganismos resistentes a los niveles mxims permitidos de estos
conservantes (Tilbury, 1976; Holyoak etal., 1996), incluso capaces de metabolizarlos como
fuente de carbono (Liewen y Marth, 1985a; Kinderlerer y Hatton, 1990). En este apartado,
aunque se refiere especficamente al sorbato, hay que mencionar que los mecanismos
generales de resistencia se consideran comunes para el grupo de cidos dbiles de cadena
corta.
La sensibilidad a la inhibicin por sorbato es variable dependiendo de la cepa y

especie de microorganismo. Entre bacterias, Staphylococcus spp., Pse udomonas spp. y
Sireptococcus spp. son ms resistentes a la inhibicin que otras especies bacterianas como
E. coli, Aerobacter aerogenes y Clostridium perfringens. En general, 5. aureus es mas
resistente al sorbato que otras bacterias, mientras que Clostridium bbtulinum es fuertemente
inhibida (Sofos, 1989).
Por su parte, algunos hongos pertenecientes al gnero Penicillium son tambin

extraordinariamente resistentes al sorbato ya que, como sucede dentro de las bacterias
lcticas, son capaces de degradar el sorbato (Skirdal y Eklund, 1993), a travs de ciertos
mecanismos que sern descritos en el Apartado V.5 de Discusin.
La adaptacin a los conservantes parece ser comn en las especies de levadura

(Warth, 1988; Piper et al., 1995). En general, las levaduras ms resistentes a los
conservantes son, adems, osmotolerantes (Deak y Beuchat, 1996); as, hay especies del
gnero Zygosaccharomyces conocidas por su resistencia a concentraciones relativamente
elevadas de cidos dbiles de cadena corta empleados como conservantes, que incluyen al
cido srbico (Cole y Keenan, 1987; Neves et aL, 1994). Entre dichas especies, cabe
destacar a Z. bailii (Warth, 1977; Deak et aL, 1992; Holyoak et al., 1996) y Z rouxii (Bilis
14
L Introduccin
-
ea aL, 1982; Restaino ea al., 1982 y 1983; Golden y Beuchat, 1992a y b); esta ltima,
debido adems a su tolerancia a concentraciones extremadamente elevadas de azcar y sal,
supone un importante riesgo para la conservacin de los alimentos de humedad intermedia
(Golden y Beuchat, 1990, 1992a y b).
Otras levaduras conocidas por su resistencia al sorbato son la especie Issatchenkia

orientalis y algunas cepas pertenecientes a los gneros Saccharomyces, Rreatanomyces,
Candida o Trigonopsis (Sofos, 1989; Deak ea al., 1992; Fleet, 1992; Sofos y Busta, 1993).
Sin embargo, es importante mencionar que existe una considerable variabilidad en la
resistencia de cepas individuales a estos cidos dbiles (Kinderlerer y Hatton, 1990).
Un factor fundamental en la resistencia al sorbato es la expsicin previa y repetida

al sorbato o preacondicionamiento (Sofos, 1989; Deak a aL, 1992; Sofos y Busta, 1993;
Deak y Beuchat, 1996). Segn Warth (1988), el fenmeno de la adaptacin celular se
manifiesta por un incremento en la tolerancia a un agente antimicrobiano debido al
crecimiento previo en su presencia, permitiendo de esta forma a las levaduras crecer en
presencia de concentraciones crecientes de cido srbico.
La mxima concentracin de conservante que una levadura puede tolerar puede estar
determinada por la velocidad con la que la molcula entra en la clula y la capacidad de
la clula para eliminarlo. Las levaduras resistentes al sorbato poseen generalmente una tasa
ms baja de captacin de conservantes, por lo que la permeabilidad de la membrana a los
mismos, debido a diferencias en la composicin de cidos grasos, puede estar implicada
en la tolerancia (Deak y Beuchat, 1996).
Si los cidos dbiles penetran en la clula desde un entorno extracelular ms cido

y se disocian en el citoplasma, la capacidad de las levaduras para tolerar elevadas
concentraciones de cidos dbiles implicar ciertos mecanismos que permitan exportar -
bombear- los protones y aniones que se acumulan intracelularmente (Praphailong y Fleet,

1997). Uno de estos mecanismos es la induccin de un sistema de transporte que elimine
tanto los protones como los aniones para mantener un pH intracelular adecuado (El Halouat
y Devebere, 1996); esta regulacin del pH puede ser el resultado de la modulacin de la
15
L- Introduccin
sntesis y actividad de la ATPasa responsable del bombeo de protones (Neves eral., 1994;
Piper ea aL, 1995). En el caso del cido benzoico, Warth (1988) postula que la disminucin
de la concentracin intracelular del anin y el mantenimiento de un pH cercano a la
neutralidad requiere un gasto continuo de energa. La mayor parte se invierte en la
extrusin de los protones liberados en la disociacin intracelular del cido, mientras que
la extrusin del anin probablemente no requiere energa adicional. La energa necesaria
para reducir la concentracin de conservante y mantener el pH interno no puede ser
empleada por tanto para el crecimiento, lo que conleva una disminucin en la tasa de
crecimiento de la levadura (Warth, 1988; Neves ea aL, 1994; El Hal9uat y Devebere, 1996).
La cesacin total del crecimiento tiene lugar cuando la capacidad de los sistemas celulares
para compensar la entrada de cido benzoico sin disociar es excedida (Warth, 1988).
El mecanismo de resistencia en Z bailii, descrito por primera vez por Warth en

1977, sera un sistema inducible, que requiere energa obtenida a partir de un sustrato como
glucosa (es por tanto un transporte activo), y que bombea las molculas de cido sin
disociar fuera de la clula, manteniendo as elevado el pH intracelular. Este mecanismo de
resistencia es un determinante general y el ms importante para la tcilerancia a conservantes
de las levaduras (Warth, 1989). Las clulas de Z bailii, en ausencia de fuente de energa,
acumulan los conservantes intracelularmente, mientras que en presencia de glucosa se
reduce el contenido intracelular de los mismos. As, y de acuerdo cn el modelo propuesto
por Warth, la respiracin aerobia del azcar podra proporcionar la energa necesaria para
bombear el conservante al exterior (Restaino mt aL, 1983). Asimismo, tanto en Z. bailii
como en 5. cerevisiae, las concentraciones subletales de cido benzoico podran estimular
la tasa de fermentacin para que las clulas obtengan la energa necesaria para bombear los
protones y mantener el pH intracelular (Warth, 1991a y b). Por ltixno, se ha postulado que
el incremento de la extrusin de protones catalizada por la ATPasa de membrana y el
volumen disminuido del protoplasma contribuye indudablemente a mantener el pH interno
en las clulas de Z bailii adaptadas al crecimiento en presencia de cidos dbiles (Cole y
Keenan, 1987; Cheng y Piper, 1994).
Cole y Keenan (1987), sin embargo, no encontraron evidencia de extrusin activa

de los cidos dbiles. Los valores de pH intracelular, medidos en clulas de Z. baiii que
16
L Introduccin
-
crecen en presencia de cido benzoico, fueron de 4,85-5,55, frente al valor normal de 5,8
referido por Warth (1991b). Esto hace pensar a los autores que esta levadura posee la
capacidad de tolerar reducciones continuadas de su pH interno. Tambin sugieren, en lugar
del sistema de bombeo de conservante descrito por Warth, que las clulas de Z. bailii
adaptadas incrementan su capacidad tampn citoplasmtica y secretan cidos orgnicos
producidos durante el metabolismo normal.
Por otra parte, Piper et al. (1995) encontraron en 5. cerevisiae dos protenas de
membrana que eran fuertemente inducidas por sorbato: una ms pequea, que se induce
tambin bajo otros tipos de estrs -choque trmico, etanol, pvaci de nutrientes-, y otra
desconocida, similar en tamao a una protena de membrana, tambin inducida por sorbato,
que se ha encontrado en Z. bailii.
Puesto que el incremento en la actividad de la ATPasa de membrana es

energticamente costoso, casi con seguridad debe haber otros mecarnsmos, incluso algunos
todava desconocidos, de tolerancia a los cidos dbiles (Piper mt al, 1995). Las diferencias
en esta tolerancia entre especies se deberan, adems de la capacidad para eliminar el
conservante y los protones, a diferencias en la tasa de penetracin del cido sin disociar en
las clulas o a una sensibilidad intrnseca caracterstica al conservante o a su anin (Warth,
1988, 1991a; El Halouat y Devebere, 1996). Por su parte, Piper a al. (1995) deducen de
sus experiencias que la protena de menor tamao inducida en 5. cerevisiae en presencia
de sorbato acta como un regulador negativo de la H~-ATPasa que provocara el descenso
en la actividad de la misma despus de que otros mecanismos de tolerancia a los cidos
dbiles se hayan activado.
Se ha descrito que el nivel de del medio puede incrementar o disminuir la

tolerancia de las levaduras al sorbato, y an no existen estudios concluyentes que
clarifiquen las observaciones discrepantes (Fleet, 1992). Por una parte, Restaino a al.
(1982) refieren que, a medida que los niveles de descienden respecto del ptimo para
Z rouxii y Z. bailii, el cido srbico y el benzoico son ms efectivos; de la misma manera,
Liewen y Mart (1985a) y Sofos (1989) indican que la sal (NaC) y el azcar intensifican
la accin del sorbato por reduccin de la a~. Por el contrario, Restaino ea aL (1983),
17
L Introduccin
-
Golden y Beuchat (1992b) y Deak y Beuchat (1996) describen que 2? rouxii puede tolerar
concentraciones crecientes de sorbato potsico a niveles de decrecientes.
Esta capacidad de crecer en medios con sorbato depende no slo de la del

sustrato, sino tambin del tipo de soluto que disminuye la (Golden y Beuchat, 1992b).
As, las clulas crecidas en un medio con sacarosa toleran mayores concentraciones de
sorbato que aqullas crecidas en glucosa. En presencia de elevadas concentraciones de
azcar, las clulas poseen componentes de la pared celular y ljdos de la membrana
modificados que pueden variar por tanto las caractersticas de permeabilidad, influyendo
as notablemente en la tolerancia de 2? rousii al sorbato (Golden y Beuchat, 1992a). Para
Z. rouxii se ha postulado adems que, a baja ~
las clulas se encogen y el tamao de poro
de la membrana disminuye (Golden y Beuchat, 1992a y b), lo que puede retardar el flujo
de sorbato al interior de la clula (Restaino et aL, 1983; Sofos, 1989; Sofos y Busta, 1993;
Deaik y Beuchat, 1996). Este efecto se combinara con el sistema inducible de transporte
activo, bombeando el poco sorbato que entre (Warth, 1977; Sofos, 1989; Sofos y Busta.
1993; Deak y Beuchat, 1996). A valores ms altos de ~la resistencia de Z. rouxii al
sorbato podra atribuirse al sistema inducible, que requiere la energa suministrada por la
oxidacin de la glucosa para bombear el conservante fuera de las clulas (Bils mt al.,
1982).
La produccin de polioles como solutos compatibles por Z. rouxii en medios con

a~ disminuida podra tambin estar involucrada en la resistencia al sorbato, protegiendo a
las enzimas de la inhibicin o inactivacin por algunos agentes antimicrobianos (Restaino
a al., 1983; Sofos y Busta, 1993).
No hay informacin sobre los productos finales secundarios producidos por las
levaduras cuando crecen en presencia de conservantes como sorbato o benzoato, aunque
en estas condiciones parece que producen cantidades anormalmenteelevadas de CO2 (Fleet,
1992), lo que puede deberse a que la fermentacin es estimulada por concentraciones

subinhibitorias de los conservantes (Sofos, 1989; Warth, 1989, 1991a y b).
18
L Introduccin
-
1.3.3.- Aplicaciones
El cido srbico y sus sales, fundamentalmente sorbato potsico, se utilizan a nivel

industrial como conservantes alimentarios. Sus principales ventajas frente a otros
conservantes son su actividad en medios poco cidos, el carecer ptcticamente de sabor y
su baja toxicidad (Lueck, 1990; Calvo, 1991). En el organismo, estos compuestos son
metabolizados como los dems cidos grasos, es decir, una vez absorbidos sufren una
oxidacin para rendir CO2, H20 y cido actico como productos finales, as como cierta
cantidad de caloras como cualquier fuente energtica (Sofos, 1989).
Los principales grupos de alimentos en los que los sorbatos se aplican como
conservantes, especialmente frente a mohos y levaduras, son los productos lcteos,
productos de panadera, pastelera y confitera, frutas y verdufas, emulsiones grasas
(mantequilla, margarina, mayonesa), alimentos azucarados, carnes y pescados y vinos
(Finol ea aL, 1982; Sofos, 1989; Lueck, 1990; Sofos y Busta, 1993).
Los mtodos de aplicacin incluyen adicin directa en la fabricacin, vaporizacin

o inmersin del alimento en una solucin acuosa, espolvoreado o tratamiento del envase
(Sofos y Busta, 1993). Dependiendo del mtodo de aplicacin, as como de la naturaleza
del alimento, se selecionar la forma del sorbato a emplear. Para alimentos lquidos (zumos,
bebidas refrescantes, jarabes, etc.), o cuando se desea aplicar el conservante en forma de
solucin para vaporizacin o inmersin (quesos, frutas desecadas, etc.), se emplear la sal
potsica, muy soluble en agua, mientras que la adicin directa en la fabricacin de
alimentos como productos de panadera y confitera o verduras se suele realizar en la forma
cida (Sofos, 1989; Lueck, 1990).
Dependiendo de la legislacin de cada pas, se establecen unos lmites legales

mximos; en general, las concentraciones de sorbato empleadas oscilan entre 0,2 y 3 gIL
(Liewen y Marth, 1985a; Sofos y Busta, 1993). En Espaa, los lmites autorizados para la
adicin de sorbato en algunos alimentos son los siguientes: 600 mg/L en bebidas
refrescantes; hasta 2 gIKg en repostera, pastelera y galletas; 11,5 g/Kg en derivados
19
L Introduccin
-
crnicos, 1 g/Kg en quesos, aceitunas en conserva, postres lcteos con frutas, mantequilla.
margarina y mermelada; y mximo 0,2 gIL en la industria de fabricacin de vino, como
inhibidor de la fermentacin secundaria (Calvo, 1991).
1.4.- Identificacin de levaduras
La identificacin de levaduras se ha llevado a cabo tradicionalmente mediante

tcnicas microbiolgicas convencionales que tienen en cuenta las caractersticas fisiolgicas,
bioqumicas y morfolgicas de las cepas (Kreger van Rij, 1984; Barnett et aL, 1990;
Kurtzman, 1994; Deak y Beuchat, 1996; Kurtzman y Feil, 1998). Los procedimientos
tradicionales incluyen diversas pruebas para determinar la capacidad de la levadura de
fermentar azcares y asimilarnumerosos compuestos carbonados y nitrogenados. Asimismo,
estos procedimientos conceden una gran importancia a la morfologa celular y el tipo de
reproduccin sexual. Una vez que se han determinado los caracteres fisiolgicos y
morfolgicos necesarios, la levadura puede identificarse mediante claves basadas en la
descripcin de especies conocidas (DeaR y Beuchat, 1996).
La laboriosidad de los mtodos tradicionales ha conducido con posterioridad a

formas alternativas simplificadas y ms rpidas de los mismos, como son los kias
comerciales. stos presentan, en la mayora de los casos, el inconveniente de incluir pocas
pruebas fisiolgicas y bioqumicas, y/o estar orientadas a levaduras de inters clnico, por
lo que levaduras relacionadas con la industria alimentaria, tanto beneficiosas como
contaminantes, suelen ser identificadas incorrectamente (Barnett a al., 1990; Deak y
Beuchat, 1996).
Ms recientemente, se ha ensayado la realizacin de las mismas pruebas

bioqumicas, fisiolgicas y morfolgicas convencionales empleando placas multipocillo en
vez de tubo, con el consiguiente ahorro de medios de cultivo y de tiempo de preparacin
e inoculacin de los mismos (Heard y Fleet, 1990; Deak y Beuchat, 1996).
Tambin se han intentado desarrollar mtodos rpidos de identificacin, como las

tcnicas basadas en reacciones enzimticas empleando sustratos cromognicos (Deak y
20
L Introduccin
-
Beuchat, 1996) y el llamado SIM (Simplifled Identification Method). que es una clave
simplificada que recoge las caractersticas fisiolgicas, morfolgicas y bioqumicas que
distinguen a las levaduras ms comnmente asociadas al deterior de alimentos. El SIM
fue desarrollado originalmente por Deak en 1986 y ha sido modificado en sucesivas
ocasiones (Deak y Beuchat, 1996>.
El anlisis bioqumico de determinados componentes celulares posee utilidad en

taxonoma y puede ser empleado tambin como mtodo de identificacin de levaduras.
Entre otros, cabe citar la quimiotaxonoma basada en la composicin en lpidos totales de
la clula (Pea y Sandra, 1995; Deak y Beuchat, 1996; Noronha-da-Costa, 1996) y de los
polisacridos de la pared celular y extracelulares (Phaff, 1998; Roeijmans ea al., 1998), la
identificacin de las ubiquinonas (Yamada, 1998) o la comparacin electrofortica de
protenas y enzimas (Poncet et al., 1992; Deak y Beuchat, 1996; Yamakazi et al., 1998).
Como ejemplo, el anlisis de los cidos grasos mediante Cromatografa de Gases

se ha utilizado para diferenciar levaduras que producen deterioro en vinos (Malfeito-
Ferreira ea al., 1989, 1997b), o para caracterizar levaduras asociadas a la industria cervecera
(Oosthuizen et al., 1987; Moreira da Silva et aL, 1994) y vincola~ (Tredoux ea al., 1987a
y b). As, esta tcnica puede resultar muy til por su aplicacin industrial para
identificacin de levaduras (Botha y Kock, 1993); de hecho, se ha comercializado un
sistema de identificacin de bacterias y levaduras, el MIDI, basado en el perfil de cidos
grasos (Deak y Beuchat, 1996).
Por otra parte, la utilizacin de tcnicas de Gentica Molecular en la identificacin

de levaduras tuvo sus comienzos en el estudio de la complementa4edad del ADN nuclear.
Algunas cepas definidas como coespecificas mediante la medida de similitud de ADN
mostraban sin embargo diferencias en la fermentacin de glucosa, la asimilacin de nitrato
o la formacin de pseudomicelio y micelio verdadero, caracteres fenotpicos fundamentales
para los sistemas tradicionales de clasificacin. As, la aplicacin de comparaciones
moleculares ofrece una novedosa oportunidad de reevaluar squemas taxonmicos
tradicionales desde la perspectiva de las diferencias genticas cuantitativas. Por ejemplo,
el gnero Torulopsis -ausencia de pseudomicelio- se convirti en sinnimo de Candida -
21
L nrroduccin
-
presencia de pseudomicelio-, y Hansenula -asimilacin de nitrato- se convirti en sinnimo

de Pichia -incapacidad de asimilar nitrato- (Kurtzman, 1994).
Actualmente, los mtodos moleculares han evolucionado hacia procedimientos que

proporcionen un nico perfil de ADN de un determinado organismo, lo que se conoce
como caracterizacin de ADN o DNA flngerprinaing. La utilidad d estas tcnicas (Trk
et aL, 1993; Kurtzman, 1998) se ve reforzada por el uso de estrategias como la
amplificacin del ADN mediante PCR (Polymerase Chain Reaction, reaccin en cadena de
la polimerasa), que posibilita la deteccin de microorganismos en muy bajo nmero, y el
diseo de sondas especificas de ADN (Deak y Beuchat, 1996). La caracterizacin de ADN
se ha utilizado en alimentos, por ejemplo, como complemento a laidentificacin rutinaria
de levaduras contaminantes, para discriminar entre cepas individuales dentro de una misma
especie (Baleiras-Couto et al., 1994, 1995, 1997; van der Vossen y Hofstra, 1996).
Una de estas tcnicas de caracterizacin de ADN se basa en el anlisis de los

fragmentos de ADN obtenidos por tratamiento con endonucleasas de restriccin. El
polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin (Restriction Fragrnenr Length
Polimorphism, R?FLP) puede incluso identificar cepas dentro de una misma especie
(Barberio et aL, 1994), y se ha utilizado para diferenciar cepas individuales de levaduras
de panadera, cerveceras y vnicas (Deak y Beuchat, 1996). Comprando los resultados de
los patrones de RFLP con los de los de los perfiles de cidos grasos y el cariotipo -
determinacin del nmero y tamao de los cromosomas-, se concluye que el primero

proporciona el mtodo ms fiable para caractenzar cepas de levadura vnicas (Deak y
Beuchat, 1996).
Una variacin del anlisis de RFLP es el anlisis de restriccin del ADN

mitocondrial (ADNmt). Este anlisis presenta la ventaja de que, al tratarse de un ADN con
un tamao unas 200 veces menor, se generan menos fragmentos de restriccin, por lo que
la complejidad del anlisis es menor (Deak y Beuchat, 1996). Un de sus aplicaciones en
alimentos es el control de las fermentaciones vnicas, ya que permite caracterizar la cepa
de 5. cerevisiae inoculada en forma de levadura seca activa y distinguirla de las cepas
naturales presentes durante las primeras etapas (Querol mt aL, 1992a y b). Mediante este
22
L Introduccin
-
tipo de anlisis basados en el polimorfismo a nivel de ADN, tanto nuclear como

mitocondrial, se puede seleccionar una cepa de 5. cerevisiae capaz de producir vinos de alta
calidad como resultado de fermentaciones controladas (Querol et aL, 1992b y c).
De la misma manera, se ha abordado el estudio de las comparaciones de ARN

ribosmico (ARNr) y de su ADN molde (ADNr), mediante anlisis de reasociacin, RFLP
y secuenciacin (White et aL, 1990; Kurtzman, 1994; Kurtzman y Blanz, 1998). Tales
tcnicas se han aplicado al estudio sistemtico de levaduras pertenecientes a los
ascomicetos y basidiomicetos (Kurtzman, 1993; Cai et aL, 1996; Kurtzman y Blanz, 1998;
Esteve-Zardoso ea aL, 1999). Como ejemplos de levaduras contaminantes de alimentos en
que se han utilizado estos mtodos, cabe mencionar los estudios acerca de las
interrelaciones entre especies del gnero Zygosaccharomyces, su diferenciacin entre s y
con especies muy cercanas filogenticamente del gnero Torulaspora (James et al., 1994,
1996), Saccharomyces (James, 1997) o Kluyveromyces (Cai, 1997; Belloch, 1998).
1.4.1.- Esporulacin
Dentro de los caracteres morfolgicos que se consideran a la hora de identificar

levaduras, la observacin de esporas sexuales es especialmente importante, en particular
cuando la identificacin se lleva a cabo mediante una clave dicotmica. Sin embargo, esta
observacin de esporas sexuales suele ser problemtica, ya que existen cepas de levaduras
que esporulan con dificultad, incluso en muchas ocasiones no se consigue la deteccin del
estado perfecto an cuando la levadura haya sido identificada, mediante otros caracteres
morfolgicos y fisiolgicos, dentro de una especie que posee dicho estado. El estado
perfecto o teleomorfo corresponde a la forma sexual, mientras que se denomina estado
imperfecto o anamorfo al estado asexual (van der Walt, 1987). Ambos estados, sexual y
asexual, reciben diferentes nombres, pero la identificacin de una levadura suele hacer
referencia al nombre del estado perfecto, que es el que recogen las principales claves de
identificacin (Davenport, 1981). an cuando no se hayan observado esporas. En general,
la deteccin del estado sexual y las esporas requiere la observacin microscpica de clulas
crecidas en diferentes medios de esporulacin durante perodos va4ables de tiempo (Deak
y Beuchat, 1996).
23
L- Introduccin
Las levaduras, en funcin del tipo de estructuras elaboradas que desarrollen para su
reproduccin sexual, se agrupan en:
- Ascomicetos: forman ascas como estructuras reproductivas con esporas en su
interior.
- Basidiomicetos: forman basidios, que son estructuras ms elaboradas que las
ascas, para su reproduccin, en los que las esporas son exgenas.
Existe un tercer grupo de levaduras que no poseen reproduccin sexual y se

denominan deuteromicetos.
Las clulas de levadura que contienen ascosporas se distinguen de las clulas

vegetativas por la presencia de corpsculos firmes de formas definidas, en un nmero
generalmente entre una y cuatro, y que pueden tener paredes gruesas, lisas, rugosas. etc.
y formas diversas (Davenport, 1981; Deak y Beuchat, 1996).
En los ascomicetos, se puede formar el asca en el medio de esporulacin por un

cambio en la clula vegetativa, o la esporulacin puede ser precedida por conjugacin de
dos clulas o de una clula con una yema que se fusionan y se convierten en un zigoto
donde se produce la fusin nuclear (Kreger-van Rij, 1987; Deak y Beuchat, 1996).
Uno de los factores que controlan la esporulacin es la existencia del locus MAT,
que en S. cerevisiae se encuentra en el cromosoma III, con dos posibles alelos, a y a, lo
que determina la existencia a su vez de dos inating-type, a y a. La esporulacin tiene lugar
normalmente en clulas diploides heterozigticas de genotipo MAT CL/MAT a (Freese mt
aL, 1982; Miller, 1989; Suizu et al., 1995). Cuando es necesaria la conjugacin de dos
clulas haploides, cada una debe ser de un mating-type.
Si las esporas se forman a partir de una clula haploide tras su diploidizacin, se

dice que la levadura es bomotlica; cuando es necesaria una combinacin de clulas de
distinto mating-type, es decir, a y a, para la esporulacin, la levadura es beterotlica
(Kreger-van Rij, 1987; Deak y Beuchat, 1996).
24
L Introduccin
-
La formacin de ascosporas en levaduras es uno de los dos programas de desarrollo

que puede seguir la clula (Miller, 1989; Codn a al., 1995), dependiendo de las
condiciones del entorno. En condiciones favorables para el desarrollo celular, la gemacin
es la forma de reproduccin ms frecuente, pero en condiciones adversas, como el
agotamiento del medio y la entrada en fase estacionaria del cultivo, algunas clulas pueden
presentar la capacidad de esporular (Bermejo. 1989). As, en un medio completo, el ncleo
diploide sufrir una mitosis que precede a la gemacin de la clula, mientras que en
condiciones de limitacin de nutrientes se produce la meiosis (Freese et al., 1982; Miller,
1989; Codn et aL, 1995; Suizu a al., 1995), seguida normalmente de la produccin de
ascosporas. El programa meitico es en esencia una modificacin de un programa mittico,
en que las clulas siguen inducidas generalmente por la escasez de nutrientes en el medio
(Wheals, 1987).
El procedimiento para inducir la esporulacin consta de ds etapas: en la primera

de ellas se cultiva la levadura en un medio de preesporulacin, que es un medio rico en
fuente de carbono (glucosa) y con suficiente fuente de nitrge~o, para conseguir un
crecimiento vegetativo abundante. A continuacin, las clulas se transfieren a un medio
pobre en glucosa, el cual constituye el medio de esporulacin (Bermejo, 1989; Miller,
1989; Codn et al., 1995), ya que en estas condiciones adversas de crecimiento es mas
probable que las clulas de levadura esporulen.
Adems de la limitacin de fuente de carbono metabolizable, en la induccin de la

esporulacin influyen otros factores como la temperatura de incubacin, la presencia de
oxgeno o la composicin y pH del medio. La formacin de ascosporas se favorece con la
incubacin a 50C por debajo de la temperatura ptima para el crecimiento vegetativo, como
se ha comprobado en Debaryomyces hansenii (van der Walt y Yarow, 1984) o
cerevisiae (Codn et aL, 1995). Asimismo, la amplia disponibilidad de oxgeno favorece
la esporulacin, mientras que la elevada presencia de CO
2 la reprime (Bermejo, 1989;
Miller, 1989). Adems del acetato, conocido inductor de la esporulacin, la presencia en
el medio de ciertos cationes como Cat Na~ o Mg~ estlinula la esporulacin, mientras que
la presencia de amonio o la adicin de extracto de levadura la reprimen (Freese ea al..
1982; Bermejo, 1989; Miller, 1989). El pH adecuado para la espol-ulacin es cercano a la
25
1?- Introduccin
neutralidad o alcalino (Bermejo, 1989; Miller, 1989; Suizu et ql., 1995). Por ltimo,
tambin se ha indicado (Bermejo, 1989; Codn et aL, 1995) que las levaduras esporulan
preferentemente en el medio lquido que en los correspondientes medios slidos de rutina.
A pesar de conocer la influencia general de todos ests factores, cada cepa

esporgena es afectada de forma particular, incluso no se llega a observar formacin de
ascosporas, por lo que no se puede definir un medio ptimo de esporulacin.
26
IL- OBJETIVOS DEL TRABAJO
El presente trabajo forma parte de un Proyecto de Investigacin financiado por la
Comunidad Europea, titulado Levaduras contaminantes de alimentos y bebidas:
caracterizacin y ecologa para la mejora de su diagnstico y control (1993-1996), en el
que han participado adems diversos grupos de investigacin de Portugal, Holanda y Reino
Unido. El objetivo fundamental de este Proyecto ha sido la caracteri~acin de las cepas ms
relevantes de levaduras contaminantes de alimentos y bebidas desde un punto de vista
fisiolgico, ecolgico y molecular, a fin de mejorar su aislamiento diferencial y desarrollar
mtodos rpidos y sensibles para su deteccin e identificacin. La aplicacin de esta
tecnologa pretende reducir las prdidas econmicas debidas a las levaduras contaminantes
en industrias alimentarias, prdidas que se han incrementado en los ltimos aos como
resultado de la tendencia a disminuir las dosis de conservantes y a la aplicacin de
tratamientos de conservacin menos severos.
La aplicabilidad de los resultados obtenidos se dirige fundamentalmente a industrias

productoras de alimentos y bebidas susceptibles de alteracin por leiaduras. Por ello, varias
empresas mostraron apoyo e inters por el Proyecto, convirtindose en el llamado grupo
de usuarios, integrado por empresas pertenecientes a los pa~es participantes en el
Proyecto. Entre las empresas espaolas, ha participado una importante industria espaola
de turrones y mazapanes, con la cual la colaboracin se haba inicido anteriormente a raiz
de la aparicin de una alteracin en algunos de sus productos. Esta alteracin consiste
bsicamente en un olor de fondo definido como a petrleo, y que provoca el rechazo de
los productos por parte de los consumidores. A partir de los productos procedentes de
devolucin se realiz un estudio microbiolgico general que inclua recuentos de mohos,
levaduras y varios grupos de bacterias, y uno ms detallado que permiti aislar e identificar
una levadura como agente responsable de la alteracin. Dicho trabajo dio lugar a la Tesina
de Licenciatura titulada Mazapn: microbiologa y alteraciones (1994).
Como continuacin de este estudio inicial, y conocida la problemtica de las

industrias de alimentos azucarados a causa de la presencia de levaduras tolerantes a
elevadas concentraciones de azcar, el trabajo ha continuado, en forma de Tesis Doctoral,
en colaboracin con esta empresa gracias a la financiacin de la CICYT (beca predoctoral).
Para la realizacin de la misma, se ha reunido y analizado un gran nmero de muestras de
productos altamente azucarados. La mayora han sido suministrados por esta empresa de
28
IL- Objetivos del trabajo
turrones y mazapanes, pudiendo disponer de muestras alteradas,, muestras sin alterar y

materias primas empleadas en su fabricacin. Tambin se han recogido muestras de otros
productos altamente azucarados, con o sin alteracin aparente.
A partir del anlisis de estas muestras, los objetivos concretos de la Tesis son:
- Estudios taxonmicos: aislamiento e identificacin de levaduras y hongos contaminantes
y/o causantes de deterioro.
- Estudios fisiolgicos: investigacin de las condiciones en las que se produce el

metabolismo que conduce al deterioro, y mecanismos implicados en este ltimo.
- Estudios fsico-qumicos: identificacin de los productos de degradacin implicados en

la alteracin.
- Aplicaciones: desarrollo de mtodos de deteccin rpida de levaduras potencialmente

peligrosas por su capacidad de alterar los alimentos.
29
11K. MATERIAL Y MTODOS
III.- Material y mtodos
111.1.- Muestras y alteraciones
La mayora de las muestras analizadas en este trabajo corresponden a productos

elaborados a base de mazapn; segn la Reglamentacin Tcnico-Sanitaria para la
elaboracin, circulacin y comercio de turrones y mazapanes (B.O.E. 2 de agosto de 1982),
se entiende por mazapn la masa obtenida por amasado, con o sin coccin, de una mezcla
de almendras crudas peladas y molidas, con azcares en sus distintas clases y derivados.
Para la fabricacin del mismo, la almendra pelada, blanqueada y picada es

dosificada automticamente y depositada en una mezcladora junto con aproximadamente
la misma cantidad de azcar (sacarosa). Una frmula tpica sera (plp): almendra 50%,
azcar 38%, azcar invertido 2%, agua 10%. En esta misma mezcladora se aaden, tambin
dosificados automticamente, los distintos aditivos, fundamentalmente cido ctrico como
acidulante, en cantidad de acuerdo con Buena Prctica de Fabricacin (BPF), y cido
srbico como conservante, en concentracin de 1 g/L, resultando un pH final de
aproximadamente 5,5. Tras la mezcla, esta pasta heterognea pasa consecutivamente por
dos refinadoras hasta que adquiere una textura homognea. Actualmente, la pasta es
sometida a un tratamiento trmico, equivalente a una pasterizacin, mediante inyeccin
directa de vapor en un recipiente cerrado, tras el cual la masa recin calentada se almacena
en contenedores y se deja reposar durante 48 horas antes de su manufactura.
Otros ingredientes que intervienen en la composicin de algunos productos

derivados del mazapn son:
- Yema confitada: yema de huevo ms azcar.
- Boniato confitado: boniato ms azcar.
- Fruta confitada: frutas variadas cocidas en jarabe de glucosa.
- Azcar invertido: mezcla equimolecular de glucosa y fructosa (Ranken, 1993).
Se puede sustituir por jarabe de glucosa, obtenido por hidrlisis enzimtica del
almidn de maz, cuya composicin, en % en peso seco, es la siguiente: glucosa,
28%; maltosa, 29%; fructosa, 9%; maltotriosa, 14%; otros polisacridos, 20%.
31
A partir de estos ingredientes se fabrican distintas variedades de mazapn. Las

analizadas en este trabajo han sido las siguientes:
- Figuritas de mazapn: masa de mazapn troquelada y horneada.
- Pan de Cdiz: Masa de mazapn horneada en forma de pan, con tres capas
interiores de relleno, alternando boniato y yema confitados.
- Pasteles de yema: masa de mazapn en forma de huevo, con relleno de yema
confitada, y horneado ligero.
- Pasteles de gloria: como los pasteles de yema pero con relleno de boniato
confitado.
- Pasta de almendra: mezcla a panes iguales de pasta cruda de mazapn y azcar
en polvo, a la que se aade agua, obteniendo una concentracin final del 66% (p/p)
de azcar.
- Turrn de frutas: masa de mazapn, con trozos de frutas confitadas distribuidos
al azar en su interior, y cortada en forma de tabletas de turrn.
- Marquesas: mezcla de masa de mazapn con huevos enteros y almidn de trigo,
con batido y coccin; la textura final es esponjosa.
La mayora de las muestras analizadas presentaban una alteracin caracterstica, que

consista en la aparicin de un olor intenso definido como a petrleo, acompaado en
ocasiones de un marcado reblandecimiento de la textura y/o del hinchamiento del envase.
En la Fotografa 1 se muestra el abombamiento de uno de estos envases individuales.
En las muestras de pasta de almendra, lo ms caracterstico de la alteracin, adems

del olor a petrleo y el hinchamiento de algunos envases, es lo que muestran las
Fotografas 2 y 3: el reblandecimiento de la textura se presenta en este caso como
licuefacciones puntuales y circulares, en cuyo centro queda un punto de pasta
aparentemente sin alterar, distribuidas al azar por la superficie y el interior de las piezas.
32
.a.4 . 1~
It- Material y mtodos
Fotografa 1.- Pasteles de yema. A la izquierda aparece una muestra sin alterar, y a
la derecha una alterada. Se puede observar el abombandento del envase de la muestra
alterada.
FotograMa 2.- En el producto de la derecha se puede observar tambin el hichamiento

del envase, adems de la licuacin puntual que se muestra con ms detalle en la
Fotografa 3.
33
III. Material y mtodos
-
Fotografa 3.- Barras de pasta de almendra, con visible alteracin en la superficie. En

el producto de la izquierda, la textura aparece totalmente licuada; en el de la derecha,
la licuacin ha tenido lugar en forma de crculos de aproximadamente 1 cm de
dimetro, con un punto central de textura aparentemente sin alterar.
Adems de las muestras de productos finales derivados de mazapn, se analizaron

las distintas materias primas y productos intermedios utilizados para la elaboracin dc los
primeros. La mayora de las muestras de productos de mazapn fueron suministradas por
una importante empresa fabricante, y el resto es de procedencia diversa.
El resto de muestras analizadas correspondieron a otros alimentos altamente

azucarados de distinto origen, con alteracin aparente o no:
- Mermelada de albaricoque.
- Bolitas de coco: coco confitado.
- Yemas: bolitas de yema de huevo confitada.
- Cereales rellenos: centro de uvas pasas, rodeada de fibras de cereales.
- Miel.
Todas las muestras analizadas se describen en las Tablas 4 a 6.
34
111.2.- Aislamiento de microorganismos
Una vez registradas y clasificadas las muestras, se pes una cantidad representativa,
5 g, en condiciones aspticas y por duplicado, de cada una. Una de las porciones se
homogeneiz en 50 mL de YMB (Yeast Morphology Broth, ver Apndice 1), que contiene
1% de glucosa. La otra porcin de cada muestra se homogeneiz en 50 mL de YMB
suplementado con glucosa hasta 330 g/L (Golden y Beuchat, 1990, 1992b), que se
simbolizar como YMBG.
Una vez homogeneizada la muestra, a partir de cada matraz se realiz una primera
siembra en superficie, mediante asa de siembra, en placas con YMA (Yeast Morphology
Agar. ver Apndice 1), que se incubaron a 280C durante 7 das. Este mtodo de
recuperacin de microorganismos constituye, para este trabajo, el aislamiento directo.
Las muestras, homogeneizadas en sus respectivos medios lquidos, se mantuvieron

en incubacin durante 30 das a 280C. Este perodo corresponde al enriquecimiento de las
muestras. De cada matraz se realizaron sucesivos aislamientos a las 72 horas (El), 10 das
(E2), 20 das (E3) y 30 das (E4) en placas de YMA que se incubaron igualmente a 280C
durante 7 das.
De cada una de las placas, tanto las correspondientes al aislamiento directo como
las de los sucesivos aislamientos de los medios de enriquecimiento, se seleccionaron todas
aquellas colonias de levaduras y hongos filamentosos que presentaban una morfologa
distinta entre s. Una vez realizado un agotamiento de asa de cada colonia elegida, a partir
de una de las colonias aisladas se sembr un tubo de agar inclinado, cada uno de ellos
constituyendo un cultivo puro.
35
111.-Material y mtodos
Tabla 4.- Muestras analizadas de mazapn y productos derivados
N0 de Campaa fabricacin!
muestra Descripcin Alteracin ao anusis
Reblandecimiento, olor a 1992/94
Mi-MS Pasteles de yema petrleo, gas en envase
Reblandecimiento, olor a
M6-MXO Pasteles de gloria 1992/94
petrleo
Reblandecimiento, olor a 1995
Mli Pan de Cdiz petrleo, gas en envase
Mil-a Relleno superior
Mii -b Relleno intermedio
Mil -c Relleno inferior
Mll-d Base mazapn
M12 Pasteles de yema petrleo, gas en envase
M13-i5 Pasteles de yema 1995
Mi6 Pasteles de yema
petrleo, gas en envase
M17 Pan de Cdiz Mohoso en superficie 1996
M28 Figuritas mazapn 1996
M29 Pan de Cdiz 1996
M30 Pasteles de yema 1996
M3 1 Pasteles de gloria 1996
M32, Licuefaccin puntual, olor
Pasta de almendra 1996
M33 a petrleo, gas en envase
M34 Marquesas Olor a petrleo i 995
M35 Turrn de frutas Olor a petrleo i996
M36 Marquesas Olor a petrleo 1997
- no alteracin aparente.
36
Tabla 5.- Muestras analizadas de materias primas y productos intermedios de

mazapn
N0 de Campaa fabricacin!
muestra Descripcin Alteracin ao anlisis
M18 Yema confitada 1996
M 19 Boniato confitado 1996
M20 Masa recin pasterizada 1996
M2 1 Masa tras reposo de 48 h 1996
M22 Almendra variedad colorada 1996
M23 Almendra variedad planeta 1996
M24 Azcar refinado 1997
no alteracin aparente.
Tabla 6.- Muestras analizadas de otros productos altamente azucarados
N0 de D~ricin Alteracin Campaa fabricacin!

muestra ao anlisis
M37 Mermelada de Licuefaccin, gas 1997
albaricoque
M38 Miel para turrn 1997
M39 Miel Turbidez 1997
M40 Bolitas de coco Sabor a queso 1995/96
M41 Yemas Mohosas 1995/96
M42 Cereales con pasas Gas en envase 1998
no alteracin aparente.
37
111.3.- Mantenimiento de las cepas
Las cepas de levaduras se mantuvieron en tubos de YMA (Barnett ea aL, 1990) a

200C durante el perodo de experimentacin y se resembraron cada seis meses. El
mantenimiento en un medio con glucosa como nica fuente de carbono reduce el riesgo de
cambios en las caractersticas del crecimiento y la fermentacin (Yarrow, 1998). Estas
cepas se conservaron tambin a -200C con glicerol al 15% como crioprotector.
Los hongos tambin se conservaron en agar inclinado a 200C, pero en este caso el
medio de eleccin fue PDA (Potato Dextrose Agar) (ver Apndice 1). Las cepas se
conservaron tambin a -200C de la forma descrita para las levaduras.
IH.4.- Identificacin de levaduras
Las levaduras se identificaron mediante mtodos clsico& descritos por Lodder

(1970) y van der Walt y Yarrow (1984), recopilados como manual por Barnett et al.
(1990), basados en los caracteres morfolgicos y fisiolgicos resumidos en la Tabla 7.
- La macromorfologa o morfologa de las colonias se estudi en YMA a simple

vista o con ayuda de una lupa (Nikon), observando caracteres como el borde y la seccin
transversal, la morfologa del margen, el tipo de superficie, el brillo, la forma, la textura
y la elevacin. Otros caracteres, como formacin de sedimento, velo, anillo o islotes, se
estudiaron en medio lquido (YMB).
- La micromorfologa y el tipo de reproduccin vegetativa se estudiaron

microscpicamente -con un microscopio Zeiss- en cultivos de 24-48 horas en medio lquido
(YMB>, describindose la forma celular, y el tipo de reproduccin.
38
Tabla 7.- Caracteres estudiados en la identificacin de levaduras
Caracteres morfolgicos
Macromorfologa morfologa de la colonia
Micromorfologa morfologa celular en medio lquido
Tipo de reproduccin gemacin o fisin
vegetativa
Filamentacin formacin de pseudomicelio o micelio verdadero
Esporulacin formacin, nmero y tipo de esporas
Caracteres fisiolgicos
Fermentacin de azcares D-glucosa, D-galactosa, maltosa, metil-a-D-glucsido,
sacarosa, a,a-trealosa, melibiosa, lactosa, celobiosa.
melicitosa, rafinosa
Asimilacin de compuestos D-glucosa, D-galactosa, L-sorbosa, D-glucosamina, D-

carbonados como nica ribosa, D-xilosa, L-arabinosa, D-arabinosa, L-ramnosa,
fuente de carbono sacarosa, maltosa, a,a-trealosa, metil-cz-D-glucsido.
celobiosa, salicina, melibiosa, lactosa, rafinosa,
melicitosa, inulina, almidn, glicerol, eritritol, ribitol,
xilitol, D-glucitol, D-manitol, galactitol, mio-inositol,
D-glucono- 1,5-lactona, 2-ceto-D-gluconato, D-
gluconato, D-glucuronato, D-galacturonato, DL-lactato,
succinato, citrato, metanol, etanol; 1,2-propanodiol,
2,3-butanodiol
Hidrlisis de arburina
Asimilacin de compuestos nitrato, nitrito, etilamina, L-lisina, cadaverina, creatina,
nitrogenados como nica creatinina
fluente de nitrgeno
Crecimiento en ausencia de
vitaminas
Crecimiento a distintas 25, 30, 35, 37, 400C
temperaturas
Tolerancia a cicloheximida 0,01, 0,1%
50, 60% (p/p)
Crecimiento en distintas
concentraciones de glucosa
Hidrlisis de urea
39
111.- Material y mtodos
- Para la observacin de la filanientacin se utiliz la tcnica de Dalmau. El medio,

Corn Meal Agar (ver Apndice 1) se virti en placas petri de 55 mm 0 y una vez slido
la levadura se inocul realizando una incisin central con el asa de siembra. A continuacin
se deposit encima de la incisin un cubreobjetos estril y las placas se incubaron a 280C
hasta tres semanas. Semanalmente se realiz una observacin microscpica sin levantar el
cubreobjetos, anotndose la ausencia de filamentos, pseudomicelio simple o elaborado o
micelio verdadero.
- El estudio de la esporulacin se describir con detalle en el Apartado 111.4.1.
- Para la fermentacin de carbohidratos, el medio base (ver Apndice 1) se

distribuy a razn de 2 mL en tubos de fermentacin (160 mm x 10 mm 0) en los que se
introdujo una campana Durham invertida. Las fuentes de carbohidratos se prepararon en
concentraciones de 60 gIL en agua destilada, excepto la rafinosa, de la que se prepararon
120 g/L, y se esterilizaron por filtracin. De cada solucin concentrada se aadi 1 mL a
los tubos que contenin el medio base, resultando una concentracin final de 20 gIL de
cada azcar (40 gIL para la rafinosa).
Los tubos se inocularon con 0,1 mL de una suspensin densa (6 de la escala

McFarland, =io~ clulas/mL) en agua de un cultivo de la levadura de 24-48 horas en YMA,
y se incubaron a 280C hasta 21 das. Se consider como prueba positiva la presencia de
cido (viraje del indicador de color verde a amarillo) junto con la presencia de gas en la
campana, siendo retrasada (D = delayed) cuando esto sucedi despus de la segunda
semana de incubacin, y dbil (W = weak) si el gas ocupaba menos de 1/3 del volumen
de la campana.
- Para la asimilacin de compuestos carbonados se dispuso una batera de tubos

(180 mm x 16 mm 0) conteniendo 4,5 mL de agua destilada estril. Las fuentes de
carbono se prepararon a una concentracin de 50 gIL en YNB (Yeast Nitrogen Base)
excepto la rafinosa, de la que se prepararon 100 g/L, y los alcoholes metanol, etanol, 1,2-
propanodiol y 2,3-butanodiol, 40 gIL; las fuentes de cidos orgnicos 2-ceto-D-gluconato,
D-gluconato, D-glucuronato, D-galacturonato, DL-lactato, succinato y citrato se ajustaron
40
a pH 5,5. Todas las fuentes se esterilizaron por filtracin y se aadieron a sus respectivos
tubos de agua a razn de 0,5 mL cada una, resultando una concentracin final del
compuesto diez veces diluida respecto a la fuente. Se incluy adems un control negativo
de crecimiento, aadiendo a uno de los tubos 0,5 mL de YNB sin fuente de carbono, y se
consider control positivo el tubo que contiene glucosa como fuente de carbono.
Los tubos se inocularon con 0,1 mL de una suspensin diluida (0,5 de la escala
McFarland, ,4Q6 clulas/mL) en agua de un cultivo de la levadura de 24-48 horas en YMA,
y se incubaron a 280C hasta 21 das. La observacin de crecimiento por aparicin de
turbidez se consider un resultado positivo.
- La hidrlisis de arbutina se estudi en medio de cultivo slido (ver Apndice 1).

En la escisin del compuesto, la hidroxiquinona liberada reacciona con las sales frricas
presentes en el medio, dando lugar a un compuesto que confiere al medio un color marrn
oscuro.
El medio se inocul con una gota de una suspensin densa (~6 de la escala
McFarland) en agua de un cultivo de la levadura de 24-48 horas en YMA, y se incub a
280C hasta 15 das.
- Para la asimilacin de compuestos nitrogenados se procedi como en el caso de

compuestos de carbono, utilizando como medio base para las fuentes y para el control
negativo YCB (Yeast Carbon Base). La concentracin de los compuestos en las fuentes fue,
en g/L, la siguiente: nitrato 7,8; nitrito 2,6; etilamina 6,4; L-lisina 5,6; cadaverina 6,8; y
creatina y creatinina 6,0. La inoculacin, incubacin y lectura de las pruebas fue similar
a las descritas para la asimilacin de fuentes de carbono.
- El crecimiento en ausencia de vitaminas se comprob inoculando un tubo con

5 mL del medio base indicado en el Apndice 1 con 0,1 mL de la suspensin diluida de la
levadura. La incubacin y lectura se realiz como en el caso de las asimilaciones.
41
JIL Material y mtodos
-
- Para estudiar el crecimiento a distintas temperaturas, se inocularon, a partir de

la misma suspensin diluida (0,5 de Mc Farland) con la que se siembran las asimilaciones,
tubos conteniendo 5 mL de YMB, incubndose a continuacin a las temperaturas elegidas
durante 4 das. El crecimiento se detect por la aparicin de turbidez abundante.
- La resistencia a la cicloheximida se estudi inoculando, a partir de la misma

suspensin diluida con la que se sembraron las asimilaciones, dos tubos con 5 mL de
medio (ver Apndice 1) conteniendo, respectivamente, 0,1 y 1 g/L del compuesto. La
lectura se realiz como en el caso de las asimilaciones.
- El crecimiento en 50 y 60% (p/p) de glucosa, o crecimiento en medios con

elevada presin osmtica, se estudi en medios slidos con las referidas concentraciones
de azcar, cuya composicin se especifica en el Apndice 1. Las placas se inocularon con
gotas de la suspensin densa (6 de McFarland) de la levadura y se incubaron a 280C
durante dos semanas, sellando la placa para evitar la evaporacin de agua.
- La hidrlisis de urea se estudi sembrando con una gota de la suspensin densa

(6 de McFarland) de la levadura una placa agar urea de Christenseh (ver Apndice 1), que
se incub a 280C durante un mximo de dos semanas. La ureasa, en caso de que la
levadura posea esta enzima, cataliza la escisin de urea en amoniaco y carbamato; este
ltimo se autohidroliza para dar cido carbnico y otra molcula de amoniaco. La reaccin
global conduce a un incremento en el pH, que provoca un viraje del indicador de su forma
cida (amarilla) a bsica (rosa intenso).
111.4.1.- Esporulacin
Para el estudio de los caracteres de la reproduccin sexual -formacin de zigotos,

ascas y ascosporas-, se realiz un estudio ms amplio que el descrito en los mtodos
tradicionales de identificacin de levaduras, debido a la dificultad conocida de observacin
de esporas en determinadas especies de levaduras. Para ello, se seleccionaron diversos
medios de cultivo con objeto de determinar las condiciones ms adecuadas para la
esporulacin de las cepas de levadura incluidas en este trabajo.
42
Los medios de presporulacin empleados, cuya composicin se detalla en el

Apndice 1, fueron los siguientes (se incluyen las notaciones abreviadas que se emplearn
en apartados posteriores):
- Yeast Morphology Agar = YMA, o Yeast Morphology Broth = YMB (Bamett et
aL, 1990).
- PRE-l (Codn et aL, 1995).
- PRE-2 (Codn et aL, 1995).
Los medios de esporulacin, de composicin detallada en el Apndice 1, fueron los

siguientes:
Medios sembrados a partir de YMA (en slido) o YMB (en lquido):
- YMA o YMB.
- YMA o YMB con 20 gIL de NaC = 2% NaC (Barnett et aL, 1990; Davenport,
1980)
- Agar o caldo de extracto de levadura, glucosa y peptona (Yeast exaract Glucose
- -
Peptone) = YEGP (Barnett et al., 1990)

- Agar o caldo extracto de malta = EM (Barnett ea al., 1990).
- Agar de patata glucosado = PDA (Barnett et aL, 1990).
- Agar o caldo de Gorodkowa = GOR (Barnett et aL, 1990).
- Agar o caldo V-8 (8 vegetales) = VS (Barnett et al., 1990).
- Agar o caldo V-8 diluido 10 veces = VS/lO (Gimnez-Jurado, O., comunicacin
personal).
- Agar de Levine con eosina y azul de metileno = EMB (Davenport, 1980).
- Agar o caldo con manitol y acetato = MAc (Davenport, 1980).
- Agar o caldo acetato de Fowell = AA-l (Miller, 1989; Barnett et al., 1990).
- Agar o caldo acetato de Kleyn = AA-2 (Miller, 1989).
- Agar o caldo acetato de McClary = AA-3 (Miller, 1989; Barnett ea al., 1990).
- Agar infusin de maz (Corn MealAgar) = CMA (Davenport, 1981; Barnett et al.,
1990).
Medio sembrado a partir de PRE- 1:

- SPO-1 (Codn et aL, 1995).
43
Medio sembrado a partir de PRE-2:

-SPO-2 (Codn ea aL, 1995).
A partir de cultivos de 48-72 h de cada cepa a ensayar, las levaduras se inocularon

mediante asa de siembra en los medios de presporulacin, en forma lquida y slida. Los
tubos y placas se incubaron durante 48-72 h a 280C para recoger las cepas en fase
estacionaria temprana (Codn ea aL, 1995) y transferiras a sus respectivos medios de
esporulacin, inoculando los slidos a partir de las placas y los lquidos a partir de los
tubos. El medio CMA se sembr mediante la tcnica de Dalmau, realizando con el asa de
siembra cargada una incisin central en el agar y depositando sobre ella a continuacin un
cubreobjetos estril.
La incubacin de los medios de esporulacin se realiz a una temperatura subptima

de 200C (van der Walt y Yarrow, 1984; Barnett et aL, 1990; Codn ea al., 1995).
La observacin microscpica de los cultivos en los medios de esporulacin, excepto

CMA, se realiz al cabo de 3, 7, 21, 28 das, y a las 6 semanas (van der Walt y Yarrow,
1984; Barnett ea aL, 1990; Codn ea aL, 1995). De los cultivos en CMA se realiz una
nica observacin despus de 6 semanas de incubacin, levantando el cubreobjetos y
tomando una muestra con el asa de siembra de la zona del cultiVo cercana al borde del
cubreobjetos, donde es ms probable que tenga lugar la esporulacin (Barnett ea al., 1990).
La observacin se realiz mediante preparaciones en fresco, observando con 400 y 1000
aumentos.
111.5.- Identificacin de honeos filamentosos
Para la identificacin presuntiva de las cepas de hongos filamentosos a nivel de

gnero, segn el mtodo descrito por von Aa (1981), se realiz una resiembra de las
mismas en placas de agar extracto de malta o MEA (ver Apndice 1), que se incubaron a
250C durante cinco das. Tras el periodo de incubacin, se llev a cabo una primera
observacin directa de las placas, as como una observacin microscpica de una

preparacin de cada cepa.
44
Iii.- Material y mtodos
Las especies del gnero Aspergillus se distinguen por la preSencia de una estructura
caracterstica, el aspergilo, que consta de una vescula globosa cuierta de al menos una
capa de fllides (clulas alargadas), a partir de las cuales se forman las esporas asexuales,
llamadas conidios. La vescula nace de un largo filamento denominado estipe.
Por su parte, la caracterstica distintiva del gnero Penicillium es la formacin de

conidios en cadena a partir de verticilos o filides, que se disponen dando lugar a una
estructura caracterstica en forma de pincel denominada por ello penicilio. En el penicilio,
a diferencia del aspergilo, las filides surgen directamente del estip, o de unas clulas
soporte que constituyen la mdula y las ramas. En algunas especies, entre la mdula y las
ramas existen las rmulas. Se denomina penicilio a la estructura completa soportada por
el estipe; la estructura incluyendo el estipe es el conidiforo, y el conidiforo surge de una
hifa frtil.
111.5.1.- Identificacin de Aspergillus
La identificacin de las especies de Aspergillus se llev a cabo segn el sistema

propuesto por Klich y Pitt (1988), basado en el crecimiento sobre tres medios de cultivo
y la incubacin durante siete das a dos temperaturas distintas.
Los medios empleados, cuya composicin se detalla en el Apndice 1, fueron los

siguientes:
- Agar Czapek extracto de levadura (Czapek Yeast Extract Agar) = CYA.
- Agar extracto de malta (Mala Extract Agar) = MEA.
- CYA con 200 gIL (20% p/v) sacarosa = CY2OS.
Las cepas a identificar se resembraron en MEA y se incubaron a 250C durante 3

das. A partir de este cultivo se sembraron dos placas del medio CYA, una de las cuales
se incub a 250C y la otra a 370C. De los medios MEA y CY2OS, se sembr una nica
placa y se incub a 250C.
45
La siembra se realiz inoculando en tres puntos equidistantes del centro y de los

bordes de la placa, y entre s. Para evitar la dispersin de las esporas, que daran lugar a
colonias independientes fuera de los puntos elegidos, las placas se inocularon, con asa de
de siembra, a partir de una suspensin de esporas en una solucin de Tween 80 (Fluka) de
0,5 g/L en agua destilada. Tras el perodo de incubacin, se procedi a la observacin de
los siguientes caracteres:
a) Caracteres macroscpicos:
- Dimetro de las colonias: medida en mm por el reverso de la placa. De la placa
correspondiente a cada medio se registr el valor medio del dimetro de las tres
colonias.
- Color de los conidios y del micelio.
- Presencia y color del exudado (gotas en la superficie de la colonia).
- Color del agar bajo la colonia (reverso de la placa) y/o del agar circundante
(pigmento soluble).
- Presencia, profundidad y textura de los surcos en la colonia.
b) Caracteres microscpicos: para la observacin microscpica, se prepar
una muestra en portaobjetos depositando, sobre una gota de Tween 80 al 0,05%,
una porcin del micelio del hongo crecido en CYA recogida con aguja de siembra.
Se examinaron:
- Forma y tamao de las vesculas, mdula, filides y conidios.
- Textura de la superficie de los conidios.
- Longitud, grosor de la pared, color y textura de la superficie del estipe.
- Aspergilo uniseriado (slo filides), biseriado (mdula y filides) o mezcla de
ambos.
- Disposicin columnar o radial de los conidios en el aspergilo.
111.5.2.- Identificacin de Penicillium
La identificacin de las especies de Penicillium se llev a cabo segn el sistema

propuesto por Pitt (1991), basado en el crecimiento sobre tres medios de cultivo y la
incubacin durante siete das a tres temperaturas distintas. Como referencia se utiliz el
atlas y manual de Ramrez (1982).
46
Los medios empleados, cuya composicin se detalla en el Apndice 1, fueron los

siguientes:
- Agar Czapek extracto de levadura (Czapek Yeasi Extract Agar) = CYA.
- Agar extracto de malta (Malt Extraca Agar) = MEA.
- Agar nitrato glicerol al 25% (25% Glycerol Nitrate Agar) = G25N.
Las cepas a identificar se resembraron en MEA y se incubaron a 250C durante 3

das. A partir de este cultivo se sembraron tres placas del medio CYA, incubando cada una
a una temperatura: 5, 25 y 370C. De los medios MEA y G25N. se sembr una nica placa
y se incub a 250C.
La siembra en MEA y CYA 250C se realiz inoculando en tres puntos, tal como
se detall en el Apartado 111.5.1. El resto de las placas se inocularon en dos puntos
equidistantes entre s y del borde de la placa. Para la inoculacin se emple una suspensin
de esporas cuya preparacin tambin se ha descrito en el Apanado 111.5.1. Tras el perodo
de incubacin, se procedi a la observacin de los siguientes carateres:
a) Caracteres macroscpicos:
- Dimetro de las colonias: la medida se llev a cabo como se ha descrito para
Aspergillus.
- Caractersticas de las colonias: pigmentacin, exudado, textura, estriacin, grado
de esporulacin y disposicin de los conidios.
b) Caracteres microscpicos: una vez elaborada la preparacin
microscpica tal como se ha descrito en el apanado anterior, se examinaron:
- Nmero de ramificaciones en el penicilio: una (monoverticilado), dos
(biverticilado), tres (terverticilado) e incluso cuatro (cuaterverticilado).
- Longitud y forma de las filides: ampuliformes (en forma de botella) o acerosas
(en forma de aguja).
- Forma y tamao de los conidios.
- Textura de la superficie de los estipes y los conidios.
47
111.6.- Reproduccin de las alteraciones
111.6.1.- Reproduccin del olor a petrleo
Para la reproduccin del olor a petrleo detectado en las muestras de mazapn y

derivados se utiliz una modificacin de las condiciones experimentales descritas para tal
fin en un trabajo previo (Casas ea al., 1996). El medio experimental se constituy de la
siguiente manera: como medio base se emple el Caldo Nutritivo n02 (Oxoid), al que se
aadi azcar de mesa (sacarosa) en proporcin 1:1 (p:v), resultando una concentracin
final de azcar de 600 gIL. A este medio se adicionaron 0,5 gIL de sorbato potsico
(Scharlau), resultando un pH final de aproximadamente 6,3.
Las cepas a ensayar se inocularon en frascos hermticos de vidrio con 50 mL del

medio experimental. Como inculo se utiliz 1 mL de una suspensin de turbidez
equivalente al 6 de McFarland, preparado a partir de un cultivo de 48-72 horas de las cepas
en YMA. La incubacin se llev a cabo a 280C hasta un total de 30 das. Los resultados
correspondientes a crecimiento, olor a petrleo y presencia de gas, se registraron cada 48
horas.
111.6.2.- Reproduccin de las licuefacciones puntuales
111.6.2.1.- Reproduccin in situ. Para reproducir esta alteracin de la textura se

cortaron, en condiciones estriles, porciones transversales de aproximadamente 1 cm de
ancho de muestras de pasta de almendra sin alterar. De cada microorganismo aislado a
partir de estas muestras se obtuvo un cultivo de 24-48 horas y se sembr por duplicado en
una porcin: en un extremo mediante siembra en masa en superficie, y en el otro extremo
por picadura en profundidad. Estas porciones se incubaron individualmente, en tubos
hermticos de plstico transparente, a 280C hasta un total de 30 das.
111.6.2.2.- Reproduccin en medios experimentales. Puesto que los ingredientes

fundamentales de la pasta de almendra son 66% de azcar y prcticamente el resto (=33%)
48
It Material y mtodos
-
almendra, se prepararon medios experimentales con distintas proporciones de los mismos,

para determinar las condiciones experimentales de reproduccin del efecto.
Los medios empleados, cuya composicin y mtodo de preparacin se detallan en

el Apndice 1, fueron los siguientes:
- 66% (plp) sacarosa + 34% (p/p) ahnendra.
- 1% (p/p) sacarosa + 99% (plp) alinendra.
- 660 gIL sacarosa + 5 gIL almendra.

De estos medios se prepararon dos series, una con 1 gIL de sorbato y otra sin
conservante.
Las placas se sembraron, mediante asa de siembra, a partir de cultivos de 24-48

horas de las cepas a ensayar, y se incubaron a 280C hasta un total de 60 das. Se realiz
una comprobacin visual de la aparicin de licuefaccin cada 2-3 das.
111.7.- Estudio del mecanismo de licuefaccin
Para estudiar por separado la posible degradacin y/o utilizacin de distintos

componentes de la pasta de almendra, azcar (sacarosa) y almendra (grasa, protenas,
almidn, pectina) se emplearon los siguientes medios, cuya composicin y mtodo de
preparacin se detallan en el Apndice 1:
a) Medios para deteccin de acidificacin/Inversin de azcar:

- YMA + 660 g/L sacarosa + indicadores de pH: azul de bromofenol, rojo congo,
verde de bromocresol y rojo de metilo.
- Chalk agar (Davenport, 1981).
b) Medios para deteccin de lipolisis:
- Medio de Gorodkowa para lipolisis (Spencer-Martins, 1., comunicacin personal),

con 50 gIL de aceite de almendras.
- Agar tributirina (British Standards Institution, 1940) + 5 g/L glucosa.
- Base de agar tributirina + 5 g/L glucosa + aceite de almendras, sustituyendo ste
a la tributirina.
49
II. Material y mtodos
-
c) Medios para deteccin de proteolisis:

- YMA + 10 g/L gelatina.
- Agar de Frazier = agar caseinato clcico (Merck) + 5 gIL glucosa.
d) Medio para deteccin de amilolisis:
- YMA + 10 gIL almidn.
e) Medio para deteccin de pectinolisis:
- Medio inductor de pectinasa (Cruickshank, 1983) + 50 gIL glucosa.
De los medios b a e se prepar una segunda serie, aadiendo un 660 gIL de

sacarosa. Todos los medios se prepararon, adems, por duplicado: una serie en ausencia de
conservante y otra serie aadiendo 1 gIL de sorbato potsico, con la finalidad de comprobar
si la presencia de sorbato era determinante en la aparicin de la alteracin caracterstica.
Los medios se prepararon en placas tal y como se describe en el Apndice 1, y se

inocularon, mediante siembra en masa, con cultivos de 24-48 horas de las levaduras. La
incubacin se realiz a 280C y se prolong hasta 60 das, reali~ando comprobaciones
visuales cada 2-3 das o un revelado final de las placas, segn el medio de que se trate, lo
que se especifica en el Apndice 1.
111.8.- Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) del cido srbico
Esta determinacin se llev a cabo mediante la tcnica de microcultivo (Eklund,

1983; Kinderlerer y Hatton, 1990; Golden y Beuchat, 1992b; Skirdal y Eklund, 1993), es
decir, experimentos de crecimiento en placas de 96 micropocillos de fondo plano (Costar).
Se prepar un gradiente de concentracin de cido srbico combinando en los

pocillos diferentes volmenes de un medio base junto con volmenes adecuados de una
solucin concentrada (2 gIL) de sorbato potsico en caldo nutritivo n0 2 (Oxoid),
esterilizada por filtracin. Como medio base se utiliz el Caldo Nutritivo n02 (Oxoid) con
azcar de mesa (sacarosa) en concentraciones de 10 y 600 gIL. El pH de la solucin de
conservante y el de los medios base se ajust a pH 5,0 con HCl iN, para favorecer la
conversin del sorbato potsico en cido srbico.
50
1.- Material y mtodos
El correspondiente medio base y la solucin de conservante se dispensaron por

separado en los pocillos con pipeta automtica (Gilson); cada pocillo contena un volumen
final de medio de 200 1.tL. Las concentraciones de conservante ensayadas fueron, en g/L:
O (usada como control positivo de crecimiento), 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 y 1,2. Las ocho
concentraciones crecientes se dispusieron en una columna de la placa multipocillo, de
manera que cada columna corresponda a la determinacin de CMI para una levadura, bien
en 10 o bien en 600 g/L de sacarosa.
Cada columna se inocul, mediante pipeta multicanal (LabSystem), con 15 pL de

una suspensin de la cepa seleccionada, preparada en agua destilad estril, equivalente al
estndar 0,5 de la escala Mc Farland. Las placas, una vez inoculadas, se sellaron con
0C durante un mximo de 15 das,
Paraifilm M y se incubaron en esttico a 28
considerando crecimiento positivo la presencia de turbidez en el pocillo. Los experimentos
se llevaron a cabo por triplicado.
111.9.- Caracterizacin del compuesto responsable del olor a petrleo
En 1966, Marth et al. fueron los primeros en describir la capacidad de algunos

hongos del gnero Penicillium de descarboxilar el sorbato, dando lugar a un compuesto,
el 1,3-pentadieno, cuyo caracterstico olor descrito como a petrleo, pintura o
hidrocarburo parece coincidir con el detectado en las muestras del presente trabajo que
presentaban esta alteracin. Por tanto, los anlisis que se describen a continuacin tienen
como finalidad confirmar si el pentadieno es el metabolito responsable del olor a petrleo
en las muestras.
111.9.1.- Identificacin de 1,3-pentadieno
El compuesto responsable del olor a petrleo se identific mediante Cromatografa

de Gases (Gas Cromatography, GC) acoplada a Espectrometra de Masas (Mass
Spectrometry, MS). La tcnica de anlisis se adapt a partir de las descritas por Liewen y
Marth (1985b) y Kinderlerer y Hatton (1990).
51
En la tcnica de Espectrometra de Masas, el vapor de una muestra se ioniza

positivamente a baja presin por bombardeo con una corriente electrnica de baja energa.
Los iones moleculares as obtenidos se separan segn su relacin de masa (m) a carga
inica (z), dando lugar al llamado espectro de masas de dicha muestra. En el espectro de
masas se representa la cantidad relativa de cada ion con su correspondiente relacin m/z.
Cuando se trata de una muestra compleja, es decir, de una mezcla de compuestos, la
Espectrometra de Masas debe estar precedida por una Cromatografa de Gases separativa.
As, conectando la salida de un cromatgrafo de gases a la cmara de ionizacin de un
espectrmetro de masas se puede obtener informacin estructural -espectro de masas- para
cada uno de los componentes de la mezcla original, previamente inyectada en el
cromatgrafo, a medida que stos son eluidos en serie, en forma de picos separados. de la
columna cromatogrfica.
Las cepas de microorganismos productores del olor caracterstico en presencia de

sorbato se inocularon en viales de medio experimental con sorbato, cuya composicin se
detalla en el Apndice 1, con 1 mL de una suspensin densa (6 de Mc Fariand) de cultivos
de 48-72 horas. El medio experimental fue el mismo descrito para la reproduccin del olor
(Casas ea aL, 1996), conteniendo 0,5 gIL de sorbato potsico, repaftido a razn de 20 mL
en viales de 50 mL. Tras cerrar los viales hermticamente con tapn de goma y sellarlos
con Parafilm M, se incubaron a 280C durante 72 horas. Estos viales son los que se
muestran en la Fotografa 4.
Los anlisis se llevaron a cabo en un cromatgrafo de gases HP 5890 Series II

(Hewlett-Packard Company, HP) acoplado a un espectrmetro de masas 5971 A Mass
Selective Detector (HP), y empleando para la integracin de datos un computador tipo PC
con programa HP ChemStation. La columna empleada para la cromatografa de gases fue
de tipo capilar, de slice vitrea, con una longitud de 25 m y un dimetro interno de 0,25
mm, con fase estacionaria SE-54; el espesor de la pelcula era de 0,31 pm. El detector.
incluido en el espectrmetro de masas, era un cuadrupolo con un voltaje de ionizacin de
70 eV.
52
Fotografa 4.- Viales empleados para la identificacin de 1,3-pentadieno
La inyeccin de gas de cabeza de cada muestra se llev a cabo en splir (divisin

de flujo), con relacin de flujo 1:50. El anlisis se desarroll a una temperatura constante
de 400C utilizando como gas portador helio a una presin de 8 psi. La temperatura del
inyector fue de 2500C. El volumen de gas de cabeza inyectado, con jeringa hermtica
Hamilton, fue de 1 pL.
El compuesto analizado se identific mediante comparacin~de su espectro de masas

con los espectros contenidos en la base de datos del programa de integracin de datos.
Adems, se inyectaron 1~
1.iL de 1,3-pentadieno (mezcla de ismeros cis y trans) y 1 pL de
isopreno (2- metil-1,3-butadieno), ambos de Aldrich Chemical, como patrones.
111.9.2.- Cuantificacin de la produccin de pentadieno a partir de sorbato
Para este experimento, se seleccionaron dos cepas de levaduras productoras de

pentadieno, representantes de aquellas especies causantes de esta alteracin, que se
53
III: Material y mtodos
-
sembraron en el medio experimental anteriormente descrito en presencia de tres

concentraciones iniciales diferentes de sorbato potsico: 0,25, 0,50 y 1,00 gIL.
El medio se reparti a razn de 15 mL en viales de 25 mL, reservando un vial con

15 mL de medio base sin sorbato. Una vez crecidas en medio slido (YMA), se realiz una
suspensin densa (6 de McFarland) de cada cepa en agua destilada estril, de la que se
sembr 1 mL en tres viales de cada concentracin de sorbato, para realizar el experimento
por triplicado, y en el vial sin sorbato, reservando este ltimo para el recuento inicial y
final de clulas. Tambin se reservaron tres viales sin sembrar, cada uno correspondiente
a una de las tres concentraciones de sorbato ensayadas, para la determinacin de sorbato
(recuperacin de la concentracin inicial).
111.9.2.1.- Cuantificacin de sorbato en los medios. Este estudio se llev a cabo

siguiendo la tcnica descrita por Montao ea al. (1995), introduciendo las modificaciones
necesarias.
La cuantificacin de sorbato se realiz sobre los 15 mL de medio reservados sin

inocular de cada una de las tres concentraciones iniciales ensayads, as como a partir de
cada uno de los frascos incubados con las levaduras.
111.9.2.1.1.- Extraccin y preparacin de las muestras. En primer lugar, el contenido

de cada frasco se traspas a tubos gruesos con tapn esmerilado, y se aadieron 2 mL de
una solucin de H2S04 0,lN, para transformar el sorbato potsico en cido srbico (pK~ =
0C durante 15-20 minutos, para
pH 4,76); los tubos se calentaron en un bao a 100
favorecer la reaccin. A continuacin, se realizaron tres extracciones consecutivas con 25
mL cada una de una mezcla a partes iguales de ter etlico y ter de petrleo. Tras agitarlos
con fuerza, los tubos se mantuvieron en reposo unos 20 minutos, hasta la desaparicin de
turbidez en el ter. La fase etrea de cada tubo se extrajo mediante pipeta y se transfiri
a un matraz de fondo redondo y cuello esmerilado. Despus de las tres extracciones, el
disolvente se evapor en un rotavapor, quedando en el fondo del matraz un residuo en el
que se encontraba el cido srbico extraido.
54
III.- Mate rial y mtodos
El residuo obtenido tras cada extraccin se resuspendi en 2 mL de metanol y se

traspas a un eppendorf tras filtrarlo, mediante una jeringa, a travs de un filtro de
membrana Fluoropore (Millipore) de 0,5 nn. De las suspensiones correspondientes a los
medios sin inocular que contenan 0,25, 0,50 y 1,00 gIL de sorbato se realiz adems una
dilucin 1/100, tomando 100 t y enrasando hasta 10 mL en metanol.
Para la posterior cuantificacin del sorbato de las muestras, se prepar una solucin
patrn de sorbato potsico de alta pureza SigmaUltra (Sigma Chefflical) de concentracin
0,4 g/L en agua desionizada mediante sistema Milli-Q (Millipor. De esta solucin se
transfirieron 1, 3 y 5 mL a matraces aforados, enrasando hasta 50 mL con una solucin
acuosa de H2504 0,0085N (pH=2). Las concentraciones finales del compuesto fueron,
respectivamente, de 0,008, 0,024 y 0,40 g/L.
It 9.2.1.2.- Condiciones de HPLC. Para la separacin analtica se utiliz un

Cromatgrafo de Lquidos de Alta Eficacia de Hewlett-Packard, modelo 1040 con un
sistema cuaternario de entrada de disolventes, equipado con un detector de Uy/visible de
diodos modelo Hewlett-Packard modelo 1040 A. La columna empleada fue un modelo
Hewlett-Packard de 250 mm x 4 mm 0 de acero inoxidable con tipo de relleno Cl 8
Hypersil ODS, con partculas esfricas de 5 pm. Los disolventes empleados fueron de
calidad HPLC (Scanlab). La cromatografa se desarroll en fase reversa.
La separacin se llev a cabo mediante un gradiente del eluyente A (H3P04 40 gIL

en agua) y del eluyente B (acetonitrilo), empezando a tiempo O hasta tiempo 5 minutos con
una composicin semifinal del eluyente B del 6%. La composicin del disolvente en
gradiente se sigue desde tiempo 5 minutos hasta 15 minutos con una composicin final del
eluyente B del 20%, mantenindose hasta 25 minutos. La velocidad de flujo empleada fue
de 0,8 mL/minuto, y la deteccin espectrofotomtrica se monitoriz a una longitud de onda
X=264 nm. Al final del gradiente, la columna se reequilibr hasta coseguir las condiciones
iniciales con un nuevo gradiente desde tiempo 25 minutos hasta 30 minutos con una
composicin final del eluyente B del 6%.
55
II.- Material y mtodos
Se realizaron, por duplicado, inyecciones de 20 pL con jeringa Hamilton tanto de

los patrones como de las muestras. Los datos obtenidos se procesaron en un ordenador
Hewlett-Packard modelo 9000/300, con un programa de integracin para evaluar el rea y
altura de los picos.
It 9.2.1.3.- Cuan tificacin de sorbato. La determinacin del sorbato presente en las

muestras se llev a cabo utilizando como patrn externo la solucin de sorbato potsico de
alta pureza descrita anteriormente. Con las reas -valor de absrbancia- de los picos
obtenidos de las tres diluciones de la suspensin patrn y sus correspondientes
concentraciones conocidas de cido srbico se construy, mediante el programa estadstico
Instat, una curva de calibracin consistente en una recta de regresin.
Atendiendo al tiempo de retencin de los picos obtenidos ~n el cromatograma de

las muestras, y por comparacin con el tiempo de retencin del compuesto patrn, se
determin el rea del pico correspondiente al cido srbico. La concentracin de sorbato
de las muestras se calcul aplicando la ecuacin de la recta de regresin, teniendo en
cuenta los correspondientes factores de dilucin empleados en la preparacin de las
muestras cromatogrficas, as como la conversin de sorbato potsico en cido srbico y
viceversa, atendiendo a sus distintos pesos moleculares.
It 9.2.1.4.- Estudio de recuperacin. Para evaluar la recuperacin del conservante

a partir del medio de cultivo, se emplearon los viales reservados previamente sin inocular
de cada una de las concentraciones de sorbato ensayadas, es decir, 0,25, 0,50 y 1,00 gIL.
Comparando cada una de las concentraciones recuperadas con las esperadas

(concentraciones iniciales), se calcul un factor medio de recuperacin, que se aplic
posteriormente a las concentraciones de sorbato obtenidas de los viales inoculados.
111.9.2.2.- Cuantificacin de pentadieno en los medios. Los anlisis se llevaron a

cabo mediante la misma tcnica adaptada de Liewen y Mart (1985b) y Kinderlerer y
Hauon (1990) descrita en el apartado anterior.
56
Tanto la preparacin de los medios de cultivo como la inoculacin de los mismos

ha sido descrita en el inicio del Apartado 111.9.2. La adicin de concentraciones crecientes
de sorbato dio lugar a un incremento de pH, tal como haban observado Marth ea al.
(1966). As, mientras que el pH del medio base sin conservante fue de 6,20, con la adicin
de 0,25, 0,50 y 1,00 g/L de sorbato los medios alcanzaron un pH final de 6,26, 6,30 y 6,36,
respectivamente.
Justo despus de inocular las cepas, se realiz una primera cuantificacin de

pentadieno (da 0). A continuacin, los viales se incubaron a 280C durante cuatro das,
realizando sucesivas cuantificaciones a las 24 (da 1), 48 (da 2), 72 (da 3) y 96 (da 4)
horas. Estas cuantificaciones se llevaron a cabo inyectando un volumen de 1 iL del gas de
cabeza de cada vial, y anotando la abundancia mxima de uno de los iones del espectro de
masas del 1 ,3-pentadieno correspondiente al pico cromatogrfico.
La cuantificacin se realiz mediante patrn externo. Para ello, se prepar una serie
de viales que contenan 15 mL del medio de cultivo estril, y en cada uno se inyect uno
de los siguientes volmenes de pentadieno patrn: 3 jiL, 10 pL y 30 pL; de cada volumen
se prepararon tres viales. Los dos primeros volmenes se inyectaron en el medio, a travs
del tapn de goma del vial, mediante jeringa hermtica Hamilton; el tercer volumen se
inyect, tambin en el medio, mediante pipeta automtica Gilson. Los viales se agitaron
suavemente para conseguir una distribucin homognea del pentadieno en el medio.
Estos viales se incubaron a 280C durante cuatro das, para permitir que el
compuesto inyectado alcance un equilibrio entre la fase acuosa y el gas de cabeza. Tras
este perodo, se procedi a la inyeccin de 1 pL del gas de cabeza de cada vial,
determinando la abundancia mxima del ion del espectro elegido. A travs de la
correspondencia entre la abundancia de este ion en el espectro de masas y el volumen de
pentadieno inyectado en el medio, se construy una recta de regresin, mediante el
programa informtico Statgraphics plus versin 2.1, que permiti expresar en unidades de
volumen las abundancias del ion del espectro medidas en las muestras inoculadas con una
levadura.
57
111.9.2.3.- Determinacin de biomasa. Para este expenmento, se determin el nmero

de clulas con que se inocularon los viales (recuentos iniciales), as como el nmero de
clulas presente en cada vial tras el perodo de incubacin (recuentos finales).
- Para los recuentos iniciales, se emple el vial con 15 mL de medio base sin
sorbato inoculado con la misma suspensin de clulas de levdura que los dems viales. Esta
suspensin inicial contendr el mismo nmero de clulas que los viales del ensayo, y se
incub junto con ellos.
La determinacin del nmero de clulas viables se llev a cabo mediante diluciones

sucesivas. A partir de un nmero adecuado de diluciones, stas se sembraron, a razn de
0,1 mL, en placas de YMA, extendiendo el inculo con asa de vidrio (asa Drigalski). Este
mtodo de recuento en superficie es ms recomendable que el tradicional de homogeneizar
inculo y medio fundido, ya que se evita la inactivacin tnnica de las clulas y/o la
inhibicin de algunas especies aerobias (no fermentativas) por la reduccin en la
disponibilidad de oxigeno (Davenport, 1981; Deak y Beuchat, 1996).
- Los recuentos finales se realizaron como en el caso de los iniciales.
A los valores obtenidos de los recuentos de cada cepa se les aplic un estudio
estadstico para estimar si las diferencias entre los tres valores que dan lugar a cada media
son significativos, y para determinar si los recuentos obtenidos para cada concentracin de
sorbato son significativamente diferentes a los obtenidos para las dems concentraciones.
El anlisis estadstico consisti en los correspondientes tests de ANOVA (anlisis de la
varianza) realizados mediante el programa informtico MicroCal Origin versin 4.0.
111.10.- Prueba estandarizada para la reproduccin del olor a petrleo
La reproduccin del olor a petrleo se realiz en el mismo medio, con 60<) gIL
de sacarosa y 0,5 gIL de sorbato potsico. Este medio se reparti a razn de 12 mL en
tubos hermticos -con tapn de rosca- de vidrio (120 mm x 15 mm 0).
58
IIL Material y mtodos

-
Las cepas seleccionadas se sembraron en una placa de YMA por agotamiento de

asa, para obtener colonias aisladas, y en otra placa se sembraron en masa, para conseguir
un crecimiento abundante.
La inoculacin de las cepas se llev a cabo mediante dos tcnicas distintas:

- Inoculacin de una colonia aislada de la levadura.
- Inoculacin de 1 mL de una suspensin densa (equivalente al 6 de la escala
McFarland) de la levadura en YMB.
En ambos casos, se ensay una inoculacin directa en el medio experimental. as

como inoculaciones tras distintos tiempos de incubacin en YMB (preincubacin): 2, 4, 8
y 24 horas. Tras el perodo de preincubacin, los tubos de YMB se agitaron y se transfiri
1 mL al correspondiente tubo de medio experimental.
La incubacin de los tubos de preincubacin y los tubos con medio experimental

se realiz a 280C. La produccin de olor y/o gas se comprob cada 8 horas.
59

E
1
1
IV.- RESULTADOS
1
u
IV- Resultados
IV.l.- Microorganismos aislados e identificacin
IV.1.1.- Levaduras
Tabla 8.- Levaduras aisladas de muestras de mazapn y productos relacionados
Muestra de
Nmero de Tcnica de
Identificacin
cepa procedencia aislamiento
lE Ml YMBG, 14 das Zygosaccharomyces rouxn

2E M9 YMBG, 7 das Zygosaccharomyces rouxii
3E YMBG, 7 das Debaryomyces hansenii
4E M6 YMBG, 7 das Debaryomyces hansenii
lOE M7 YMBG, 14 das Debaryomyces hansenii
i4D Mli Aislamiento directo Zygosaccharomyces rouxii
lSD Mil Aislamiento directo Zygosaccharomyces rouxz
1 4E 1 Mli YMBG, 3 das Zygosaccharomyces rouxii
1 4E2 Mii YMBG, 10 das Zygosaccharomyces rouxii
14E4 Mil YMBG, 30 das Zygosaccharomyces rouxu
i6D Mil-a Aislamiento directo Zygosaccharomyces rouxii
17D Ml 1-a Aislamiento directo Zygosaccharomyces rouxii
1 6E 1 Mil-a YMBG, 3 das Zygosaccharomyces rouxii
1 6E2 Mil-a YMBG, 10 das Zygosaccharomyces rouxn

1 6E3 Mil-a YMBG, 20 das Zygosaccharomyces rouxn
1 6E4 Mil-a YMBG, 30 das Zygosaccharomyces rozan
18D Mil-b Aislamiento directo Zygosaccharomyces roux.
19D M1l-b Aislamiento directo Zygosaccharomyces rouxu
1 8E 1 Mil -b YMBG, 3 das Zygosaccharomyces rouxii
1 8E2 Mil -b YMBG, 10 das Zygosaccharomyces rouxii
1 8E3 Mli-b YMBG, 20 das Zygosaccharomyces rouxn
1 8E4 Mil -b YMBG, 30 das Zygosaccharomyces rouxu
20D M1l-d Aislamiento directo Zygosaccharomyces rouxzz
61
IV. Resultados
-
21D Mll-d Aislamiento directo Zygosaccharomyces rouxii

20E2 Mll-d YMBG, 10 das Zygosaccharomyces rouxii
20E3 Mli-d YMBG, 20 das Zygosaccharomyces rouxii
20E4 Mli-d YMBG, 30 das Zygosaccharomyces rouxii
22E 1 Mli -c YMBG, 3 das Zygosaccharomyces rouxu

22E2 Mil -c YMBG, 10 das Zygosaccharomyces rouxii
22E3 Mli -c YMBG, 20 das Zygosaccharomyces rozan
22E4 Mli -c YMBG, 30 das Zygosaccharomyces rouxn

24E 1 M 12 YMBG, 3 das Zygosaccharomyces rouxii
24E2 M12 YMBG, 10 das Zygosaccharomyces rouxii
24E3 M12 YMBG, 20 das Zygosaccharomyces rouxu

24E4 M12 YMBG, 30 das Zygosaccharomyces rouxn
26E2 Mi6 YMBG, 10 das Zygosaccharomyces rouxz
29E 1 M28 YMBG, 3 das Saccharomyces cerevisiae
29E2 M28 YMBG, 10 das Saccharomyces cerevisiae
29E3 M28 YMBG, 20 das Saccharomyces cerevnszae
30E 1 M29 YMBG, 3 das Lodderomyces elongisporus
30E2(i) M29 YMBG, 10 das Saccharomyces cerevzsae
30E2(2) M29 YMBG, 10 das Saccharomyces cerevzsae
30E3 M29 YMBG, 20 das Saccharomyces cerevzsnae
30E4 M29 YMBG, 30 das Saccharomyces cerevsnae
33E1(l) M3 1 YMBG, 3 das Lodderomyces elongisporus
33Ei(2) M3 1 YMBG, 3 das Lodderomyces elongisporus
33E2(i) M3 1 YMBG, 10 das Lodderomyces elongisporus
62
IV- Resultados
33E2(2) M3 1 YMBG, 10 das Lod4eromyces elongisporus

33E3 M3 1 YMBG, 20 das Lodderomyces elongisporus
33E4 M3 1 YMBG, 30 das Lodderomyces elongisporus
34E1(l) M32 YMBG, 3 das Zygosaccharomyces rouxii
34E1(2) M32 YMBG, 3 das Zygosaccharomyces rousu
35E1(i) M33 YMBG, 3 das Zygosaccharomyces rouxn
35E1(2) M33 YMBG, 3 das Zygosaccharomyces rouxii

35E3(l) M33 YMBG, 20 das Zygosaccharomyces rouxu
35E3(2) M33 YMBG, 20 das Zygosaccharomyces rouxn
35E4 M33 YMBG, 30 das Zygosaccharomyces rouxiz
36E 1 M35 YMBG, 3 das Zygosaccharomyces rouxu
63
IV- Resultados
Tabla 9.- Levaduras aisladas de materias primas
Muestra de
Nmero de Tcnica de Identificacin
27E1(l) M22 YMBG, 3 das ssaachenkia orientalis
27E1(2) M22 YMBG, 3 das Torulaspora delbrueckii
27E2(l) M22 YMBG, 10 das Issatchenkia orientalis
27E2(2) M22 YMBCi, 10 das Torulaspora delbrueckii
27E3(l) M22 YMBG, 20 das Issatchenkia orientalis
27E3(2) M22 YMBG, 20 das Torulaspora delbrueckii
28E2 M23 YMBG, 10 das Candida glabrata
28E3(l) M23 YMBG, 20 das Candida glabrata
28E3(2) M23 YMBG, 20 das Can4ida glabrata
28E4(l) M23 YMBG, 30 das Candida glabrata
28E4(2) M23 YMBG, 30 das Candida glabrata
28E4(3) M23 YMBG, 30 das Candida glabrata
Tabla 110.- Levaduras aisladas de otros productos altamente azucarados
Nmero de Muestra de Tcnica de Identificacin

38E 1 M37 YMBG, 3 das Pichia guilliermondii

38E2 M37 YMBG, 10 das Pichia guilliermondii
39E2 M38 YMBG, 10 das Schizosaccharomyces octosporus
39E3 M38 YMBG, 20 das Schizosaccharomyces octospo rus
39E4 M38 YMBG, 30 das Schizosaccharomyces octospo rus
64
Y- Resultados
Zygosaccharomyces rouxii
(Fotografa 9)
Utilizacin de azcares
Glucosa F Maltosa F Galactosa A
Asimilacin de otras fuentes de carbono
Glicerol A D-manitol A D-gluconato A

D-glucitol A D-glucono 1,5-lactona A
Asimilacin de compuestos nitrogenados
Etilamina A L-lisina A Cadaverina A
Crecimiento en ausencia de vitaminas y
400C
Crecimiento a distintas temperaturas 370C +
y
Formacin de oseudomicelio
Estado asexual no descrito. Colonias de color blanco a cremoso, butirosas;

reproduccin vegetativa por gemacin; ausencia de filamentos, o pseudomicelio simple;
ascas persistentes, conteniendo de 1 a 4 ascosporas redondas, de pared gruesa o fina;
ausencia de conjugacin, o clula a clula, a veces slo tras la mezcla de cepas
sexualmente compatibles.
F = fermentado y asimilado; A = asimilado pero no fermentado; V = variable; + =

crecimiento (turbidez) en el medio; - = ausencia de crecimiento.
65
IV- Resultados
Debaryomyces hansenii
(Fotografa 10)
Asimilacin de fuentes de carbono (A
Glucosa Galactosa Sorbosa Raninosa

Sacarosa Maltosa a,a-trealosa Metil-a-D-glucsido
Celobiosa Salicina Arbutina Melibiosa V
Lactosa Rafinosa Melicitosa Inulina V
Glicerol Eritritol Ribitol Xilitol
D-glucitol V D-manitol D-gluconato D-glucono- 1,5-lactona
D-glucuronato DL-lactato Citrato Etanol
Asimilacin de compuestos nitro2enados
Etilamina L-lisina Cadaverina Creatina Creatinina y
Crecimiento en ausencia de vitaminas +
Crecimiento a distintas temperaturas 30C + 350C
Tolerancia a cicloheximida 0,01% V 0,1%
Estado asexual: Candida famata. Colonias de color blanco a cremoso, butirosas;

reproduccin vegetativa por gemacin; ausencia de filamentos; ascas persistentes,
conteniendo de 1 a 2 ascosporas redondas, de pared gruesa.
F = fermentado y asimilado; A = asimilado pero no fermentado; Y = variable; + =

66
)
IV- Resultados
Issatchenkia orientalis
(Fotografa 11)
Asimilacin de azcares
Glucosa F
Asimilacin de otras fuentes de carbono
Glicerol A A DL-lactato A
D-glucono- 1,5-lactona
Succinato A Etanol A
Citrato A
Asimilacin de compuestos nitro 2enados
A Cadaverina A
Etilamina A L-lisina
Crecimiento en ausencia de vitaminas
400C
370C + +
Crecimiento a distintas temperaturas
Formacin de oseudomicelio +
Estado asexual: Candida krusei. Colonias de color blanco a cremoso, butirosas;

reproduccin vegetativa por gemacin; pseudomicelio elaborado.
67
IV- Resultados
Torulaspora delbruecldi
(Fotografa 12)
Glucosa F Maltosa F Metil-cz-D-glucsido F

Sacarosa F cc,cc-trealosa F
Melicitosa F Rafinosa F
Asimilacin de otros compuestos carbonados
A Etanol A
2-ceto-D-gluconato A DL-lactato
L-lisina A
400C
Crecimiento a distintas temperaturas 370C +
Crecimiento en altas concentraciones de glucosa 50% + 60% +
Estado asexual: Candida colliculosa. Colonias de color blanco a cremoso, butirosas;

reproduccin vegetativa por gemacin; ausencia de filamentos; ascas persistentes,
conteniendo de 1 a 4 ascosporas redondas, de pared gruesa.
F = fermentado y asimilado; A = asimilado pero no fermentado; V = variable; +
68
IV- Resultados
Candida glabrata
(Fotografa 13)
Glucosa F cx,cc-trealosa F
A
Glicerol A D-glucono- 1,5-lactona
D-gluconato A DL-lactato Y
370C + 400 +
Crecimiento a distintas temperaturas
Colonias de color blanco a cremoso, butirosas; reproduccin vegetativa por

gemacin; ausencia de filamentos; ausencia de reproduccin sexual.
F = fermentado y asimilado; A = asimilado pero no fermentado; V = variable; + =

69
IV- Resultados
Saecharomyees eerevisiae
(Fotografa 14)
F
Glucosa F Galactosa F Maltosa
F
Sacarosa F Melibiosa Celobiosa
a,ct-trealosa F,A
Melicitosa F Rafinosa F
Metil-ct-D-glucsido F
Etanol A Lactato y
Crecimiento en ausencia de vitaminas +
Crecimiento a distintas temperaturas 37C + 400C y
+
Formacin de useudomicelio
Estado asexual: Candida robusta. Colonias de color blanco a cremoso, butirosas;

reproduccin vegetativa por gemacin; pseudomicelio simple; ascas persistentes,
conteniendo de 1 a 4 ascosporas redondas, de pared gruesa; ausencia de conjugacin.
70
IV Resultados
-
Lodderomyces elongisporus
(Fotografa 15)
Asimilacin de azcarest
Glucosa F a,a-trealosa F,A Galactosa F,A

Sorbosa A Sacarosa A Maltosa A
Melicitosa A D- xilosa A Metil-a-D-glucsido A
Glicerol A Ribitol A Xilitol A

Glucitol A Manitol A D-gluconato A
Succinato A Citrato A Etanol A

D-glucono- 1,5-lactona A 2-ceto-D-gluconato A
Crecimiento a distintas temperaturas 370C + 400C +
Tolerancia a cicloheximida 0,01% + 0,1% +
Crecimiento en altas concentraciones de alucosa 50% y 60%
Formacin de pseudomicelio +
Estado asexual no descrito. Colonias de color blanco a cremoso, butirosas;

reproduccin vegetativa por gemacin; pseudomicelio elaborado.
71
IV- Resultados
F = fermentado y asimilado; A = asimilado pero no fermentado; y = variable; + =

sOtros compuestos asimilados como fuente de carbono por algunas cepas: D-
glucosamina -33E2(l)-, D-ribosa -33E1(2), 33E2(1), 33E3-, L-ramnosa -33El(l), 33E2(l),

33E2(2)-, celobiosa -33E1(l), 33E2(l), 33E2(2)-, salicina -33E1(l), 33E2(l), 33E2(2)-,
arbutina -33E2(l).
72
IV.- Resultados
Piehia guilliermondii
(Fotografa 16)
Glucosa F Galactosa F Sacarosa F

Melibiosa F a,a-trealosa F Rafinosa F
Sorbosa A Xilosa A Glucosamina A
L-arabinosa A 0-arabinosa A Rainnosa A
Maltosa A Celobiosa A Metil-a-D-glucsido A
Salicina A Arbutina A Melibiosa A
Rafinosa A Melicitosa A. Inulina A
A Ribitol A Xilitol A
Glicerol
Galactitol A
Glucitol A Manitol A
Etanol A
Succinato A Citrato A
D-gluconato D-glucono- 1,5-lactona A
Asimilacin de compuestos nitro2enados
Crecimiento a distintas temperaturas 37 0C + 400C +
Tolerancia a cicloheximida 0,01% + 0,1% +
Formacin de pseudomicelio +
73
IV- Resultados
Estado asexual: Candida guilliermondii. Colonias de color blanco a cremoso,

butirosas; reproduccin vegetativa por gemacin; ausencia de filamentos, o pseudomicelio
elaborado; no se observan ascosporas (en forma de sombrero); la conjugacin es clula a
clula tras la mezcla de cepas sexualmente compatibles, pero la esporulacin es
extremadamente escasa (Barnett ea al., 1990).
74
IV Resultados
-
Schizosaccharoromyces octosporus
(Fotografas 17 y 18)
Glucosa F Maltosa F,A,(-) Metil-a-D-glucsido A,F,(-)
Crecimiento en altas concentraciones de alucosa 50% + 60% +
Hidrlisis de urea +
Estado asexual no descrito. Colonias de color crema a tostado, butirosas;

reproduccin vegetativa porfisin; ausencia de filamentos; ascas evanescentes, conteniendo
de 1 a 8 ascosporas ovales o redondas, de pared fina; ausencia de conjugacin, o clula a
clula.
F = fermentado y asimilado; A = asimilado pero no fermentado; y = variable; + =
75
IV.- Resultados
IV.1.2- Hongos filamentosos
Tabla 11.- Hongos filamentosos aislados de distintos productos
Nmero de cepa Muestra de procedencia Identificacin

Hl Mli Penicillium chrysogenum
H2 Mil Penicillium crustosum
H3 M34 Penicillium chtysogenum
H4 M17 Penicillium chrysogenum
H5 M35 Penicillium chrysogenum
H6 M36 Penicillium simplicissimum
H7 M39 Aspergillus niger var. niger
76
IV- Resultados
Aspergillus niger var. niger
Subgnero: Circumdati
Seccin: Nigri
Caractersticas macroscpicas
Dimetro de las colonias en CYA 7 mm. Areas condiales negras, densamente
pobladas. Hifas hialinas, blancas. Reverso blanco amarillento. Colonias densas, granulares,
ligeramente surcadas por la variacin en longitud de las hifas. Dimetro de las colonias a
37C 7 mm.
Dimetro de las colonias en CY2OS 7 mm. Colonias similares en apariencia a las

crecidas en CYA, pero los aspergilos incluso ms densamente empaquetados.
Dimetro de las colonias en MEA 7 mm. reas conidiales negras. Micelio blanco
e hialino. Reverso incoloro. Colonias granulares.
Caractersticas microscpicas
Cabezas conidiales radiadas. Paredes de los estipes finas. Vesculas prcticamente
esfricas. Aspergio biseriado. Mdula cubriendo virtualmente la superficie completa de la
vescula. Conidios globosos, de paredes no muy speras, con resaltes irregularmente
distribuidos.
Caracteres distintivos
Colonias negras, aspergilo biseriado con vesculas grandes, mdula de mediana
longitud, conidios irregularmente ornamentados.
77
1 4~ h~
2-; 018 4~ x
Sa..
IV- Resultados
5c.
(a k
o.
Y 4
Fotografa 5.- Anverso (a) y reverso (b) de las colonias de A. nger crecidas en CYA,
MEA y CZOG. En e se puede observar el aspergilo biseriado, y en d los conidios
ornamentados, sealados con flechas.
78
IV- Resultados
Penicillium chrysogenum
Subgnero: Penicillium
Sector: Peniciliium
Dimetro de las colonias en CYA 35-38 mm, surcadas radialinente y aterciopeladas.
Micelio blanco amarillento. Conidios de color verde azulado. Exudado transparente y
reverso amarillo brillante debido a la presencia de pigmento soluble de este color; otras
colonias carecen de exudado y de pigmento, por lo que el reverso es plido. Colonias
microscpicas a 50C. A 370C, colonias de 1-8 mm.
Dimetro de las colonias en MEA 35-45 mm, planas, superficiales y granulares.

Micelio hialino. Conidios de color verde azulado. Reverso verde plido.
Colonias en G25N 17-25 mm, densas y radialmente surcadas. Reverso amarillo

plido.
Estipes con paredes finas y lisas. Penicilio tpicamente terverticilado, terminal y
compacto, con una o dos ramas. Mdula corta y filides ampuliformes. Conidios
subesferoidales, de paredes finas, dispuestos en columnas largas e irregulares.
Las colonias crecen rpidamente en los medios comunes a 250C, produciendo en
CYA un abundante crecimiento de color verde azulado por la presencia de los conidios y
amarillo por la produccin de pigmento soluble en el reverso. Microscpicamente, los
penicilios son terverticilados y de paredes finas. Algunas cepas carecen de pigmentacin
amarilla.
79
61~
IV- Resultados
Fotografa 6.- Anverso (a) y reverso (b) de las colonias de P. chrysogenum crecidas en
CYA, MEA y G2SN. En e se puede observar la estructura del penicilio y la morfologa
de los conidios.
8<>
IV- Resultados
Penicillium crustosum
Subgnero: Penicillium
Sector: Penicillium
Dimetro de las colonias en CYA 30 mm, planas, tpicamente bajas, con aspecto
aterciopelado y superficie pulverulenta. Micelio blanco e hialino. Conidios de color verde
oscuro, muy abundantes en todo el rea de la colonia, que en los mrgenes adquiere color
gris azulado. Exudado naranja oscuro. Reverso marrn oscuro por la produccin de
pigmento de este color. No crecimiento a 5 ni a 370C.
Dimetro de las colonias en MEA 30 mm, planas y bajas. El micelio penetra en el

medio. conidiognesis abundante, formando masas caractersticas de conidios verdes de
apariencia pulverulenta, que se desprenden en gran nmero cuando se agita la placa.
Reverso verde plido.
Dimetro de las colonias en G25N 20 mm, finamente surcadas radialmente,

profundas y densas. Reverso amarillo.
Estipes de paredes speras, sosteniendo penicilios terminales terverticilados de
elementos largos y muy juntos. Generalmente dos ramas por penicilio. Filides
ampulifonnes. Conidios elipsoidales, de paredes lisas, dispuestos en largas columnas
paralelas, que en MEA se adhieren formando masas.
Las colonias de P. crustosum en CYA son verde oscuro, pero verdeazuladas en los
mrgenes. Todos los elementos del conidiforo son largos, y las paredes de los estipes son
speras. Tras el crecimiento en MEA durante 7-10 das, P. crusaosum produce gran cantidad
de conidios, que se liberan con facilidad cuando se agita la placa. Este carcter es decisivo
y sumamente til en la identificacin de esta especie.
81
TV.
IV- Resultados
Fotografla 7.- Anverso (a) y reverso (b) de las colonias de P. crustosum crecidas en
CYA, MEA y GZ5N. En c se puede observar la estructura del penicilio y la morfologa
de los conidios.
82
IV Resultados
-
Penicillium simplicissimum
Subgnero: Furcatum
Sector: Furcatum
Dimetro de las colonias en CYA 46 mm (tpicamente 40-50), surcadas radialmente.
Micelio denso, blanquecino. Conidiognesis moderada, de color tpicamente verde grisceo.
Reverso tpicamente plido. No germinacin a 50C, y a 370C colonias de 7 mm.
La mayora de los aislamientos del hemisferio norte crecen a 370C, pero muchos
de Australia y Nueva Zelanda no; estos aislamientos del sur crecen a veces a 50C (Pitt,
1991).
Dimetro de las colonias en MEA 45 mm (tpicamente 40-50 mm), planas y

aterciopeladas. Micelio blanco. Conidiognesis moderada, de color Verde grisceo. Reverso
plido.
Dimetro de las colonias en G25N 18 mm, arrugadas y flocosas (peludas). Micelio

blanco. Reverso plido.
Estipes de paredes no muy speras, de los que parten verticilos a veces irregulares
de mdulas y ramas bien definidas, y muy raramente conidiforos o mdulas fuera de la
posicin terminal o subterminal. Verticilos de 2-3 mdulas de paredes speras. Fialides
ampuliformes, que se estrechan abruptamente dando lugar a un largo cuello del que parten
conidios esfricos o subesferoidales, de paredes gruesas y dispuestos en cadenas
desordenadas.
Los conidios son muy variables en forma entre aislamientos, y frecuentemente

incluso dentro de una misma preparacin microscpica (Pitt, 1991).
83
IV. Resultados
-
Los aislamientos de P. simplicissimum crecen rpidamente a 25<C, formando
colonias relativamente profundas debido a la longitud de los conidiforos. Estos
conidiforos son caractersticos: los estipes son largos y gruesos, de paredes speras, con
mdulas terminales o subterminales y ramas. Los conidiforos cortos y las mdulas

intercalares son muy infrecuentes.
84
11/.- Resultados
Vb
Fotografa 8.- Anverso (a) y reverso (b) de las colonias de P. simplicissimum crecidas
en CYA, MEA y GZ5N. En e se puede observar la estructura del penicilio y la
morfologa de los conidios.
85
IV- Resultados
IV.2.- Esporulacin en cepas representativas
Tabla 12a.- Esporulacin de cepas representantes en diversos medios de cultivo
Nmero 2%
YMA YEGP EM PDA GOR VS VS/lO
de cepa NaC
lE + + + + +
2E
3E + + + + + +
4E + + + + - + +
lOE + + + + + + +
14D
24E 1 + + + + + .+ + +
26E 1 + + + - + + +
27E 1(1)
27E1(2) + + - + + + +
29E1 + + + + + + + +
30E 1
32E 1 + + + + +
33E 1(1)
33E1(2)
34E1(l) + + + - +
34E1(2) + + + + + +
35E1(l) + + - +
35E1(2) + 4. + - +
36E 1 + + + + - + - +
38E 1
39E2 + + + + + 1+ + +
86
IV. - Resultados
Tabla 12b.- Esporulacin de cepas representantes en otros medios de cultivo
Nmero EMB ~c AA-1 AA-2 AA-3 CMA SF04 SPO-2

de cepa
lE + +
2E
3E + + + +
4E + + + + + +
lOE + + + +
14D
24E1 +
26E 1 +
27E1(l)
+ + +
27E1(2) + + +
+ + + +
29E1 + +
30E 1
32E 1 +
33E 1(1)
33E1(2)
34E1(1) +
34E1(2) + +
35E1(1) + + + + +
35E1(2)
36E 1 +
38E 1
39E2 +
+ = presencia de ascosporas en el medio.

- ausencia de ascosporas observadas.
87
u
3 IV- Resultados
E
a jo
u :i~L Si
E
E
E cte.
u 19
u
88
u
IV. Resultados
-
LS
a%a~. a
Fotografas 9 a 18. Clulas de levadura crecidas en el medio de esporulacin VS/lO

durante 28 das a 200C. 9: Z. rouxii cepa 32E1; en el centro de la imagen, dos clulas
conjugadas, y dentro de una de ellas la presencia de dos esporas. 10: D. hansenil cepa
4; sealadas con flechas, clulas conjugadas con sus yemas y una gran espora de pared
gruesa en el interior de las clulas madre. 11: L orientalis cepa 27E1(1), clulas sin
esporular. 12: T. delbrueekii cepa 27E1(2); en el centro de la imagen, dos clulas
conjugadas, unidas por un grueso tubo de conjugacin, y en el interior de una de ellas
cuatro esporas, tres de ellas visibles. 13: C. glabrata cepa 28E2, clulas vegetativas. 14:
S. cerevislee cepa 29E1; sealada con una flecha, clula que contiene en su interior
cuatro esporas situadas en dos planos, de las que se observan tres. 15: L. elongisporus
cepa 33E11), clulas sin esporular; 16: P. gulliermondil cepa 38E1, clulas no
esporuladas. 17 y 18: S. octosporus; en 17, sealada con una flecha, clula en divisin
mediante fisin, en la que se aprecia la formacin de un tabique central; en 18, clula
con ocho esporas en su interior.
89
IV- Resultados
IV.3.- Reproduccin de las alteraciones
IV.3.t- Reproduccin de olor a petrleo y/o gas
Tabla 13.- Reproduccin de olor a petrleo y/o gas por las cepas de levaduras
aisladas de productos de mazapn
Cepa Especie Olor Gas Cepa Especie Olor Gas
lE Z rouxii + + 26E3 7 rouxii +
2E Z. + + 26E4 7 rouxii + +
3E D. hansenu + 29E 1 S. cerevzszae

4E D. hansenii + 29E2 S. cerevisiae
lOE D. hansenii + 29E3 S. cerevisiae
14D Z. rouxii + + 30E 1 L. elongisporus
14E 1 7 rouxii + + 30E2(l) S. cerevisiae

14E2 7 rouxii + + 30E2(2) S. cerevisiae
14E4 7 rouxii + 30E3 S. cerevszae
lSD Z. rouxii - + 30E4 S. cerevisiae
16D 7 rouxi - + 32E 1 Z. rouxii + +
16E 1 7 rouxi + + 32E2 7 rouxii + +
16E2 7 rouxii + + 32E3 Z. rouxii + +
1 6E3 7 rouxii + + 32E4 Z. rouxii + +
1 6E4 7 rouxii + + 33E1(l) L. elongisporus

17D Z. rouxii + + 33E1(2) L. elongisporus
lSD 7 rouxii + + 33E2(l) L. elongisporus
1 8E 1 7 rouxu + 4. 33E2(2) L. elongisporus
1 8E2 7 rozan + + 33E3 L. elongisporus
1 8E3 Z. rouxii + + 33E4 L. elongisporus
1 8E4 7 rouxii + + 34E 1(1) 7 rouxii + +
19D 7. rouxii + + 34E1(2) Z. rouxii + +
90
1V- Resultados
20D 7 rouxu + + 34E2 7 rouxii + +
20E2 7 rouxu + 34E3 7 rouxii + +
20E3 7 rouxu + + 34E4 7 rozaii + +
2OE4 7 rozan - + 35E1(l) 7 rouxii + +
21D z. rozni - + 35E1(2) 7 rouxii + +
22E 1 z. rozan + + 35E2(1) 7 rouxii + +
22E2 7 rouxu - + 35E2(2) Z. + +
22E3 7 rozan + + 35E3(1) 7 rouxii + +
22E4 7 rouxu + 35E3(2) 7 rouxii + +
24E1 7 rouxu + + 35E4 7 rouxii + +
24E2 7 rouxu + + 36E1 Z. + +
24E3 a rouxn + + 36E2 Z. rouxii + +
24E4 a ronz + 36E3 7 rouxii + +
26E 1 7 rouxu + + 36E4 Z. + +
26E2 a rozan + +
Medio experimental: Caldo Nutritivo + 600 gIL sacarosa + 0,5 g/L sorbato potsico.
Tabla 14.- Reproduccin del olor a petrleo por las cepas de levaduras aisladas de
materias primas
27E 1(1) L orientalis 28E2 C. glabrata - -
27E1(2) T. delbrueckii 28E3(1) C. glabrata - -
27E2(l) L orientalis 28E3(2) C. glabrata - -
27E2(2) T. delbrueckii 28E4(l) C. glabrata - -
27E3(l) L orientalis 28E4(2) C. glabrata - -
27E3(2) T. delbrueckii 28E4(3) C. glabrata - -
91
IV. Resultados

Fotografa 19.- Reproduccin de la formacin de gas, tras 5 das de incubacin a 280C,

por cepas productoras de olor a petrleo. De izquierda a derecha, los cultivos
corresponden a las cepas 3E y 4E (D. hansenil) y 14D, lE y 24E1 (Z. rouxifl.
Tabla 15.- Reproduccin a petrleo por las cepas de levaduras aisladas de otros
productos altamente azucarados
38E1 P. guilliermondii - - 39E2 octosporus - +
38E2 P. guilliermondil - - 39E3 S. octosporus - +
38E3 P. guilliermondii - - 39E4 S. octosporus - +
38E4 P. guilliermondil - -
Medio experimental: Caldo Nutritivo + 600 g/L sacarosa + 0,5 g/L sorbato potsico.
92
IV. Resultados
Tabla 16.- Reproduccin del olor a petrleo por los hongos filamentosos aislados
de distintas muestras
Cepa Especie Olor Cepa Especie Olor
Hl P. chrysogenum + H5 P. chrysogenurn +
H2 P. crystosum + H6 P. simplicissimuin +
H3 P. chrysogenutm + H7 A. niger +
H4 P. chrysogenum +
IV.3.2.- Reproduccin de las licuefacciones puntuales
Fotografa 20.- Reproduccin de la licuefaccin puntual en pasta de almendra por las

cepas de levadura ensayadas. La zona licuada (abajo) corresponde a la inoculacin en
superficie, y la menos alterada (arriba) a la inoculacin en profundidad.
93
IV. - Resultados
IV.3.2.1.- Reproduccin in situ. Para la reproduccin in situ de la alteracin, es

decir, sobre el propio sustrato -pasta de almendra- se inocularon las cuatro cepas de 7
rozaii correspondientes a los primeros aislamientos de la muestra M32, 34E1(l) y 34E1(2),
y de la muestra M33, 35E1(1) y 35E1(2). La licuefaccin en las porciones de pasta de
almendra fue positiva para las cuatro cepas ensayadas, efecto que recoge la Fotografa 20.
IV.3.2.2.- Reproduccin en medios experimentales
Tabla 17.- Reproduccin en medios de composicin similar al sustrato original
Medio 0,1% sorbato Lectura*

+ Licuefaccin
66% (p/p) sacarosa +
34% (p/p) almendra Licuefaccin
+ Slo crecimiento
1% (p/p) sacarosa +
99% (plp) almendra Slo crecimiento
+ Slo crecimiento
660 gIL sacarosa +
5 g/L almendra Slo crecimiento
+ Viraje del indicador

66% sacarosa +
azul de bromofenol Viraje del indicador
+ yiraje del indicador

66% sacarosa +
rojo congo Viraje del indicador

66% sacarosa +
verde de bromocresol Viraje del indicador

66% sacarosa +
rojo de metilo Viraje del indicador
* Las cuatro cepas ensayadas -34E1(l), 34E1(2), 35E1(1), 35E1(2)- dieron

los mismos resultados.
94
1V- Resultados
Fotografa 21.- Efecto del crecimiento de la cepa 34E1(1) de Z. rouxii en los medios
con 66% de sacarosa + 34% de almendra (plv) -a la izquierda.~, y con 1% de sacarosa
y 99% de almendra (plp) -a la derecha-. En el primer medio no se observa ningn
efecto, mientras que en el segundo se aprecian cuatro puntos donde el crecimiento de
la levadura ha provocado la prdida de masa slida, rodeados de una zona con el
mismo aspecto licuado que se aprecia en las Fotografas 2 y 20.
95
IV- Resultados
Tabla it- Estudio de distintas actividades enzimticas relacionadas
Medio % azcar (plv) 0,1% sorbato Lectura (halos)

+
5% glucosa +
Chalk agar
(acidificacin) +
66% sacarosa
Gorodkowa + 5% 0,1% glucosa +

aceite de almendra
+
(lipolisis) 66% sacarosa
-
Agar tnbutirina 0,5% glucosa -
(lipolisis)
+
66% sacarosa
Base agar tributirina + 0,5% glucosa +

aceite de almendra
+
(lipolisis) 66% sacarosa
1% glucosa +
YMA + 1% gelatina
(proteolisis) +
66% sacarosa
0,5% glucosa +
Agar de Frazier
(proteolisis) +
66% sacarosa
1% glucosa +
YMA + 1% almidn
(amilolisis) +
66% sacarosa
+
0,5% glucosa
Agar pectina
(pectinolisis) +
66% sacarosa
96
IV Resultados
-
IV.4.- CMI de cido srbico para cepas seleccionadas
Tabla 19.- CMI en gIL de cido srbico para cepas de levadura aisladas de productos
de mazapan
MIC englucosa
1% (plv) de MIC englucosa
60% (plv) de
Nmero de cepa
lE <0,5 g/L 1,2 g/L

2E <0,5 gIL 0,9 gIL
3E <0,5 gIL 0,9 gIL
lOE <0,5 gIL 1.2 gIL
14D <0,5 g/L 0,8 g/L
24E1 <0,5 gIL >1,2 g/L
26E1 <0,5 gIL >1,2 gIL
32E1 <0,5 gIL 1,2 g/L
Rango de concentraciones de cido srbico ensayadas: 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0,
1,2 gIL.
IV.5.- Identificacin del compuesto responsable del olor a petrleo
Como se mencion en el Apartado 111.9 de Material y mtodos, Marth et al. (1966)

describieron por primera vez la capacidad de algunos hongos del gnero Penicillium de
descarboxilar el sorbato a 1,3-pentadieno, compuesto con un caracterstico olor a petrleo,
pinturat o hidrocarburo, como el detectado en algunas muestras de este trabajo. La
Figura 1 muestra el cromatograma del 1,3-pentadieno patrn (la); el pico corresponde a la
inyeccin de 1 pL del compuesto, cuyo espectro de masas aparece debajo (lb). En la
Figura 2 se muestran el cromatograma (2a) y el espectro de masas (2b) correspondientes
a la inyeccin de 1 pL de otro compuesto patrn, isopreno (2-metil-1,3-butadieno). Tanto
el tiempo de retencin como la fragmentacin m/z del segundo compuesto son coincidentes
con los del pentadieno patrn.
97
IV- Resultados
Ambos compuestos, como se observa en las Figuras la y 2a, poseen un tiempo de

retencin de 1,5 minutos; la fragmentacin m/z, que aparece en las Figuras lb y 2b, es la
siguiente: 27, 39, 53, 67.
Por su parte, las Figuras 3 a 9 muestran los correspondientes cromatogramas (3a a

9a) y espectros de masas (3b a 9b) de los metabolitos presentes en el gas de cabeza de los
cultivos de los microorganismos productores del olor a petrleo que se indican en cada
figura. Los tiempos de retencin de los picos del compuesto correspondientes a la cepa
representante de Z. rouxii -lE- (Figura 3a), D. hansenii -3E- (Figura 4a), S. octosporus
(Figura Sa), P. chrysogenum (Figura 6a), P. crustosum (Figura 7a), P. simplicissimurn
(Figura 8a) y A. niger (Figura 9a) son similares a los de los compuestos patrn. Asimismo,
los espectros de masas correspondientes a estos picos se asemejan a los de los patrones,
siendo la fragmentacin m/z muy similar en todos los casos. Los resultados se confirmaron
por comparacin con los espectros de masas del 1,3-pentadieno y el isopreno contenidos
en la base de datos del programa.
98
1
1 IV Resultados
-
u Abu~dance
1 iOOO
6000
2000
lO 20 40 0 6.0
Abn,dance
loo
3
E 60
.101 u1
=1.
1 20
~2 tt,~~-~-i ..,
63
u 30
M
60 0
t un~I
E
1 FL9w-o-2
99
u
IV. Resultados
-
Figura 1.- Cromatograma (a) y espectro de masas correspondientes a la inyeccin de 1 pL

de 1,3-pentadieno (mezcla de ismeros cis y trans) patrn.
Figura 2.- Cromatograma (a) y espectro de masas coaespondiente~ a la inyeccin de 1 pL

de isopreno (2-met 1,3-butadieno) patrn.
Las siguentes figuras representan el cromatograma (a) y espectro de masas obtenidos

por la inyeccin de 1 gL del gas de cabeza de un cultivo de 4 das en el medio
experimental con sorbato de la cepa de hongo o levadura que se indica. El espectro
corresponde a los picos cromatogrficos de metabolitos cuya fragmentacin m/z contenga
un ion de valor 67, seleccionado a partir de los espectros de los compuestos patrn.
Figura 3.- Cepa lE de 7 rouxii. Esta figura representa a los cromatogramas y respectivos
espectros obtenidos para el resto de cepas de 7. rouxii: 2E, 14D, 24E1, 26E1, 32E1,
34E1(l), 34E1(2), 35E1(l) y 35E1(2).
Figura 4.- Cepa 3E de D. hansenii. Esta figura representa a los cromatogramas y

respectivos espectros obtenidos para el resto de cepas de D. hansenii: 4E y lOE.
Figura 5.- Cepa 39E3 (S. octosporus).
Figura 6.- Cepa Hl (P. chrysogenum). Esta figura representa a los cromatogramas y
respectivos espectros obtenidos para el resto de cepas de P. chrysogenum: H3, H4 y H5.
Figura 7.- Cepa H2 (P. crustosum).
Figura 8.- Cepa H6 (P. simplicissimum).
Figura 9.- Cepa H7 (A. niger).
1(X)
IV- Resultados
101
11/.- Re~sutados
bu nd at. o e
600
500
400
200
200
loo
O n i
19.> 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 1.00 9.00 9.00
~1
SiHdnce
80 39 69
53
4
60
40
20
O ~ 21 .1], r,fl,,fl
9T~1 rnmrT rTflVT
13> j9202224262*3022343638404244464950525456586062646667072776
FLguxo-S
rt3ia~G
1 (>2
11/.- Resultados
1 Abisodance
5000
800
00
400
u
200
2 4 8 9 lO 12 14 lO
l1,,e (mio.)
Abundance
9,
90
53
40
tI 30 it
30.
0
30
MastICh aro.
50 OC 70
1 h~icrcS
E
1
Abije dance
700
600
$00
400
300
200
100
o
1 M,undance
1.0 2.0 3,0 4.0
Tinte(osin.)
5.0 0.0 7.5
E
4
42
1
E 40 50
M.sCharg.
00 70
8
rj~x-o-
1 <)3
u
IV Resultados
-
Abllndanca
-o
3000
2000
1000
o
0 2 4 a 9 lO 12 14 58
Time (mIn4
Abundance
100 ej
53 99
80
lo
40 II
31
20
0 30 A
Malial.rga50 70
Fi.gLLraS
1(>4
IV.- Resultados
V.6.- Cuantificacin de pentadieno producido a partir de sorbato
IV.6.L- Cuantificacin de sorbato
Para el clculo de la concentracin de sorbato presente en las distintas muestras, sc

construy previamente una curva de calibracin a partir de las tres diluciones de la solucin
patrn. La Figura 10 muestra el cromatograma obtenido por la inyeccin de una de estas
diluciones.
.10
~
E 50
40
o,
30
20
Ifl
5 10 15 20 25
Time Unir.)
Figura 10. Cromatograma (HPLC) correspondiente a la dilucin menos concentrada de la

solucin patrn de cido srbico, 0,008 gIL. El volumen inyectado fue de 20 pL y la
deteccin espectrofotomtrica se llev a cabo a 264 nm. El pico obtenido present un
tiempo de retencin de 21,17 minutos.
105
11/.- Resultados
La relacin entre las reas medias calculadas para las tres diluciones y sus
respectivas concentraciones dio lugar a una curva de calibracin donsistente en una recta
de regresin definida por la siguiente ecuacin:
Y = 1,078 x 104X + 3,010 x 101
donde:
X = rea media del pico obtenida de las dos inyecciones.
Y = concentracin de sorbato en g/L.
Desviacin estndar (a) = O

Varianza (&) = O
Coeficiente de correlacin (r) = 1,00
Coeficiente de determinacin (r2) = 1,00
IV.6.l.l.- Recuperacin de sorbato de los medios sin inocular. La concentracin de sorbato

recuperada de los medios sin inocular se calcul, aplicando la recta de regresin
mencionada en el apartado anterior, a partir de las reas de los respectivos picos
cromatogrficos. En la Figura 11 aparece el cromatograma obtenido por la inyeccin de una
de estas muestras.
106
IV- Resultados
Figura 111. Cromatogrania (HPLC) correspondiente a un medio con una concentracin

afiadida de 1 gIL de sorbato potsico. El residuo extraido se resuspendi en 2 mL de
metanol y se realiz una nueva dilucin 1/100 en el mismo disolvente. El volumen
inyectado fue de 20 pL y la deteccin espectrofotomtrica se llev a cabo a 264 nm. Se
observa la coincidencia en el tiempo de retencin del pico principal con el del pico del
patrn, as como la aparicin de un pico secunadario.
1 (>7
IV- Resultados
Las concentraciones de sorbato recuperadas a partir de los distintos medios, as

como los porcentajes de recuperacin calculados a partir de las mismas, se recogen en la
Tabla 20.
Concentracin Concentracin Porcentaje de Coeficiente de

inicial (gIL) recuperada (gIL) recuperacin (%) recuperacin (%)
0,25 0,20 80,66
0,50 0,44 88,30 84,24
1,00 0,83 84,24
Tabla 20. Determinacin de sorbato a partir de tres concentraciones conocidas. Los

valores consignados corresponden a la media de dos inyecciones de HPLC. De las
concentraciones de sorbato calculadas respecto de las esperadas se obtuvieron tres
porcentajes de recuperacin, uno para cada concentracin inicial de sorbato. La
media de los tres porcentajes (coeficiente de recuperacin) es el valor aplicado a las
concentraciones de sorbato determinadas en las muestras inoculadas.
IV.6.l.2.- Determinacin de sorbato en los medios inoculados. La cuantificacin del sorbato

presente en los medios inoculados se realiz segn la metodologa anterior. En las Figuras
12 y 13 se muestran los cromatogramas obtenidos de dos de estos medios inoculados,
respectivamente, con 7 rouxii y D. hansenii, siendo la concentracin inicial de sorbato de
1 gIL en ambos casos.
108
IV- Resultados
5 10 15 20 25
Timo (mm.)
AL
D
ct
E
5 10 15 20 25
Timo CmIn. )
%ao~ 3
Figuras 12 y 13. Cromatograma HPLC correspondiente al cid srbico recuperado tras

la incubacin durante cuatro das con la cepa lE de 7 rozad (Figura 12) o 3E de D.
hansenii (Figura 13). El extracto se resuspendi en 2 mL de metanol, de los que se inyect
un volumen de 20 1.iL y la deteccin espectrofotomtrica se llev a cabo a 264 nm.
109
IV- Resultados
En la Tabla 21 se recogen las concentraciones de sorbto recuperadas de los

distintos medios incubados, calculados a partir de las reas de sus picos respectivos.
Concentracin de sorbato (gIL)

Concentracin final
Concentracin inicial
Z. roaxil (Cepa lE) D. hansenii (Cepa 3E)
0,25 1,60 x 0~ 3,18 x l0~
0,50 3,14 x 1W 4,43 x 1W
1,00 9,85 x 1W 5,23 x 1W
Tabla 21. Cuantificacin de sorbato en los medios de cultivo despus de cuatro das
de incubacin de los mismos con 7 rouxii (cepa lE) o D. hansenii (cepa 3E)
(concentracin final). Los valores consignados representan la media de los
triplicados incubados para cada concentracin y de las inyecciones de HPLC por
duplicado, tras aplicar el coeficiente de recuperacin calculado como se indica en
la Tabla 20.
IV.6.2.- Cuantificacin de pentadieno
La relacin entre los volmenes de pentadieno patrn inyectados en los viales de

medio de cultivo estril y su respectiva abundancia mxima medida del ion 67 en el
espectro de masas dio lugar a una curva de calibracin consistente en una recta de
regresin definida por la siguiente ecuacin:
Y = 376,68 X - 618,647,
donde:
X = volumen de pentadieno inyectado en pL.
Y = abundancia mxima del ion 67.
Coeficiente de correlacin (r) = 0,927533

Coeficiente de determinacin (9) = 0,8603 17
lo
IV.- Resultados
Mediante esta recta de regresin, la abundancia mxima del ion 67 medida en cada
muestra se transform en volumen de pentadieno producido, valores que recogen las Tablas
22 y 23.
Volumen de Pentadieno producido (pL)

1 rouxii (cepa lE) Concentracin inicial de sorbato (gIL)
Tiempo (das) 0,25 0,50 1,0<)

DaO O O O
Dial O O O
Da 2 3,12 3,85 5,00
Da 3 3,85 5,96 8,67
Da4 3,91 7,27 11,11
Volumen de Pentadieno producido (pL)

D. hansenii (cepa 3E) Concentracin inicial de sorbato (g/L)
Tiempo (das) 0,25 0,50 1,00

DaO O O O
Dial 0 0 0
Da 2 2,26 3,43 10,89
Da 3 2,42 3,55 12,58
Da 4 2,82 4,85 19,44
Tablas 22 y 23. Resultados de la determinacin cuantitativa de la produccin de

1,3-pentadieno por la cepa lE de 7 rouxii (Tabla 22) y 3 de D. hansenii (Tabla
23). El primer anlisis (da O) se realiz justo despus de la inoculacin de la
levadura. Los valores de la tabla representan la media de las tres determinaciones
para cada concentracin.
111
EJ BU OTEO A
IV- Resultados
IV.6.3.- Recuentos celulares
Z. rouxii (cepa lE)
Recuentos iniciales Concentraciones de Recuentos finales Varianza

(UFC/mL) sorbato (gIL) (UFC/mL)
0,00 5,0 x 106
0,25 3,6 x 106 5,33333

4,0 x o~
0,50 4,0 x 106 3
1,00 4,0 x 106 1
Tabla 24. Recuento de clulas de 7 rouxii (cepa lE) en los medios con distintas
concentraciones de sorbato antes de la incubacin (recuentos iniciales) y despus
de 4 das de incubacin de los mismos (recuentos finales). En el caso de los medios
con 0,25, 0,50 y 1,00 gIL de sorbato, los valores corresponden a la media de los
recuentos de los triplicados; junto a la media, aparece la varianza de los tres
valores.
Test de ANOVA para el conjunto de recuentos finales:

F = 0,14286
p = 0,93057
Para un nivel de significacin a = 0,05, las medias NO SON significativamente diferentes.
112
IV- Resultados
D. hansenii (cepa 3E)
Recuentos iniciales Concentraciones de Recuentos finales Varianza

(UFCImL) sorbato (gIL) (UFC/mL)
0,00 7,5 x 1(19
0,25 1,5 x 10~

1,5 x 106
0,50 1,0 x o~
1,00 1,6 x o~
Tabla 25. Recuento de clulas de D. hansenii (cepa 3E) en los medios con distintas
concentraciones de sorbato antes de la incubacin (recuentos iniciales) y despus
de 4 das de incubacin de los mismos (recuentos finales). n el caso de los medios
con 0,25, 0,50 y 1,00 gIL de sorbato, los valores correspoden a la media de los
recuentos de los triplicados; junto a la media, aparece la varianza de los tres
valores.
Test de ANOVA para el conjunto de recuentos finales:

F = 50,2399
p = 1,20977 x l0~
Para un nivel de significacin a = 0,05, las medias SON significativamente diferentes.
Test de ANOVA excluyendo el valor (recuento) correspondiente al medio sin sorbato:

F = 1,12315
p = 0,38519
Para un nivel de significacin a = 0,05, las medias NO SON signiflcativamente diferentes.
113
u
u
u
u
u
E
u
u
u
u
1
u
u
u
u
u
u
U V.- DISCUSIN
u
u
u_
Y Discusin
-
Vi- Caracterizacin de microorganismos aislados
Todas las bacterias aisladas (Bl-B5 de M32, B6-BlO de M33 y B1l-B17 de M35,
respectivamente) fueron bacilos grampositivos aerobios y esporulados, con espora central
no deformante, que se pueden identificar como Bacillus sp.. Estas bacterias, probablemente
presentes en las muestras en forma esporulada debido a las condiciones adversas de a~,
como se refiri en la Introduccin (Apartado 1.2), no son capaces de germinar y
multiplicarse, y por tanto no contribuyen al deterioro del producto, ya que no reprodujeron
ni el olor a petrleot ni la licuefaccin puntual, por lo que su presencia en estas muestras
no ser tenida en cuenta en los siguientes apartados.
V.1.1.- Levaduras
Antes de comenzar la descripcin de la especies aisladas de cada uno de los

sustratos, cabe mencionar que todas estas especies pertenecen a los Ascomicetos, y no se
aisl ninguna levadura perteneciente a los Basidiomicetos.
En la Tabla 8 se recogen las levaduras aisladas a partir de las muestras indicadas

de mazapn y productos relacionados, muestras que se describieron previamente en la Tabla
4 de Material y mtodos.
Las muestras Ml a M5 (pasteles de yema) y M6 a MiO (pasteles de gloria),

procedentes de devoluciones, se almacenaron a temperatura ambiente durante dos aos
antes de su anlisis. A pesar de mantenerlas en enriquecimiento un largo perodo de tiempo
(30 das), slo se recuperaron levaduras en cuatro muestras de las diez analizadas (M, M,
M7 y M9). Lo ms destacable es que aunque el enriquecimiento se realiz simultneamente
en YMB, con 10 gIL de glucosa, e YMBG, con 330 gIL de glucosa, el aislamiento de las
cepas tuvo lugar slo a partir de YMBCI. De los resultados obtenidos del anlisis de estas
muestras antiguas se derivan las siguientes consideraciones. Para que la alteracin de un
producto se haga evidente, la poblacin inicial que lo contann debe multiplicarse hasta
alcanzar cierta magnitud, que en mazapn suele ser del orden de 106 clulas de levadura
115
Y- Discusin
(UFC)Ig (Tilbury, 1976; Jermini et aL, 1987; Tudor y Board, 1993). A medida que la
levadura se desarrolla, el sustrato se va transformando en un entorno adverso por prdida
de nutrientes y humedad, acumulacin de metabolitos, etc., con lo que se produce un
descenso en el nmero y viabilidad de la poblacin de levaduras y la presencia de stas
puede pasar desapercibida al no poder recuperarse en medios tradicionales. Este efecto se
debe en parte al choque osmtico que supone el paso desde dn sustrato con elevada
presin osmtica ejercida por la presencia en elevada cantidad de un soluto (azcar o
cloruro sdico) a un medio donde la concentracin de soluto es drsticamente menor (El
Halouat y Debevere, 1996). Parece adems que las clulas de levadura en fase estacionaria
son ms sensibles al choque osmtico (Jermini a aL, 1987).
El empleo de medios de cultivo y diluyentes con elevada concentracin de azcar

se ha convertido en una metodologa muy extendida (Restaino et al.. 1983; Deak y
Beuchat, 1996). Resulta especialmente til para la recuperacin de levaduras que por su
bajo nmero yio estado fisiolgico necesitan medios que reproduzcan lo ms fielmente
posible el entorno en el que se encuentran, pues se reduce el efecto del choque osmtico
(Deak y Beuchat, 1996; El Halouat y Debevere, 1996). Las concentraciones de azcar
incorporadas a los medios de cultivo para este fin son diversas: 2, 40 60% (p/v) de
glucosa (Windisch a al, 1978a); sacarosa, glucosa o fructosa en concentracin =60%(p/v)
(Windisch et al, 1978b), aunque el crecimiento en medios con sacarosa fue menos
abundante que en medios con glucosa o fructosa; 40% (plp) de sacarosa, a.~ 0,96 (El
Halouat y Debevere, 1996); 50% (p/p) de glucosa (Jermini a al., 1987); 60% (p/p) de
glucosa, a~ 0,82 (Zimmerly, 1980); 30, 50 y 60% (p/p) de glucosa para medios de
enriquecimiento en lquido y de aislamiento en slido (Taing ok y Hashinaga, 1997).
Los valores de a~ conseguidos por la adicin de distintas concentraciones de glucosa

a un medio base, segn El Halouat y Debevere (1996), se refieren en la Tabla 26.
116
Y- Discusin
Tabla 26.- Valores de a. obtenidos por la adicin de distintas concentraciones de

glucosa a una solucin acuosa al 0,5% (plp) de extracto de levadura, con y sin agar.
% Glucosa 30 40 45 50 55 60 65 70
a.~ (lquido) 0,96 0,94 0,92 0,90 0,88 0,84 0,80 0,76
a.,< (slido) - 0,93 0,92 0,90 0,87 0,83 0,79 0,74
Modificado de El Halouat y Debevere (1996).
Golden y Beuchat (1990, 1992b), para mejorar la deteccin de levaduras osmfilas

en productos azucarados, emplean medios generales (YMA, YMB) a los que complementan
con glucosa, sacarosa o NaC. Cuando se emplea YMB como medio de crecimiento la a~
es de 0,99, mientras que los productos altamente azucarados tienen una a~ reducida, como
se muestra en la Tabla 2 de la Introduccin. Golden y Beuchat (1992b), para reducir la a~
hasta 0,93, incorporan al YMB distintos solutos, cada uno en su correspondiente
concentracin (p/v): glucosa 33%, sacarosa 45%, o NaC 10%. La adicin de un 1,5% de
agar para obtener los correspondientes medios slidos no vari de forma perceptible la a.~,
como tambin se observa en la Tabla 26, aunque Tilbury (1976) refiere que para un mismo
valor de a el contenido en agua total es mayor en liquido que en slido, ya que la a~
mnima necesaria para el crecimiento de levaduras osmotolerantes es ms baja en medios
lquidos que en slidos.
Yarrow (1998) recomienda, como medios slidos para el aislamiento directo de

levaduras osmotolerantes y osmfilas a partir de alimentos, medios como YPG o YMA que
contengan de 30 a 50% (p/v) de glucosa. Estos medios, con las mismas concentraciones
de azcar, pueden emplearse en lquido para el enriquecimiento de los cultivos.
Para procesar las muestras de productos altamente azucarados contaminados con

levaduras, es recomendable su homogeneizacin directa en caldo enriquecido con azcar
(Jermini a aL, 1987; El Halouat y Debevere, 1996; Taing ok y Hashinaga, 1997). Cuando
adems se quieren realizar recuentos, se debe realizar la serie de diluciones decimales en
117
Y- Discusin
un diluyente ajustado a un valor bajo de a,~, aadiendo 40 50% de glucosa (Tilbury,

1976; Deak y Beuchat, 1996); independientemente del soluto que reduce la a,, en el sustrato
de origen, Golden y Beuchat (1992b) recomiendan el empleo de YMB suplementado con
glucosa, y luego sembrar en el correspodiente medio slido que contenga glucosa, sacarosa
o NaC (33, 45 10% plv, respectivamente). Cuando el soluto empleado en el medio slido
es la glucosa, se favorece la recuperacin de las levaduras.
Por tanto, los medios de cultivo con alta concentracin de azcar son recomendables
para la recuperacin de levaduras osmotolerantes porque constituyen un medio apropiado
de enriquecimiento selectivo para las mismas, y porque reducen la prdida de viabilidad
debida al choque osmtico (Jermini a aL, 1987). Los resultados consignados en la Tabla
8 confirman la utilidad de emplear medios de cultivo que reproduzcan lo ms fielmente
posible las condiciones del sustrato original, en este caso con a,, disminuida. As, el medio
YMBG permiti recuperar levaduras que, debido a las condiciones de tiempo y
conservacin de las muestras, deban encontrarse daadas yio en bajo nmero.
Respecto al anlisis de la muestra Mli (pan de Cdiz), puesto que se realiz el

mismo ao de su elaboracin y por tanto la aparicin de la alteracin era reciente, las
levaduras se pudieron recuperar por aislamiento directo mediante mtodos tradicionales, as
como por mtodos de enriquecimiento. Al analizar por separado distintas porciones de esta
muestra (Ml la-Ml d), a partir del relleno inferior (Ml lc) slo se aislaron levaduras a
partir de YMBG, lo que indica que estas levaduras estaban en bajo nmero y slo pudieron
recuperarse en las condiciones de a,, ms favorables.
Un hecho a destacar es el anlisis de las muestras M12 a M16, de pasteles de yema:

aunque las muestras M13-M15 no estaban alteradas, se incluyeron en esta tabla junto con
M12 Y M16, que si presentaban la alteracin caracterstica, por pertenecer al mismo lote
de fabricacin. Como era de esperar, de las muestras alteradas se aislaron levaduras,
mientras que de las no alteradas no se aisl ninguna; el aspecto ms interesante es conocer
por qu ciertos productos resultan finalmente alterados y otros no, estando confeccionados
ambos con las mismas materias primas y siendo sometidas al mismo proceso de fabricacin
hasta su envasado. Las posibles causas de esta diferencia se discutirn ms adelante.
118
Y- Discusin
En la Tabla 8 se observa que del medio de enriquecimiento YMBG, en el cual se

mantuvieron en incubacin las muestras anteriores -adems del aislamiento directo realizado
de la muestra Mil-, se recuperaron levaduras ya en la primera resiembra, a los tres das
de incubacin (El) de las muestras Mil, M12 y M16. Sin embargo, fueron necesarios 7
das de incubacin de las muestras M6 y M9, y 14 das de Ml y M7 para aislar levaduras
del medio de enriquecimiento con 330 gIL de glucosa. Esta diferencia tambin sugiere que
en las muestras antiguas las levaduras se encontraban daadas y por eso tardaron ms en
desarrollarse.
La identificacin de las especies de levadura aisladas de productos alterados de

muestras de mazapn se muestra tambin en la Tabla 8. Como puede observarse, la especie
que se asla mayoritariamente, con 36 aislamientos de un total de 39 cepas, corresponde
a 21 rouxii. Esta especie, como ya se refiri en la Introduccin, <es la que se asla con
mayor frecuencia de alimentos altamente azucarados, pero adems los estudios realizados
sobre muestras de mazapn alterado apuntan a la levadura Z. rouxii como principal agente
causante (Windisch, 1969; Tilbury, 1976; Jermini a al., 1987); los efectos de esta
alteracin se deben fundamentalmente a la actividad fermentativa de esta levadura
(Blaschke-Hellmessen y Teuschel, 1970; Seiler, 1977; Tudor y Board, 1993). Sin embargo,
aunque en mucha menor proporcin (3 aislamientos de 39), tambin se ha aislado otra
especie de levadura, D. hansenii, que no es fermentativa.
Parece probable que, como seala Windisch (1969), cuando 21 rouxii contamina el
mazapn, la distribucin sea desigual, por lo que habr muestras contaminadas y otras no,
y puede ser necesario examinar un amplio nmero de muestras para detectar esta
contaminacin. En mazapn sin alterar, la incidencia de levaduras es escasa o nula, y la
presencia de 21 rouxii es rara; sin embargo, una vez que se ha producido la contaminacin
de una muestra, Z. rouxu se desarrolla (profusamente) en la masa de mazapn, a
temperatura entre 15-250C (Blaschke-Hellmessen y Teuschel, 1970), teniendo lugar la
alteracin perceptible del producto. Esta presencia o ausencia de Z. rouxii en el mazapn,
as como su capacidad de propagarse en el mismo, pueden explicar que, dentro de un
mismo lote, las muestras M12 y M16 resultaron alteradas y M13-M15 no.
119
Y- Discusin
21 rouxii es una de las levaduras osmotolerantes mejor conocidas, aunque existe

cierta diversidad dentro de la especie respecto a la a,, mnima tolerada (El Halouat y
Debevere, 1997). Como ya se refiri en el Apartado 1.2.1 de la Introduccin, es capaz de
producir y acumular intracelularmente polioles como solutos compatibles, lo que permite
a cepas de esta especie crecer en sustratos con un valor de a,, tan bajo como 0,63. Algunas
cepas de 21 rouxii son adems halotolerantes, dependiendo de su origen, aunque la a,, en
este caso debe ser mayor (Tokuoka e Ishitani, 1991).
D. hansenii es una especie de levadura conocida por su elevada tolerancia a la sal

(Deak y Beuchat, 1996), aunque tambin es capaz de crecer en alimentos altamente
azucarados; de hecho, tambin se asla de estos ltimos, pero en menor proporcin que 21
rouxii (Jermini a aL, 1987; Praphailong y Fleet, 1997). Aunque se considera que el
mecanismo de tolerancia al azcar es distinto del de tolerancia a la sal (Tokuoka e Ishitani,
1991; Deak y Beuchat, 1996; laing ok y Hashinaga, 1997), incluso el mecanismo de
tolerancia a la glucosa y a la sacarosa puede ser diferente (Tokuoka e Ishitani, 1991; Deak
y Beuchat, 1996), la a,, mnima necesaria para el crecimiento de D. hansenii en medios con
sal y en medios con distintos azcares es similar, aproximadamente de 0,83 (ICMSF, 1991;
Tokuoka e Ishitani, 1991). A pesar de ser 21 rouxii el principal causante de deterioro en el
mazapn, D. hansenii tambin es responsable de la alteracin en productos realizados a
base del mismo, como los pasteles de gloria (muestras M y M7) que aparecen en la Tabla
4. Los valores de a,, del mazapn oscilan entre 0,67-0,79 y 0,75-0,80, segn el autor -datos
que aparecen en la Tabla 2 de la Introduccin (Apartado 1.2)-, por lo que el crecimiento
de DL hansenii estara en principio restringido, aunque la capacidad de tolerar elevadas
concentraciones de azcar vara de una cepa a otra (Windisch, 1969>. As, Praphailong y
Fleet (1997) hacen referencia a cepas de D. hansenil capaces de crecer en presencia de 60-
70% (p/p) de sacarosa. Es importante mencionar aqu de nuevo el fenmeno de adaptacin
al azcar referido en el Apartado 1.2.1 de la Introduccin, por el cual la preincubacin de
las levaduras en presencia de un azcar disminuye la a,, para el posterior crecimiento en
el mismo azcar. Sin embargo, tambin cabe destacar que la presencia de relleno -en este
caso boniato confitado-, con una humedad aproximada de un 29% (Casas a aL, 1996),
puede incrementar el contenido en agua de la masa de mazapn adyacente, alcanzndose
un valor de a~ ms favorable para el desarrollo de D. hansenu.
120
Y- Discusin
La Tabla 8 tambin recoge las cepas de levaduras aisladas e identificadas de

productos finales sin alterar. De las cuatro muestras analizadas, las especies de levaduras
identificadas a lo largo del perodo de enriquecimiento son 5. cerevisiae (29E1-29E4 de la
muestra M28 y 30E2(1)-30E4 de M29), L. elongisporus (30E1 de M29 y 33E1(1)-33E4 de
M31> y 21 rouxii (32E1-32E4 de M30), entre las cuales slo 7. rouxii es una de las
especies responsables del deterioro de productos finales, como se ha discutido
anteriormente.
El perfil taxonmico -tanto fisiolgico como morfolgico- de algunas cepas

incluidas como L. elongisporus (33E1(l), 33E2(l> y 33E2(2)), identificadas mediante el
programa informtico como D. hansenii, difiere sensiblemente del de las cepas de D.
hansenii causantes de alteraciones (3E, 4E, lOE) y se asemeja ms al de las cepas de L.
elongisporus (30E1, 33E1(2), 33E3 y 33E4). Este conjunto de cepas fue finalmente
asignado a la segunda opcin mostrada por el programa informtico, L. elongisporus, por
varias razones. En trminos morfolgicos, las clulas son ms irregulares que las cepas de
D. hansenii tpicas -3E, 4E y lOE-, como se aprecia comparando las Fotografas 15 y 10;
asimismo, la presencia de un pseudomicelio muy desarrollado es excepcional en las
especies de D. hansenii (Yarrow, 1984; Barnett a al., 1990); y la fcil deteccin de esporas
en las cepas tpicas de D. hansenii, como se discutir ms adelante, contrasta con la
ausencia total de estas formaciones en las cepas consideradas como L. elongisporus.
En trminos fisiolgicos, el hecho ms destacable es que, pese a haber sido aisladas

de productos de mazapn con sorbato, al igual que las cepas de D. hansenii, las cepas
identificadas como L. elongisporus no reprodujeron en ningn caso las alteraciones
estudiadas para las primeras. Por tanto, en este caso la correcta taxonoma de este conjunto
de levaduras no es crucial para este estudio, ya que su presencia en los sustratos de origen
no produjo ningn efecto negativo sobre los mismos. En cualquier caso, estas cepas de
identificacin incierta son un claro ejemplo de la utilidad de las tcnicas moleculares para
la identificacin de levaduras, descritas en el Apartado 1.4 de la Introduccin. En este
sentido, cabe destacar que, mediante la comparacin de ADNr, se ha determinado que L
elongisporus presenta una significativa asociacin filogentica con especies como D.
hansenii o C. guilliernondii (Cai a al., 1996).
121
Y- Discusin
La a mnima para el crecimiento de S. cerevisiae se sita generalmente alrededor

de 0,90 (ICMSF, 1991), por lo que no se la considera osmotolerante ni, como en este caso,
capaz de producir alteracin visible. Sin embargo, s existen referencias de cepas
osmotolerantes de S. cerevisiae capaces de crecer a un valor de a~ de 0,75, en miel, fruta
confitada, pasas, o productos de confitera (Deak y Beuchat, 1996).
Una vez ms, cabe hacer mencin de la utilidad del enriquecimiento en un medio
con elevada concentracin de azcar -YMBG-, que permite recuperar levaduras en un
nmero suficientemente bajo como para producir deterioro, pero que pueden proliferar en
el sustrato y llegar a desarrollar la alteracin, en este caso de la muestra M30 (pasteles de
yema, ver Tabla 4 de Material y mtodos). Adems, este procedimiento permiti aislar dos
especies de levaduras distintas a partir de una misma muestra; en al anlisis de la muestra
M29, la levadura identificada en el primer aislamiento -L elongisporus- fue distinta a las
identificadas en aislamientos posteriores -S. cerevisiae-, lo que implica que utilizando
mtodos de aislamiento de levaduras menos prolongados la presencia de levaduras en
menor nmero o de crecimiento ms lento que otras cepas podra pasar inadvertida.
Por ltimo, en la Tabla 8 se detalla el anlisis de dos muestras de pasta de

almendra, M32 y M33, con licuefacciones puntuales y olor a petrleo. Asimismo, se
recoge la identificacin de las cepas de levadura aisladas de turrn de frutas con olor y
sabor a petrleo (M35). La levadura aislada tras el perodo de incubacin fue en los tres
casos la misma, 21 rouxii. El agente responsable es, por tanto, el mismo que en otros
productos a base de mazapn, y la reproduccin de los efectos ser discutida ms adelante.
En la Tabla 9 se recoge la identificacin de las levadurs aisladas de distintos

ingredientes. Es importante mencionar que, de todas las materias primas y productos
intermedios analizados (ver Tabla 5 de Material y mtodos>, slo se aislaron levaduras de
las muestras de almendras (M22 y M23). Este resultado concuerda en principio con las
observaciones de Windisch a al. (1978a y b), que consideran que las levaduras
osmotolerantes responsables de la fermentacin del mazapn son introducidas en la fbrica
por las almendras. Sin embargo, estos autores no detectan estas levaduras cuando las
almendras que analizan estn peladas y blanqueadas, siendo esta ltima forma en la cual
122
E- Discusin
se recibieron en la fbrica las almendras que se analizaron para este trabajo. De hecho, se
puede observar que las especies encontradas (L orientalis, 71 delbrueckii y C. glabrata) no
son las mismas que se identifican como responsables de las alteraciones en los productos
finales de mazapn (21 rouxii y D. hansenii). Entre ellas, 71 delbrueckii es una especie
osmotolerante (Jermini et aL, 1987; Tokuoka e Ishitani, 1991); 1. orientalis es capaz de
deteriorar alimentos con elevado contenido de azcar o de sal (Tilbury, 1976); y resiste
hasta 0,8 gIL de cido srbico (Deak et aL, 1992); C. glabrata tambin puede alterar
alimentos altamente azucarados (Tilbury, 1976). Para el aislamiento de levaduras a partir
de estas almendras, como se cita en la Tabla 9, tambin se emple el medio de
enriquecimiento con 330 gIL de glucosa (YMBG) para favorecer la seleccin de
organismos omotolerantes, ya que slo stos sern potencialmente capaces de desarrollarse
en los productos finales y dar lugar a su alteracin.
Las cuatro muestras de azcar refinado analizadas (muestras M24 a M27 de la Tabla
5 de Material y mtodos) estaban libres de levaduras. Autores como Blaschke- Helmesen
y Teuschel (1970) tampoco encuentran levaduras osmotolerantes en el azcar, aunque s
en otras materias primas; por el contrario, Pouncy y Summers, en 1939, afirmaron que las
levaduras osmotolerantes son introducidas continuamente en las industrias con cualquier
forma de azcar que se recibe (Tudor y Board, 1993). Parece que los insectos (abejas,
avispas y moscas de la fruta) juegan un importante papel en la transmisin de levaduras
osmotolerantes entre frutas, miel o pilas de azcar sin refinar; incluso se han aislado cepas
de Candida apicola, D. hansenii y 1 rouxii del contenido abdominal de abejas y avispas
(Tilbury, 1976). La esterilizacin de los jarabes de sacarosa y el tefinado del azcar son
por tanto imprescindibles para su conservacin. As, el deterioro del azcar refinado
cristalizado es muy poco frecuente (Tilbury, 1976; Tudor y Board, 1993), slo se conoce
un caso en un silo de azcar blanco donde haba tenido lugar una migracin de humedad,
y la levadura responsable fue identificada como C. apicola (Tilbury, 1976). Por su parte,
21 rouxii slo es capaz de contaminar soluciones de sacarosa de baja pureza y azcar sin
refinar (Tilbury, 1976; Tudor y Board, 1993).
El tratamiento trmico equivalente a una pasterizacin que se aplica a la pasta cruda

de mazapn, tal y como se describi en el Apanado 111.1 de Material y mtodos, parece ser
efectivo en la eliminacin de las levaduras presentes, ya que no se recuper ninguna cepa
123
Y Discusin
-
tras el perodo de enriquecimiento de las muestras de masa de mazapn antes y despus del
perodo de reposo (M20 y M21, respectivamente). El horneado al que se someten los
productos, que se denomina hornaya, es un tratamiento trmico corto que puede ser
inefectivo debido a la proteccin de los microorganismos frente al calor por la presencia
de solutos como el azcar (Golden y Beuchat, 1992b; Deak y Beuchat, 1996).
Las cepas de 21 rouxii identificadas en este trabajo no son capaces de asimilar la

sacarosa. En general, mientras que Z. rouxii puede metabolizar con facilidad la glucosa, no
es capaz de degradar la sacarosa o lo hace muy lentamente (Restaino et al., 1983), por eso
no es capaz de alterar azcar refinado puro cristalizado o en solucin. En estas condiciones
predominan las levaduras productoras de invertasa, enzima que cataliza la escisin de la
sacarosa -disacrido- en sus dos monosacridos, glucosa y fructosa, cuya mezcla
equimolecular es lo que se denomina azcar invertido (Ranken, 1993).
Las cepas de levaduras con menores niveles de invertasa presentan una ventaja en
sustratos con una elevada concentracin de sacarosa respecto a las <cepas con niveles altos
de invertasa. La hidrlisis de la sacarosa, que libera glucosa y fructosa, incrementa la
presin osmtica; por tanto, cuando las levaduras poseen una elevada actividad invertasa,
se exponen ms rpidamente a un mayor estrs osmtico, lo que puede conducir a la
inhibicin de las clulas (Myers et al., 1997).
Puesto que en las pruebas de identificacin 21 rouxii no fue capaz de fermentar ni

asimilar en condiciones aerobias la sacarosa, cabe preguntarse cmo esta levadura es capaz
de alterar productos fabricados a base de sacarosa. La explicacin estriba en la proporcin
de azcar invertido con la que suele sustituirse parte de la sacarosa, como se refiri en el
Apartado 111.1 de Material y mtodos al describir la composicin del mazapn; la utilidad
del empleo del azcar invertido reside en que, mientras que la sacarosa cristaliza con
facilidad, de la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa es muy difcil que se produzca
la cristalizacin de la segunda, por lo que el azcar invertido se emplea como humectante
(Ranken, 1993). En lugar de azcar invertido, tambin puede emplearse hidrolizado de
almidn, con una composicin en distintos azcares reductores que pueden ser asimilados
por 21 rouxii, detallada en el Apanado 111.1 de Material y mtodos.
124
Y- Discusin
Otras muestras de materias primas que aparecen en la tabla 5 de Material y

mtodos y que no contienen levaduras son: yema confitada (MiS) y boniato confitado
(M19). Tampoco se detectaron levaduras en la masa de mazapn, ianto recin sometida a
tratamiento trmico (M20) como tras 48 horas de reposo (M21). Por otra parte, aunque la
presencia de levaduras en el ambiente es significativa -se puede~ aislar por ejemplo D.
hansenii del aire (Deak y Beuchat, 1996)-, la contaminacin por leVaduras osmotolerantes
no se produce normalmente a travs del aire (Tilbury, 1976; Seiler, 1977). La
contaminacin final de los productos, como muchos autores (Blaschke-Hellmessen y
Teuschel, 1970; Tilbury, 1976; Seiler, 1977; Jermini a al., 1987; Tudor y Board, 1993)
sealan, se debe probablemente al contacto fsico con reservorios de levaduras, es decir,
residuos previamente contaminados que permanecen en zonas poco accesibles a la limpieza
a lo largo del equipo empleado en la manufactura, en sup~rficies de trabajo, o
localizaciones de almacenamiento. En estos reservorios, levaduras como Z. rouxii
permanecen en estado latente en su fase estacionaria, y son transportadas y enriquecidas
a lo largo de sucesivos lotes de fabricacin.
En relacin con las levaduras aisladas de otros productos~ altamente azucarados,

consignadas en la Tabla 10, las especies identificadas son P. guilliermondii y 5. octosporus,
aisladas respectivamente de mermelada (M37) y miel de la utilizada como materia prima
para turrn (M38). Mientras que la muestra de mermelada presentaba la alteracin tpica
por desarrollo de levaduras -aroma alcohlico, gas en el recipiente y prdida de masa
slida-, como se describi en el Apanado 1.2 de la Introduccin, la muestra de miel no
presentaba ninguna alteracin visible. Cabe suponer que la diferencia entre la simple
presencia de levaduras en la segunda muestra y la alteracin de la primera se debe al
nmero de clulas presente, ya que en la mermelada se recuperaron levaduras en el primer
aislamiento (3 das), y en la miel fueron necesarios 10 das de incubacin en el medio de
enriquecimiento -YMBG- para detectar la presencia de levaduras.
Durante la transformacin del nctar en miel, las abejas reducen el contenido en

agua del primero de 30-60 a 15-19% (p/p) y producen una apreciable conversin de la
sacarosa a travs de la adicin de invertasa (Tudor y Board, 1993). La miel es adems un
sustrato del que se conoce que posee actividad antimicrobiana, debido a la presencia de
125
Y- Discusin
ciertas sustancias procedentes de las abejas denominadas inhibinas, entre las cuales cabe
destacar el perxido de hidrgeno, as como flavonoides, y cidos fenlicos: cido cafeico
y ferlico (Wahdan, 1998). La glucosa oxidasa, que produce perxido de hidrgeno y causa
una ligera acidificacin, es probablemente el principal agente antimicrobiano de la miel
(Tudor y Board, 1993).
P. guilliennondil es una especie de levadura que se asla de ambientes diversos,

como insectos, suelo, aire, flores, hombre, zumos de fruta, cerveZa, etc. (Barnett el aL,
1990), por lo que la contaminacin de productos, en este caso mermelada, expuestos al
ambiente y al contacto humano, no es extraa. Es capaz de crecer en un 57% (p/p) de
glucosa, equivalente a un valor de a de 0,865, por lo que normalmente produce deterioro
de productos altamente azucarados (Tilbury, 1976).
8. octosporus es una especie de levadura que slo se ha aislado de miel, como en

este trabajo, y de grosellas (Barnett et al., 1990). Una caracterstica importante es que se
trata de una levadura de fisin, es decir, que su reproduccin vegtativa es por particin
y no por gemacin, que es la forma ms corriente en levaduras (Davenport, 1981).
Anteriormente esta especie se consideraba la nica representante del gnero

Octosporomyces (Barnett et aL, 1990), denominndose por tanto O. octosporus, en alusin
a la produccin caracterstica de hasta 8 ascosporas por clula, como se describir en el
Apartado V.2. Actualmente este gnero no existe, y su nica especie se ha incluido en el
gnero Schizosaccharomyces, cuyas especies se comportan como las levaduras
fermentativas clsicas, como Saccharomyces, pero difieren por su peculiar modo de
reproduccin vegetativa. Son osmotolerantes, y octosporus en panicular es conocida por
su capacidad de alterar jarabes y concentrados de frutas (Deak y Beuchat, 1996).
De las muestras M39 (miel), M40 (bolitas de coco), M41 (yemas) y M42 (cereales
con pasas), no se pudieron estudiar los agentes causantes de las alteraciones enumeradas
en la Tabla 6 de Material y mtodos. En la miel y las yemas, es posible que el tiempo
transcurrido entre la aparicin de la alteracin y el de la obtencin de la muestra y su
anlisis haya sido suficientemente largo como para no recuperar ningn microorganismo,
126
Y- Discusin
ni siquiera tras un largo perodo de enriquecimiento en YMBG. De la bolitas de coco

tampoco se recuper ningn microorganismo, y de los cereales con pasas se recuperaron,
en YMBG, bacilos como los descritos antes de este apanado, cuyo estudio queda fuera de
los objetivos de este trabajo.
Por ltimo, y tras discutir el aislamiento de levaduras a partir de las distintas

muestras analizadas, es posible hacer ciertas consideraciones acerca de la duracin del
perodo de enriquecimiento. Segn los resultados obtenidos, parece evidente que slo los
primeros 15 das de incubacin son necesarios para la caracterizacin de las levaduras
presentes en las muestras. Por una parte, en muestras como Mi, M7, M23 o M38, el
tiempo necesario para conseguir el aislamiento de las primeras cepas -lE, lOE, 28E2, 39E2.
respectivamente- fue de 10-14 das. Por otra parte, en muestras como M29, el aislamiento
de una segunda especie de levadura -L. elongisporus, 30E2(l) y (2)- tuvo lugar tambin
a los 10 das, mientras que en el primer aislamiento la cepa aislada perteneca a otra
especie -8. cerevisiae, 30E 1-. Tras dos semanas de incubacin, <no se consigui aislar
ninguna especie nueva de ninguna de las muestras, incluso en algunas de ellas -M22, M28-
las levaduras presentes en aislamientos previos no se recupe~aron tras un mes de
incubacin. Este efecto es debido al prolongado perodo de incubacin de las muestras, con
la consiguiente acumulacin de metabolitos en el medio de cultivo, y a la elevada
concentracin de azcar del mismo, ya que, como se mencion en el Apartado 1.2 de la
Introduccin, estas levaduras son osmotolerantes y no osmfilas, por lo que crecen mejor
en presencia de concentraciones ms bajas de azcar. Estos factores tambin pueden
explicar en parte la incapacidad de algunas cepas correspondientes a los ltimos
aislamientos para reproducir el olor a petrleo (20E4) y sobre todo la produccin de gas
(14E4, 22E4, 24E4 y 26E3), como se discutir en el apartado correspondiente.
V.12.- Hongos filamentosos
Respecto a los hongos filamentosos o mohos (Tabla 11), lo ms destacado es el

reducido nmero de aislamientos respecto al de levaduras. De los productos de mazapn
que se enumeran en la Tabla 4 de Material y mtodos, ~1o la muestra M17,
correspondiente a un pan de Cdiz, presentaba crecimiento fngico visible en la superficie
127
Y Discusin
-
(H). Otro pan de Cdiz (Ml 1), que contena mohos (Hl y H2), no presentaba crecimiento
fngico evidente. Esto mismo sucede en la muestra M35 de turrn de frutas (Tabla 4 de
Material y mtodos), de composicin similar al pan de Cdiz, de la que se aisl el hongo
HS, que no se desarroll visiblemente.
En los alimentos de humedad intermedia, sustratos que permiten el crecimiento de

levaduras y hongos filamentosos osmotolerantes, parece existir una marcada competencia
entre ambos tipos de organismos. A ello se debe que un moho se desarrolle visiblemente
slo cuando las levaduras estn ausentes, ya que en caso contrario, son las levaduras las
que colonizan el alimento y producen su deterioro, y la presencia de mohos pasa
inadvertida. Puesto que tanto estas levaduras como los mohos son resistentes al sorbato,
desarrollndose en presencia del mismo en el sustrato. la ventaja fisiolgica de las primeras
sobre los segundos es su mayor actividad metablica (el crecimiento de los mohos es
mucho ms lento), su capacidad de crecer en ausencia de oxgeno (estos productos suelen
comercializarse envasados individualmente bajo atmsfera modificada) y su capacidad para
producir y tolerar alcohol, CO2 y cidos orgnicos (Fleet, 1992), creando ambientes
desfavorables para el crecimiento fngico (Tilbury, 1976; Restaino a al., 1983).
En productos como las marquesas (M34 y M36), invariablemente se aslan hongos

filamentosos (H3 y H6, respectivamente) que, an sin desarrollar micelio visible, dan lugar
a la aparicin de olores y sabores extraos. El que en este tipo de alimento se aslen
hongos filamentosos y no levaduras parece deberse a la menor concentracin de azcar de
su composicin, al mezclar la pasta de mazapn con huevos y almidn, como se describi
en el Apartado 111.1 de Material y mtodos. Tambin la textura esponjosa, ms rgida que
los productos antenores, puede tener cierta influencia en el predominio de los hongos
filamentosos, ya que stos tienen mayor capacidad de colonizar y penetrar sustratos slidos
(Tilbury, 1976).
Los hongos Hl a H6 fueron identificados dentro del gnero Penicillium. Este gnero
de hongos es bien conocido por su capacidad de degradar el sorbato, como se describi en
la Introduccin (Apanado 1.3.2). Este hecho, junto con su capacidad de crecer a valores
relativamente bajos de a,,, entre 0,79 y 0,83 (ICMSF, 1991), hace que estos organismos
128
Y- Discusin
sean peligrosos por poder desarrollarse en productos azucarados y en presencia de sorbato.

como las muestras de las que se han aislado las cepas de este trabajo.
Las cepas H, H3, H4 y HS fueron identificadas dentro de la especie P.

chrysogenum. Tanto la morfologa de las colonias como la estructura microscpica son
comunes a las cuatro cepas, pero cabe hacer una distincin entre ellas. Hl y H3 son
idnticas en cuanto a la produccin del pigmento amarillo carcaterstico de esta especie,
y la ausencia de crecimiento a 370C. Por el contrario, H4 y HS carecen de pigmento
amarillo y ambas crecieron a 370C, dando lugar a colonias de 8 mm de dimetro. Pitt
(1991) describe un crecimiento variable a 370C dentro de P. chrysogenum, desde especies
incapaces de crecer a esta temperatura hasta otras que producew colonias de 5 mm de
dimetro. Asimismo, este autor refiere, dentro de esta especie, aislamientos que carecen de
pigmentacin amarilla; de hecho, estos P. chrysogenum no pigmentados se agrupaban, antes
de 1979, en una especie separada -P. tneleagrinum-, que posteriormente se incluy dentro
de P. chrysogenum junto con la conocida especie P. notatum, cuya cepa tipo es,
precisamente, un P. chrysogenum. Actualmente, P. notatum y P. meleagrinum se consideran
sinnimos de P. chrysogenum (Pitt, 1991).
P. chrysogenum es un hongo ubicuo, que se encuentra entre~ las formas eucariticas

de vida ms comunes en el mundo. Ocupa un rango muy amplid de habitats en suelos,
vegetacin en descomposicin y alimentos. Su distribucin parece ser universal, a lo largo
de todas las regiones y climas biolgicamente accesibles (Pitt, 1991). Las cepas
xerotolerantes son capaces de crecer en sustratos con una a,, de 0,80, aproximadamente (El
Halouat y Debevere, 1997).
Por su parte, H2 pertenece a la especie P. crustosum. Adems del tamao y textura

de las colonias, diferente de las dems especies de Penicillium identificadas en este trabajo,
la cepa de P. crustosum produjo un exudado marrn, y en la placa de MEA, tras la
manipulacin necesaria para la identificacin, el medio que rodeaba las colonias crecidas
en los puntos de inoculacin se recubri de colonias secundarias, como se aprecia en la
Fotografa 7 (a y b). Esta caracterstica distintiva de P. crustosum, debido a la fcil
dispersin de los conidios en este medio, sirvi para confirmar la identificacin.
129
Y- Discusin
Aunque P. crustosum se asla principalmente de frutas pomceas. Pitt (1991) lo

considera un hongo ubicuo responsable de alteraciones, mencionado con muy poca
frecuencia en la literatura debido a la confusin en su taxonoma con otras especies del
subgnero Penicillium. Bajo distintos nombres, P. crustosum ha sido responsable del
deterioro de maz, carnes procesadas, queso, galletas, zumos de frutas, etc. (Kinderlerer y
Hatton, 1990; Pitt, 1991).
Tanto P. chrysogenum como P. crustosum pertenecen al subgnero Penicillium, que

se caracteriza fundamentalmente por poseer penicilios terverticilados. Dentro de este
subgnero, el sector Penicillium, al que pertenecen ambas especis, se diferencia de los
dems sectores por la forma y color de los conidios -esfricos o lipsoidales, y verdes o
azules- y la estructura del penicilio -regular y con un mximo de dos ramas-.
Las especies del subgnero Penicillium presentan adems afinidades entre s. De esta
manera, la principal afinidad de P. chrysogenum corresponde a las dems especies del
sector Penicillium, aunque tambin muestra afinidad con especies dl subgnero Furca:um,
como puede ser P. citrinum; su capacidad de crecer lentamente a 370C apoya esta
observacin. Por su parte, P. crustosum ha sido usualmente confundido con P. viridicaturn
y P. aurantiogriseum, con los cuales presenta afinidades, as como con P. roquefortii y P.
expansum, perteneciendo todas estas especies al sector Pencillium (Pitt, 1991).
El hongo H6 ha sido identificado como P. simplicissimum. A diferencia de las

anteriores, esta especie pertenece al subgnero Furcatum, que se caracteriza por poseer
penidiios biverticilados y de mdula mucho ms larga que las filides. P. simplicissimum
se encuentra entre las especies de Penicillium ms frecuentemente aisladas; es un activo
agente degradativo y ha sido aislado de muchos tipos de materiales en descomposicin, as
como de suelos. Al igual que en el subgnero Penicillium, P. simplicissimum presenta,
dentro del subgnero Furcatum, afinidades con P. oxalicum respecto a la tasa de
crecimiento a 250C y el tipo de conidiforo. Ambas especiet pertenecen al sector
Furcatum, puesto que poseen penicilios regulares que parten de yerticilos terminales de
mdulas (Pitt, 1991).
130
Y- Discusin
La muestra de miel que apareca turbia (M39) contena un hongo, H7, identificado
como Aspergillus niger. Dentro de este gnero se encuentran especies osmoflicas, capaces
de alterar alimentos con un valor de a,, entre 0,75 y 0,90, como los productos de panadera
(Vias a al., 1990>, o frutas secas hidratadas (El Halouat y Debevere, 1997). El ICMSF
(1991) establece, para especies de Aspergillus, una a,, mnima para el crecimiento de 0,75-
0,82. Segn Tilbury (1976) y Tudor y Board (1993), la a,, de la miel se encuentra en el
rango de 0,75-0,80, valor que permite el desarrollo miceliar de esta especie.
A. niger var. niger es una especie ubicua, que se encuentra normalmente en suelos,
plantas, semillas, frutas desecadas y frutos secos. Es uno de los hongos aislados con mayor
frecuencia en alimentos (Klich y Pitt, 1988).
V.2.- Esporulacin
Para el estudio de la esporulacin, se escogieron los primeros aislamientos de todas

las muestras que contenan levaduras: lE (M), 2E (M9), 3E y 4E (M6), lOE (M7), 14D
(Mil), 24E1 (M12), 26E1 (M16), 27E1(l) y 27E1(2) (M22), 29E1 (M28), 30E1 (M29),
32E1 (M30), 33E1(1) y 33E1(2) (M31), 34E1(l) y 34E1(2) (M32), 35E1(1) y 35E1(2)
(M33), 36E1 (M35), 38E1 (M37> Y 39E2 (M38). Los resultados que se discuten a
continuacin corresponden a las Tablas 12a y 12b del Apartado 111.4.1 de Resultados.
De estas levaduras escogidas como representantes, la espeie ms frecuentemente

identificada es 21 rouxii, con 11 aislamientos de 22. Entre ellas, slo dos (cepas 2E y 1 4D)
no esporularon. Las tres cepas de D. hansenil (cepas 3E, 4E y lOE) fueron esporgenas,
as como las nicas cepas representantes de 71 delbrueckii (cepa 27E1(2)), S. cerevsae
(cepa 29E1) y octosporus (cepa 39E2). Por el contrario, adems de C. glabrata (cepa
28E2), de la que no existe estado perfecto, tampoco esporularon las cepas de L orientalis
(cepa 27E2(1)), L. elongisporus (cepas 30E1, 33E1(l) y 33E1(2>) y P. guilliermondil (cepa
38E2).
Yarrow (1984) clasific los gneros Zygosaccharomyces ~ Torulaspora fuera del

gnero Saccharomyces, incluyendo dentro de este ltimo las especies en las que la fase
131
Y Discusin
-
vegetativa es predominantemente diploide, mientras que aquellas en las que la fase

vegetativa es predominantemente haploide se clasifican como Zygosaccharomyces y
Torulaspora. El hecho de que la fase vegetativa predominante en 21 rouxii sea haploide
explicara en parte la presencia de algunas cepas no esporgenas, que indicara la ausencia
de mating-types (cepas sexualmente compatibles) necesarios para la conjugacin de los
organismos haploides (Jermini et aL, 1987; Deak y Beuchat, 1996). De hecho, varios
autores (Tilbury, 1976; Bamett et aL, 1990; Taing ok y Hashinaga, 1997) refieren que la
identificacin de ciertas levaduras osmotolerantes, como 21 rouxii o 21 bisporus, es
complicada por la facilidad con la que pueden perder su capacidad de esporular. Al ser
especies heterotlicas (ver Apartado 1.4 de la Introduccin), normalinente se encuentran en
estado haploide, de manera que el aislamiento de una cepa a partir de una nica colonia
puede conducir a la seleccin de un nico mating-type, que ser incapaz de esporular en
ausencia de su mating-iype complementario (Deak y Beuchat, 1996). Otra explicacin para
la ausencia de esporulacin en estas cepas concretas es que las condiciones o los medios
de cultivo elegidos no sean favorables para la conversin en el estado perfecto en estos
medios (van der Walt y Yarrow, 1984; Davenport, 1981). Muchas levaduras, tras ser
subcultivadas repetidamente, pierden su capacidad de esporular, unque en ocasiones se
haban podido observar sus esporas en aislamientos recientes y a veces en los propios
productos alterados, antes del aislamiento de las cepas (Davenport, 1981; Barnett et al.,
1990; Deak y Beuchat, 1996; Yarrow, 1998). Tambin se han sealado la dificultad de
observacin, incluso la falta de experiencia del investigador, como causas de no poder
detectar el estado perfecto (Barnett ej al., 1990).
Como ya se ha expuesto en el Apartado Vl, las cepas de L. elongisporus

mostraron, al ser identificadas segn la metodologa descrita por Barnett et al. (1990),
propiedades bioqumicas y fisiolgicas coincidentes con el perfil de D. hansenii. Esta
semejanza no es la nica: el anlisis de la secuencia del gen que codifica para el ARNr 18s
(Cai et al., 1996) revel que el grupo filogentico en el que se inluyen las especies del
gnero Debaryomyces presentaba una asociacin significativa conel cluster en el que se
integra L elongisporus. Sin embargo, la identificacin final de las cepas 30E1, 33E1(l) y
33E1(2) fue como L elongisporus, entre otras razones que ya se han explicado,
precisamente por la ausencia de ascosporas. D. hansenii es una levadura que esporula con
132
V.- Discusin
facilidad, y por tanto las especies 30E1, 33E1(l) y 33E1(2), que no esporularon en ninguno
de los medios ensayados, no pudieron ser identificadas como pertenecientes a esta especie.
Este hecho evidencia la importancia de la observacin de esporas para la caracterizacin
taxonmica de las levaduras, an cuando el sistema de identificacin empleado no sea una
clave dicotmica.
Respecto a la incidencia de la esporulacin en los diferentes medios, el primer

aspecto a mencionar es que, aunque Codn et al. (1995) refiri <que la esporulacin se
favoreca en medio lquido en relacin con el correspondiente medio slido, los resultados
obtenidos con las cepas de este trabajo no lo confirman. La observacin de esporas en
medio lquido se abandon principalmente por tres razones: 1) el menor nmero de clulas
recogido con el asa de siembra o la pipeta para su observacin sobre el portaobjetos; 2) la
dificultad de observacin de clulas aisladas debido a la formacin de agregados o
pseudomicelio; y 3) la aparentemente menor frecuencia de esporulacin. Segn Tilbury
(1976), las levaduras osmotolerantes crecen mejor sobre la superficie de los medios slidos
que en los medios lquidos.
El nmero del total de cepas esporgenas representantes estudiadas que esporularon

en cada medio slido es, en orden decreciente: VS/lO: 15 cepas; 2% NaC, PDA, GOR,
EMB: 12 cepas; YEGP: 11 cepas; ME, V8: 10 cepas; YMA: 9 cepas; CMA: 7 cepas; AA-
3: 6 cepas; AA-2: 5 cepas; SPO-l: 4 cepas; MAc: 3 cepas; AA-1: 1 cepa.
En general, los medios ms adecuados para inducir la esporulacin fueron aqullos

pobres en nutrientes, como V8/l0, PDA, GOR, ME, VS y CMA, o con algn factor
estresante como 2% NaC (con una concentracin moderadamente elevada de sal) o EMB
(que contiene los colorantes eosina y azul de metileno). Un segundo grupo comprende
medios ricos en nutrientes como YEGP o YMA, en los cuales las levaduras, al poder. crecer
profusamente, agotan todos los nutrientes disponibles y pueden iniciar la esporulacin
durante el posterior perodo de latencia (Freese eraL, 1982). Segn Suizu et al. (1995). en
un medio rico con una concentracin inicial de un 1% de glucosa, el azcar es consumido
a los dos das de incubacin. Estos mismos autores afirman que la transduccin de la seal
nutricional necesaria para la meiosis y/o esporulacin en condiciones de abundancia de
nutrientes es diferente de la que tiene lugar en condiciones de escasez de nutrientes.
133
Y- Discusin
Otros medios, como AA-l, AA-2, AA-3, SPO-1 y SPO-2, contienen acetato, un
inductor de la esporulacin bien conocido (Freese et aL, 1982; Codn et al., 1995; Suizu
et al., 1995). 8. cerevisiae puede utilizar para su crecimiento fuentes de carbono tanto
glucolticas -glucosa, fructosa- como gluconeognicas -acetato, etanol, piruvato- (Freese a
al., 1982). Para optimizar la esporulacin, las clulas deben crecer bajo condiciones en las
que todas las enzimas del ciclo del glioxilato y enzimas gluconeognicas estn
desreprimidas, por ejemplo en agar con acetato (Miller, 1989; Codn et aL, 1995). El
medio MAc contiene cido actico, que al ser una molcula neutra puede traspasar la
membrana celular mucho ms rpidamente que su correspondiente anin acetato (Freese
et al., 1982). Sin embargo, en medios como MAc, SPO-1 o AA-l, el crecimiento de las
levaduras fue tan escaso que su utilidad, al menos para este trabajo, fue muy limitada. La
transferencia desde un medio con exceso de fuente de carbono a otro con fuente de carbono
limitada permite slo un metabolismo celular lento (Freese et aL, .1982).
Los medios ms recomendables para la esporulacin seran aqullos en los cuales

han esporulado mayor nmero de cepas. Sin embargo, el orden anterior vara segn la
especie:
- Z. rouxii (9 cepas esporgenas de 11): V8/l0, EM: 9 cepas; GOR, EMB: 7 cepas; PDA:
6 cepas; 2% NaC, YEGP: 5 cepas; YMA, VS: 4 cepas; AA-2, AA-3, CMA: 2 cepas; MAc,
SPO-2: 1 cepa; AA-l, SPO-1: ninguna cepa esporulada.
- D. hansenii (3 cepas): YMA, 2% NaC, YEGP, PDA, VS, VS/lO; EMB, CMA: 3 cepas;
GOR, AA-2, AA-3, SPO-l, SPO-2: 2 cepas; EM, MAc, AA-l: ninguna cepa esporulada.
- 71 delbrueckii (1 cepa): esporul en YMA, YEGP, PDA, GOR, VS, V8/l0, EMB, MAc,
AA-2, AA-3, CMA, SPO-l y SPO-2.
- cerevisiae (1 cepa): esporul en YMA, 2% NaC, YEGP, EM, PDA, GOR, V8, VS/lO,
EMB, MAc, AA-2, AA-3, CMA, SPO-1 y SPO-2.
- 8. octosporus (1 cepa): esporul en YMA, 2% NaC, YEGP, EM, PDA, GOR, VS, VS/lO
y AA-l.
Se puede observar que medios en principio recomendables como EM, en el cual

esporularon 10 cepas de 15 esporgenas, parece ser inadecuado para la esporulacin en D.
hansenii, ya que ninguna de las tres cepas estudiadas lo hicieron en este medio. Por el
134
Y- Discusin
contrario, las tres cepas de D. hansenii esporularon en medios como VS o CMA, mientras
que menos de la mitad de las cepas de 21 rouxii -4 y 2 cepas, respectivamente- lo hicieron
en estos mismos medios. Adems, el comportamiento de las cepas de 21 rouxii no
concuerda con el observado por Jermini et al. (1987) en otras siete cepas esporgenas de
esta misma especie, de las cuales todas esporularon en CMA, una en EM, una en AA-3 y
ninguna en V8, aunque s con los resultados obtenidos por Taing ok y Hashinaga (1997),
que observaron esporas de cepas osmotolerantes de Z. rouxii en EM y VS. Respecto a otras
especies, no cabe hacer comparaciones, al haberse estudiado slo una cepa de cada una.
Aparentemente, VS/lO es el medio comn recomendable, pues todas las cepas esporgenas
representantes esporularon en l, aunque, como sealan Freese et al. (1982) y Barnett et
al. (1990), es adecuado emplear simultneamente ms de un medio de esporulacin.
Adems de la composicin de los medios de pre- y esporulacin, hay otros factores

extrnsecos pero tambin intrnsecos que afectan a la incidencia de la esporulacin.
Especies como D. hansenii, 71 delbrueckii, 5. cerevisiae o octosporus esporularon en la
mayora de los medios ensayados, al menos las cepas estudiadas aqu. Por ejemplo, 8.
cerevisiae incluso esporul en 2% NaC, EMB y MAc, que son medios descritos para la
esporulacin en 21 rouxii (Davenport, 1980). Asimismo, las cepas de D. hansenii
esporularon en 2% NaC y EMB, 71 delbrueckii en EMB y MAc, y 8. octosporus en 2%
NaC. Por el contrario, algunas cepas esporgenas de 21 rouxii no esporularon en estos
medios recomendados, como las cepas 35E1(l) y 35E1(2) en 2% NaC, las cepas 32E1 y
35E1(2) en EMB y las cepas 24E1, 26E1, 32E1, 35E1(2) y 36E1 en MAc, donde incluso
el crecimiento fue escaso o nulo.
No se puede concluir nada ms acerca de la esporulacin en las especies que slo

tienen un representante. Entre las cepas de 21 rouxii, algunas de ellas esporularon con
facilidad, como las cepas 24E1, 34E1(2) 35E1(l), mientras que las cepas 32E1, 34E1(l)
y 35E1(2) esporularon con dificultad. Las diferencias entre las cepas de 21 rouxii que
esponilaron con facilidad y las que lo hicieron con dificultad no se refieren slo al nmero
de medios en los que espomaron, sino tambin a otros aspectos que no reflejan las tablas,
como el nmero de clulas esporuladas en esos medios (mucho mayor en las primeras) y/o
el tiempo necesario para la observacin de las mismas (ms cortopara las primeras).
135
E Discusin
-
El crecimiento en medios con acetato fue muy limitado. Se puede deducir que este
sustrato no puede ser asimilado como fuente de carbono por las cepas estudiadas, o bien
stas no se han adaptado al paso de un metabolismo glucoltico a otro gluconeognico
utilizando como sustrato al acetato. Tambin puede influir la ecologa (Jermini et aL, 1987)
de estas levaduras: las levaduras osmotolerantes aisladas de alimentos altamente azucarados
pueden ser incapaces de adaptarse a medios con muy poca glucosa (AA-2, AA-3, SPO-l),
o incluso con ausencia de azcar (AA-l, SPO-2).
Se conocen otros factores, como la temperatura de incubacin, pH de los medios,

fase de crecimiento durante la que los cultivos de levadura son transferidos desde el medio
de presporulacin al medio de esporulacin y nmero de clulas transferidas, que tambin
influyen en la esporulacin.
Los estudios de Suizu et aL (1995) con 5. cerevisiae determinaron que el

crecimiento era mximo a pH 6,0 y se detena completamente a pH 8,0; la formacin de
ascosporas era mxima a pH 7,0 y disminua de acuerdo con el descenso en el pH original
del medio rico en nutrientes. Asimismo, cuando la esporulacin tena lugar en un medio
pobre que contena acetato potsico, el pH del medio se incrementaba de 7 a 9; como las
clulas de levadura no crecen a pH por encima de 8, se desconce si la supresin del
crecimiento (detencin de la mitosis en la fase G) se debe a la deficiencia en nutrientes
o al elevado pH.
La competencia para la esporulacin tambin depende del desarrollo de la capacidad

oxidativa; las clulas crecidas en acetato o glicerol, ninguno de los cuales requiere que las
clulas pasen por un perodo de adaptacin respiratoria al transferiras al medio de
esporulacin, esporulan mejor cuando son recogidas durante la fase logartmica de
crecimiento, mientras que las clulas crecidas en glucosa lo hacen cuando se toman de
cultivos en fase estacionaria temprana (Codn et al., 1995).
La esporulacin en medios con nutrientes limitados depende asimismo de la

concentracin de clulas transferidas desde el medio rico de presporulacin, debiendo ser
de al menos 0~ UFC/mL (Suizu et aL, 1995).
136
E Discusin
-
Para optimizar la esporulacin, se han adoptado slo las condiciones ms favorables;

temperatura subptima de incubacin (ver Material y mtodos), pH recomendado para cada
medio (ver Material y mtodos) y transferencia de los cultivos en fase estacionaria
temprana. La frecuencia de observacin de esporas es mayor que la generalmente descrita
(Tilbury, 1976; Jermini et aL, 1987), por lo que la combinacin de varios factores parece
favorecer efectivamente la esporulacin.
Respecto a las condiciones ms adecuadas para la observacin de ascosporas, cabe

destacar que la utilizacin de 400 aumentos, empleada para la observacin de organismos
eucariotas, no permiti distinguir esporas tan claramente como con 1000, y la presencia de
stas podra pasar inadvertida. En especies como D. hansenii, las esporas se pueden
detectar con facilidad, por su alta frecuencia de esporulacin y la morfologa caracterstica:
una nica ascospora, de pared gruesa, dentro de una clula madre normalmente conjugada
con su yema. Asimismo, la nica cepa representante de 5. cerevisiae form abundantes
tetradas. Sin embargo, las paredes de las ascosporas de 21 rouxii son ms finas y slo
pudieron distinguirse claramente utilizando 1000 aumentos, ob~ervndose dos clulas
conjugadas y en el interior de una de ellas las esporas, generalmente dos (diadas) y en
algunas cuatro; estas observaciones coinciden con las que refieren Taing ok y Hashinaga
(1997) para las cepas osmotolerantes de 2. rouxii que estudiaron. La cepa representante de
71 delbrueckii form usualmente una ascospora por clula, pudindose observar adems
tubos de conjugacin caractersticos; la cepa osmotolerante de esta especie aislada por
Taing ok y Hashinaga (1997) formaba dos ascosporas por clula. Eh octospo rus, lo ms
llamativo fue el nmero de esporas, hasta ocho en una misma clula.
Estas condiciones de observacin microscpica no hicieron necesaria la aplicacin

de la tincin diferencial de ascosporas por la tcnica del verde de malaquita y safranina de
Schaeffer y Fulton para esporas bacterianas (van der Walt y Yarrow, 1984; Davenport,
1981) como confirmacin.
En todas las cepas esporgenas, excepto 32E1 (21 rouxii) y 39E2 (5. octosporus),
fueron necesarios slo siete das de incubacin en VS/lO para la observacin de esporas,
mientras que en otros medios como 2% NaC, EMB, PDA o GOR el perodo de incubacin
137
Y- Discusin
requerido fue ms largo, de hasta seis semanas. En general, las cepas de 8. cerevisiae, 71
delbrueckii y D. hansenii esporularon ms rpidamente que 21 rouxii o octosporus.
V.3.- Reproduccin de las alteraciones
V.3.1.- Reproduccin del olor a petrleo y/o gas
En un estudio previo (Casas et aL, 1996) se aislaron varias cepas de levadura a

partir de muestras de productos a base de mazapn que presentban el mismo tipo de
alteracin estudiado en este trabajo, es decir, aparicin de un olor caracterstico a petrleo
acompaado o no del hinchamiento de los envases. Con objeto de comprobar que tales
levaduras eran las responsables de la alteracin, las cepas se resembraron en porciones del
mismo sustrato as como en diferentes medios de laboratorio que intentaban reproducir las
condiciones del producto. Las cepas aisladas reprodujeron el olor a petrleo
preferentemente en uno de los medios experimentales empleados, de hecho algunas cepas
lo hicieron en el medio experimental pero no en el propio sustrato. Dicho medio contena
600 gIL de sacarosa y sorbato en la misma proporcin que el maiapn (0,5 gIL de cido
srbico y 0,75 gIL de sorbato potsico), y cuyo pH era de 7,1. As, en ensayos posteriores
se opt por la utilizacin del medio experimental, puesto que facilita la reproduccin del
efecto y es ms fcil prepararlo que disponer de muestras de mazapn que no contengan
levaduras.
Posteriormente, se modific la adicin del conservante, para contener 1 gIL de

sorbato (Casas et aL, 1999), y finalmente se adopt una concentraqin de 0,5 g/L,ye] pH
resultante, 6,3, se mantuvo sin ajustar. Por una parte, la adicin de la mitad de la dosis
inicial de conservante facilita la degradacin del mismo, y se contina detectando con
facilidad la aparicin del olor caracterstico, ya que este tipo de metabolitos voltiles, an
producidos en pequea cantidad, tienen umbrales de olor y sabor muy bajos (Fleet, 1992).
Por otra parte, la adicin del conservante en forma de sal potsica tiene dos ventajas
fundamentales para la reproduccin del efecto, que ya fueron descritas en el Apartado 1.3
de la Introduccin. Una de ellas es la mayor solubilidad de la sal en medio acuoso, ya que
138
Y- Discusin
el cido srbico es prcticamente insoluble. Otra ventaja es que su poder inhibitorio es

mucho menor, y al mantener el pH en un valor cercano a la neutralidad (6,3), la presencia
de la forma cida es muy escasa. EL pK~ del cido srbico (referido a su constante de
disociacin) corresponde a un pH del medio de 4,76 (Sofos, 1989), valor al cual el 50%
del compuesto est en forma protonada; a medida que el pH del medio asciende por encima
de este valor, la concentracin de la forma cida disminuye, de manera que, para un
producto con un pH de 5,8 y una concentracin de sorbato del 0,2%, slo un 0,014% del
compuesto se encuentra en forma protonada (Sofos, 1989).
En la Tabla 13 aparecen los resultados de la reproduccin del olor a petrleo y/o

produccin de gas por todas las cepas de levaduras aisladas de distintas muestras que
presentaban esta caracterstica alteracin. Como puede observarse, la gran mayora de estas
cepas, pertenecientes a las especies Z. rouxii y D. hansenii, reprodujeron el olor a
petrleo en las condiciones de experimentacin que figuran a pie de tabla.
A pesar de que Tilbury (1976) y Praphailong y Fleet (1997) establecen que

alimentos altamente azucarados sin conservantes son deteriorados por 21 rouxii, y aqullos
con a~ ms alta pero que contienen conservantes por 21 bailii, esta ltima especie de
levadura no fue identificada en ninguna de las muestras, y la resistencia al sorbato se
manifest en otras dos especies, 21 rouxii y, sorprendentemente, 11?. hansenil.
Es un hecho conocido que el cido srbico puede ser metabolizado por varios
microorganismos, al menos en aerobiosis (Warth, 1977; Deak ej aL, 1992). lo que se
atribuye a un proceso de destoxificacin (Sofos, 1989; Kinderlerer y Hatton, 1990). En
mohos, algunas cepas pueden metabolizar el sorbato para dar CO2 y H20 como productos
de la 13-oxidacin, 1,3-pentadieno y otra serie de compuestos orgnicos. La capacidad de

descarboxilar el sorbato a 1,3-pentadieno parece estar restringida al gnero Penicillium, y
es un compuesto voltil que posee un caracterstico olor descrito como a hidrocarburo,
pintura o keroseno, fcilmente detectable en algunos alimentos y bebidas tratados con
sorbato (Marth et aL, 1966; Finol et aL, 1982; Liewen y Marth, 1955a y b; Sofos, 1989;
Kinderlerer y Hatton, 1990; Sofos y Busta, 1993). Las bacterias lcticas tambin pueden
transformar el sorbato en 1,3-pentadieno de manera similar a la de los hongos (Sofos, 1989;
139
E Discusin
-
Sofos y Busta, 1993). Por su parte, se han citado ciertas especies de levaduras (Candida
albicans, C. tropicalis, C. pseudotropicalis, C. claussenii y C. utilis) capaces de asimilar
sorbato como nica fuente de carbono (Deak y Nov, 1972).
En el estudio de Casas et al. (1996) mencionado anteriormente, las levaduras

responsables de la produccin del olor a petrleo fueron identificadas como D. hansenii.
El presente trabajo, junto con dicho estudio, constituyen hasta el momento las dos primeras
referencias de levaduras responsables de este tipo de alteracin.
Como se observa en la Tabla 13, las cepas de D. hansenii n produjeron gas en este
experimento ni en ninguno de los posteriores; por el contrario, salvo excepciones (14E4,
22E4, 24E4, 26E3 y 26E4), las cepas de 21 rouxii produjeron gra~ cantidad de gas en el
medio. Este gas, presumiblemente CO2 procedente de la fermentacin de la glucosa, seria
el responsable del hinchamiento de los envases individuales de los productos alterados.
Dentro de la especie Z. rou.xii, algunas de las cepas aisladas (lSD. 16D, 20E4, 21D.
22E2) no pudieron reproducir el olor a petrleo. Si bien es posible que estas cepas sean
resistentes al sorbato sin degradarlo, puesto que fueron capaces de crecer y fermentar el
azcar con produccin de gas, es ms probable que, por alguna razn, como puede ser el
mantenimiento de las cepas en ausencia de sorbato -sera como un
desacondicionamiento no hayan degradado el sorbato, ya que tras cepas de la misma
especie aisladas de las mismas muestras tras distintos tiempos de incubacin (ver Tabla 5),
que pueden ser las mismas, silo hicieron.
En la Tabla 13 tambin se recoge la reproduccin de estos efectos por parte de

levaduras aisladas de productos sin alterar, recogidos en la Tabla 4 de Material y mtodos.
Llama la atencin el hecho de que ninguna de las cepas identificadas como cerevisiae
o L. elongisporus reprodujeron ni olor ni gas, pero s las cepas 32E1-32E4; estas cuatro
levaduras se identificaron como 2. rouxii (Tabla 5>, por lo que su capacidad de reproducir
la alteracin en medio experimental antes de que sta sea evidente en el producto hace
suponer que con el tiempo acabar teniendo lugar la alteracin del mismo, como sucede
en otras muestras de mazapn que contenan 21 rouxii. En la rapidez con que se reproduce
140
E- Discusin
la alteracin en medio lquido respecto del deterioro en las muestras se basa el mtodo
estandarizado que se describe ms adelante para la deteccin de leVaduras potencialmente
peligrosas en el anlisis rutinario industrial de los distintos lotes.
Por otra parte, tambin es interesante observar que especies de levaduras como 5.
cerevisiae (29E1-29E4), tpicamente fermentativa, no produzca gas en un medio azucarado.
Este resultado refleja que, aunque la levadura sea capaz de crecer en presencia de sorbato,
lo que se aprecia por la aparicin de turbidez en el medio, al menos la capacidad
fermentativa de estas cepas es afectada por la presencia de conservate y/o la concentracin
de azcar -60% de glucosa- del medio, ya que 8. cerevisiae no es en principio resistente
a los conservantes ni osmotolerante (Fleet, 1992), a pesar de haber sido aislada en un
medio con 33% de glucosa, YMBG. La inhibicin de la fermentacin puede explicarse por
algunos de los mecanismos de accin del sorbato descritos en el Apartado 1.3.1 de la
Introduccin.
La Tabla 14 muestra la reproduccin de olor y/o gas por las levaduras aisladas de
materias primas e identificadas como L orientalis, 71 delbrueckii y C. glabrata; ninguna
de las cepas reprodujo ni olor ni gas, por lo que parece probable que, an en el caso de que
no fueran eliminadas durante la manufactura de los productos, no seran capaces de
producir la alteracin de los mismos.
En la Tabla 15 se reflejan los resultados de la reproduccin~ del efecto por parte de

las levaduras aisladas de otros productos altamente azucarados. Se observa que ni las cepas
de P. guilliennondii (38E1-38E4) ni las de 8. octosporus (39E2-39E4> reprodujeron el olor
caracterstico ni produjeron gas en cantidad apreciable. Esto es lgico si se admita que el
preacondicionamiento es necesario para el desarrollo de esta altercin, pues estas cepas.
al menos en el transcurso de este trabajo, no han estado en contacto con el conservante.
Tanto P. gullliennondii como octosporus son fermentativas, y adems

osmotolerantes, como ya se ha mencionado en apartados anteriores. La ausencia de gas
procedente de fermentacin parece deberse al efecto inhibitorio del sorbato sobre la
fermentacin que se expuso para el caso de 5. cerevisiae.
<141
Y- Discusin
Respecto a la reproduccin del olor a petrleo por los hongos (Hl-H6), recogida
en la Tabla 16, los resultados coinciden con el hecho conocido, citado en este mismo
apartado, de que algunos mohos pertenecientes al gnero Penicillium, agrupados en las
especies P. chrysogenum, P. crustosum y P. simplicissimum, son capaces de descomponer
el sorbato en CO2 y 1,3-pentadieno. Puesto que el olor del metabolito recuerda al del
petrleo, se puede suponer que las cepas de este trabajo, tanto levaduras como mohos,
son capaces de descarboxilar el sorbato y producir este mismo <compuesto, aunque es
necesaria la identificacin del mismo, como se detallar en el Apartado VS.
En las muestras Mil y M35, de las que se aislaron mohos y levaduras (Tabla 4 de
Material y mtodos), la alteracin evidente -gas y reblandecimiento-, se debe a la
proliferacin de las levaduras, como se discuti anteriormente. Sin embargo, la presencia
de hongos filamentosos en estas muestras (Hl y H2 en Mli, y H5 en M35) puede
contribuir hasta cierto punto a la produccin del olor a petrleo an cuando no
desarrollen micelio en el sustrato, ya que en las muestras M17, M34 y M36, los hongos
aislados (H4, H3 y H6, respectivamente) fueron los nicos organismos responsables de la
produccin del olor a petrleo y tampoco desarrollaron micelio visible. En este sentido,
Marth et aL (1966) apuntaron la posibilidad de que la descarboxilacin del sorbato pueda
preceder al crecimiento visible del hongo.
La Tabla 27 recoge las especies del gnero Penicillium en las que se ha estudiado
este mecanismo de destoxificacin del sorbato.
En las especies P. chrysogenum (cepas H, H3, H4 y H5) y P. crustosum (cepa H2)

ya se haba detectado por tanto la capacidad de descarboxilacin del sorbato. Por el
contrario, este trabajo constituye la primera referencia en la especie P. simplicissirnum y
de esta capacidad en el gnero Aspergillus.
142
E Discusin
-
Tabla 27.- Produccin de pentadieno por algunas especies de Penicillium
Especie Pentadieno
P. bilaii d
P. brevicompactum
P. chrysogenum +a
P. citrinum
P. conunune
P. crustosum +b cd
P. cyclopium
P. fellutanum d
P. glabrum +a, d
P. lanoso-viride +b~c
P. melanchorum .0
P. palitans
P. paxillii
P. puberulum +bc
P. roqueforti +a. be
P. viridicatum
Datos de Marth et aU (1966), Finol et al.b (1982), Liewen y Marthc (1985b) y

Kinderlerer y Hattond (1990).
V.3.2.- Reproduccin de las licuefacciones puntuales
La reproduccin de las licuefacciones puntuales se realiz con los cuatro primeros

aislamientos de las dos muestras analizadas: 34E1(l) y 34Ei(2) (M32), y 35E1(1) y
35Ei(2) (M33).
La inoculacin de las cepas seleccionadas en el mismo sustrato del que fueron

aisladas produjo el efecto que se muestra en la Fotografa 20. La reproduccin in situ de
la alteracin, revela que sta se debe al desarrollo de 21 rouxu.
143
E- Discusin
De los medios que imitaban el sustrato original, recogidos en la Tabla 17, cabe
destacar en primer lugar el viraje de los cuatro indicadores, aadidos al medio con 66%
(p/v) de sacarosa, a su forma cida. Por otra parte, y como muestra la Fotografa 21, slo
se manifiesta la licuefaccin de la textura cuando en el medio slido se aade una
concentracin elevada de sacarosa (66% p/p) y se suprime el agari
De las actividades enzimticas estudiadas, recogidas en la Tabla 18, se puede

deducir que el fenmeno de licuefaccin no se debe a lipolisis, proteolisis, amilolisis o
proteolisis, al menos en las condiciones ensayadas.
Los resultados de ambas tablas permiten establecer que esta caracterstica alteracin
es una manifestacin ms de una alteracin tpica por levaduras osmotolerantes, es decir,
prdida de masa slida y alteracin de la solubilidad de los solutos, lo que provoca el
incremento de humedad y a,, (Tilbury, 1976; Restaino et al., 1983; Jermini et aL, 1987).
Este efecto quedara enmascarado por la presencia de agar en los medios experimentales,
ya que forma una estructura rgida que no permitira observar l desestructuracin del
sustrato por prdida de masa slida. Tambin se deduce que los resultados de estos ensayos
no son afectados por la presencia o ausencia de sorbato en los medios.
El metabolismo microbiano en general implica la liberacin de agua, hecho que

incrementa localmente la a,, y acelera por tanto la tasa de crecimiento del organismo
causante de la alteracin (Tilbury, 1976). En este caso, la zona puntual de mayor humedad
correspondera a las zonas circulares que se aprecian en las fotografas de las muestras.
Ya se hizo referencia en el Apartado V. 1.1 a la incapacidad de las cepas de 21

rouxii para asimilar la sacarosa. Inicialmente, el metabolismo de las cepas aisladas de estas
muestras alteradas tendra lugar a partir de la proporcin de jambe de glucosa que se
incorpora en la masa de mazapn como humectante, sustituyendo a la sacarosa: un 3%,
segn datos de la empresa productora de mazapn. Llama la atencin el hecho de que los
azcares mayoritarios de este jarabe, glucosa y maltosa (ver Apartado 111.1 de Material y
mtodos), son fermentados vigorosamente por 21 rouxii; de hechp, la fermentacin de la
maltosa es una de las principales caractersticas para la identifiacin de esta especie
(Jermini et al., 1987).
144
Y Discusin
-
A partir de estos azcares comienza el desarrollo de 21 rouxii. En su metabolismo

las clulas liberan cidos, como pone de manifiesto el viraje de los indicadores en el medio
altamente azucarado, resultado de la Tabla 17 que ya se ha discutido. Este cido, debido
a que el sustrato es muy compacto, a diferencia de otros productos a base de mazapn
descritos, puede acumularse en la zona circundante al crecimiento de la levadura si no
difunde a travs del sustrato, y esta acumulacin puntual de cido va a tener un doble
efecto. Por una parte, sobre la pectina, que es una sustancia compleja de elevado peso
molecular que se encuentra naturalmente en todos los tejidos vegetales (Olliver, 1962).
como puede ser la almendra, uno de los componentes mayoritarios de la pasta de almendra;
la pectina contiene cidos pectinicos, capaces de formar un gel con azcar y cido, siendo
la ptima proporcin de estos componentes de 66% de azcar, <1% de cido y 1% de
pectina (Ranken, 1993). Este fenmeno dara cuenta de parte de la licuefaccin puntual del
sustrato que tiene lugar.
Por otra parte, cuando se hierve una solucin de azcar en agua, se invierte una
pequea cantidad de azcar, dependiendo de la acidez de la solucin y del tiempo de
calentamiento. Cuando ste es intenso y prolongado, la D-fructosa (levulosa) del azcar
invertido se descompone y da lugar a cido levulnico, que adems de formar compuestos
coloreados, eleva el punto de acidez de la solucin, lo que motiv el desdoblamiento de
mayor cantidad de sacarosa (Ranken, 1993).
Este efecto explicara el hecho de que 21 rouxii sea capaz de crecer en soluciones
de sacarosa como son el medio experimental para la deteccin del olor a petrleo.
Aplicado a sustratos slidos, tanto el pretratamiento trmico equivalente a una pasterizacin
que se aplica a la masa cruda de mazapn (ver Apartado 111.1 de Material y mtodos) como
la esterilizacin en autoclave del medio donde se reprodujo la alteracin dara lugar a la
conversin de parte de la sacarosa en glucosa y fructosa. Estos azcares simples, junto con
otros integrantes del jarabe de glucosa empleada en la fabricacin de la pasta de almendra,
como se ha descrito en este mismo apartado, son sustrato para el ciecimiento de 21 rouxii,
cuyo metabolismo, con produccin de cidos, sera responsable de la inversin de mayor
cantidad de sacarosa.
145
E Discusin
-
Respecto a otras referencias de alteraciones similares a sta, cabe destacar dos. Una
de ellas se ha encontrado en aceitunas, sobre las cuales ciertas leVaduras fermentativas y
pectinoliticas producen reblandecimiento y formacin de bolsas de gas en los frutos; este
efecto, junto con la produccin de depresiones bajo y alrededor de las colonias individuales
debido a la pectinolisis, dan lugar a una alteracin que por su geometra caracterstica se
ha denominado ojo de pez (Vaughn el al., 1972). Por otra parte, se ha detectado en fresas
la presencia de la levadura Kloeckera apiculata, que se multiplica en zonas daadas de la
fruta hasta desarrollar una masa color crema que crece hasta formar un crter (Tudor y
Board, 1993). La masa color crema, en la pasta de almendra, correspondera a la zona de
crecimiento de 21 roaxil, en el punto central de la licuefaccin, cuyo color se asemejara
al de la pasta sin alterar.
V.4.- CMI de sorbato tiara cepas seleccionadas
La determinacin de la concentracin de sorbato capaz de inhibir las cepas es

fundamental a la hora de investigar las alteraciones que pueden producir los organismos
en presencia del conservante.
El estudio de la CMI de sorbato se limit a algunas cepas de levaduras

representativas de las especies consideradas resistentes. Respecto a la CMI para las cepas
y especies de hongos filamentosos aislados en este trabajo, cabe mencionar que, en general,
las especies de Penicillium son muy resistentes al sorbato, resistencia que se puede atribuir
a su capacidad de descarboxilar el compuesto (Skirdal y Eklund, 1993). As, Liewen y
Marth (1955a) hacen referencia a cepas estudiadas por Marth el al. (1966) de la especie P.
roquefort capaces de crecer en presencia de 5,4 y hasta 7,1 gIL de sorbato; estas cepas
haban sido aisladas de quesos tratados con sorbato. Posteriormente, Finol et al. (1982)
encontraron cepas de P. cyclopium, P. puberulum y P. roquefort capaces de crecer frente
a concentraciones de sorbato tan elevadas como 12, 12 y 10 g/L, respectivamente. Para P.
crustosum, Kinderlerer y Hatton (1990) calculan una CMI de sorbato de 1,25 g/Kg. pero
Finol el al. (1982) estudiaron cepas de esta especie capaces de crecer en presencia de 7 g/L
del conservante. Por otra parte, Liewen y Marth (1985a) encontraron que el gnero
Aspergillus es generalmente ms sensible al sorbato que el gnero Penicillium, y calcularon,
146
Y Discusin
-
como concentracin mxima del conservante que permiti el crecimiento de A. niger, tan
slo 0,5 gIL.
Para la determinacin de la concentracin mnima inhibitoria de cido srbico se

escogieron las siguientes cepas: lE, 2E, 3E, lOE, 14D, 24E1, 26E1, 32E1, correspondientes
a primeros aislamientos de las especies productoras de olor a petrleo. Lo ms destacado
de la Tabla 19, que recoge las CMI determinadas para cepas de 21 rouxii (cepas lE, 2E,
14D, 24E1, 26E1, y 32E1) y de D. hansenii (cepas 3E y lOE), es la diferencia de valores
existente cuando las cepas crecen en 1 y 60% (p/v) de glucosa. Para todas las cepas
ensayadas, la CMI en medio base con 1% de glucosa fue =0.5gIL; sin embargo, cuando
el medio base contiene 60% de glucosa, la CMI, es decir, la concentracin de sorbato
necesaria para inhibir el crecimiento, fue muy superior para todas las cepas,
independientemente de que pertenezcan a Z. rouxii o a D. hansenii. Puesto que en la
fabricacin de mazapn se emplea una dosis de 1 gIL de cido srbico y la concentracin
de azcar es similar a la del segundo medio base, es lgico que la CMI para las cepas que
han alterado estos productos -cepas lE a 26E1- sea cercana o incluso superior a este valor.
Incluso la cepa 32E1, aislada de pasteles de yema sin alterar (muestra M30), no es inhibida
por 1 gIL de sorbato pues la CMI de conservante para esta cepa es 1,2 gIL, lo que es
indicativo de que el producto puede ser alterado con el transcurso del tiempo.
Respecto a las diferencias de la CMI en 1 y 60% de lucosa, los resultados

confirman el hecho, expuesto en el Apartado 1.2.1 de la Introduccin, de que la tolerancia
al sorbato por Z. rouxii se incrementa cuanto ms baja es la a,, del sustrato. Este efecto se
debera a un cambio en los componentes de la pared celular y de los lpidos de la
membrana, que provocara un cambio en la permeabilidad celular al sorbato, asociado al
modelo propuesto para la resistencia al sorbato por esta levadura, segn el cual sus clulas
se encogen en respuesta a la baja a,,, con lo que el tamao de poro disminuye y se dificulta
el influjo de sorbato. Otras hiptesis acerca de este comportamiento se refieren en el mismo
apartado de la Introduccin.
La influencia de la concentracin de azcar sobre la resistencia al sorbato se estudi

cualitativamente mediante el siguiente experimento: se sembraron dos cepas de D. hansenii
147
E- Discusin
-cepas 3E y 4E- y seis de Z. rouxii -cepas lE, 2E, 14D, lSD, 35E1(l) y 36E1- en medio
YMA en tres condiciones distintas: 1% (p/v> de glucosa y 0,05% de sorbato potsico; 60%
(p/v) de glucosa y 0,05% de sorbato potsico; 60% (plv) de glucosa y ausencia de
conservante. Las cepas de D. hansenii produjeron olor a petrleo en presencia de
conservante en ambas concentraciones de glucosa, pero no en ausencia del mismo,
resultados que coinciden con los encontrados previamente (Casas et aL. 1996). Sin
embargo, todas las cepas de 21 rouxii mostraron un comportamiento distinto: produjeron
olor a petrleo en presencia del conservante slo cuando el medio contena 60% de
glucosa, pero no, sorprendentemente, cuando la concentracin de azcar era del 1%, ni, por
supuesto, en ausencia de sorbato. Respecto a la produccin de gas por parte de Z. rouxii,
sta fue muy elevada en el medio con 60% de glucosa y en ausencia de conservante, lo
cual es indicativo de una gran actividad fermentativa; en presencia de 0,05% de sorbato,
la produccin de gas fue tambin moderadamente elevada cuando el medio contena 60%
de azcar, pero para la misma concentracin de sorbato y un 1% de glucosa, la produccin
de gas fue muy escasa. Estos resultados ponen de manifiesto que en 21 rouxii existe una
estrecha relacin entre capacidad de resistencia al sorbato y actividad fermentativa, aunque
se desconoce si la explicacin a esta relacin reside en alguna de las hiptesis planteadas
anteriormente. Marth et al. (1966) dedujeron de sus estudios con cepas de P. roquefor:i que
los sustratos altamente nutritivos favorecen la rpida y completa eliminacin del sorbato
por parte del hongo, lo que concuerda con el efecto encontrado en Z. rouxu.
V.5.- Identificacin de nentadieno como comnuesto responsable del olor a petrleo
El anlisis de 1,3-pentadieno se llev a cabo sobre las cepas de levadura productoras

del olor a petrleo correspondientes a los primeros aislamientos (lE, 2E, 14D, 24E1,
26E1, 32E1, 34E1(l), 35E1(1) y 36E1 del rouxii, y 3E, 4E y lOE de D. hansenii). y los
hongos aislados (Hl a H7).
Como ya se ha descrito previamente, algunos hongos del gnero Penicilliurn y las

bacterias lcticas son capaces de degradar por descarboxilacin el sorbato a 1,3-pentadieno,
que posee un caracterstico olor a petrleo. El metabolito voltil producido por las
levaduras y hongos filamentosos aislados en este trabajo, que posee el mismo olor, ha sido
148
Y- Discusin
tambin identificado como 1,3-pentadieno mediante sus cromatogramas y espectros de

masas, que se muestran en las Figuras 3 a 9. Se trata pues de la primera referencia de la
capacidad de descarboxilacin del sorbato en dos especies de levaduras, 21 rouxii y D.
hansenil, y en dos especies de hongos filamentosos, P. simplicissimum y A. niger.
De los cromatogramas del gas de cabeza de algunos cultivos cabe tambin destacar
que no se consigui la separacin total de los compuestos. En el cromatograma 3a,
correspondiente a la cepa lE de 21 rouxii, se observan picos interferentes con el de 1,3-
pentadieno, que corresponden a productos de fermentacin del azcar por parte de la
levadura: CO2 y etanol. Como los mohos no son fermentativos, y D. hansenii tampoco
produce gas en cantidad apreciable, como ya se discuti en el Apartado V.3.l, no

aparecieron estas interferencias en el pico del 1,3-pentadieno.
Ya que el cido srbico puede penetrar continuamente a travs de la membrana

celular de la levadura, los mecanismos de resistencia descritos en el Apartado 1.3.2 de la
Introduccin, como la extrusin de protones a expensas de un aumento en la actividad de
la ATPasa de membrana, terminaran por agotar las reservas energticas de la clula (Cole
y Keenan, 1987). Por tanto, el desarrollo de un sistema de degradacin del sorbato, como
su descarboxilacin, sera ms rentable energticamente.
CH3-CH=CH-CH=CH-COOH -+ CH3-CH=CH-CH=CH2 + CO2

cido srbico 1 ,3-pentadieno
Adems del pentadieno, se han identificado otros derivados del cido srbico como
productos de destoxificacin. Estos productos, generados por algunos mohos y/o bacterias
lcticas, son el resultado de ciertas reacciones de esterificacin, reduccin y formacin de
ter que afectan al grupo carboxilo, altamente reactivo, del cido srbico (Kinderlerer y
Hatton, 1990). En bacterias, se han encontrado varios derivados voltiles procedentes de
la degradacin del cido srbico en vinos producida por bacterias lcticas, ocasionando una
prdida de calidad de estos vinos. La degradacin comienza con la reduccin del sorbato
al correspondiente alcohol, es decir, hexadienol, el cual reaciona con el etanol para rendir
una serie de compuestos responsables de la aparicin de un olor descrito como a geranio
149
E- Discusion
(Liewen y Marth, 1985a; Sofos, 1959; Kinderlerer y Hatton, l990~ Sofos y Busta, 1993).
Por tanto, parece evidente que el grupo carboxilo libre es necesario para la actividad
antimicrobiana del sorbato, y as, los microorganismos que han desarrollado un mecanismo
de destoxificacin lo hacen suprimiendo qumicamente el grupo carboxilo cargado
(Kinderlerer y Hatton, 1990).
Dentro de los hongos filamentosos, la capacidad de destoxificacin del sorbato por

conversin en 1,3-pentadieno parece estar restringida al gnero Penicillium; este sistema
de destoxificacin permite a algunos Penicillium crecer en presencia de niveles de sorbato
hasta de 1,2 gIL (Kinderlerer y Hatton, 1990). En 1966, Marth et aL fueron los primeros
en estudiar este fenmeno en cuatro especies de Penicillium: P. roqueforti. P. notatum, P.
frequentans y P. cyaneo-fulvum, aisladas de quesos tratados con sorbato que desprendan
un caracterstico olor a hidrocarburo Actualmente estas especies, a excepcin de P.
roquefortii, han sufrido un cambio en su taxonoma: P. frequentans es sinnimo de P.
glabrum (Pitt, 1991), P. notatum se incluye en la especie P. chysogenum (Ramrez, 1982;
Pitt, 1991) y P. cyaneo-fulvum tambin forma parte de la especie P. chrysogenum (Ramrez,
1982). La capacidad de estas y otras especies capaces de producir pentadieno ya se ha
descrito en la Tabla 27 de Discusin.
Por tanto, las cepas Hl. H3, H4 y H5, identificadas en este trabajo como P.
chrysogenum, pertenecen a una de las especies en las que primero se describi el sistema
de destoxificacin del cido srbico por descarboxilacin a pentadieno, y representan la
especie mayoritaria, con 4 aislamientos de 7.
La cepa H2 fue identificada dentro de otra especie productora de pentadieno. P.

crustosum. Kinderlerer y Hatton (1990) estudiaron 7 cepas de P. crustosum y todas fueron
capaces de descarboxilar el sorbato; aunque dentro de una misma especie de hongo hay
cepas extremadamente resistentes al cido srbico mientras que, otras son sensibles al
mismo, P. crustosum parece ser una de las especies ms resistentes <al conservante. Liewen
y Marth (1985a) estiman una concentracin mxima de sorbato potsico que permite el
crecimiento de P. crustosum de 6 gIL a 250C y 2 gIL a 40C, mientras que para P.
chrysogenum y P. notatum, actualmente sinnimo de la anterior, estas concentraciones se
150
Y Discusin
-
reducen a 0,5 g/L a cualquiera de las dos temperaturas. La variacin de la tolerancia al

sorbato en funcin de la temperatura se explica por el hecho de que, generalmente, las
temperaturas fuera del rango ptimo para el crecimiento de cualquier microorganismo
incrementan la efectividad del sorbato para inhibir su crecimiento (Liewen y Marth, 1985a;
Sofos, 1989). Esta influencia de la temperatura en la efectividad del sorbato debe, por tanto,
tenerse en cuenta a la hora de establecer la temperatura de almacenamiento de los alimentos
tratados con este conservante (Finol et al., 1982).
Respecto a la tercera especie identificada, P. simplicissimum (H6), no se han

encontrado referencias anteriores sobre su capacidad de produccin de pentadieno, pese a
ser, como ya se ha dicho, una especie contaminante muy comn en diferentes sustratos
como suelos y materiales en descomposicin (Pitt, 1991). No obstante, es posible que esta
ausencia de referencias se deba a una distinta interpretacin respecto a la taxonomia.
Mart et aL (1966) no establecieron en su estudio si los hongos obtienen energa

a partir del cido srbico mediante su descarboxilacin, o si el nico beneficio derivado de
esta reaccin es modificar el conservante, inactivndolo de manera que permita su
crecimiento. Se conoce adems muy poco acerca de la conversin del sorbato en 1,3-
pentadieno, respecto a la ruta metablica y enzimas implicadas. Una serie de
microfotografas electrnicas realizadas por Kinderlerer y Hatton< (1990) en micelio de
Penicillium crustosum crecido en presencia de cido srbico no proporcionaron ninguna
evidencia acerca de la localizacin celular donde tiene lugar la conversin del conservante
en 1,3-pentadieno.
Por ltimo, se desconoce si la capacidad de degradacin de sorbato se debe

exclusivamente a la exposicin continuada al conservante, como se refiri en el Apartado
1.3.2 de la Introduccin, o si existe alguna determinacin gentica que confiera slo a
ciertas cepas de microorganismos esta capacidad de degradacin. Marth et al. (1966)
estudiaron el comportamiento de P. roqueforri, un contaminante comn de los quesos, que
result ser la especie de Penicilliuzn ms resistente al sorbato entre las que estudiaron estos
autores; stos proponen que P. roqueforti puede haber desarrollado esta resistencia a travs
de la prolongada exposicin al sorbato, ya que el tratamiento de los quesos con este
151
Y Discusin
-
conservante es una prctica muy frecuente. Posteriormente, Finol et aL (1982) aislaron de

quesos algunas cepas de Penicillium que resistan concentraciones bastantes superiores de
sorbato; puesto que las queseras de origen eran distintas en los dos estudios, estos autores
no pueden asegurar que se desarrolle una flora fngica resistente al sorbato en estas
factoras donde se emplea constantemente este conservante, aunque admiten esta
posibilidad. Asimismo, como las especies de Penicillium identificadas en ambos estudios
eran diferentes excepto P. roqueforti, como se refleja en la Tabla 27, los autores deducen
que la capacidad de metabolizar el sorbato no est restringida a unas pocas especies de
Penicillium.
Se ha descrito que, a diferencia de los hongos del gnero Penicillium, los del gnero
Aspergillus no son capaces, en general, de descarboxilar el sorbato. Kinderlerer y Hatton
(1990) investigaron esta capacidad en 15 cepas xerotolerantes del gnero Eurotium,
perteneciente al grupo de Aspergllus glaucus, y tan slo una cepa perteneciente a la
especie E. repens fue capaz de producir una pequea cantidad de pentadieno. Sin embargo,
la cepa de A. nger (H7) aislada en este estudio fue capaz de descarboxilar el sorbato
aunque se aisl de una muestra de miel (M39), como se cita en la Tabla 6 de Material y
mtodos, y por tanto no haba tenido lugar un contacto previo con el conservante, al menos
en el curso de este trabajo.
Segn sealan Mart et aL (1966), el cido srbico ejerce un efecto fungisttico

sobre A. niger a travs de la inhibicin de la actividad catalasa. Por su parte, Liewen y
Mart (1985a) establecen una concentracin mxima de sorbato potsico que permite el
crecimiento de A. nger de 0,5 g/L a 250C, mientras que a 40C esta misma concentracin
de sorbato inhibe por completo el crecimiento, variacin debida al efecto de la temperatura
que ya se ha apuntado. Aunque Sofos (1989) y Sofos y Busta (1993) refieren la existencia
de cepas de Aspergillus capaces de degradar el sorbato, no especifican a qu especies
pertenecen estas cepas, ni si la degradacin del compuesto produce pentadieno como
metabolito final. As, sera sta la primera ocasin en que se ha aislado una cepa de A.
nger productora de pentadieno sin haber existido adems exposicin previa al sorbato. Esta
caracterstica convierte a A. niger en una nueva especie peligrosa que debe considerarse en
cuanto a la conservacin de los alimentos mediante su tratamiento con sorbato.
152
V.- Discusion
Como en el caso de los mohos, los resultados en levaduras no permiten afirmar si

la capacidad de resistencia al sorbato est restringida genticamente a cepas de las especies
21 rouxii y D. hansenii, que de esta manera han sobrevivido en presencia del conservante,
o bien su capacidad de multiplicarse en un medio altamente azucarado ha permitido que,
tras el contacto repetido con el conservante, hayan desarrollado la capacidad de degradarlo,
llegando en cualquiera de los dos casos a alterar el alimento.
Cabe mencionar un trabajo realizado por Berenguer et al. (1991) en el que se

describe la alteracin de un producto de bollera -sobao pasiego- consistente en la emisin
de un olor intenso a hidrocarburo, que puede asociarse a la alteracin de los productos
de mazapn descrita en este trabajo. Los autores atribuyen la aparicin de este olor a la
produccin de isopreno por mohos contaminantes del producto pertenecientes al gnero
Eurotium. Como puede observarse en el cromatograma 2a y su correspondiente espectro,
2b, tanto el tiempo de retencin -1,8 minutos- como la fragmentacin m/z del isopreno (2-
metil 1,3-butadieno) son prcticamente coincidentes con los del 1.3-pentadieno, ya que la
estructura del primer compuesto es similar a la del segundo, ramificada:
CH3-CH=CH-CH=CH2 CH2=CH-C(CH3)=CH2
1 ,3-pentadieno isopreno
Esta coincidencia no permitira en principio afirmar que el compuesto responsable

del olor a petrleo de las muestras de mazapn sea realmente 1,3-pentadieno, y la
imprecisin implica una importante consecuencia respecto a la ruta a travs de la cual se
forma el compuesto. Si se trata de pentadieno, tal y como se ha descrito previamente, el
microorganismo en cuestin sera capaz de descarboxilar el cido srbico a una forma
inactiva, superando as la inhibicin por el conservante. Sin embargo, tratndose de
isopreno, cabra deducir que la presencia de sorbato induce una ruta metablica especial
que no implica la degradacin del conservante.
El isopreno es un metabolito sillar de muchas sustancias naturales de origen vegetal,

entre otras, los precursores de las cuatro vitaminas liposolubles: carotenoides vegetales
(precursores de la vitamina A), ergosterol de levaduras y otros hongos (precursor de la
153
Y Discusin
-
vitamina D2 o ergocalciferol), tocoferoles (precursores de la vitamina E) y naftoquinonas
(precursoras de la vitamina K) (Lehninger et al., 1995). Berenguer et aL (1991) no

especifican el precursor ni la ruta de produccin de isopreno por parte de los mohos
aislados, ni la causa de acumulacin de este metabolito, que da lugar a la aparicin del olor
caracterstico. Tampoco indican si se ha empleado sorbato en la fabricacin del producto
alterado, dato fundamental si tenemos en cuenta que en este trabajo la presencia del
conservante es impresicindible para la produccin del olor a petrleo, tanto por parte de
las levaduras (Casas et aL, 1996) como de los hongos filamentosos (Liewen y Marth,
1985a). Previamente, Liewen y Marth (1985b) ya haban comprobado que aquellos hongos
inoculados en YMB en presencia de sorbato producan pentadieno, mientras que en el
mismo medio pero en ausencia del conservante no se detectaba presencia de pentadieno.
Como sealan Mart et aL (1966) o Liewen y Mart (1985b), la produccin de 1,3-

pentadieno por parte de Fenicillium viene acompaada por un descenso en la concentracin
de sorbato. La desaparicin de sorbato en en el medio es, por tanto, el hecho que permitir
afirmar que el compuesto voltil responsable del olor a petrleo i) se produce a expensas
de la degradacin del sorbato; u) es pentadieno y no isopreno, ya que es el primero de ellos
el que tiene una estructura lineal como el sorbato, mientras que la del segundo compuesto
es ramificada.
La produccin de 1,3-pentadieno a partir de sorbato se cuantific, midiendo la

aparicin e incremento del primero y la disminucin del segundo, as como el incremento
del nmero de clulas, en dos cepas, lE y 3E, representantes de las dos especies
productoras del olor a petrleo, Z. rouxii y D. hansenii, respectivamente.
V.5.1.- Cuantificacin de sorbato
Respecto a la tcnica de cuantificacin de sorbato mediante HPLC, debe

mencionarse que fueron necesarios varios ensayos para lograr establecer unas condiciones
cromatogrficas adecuadas, en referencia al tipo de columna seleccionada, as como a la
fase mvil empleada y la velocidad de flujo de la misma. Dichas condiciones permitieron,
en primer lugar, obtener tiempos de retencin del compuesto patrn -21,17 minutos- (Figura
154
Y- Discusin
10) reproducibles en las sucesivas inyecciones de extractos procedentes del medio

experimental sin inocular (Figura 11), o inoculado e incubado durante cuatro das con la
cepa lE de 21 rauxil (Figura 12) y con la cepa 3E de D. hansenii (Figura 13). Por otra
parte, en el metabolismo de las levaduras, adems de CO2 y etanol, se producen una serie
de productos secundarios finales como alcoholes superiores, cidos orgnicos, steres,

aldehdos y sustancias cetognicas (Fleet, 1992), algunos de los cuales pueden interferir al
absorber a longitudes de onda cercanas a la fijada para la deteccin por UV del cido
srbico (~ = 264 nm). La correcta puesta a punto de la tcnica condujo a la eliminacin
prcticamente total de picos interferentes con los del cido srbico.
Cabe tambin destacar una diferencia notable entre el cromatograma obtenido a

partir del compuesto patrn (Figura 10) y los obtenidos de la inyeccin de los extractos de
los medios de cultivo (Figuras 11, 12 y 13). En el primero se trata de un pico nico,
mientras que en el resto el pico principal, con el mismo tiempo de retencin que el patrn,
aparece precedido por un pico de menor altura que no llega a separarse del segundo. Esta
diferencia se debe a la naturaleza de los reactivos empleados; para l~ preparacin del patrn
se emple cido srbico de alta pureza, mientras que en los medios de cultivo el
conservante se aadi en forma de sal potsica de calidad comercial. Durante el proceso
de preparacin de las muestras para HPLC, como se describi en el Apartado 111.9.2.1.1
de Material y mtodos, la sal sdica se transforma en su forma cida, de ah que fuera
necesario aplicar un factor de correccin en el clculo de la concentracin extraida de
sorbato potsico a partir de la concentracin medida en forma cida. La adicin de sal
potsica de baja pureza puede dar lugar a la deteccin cromatogrfica de un ismero
minoritario cuyo pico no se separa del pico principal, y cuyo rea se sum a la del
compuesto mayoritario a la hora de calcular la concentracin de sorbato extraida de las
muestras.
La Tabla 21 muestra la cuantificacin de sorbato en el medio tras la incubacin de

las cepas de levadura lE de Z. rouxii y 3E de D. hansenii en: presencia de distintas
concentraciones de sorbato. Como puede observarse, las concentraciones iniciales -0.25.
0,50 y 1,00 gIL (equivalentes a 250, 500 y 1000 ppm) se redujeron; respectivamente, hasta
1.60, 3,14 y 9,85 ppm para lE y 3.18, 4,43 y 5,23 ppm para 3E, lo que demuestra que las
155
E- Discusron
levaduras han sido capaces de destoxificar casi en su totalidad el conservante y lo ha

transformado en pentadieno, siendo sta una (capacidad) que hasta el momento no se haba
encontrado en levaduras.
V.5.2.- Produccin de pentadieno
Se puede observar que tanto la cepa lE de 21 rouxii (Tabla 22) como la cepa 3E
de D. hansenii (Tabla 23) produjeron 1 ,3-pentadieno en una cantidad creciente a lo largo
del perodo de incubacin. El primer aspecto a destacar de ambas tablas es que ninguna de
las dos cepas produjo pentadieno hasta el segundo da de incubacin, lo que concuerda con
los resultados obtenidos en el diseo de la prueba estandarizada para la deteccin de olor
a petrleo que se describir en el apartado siguiente.
Por otra parte, tambin se observa que cuanto mayor es la concentracin de sorbato
aadida al medio, la cantidad de pentadieno producido tras finalizar el perodo de
incubacin es superior. Los valores finales de pentadieno corresponden a la transformacin
casi completa del sorbat en pentadieno, como ya se ha discutido, pero las determinaciones
de pentadieno durante el perodo de incubacin (das 2 y 3) revelan ~jueno slo los valores
finales, sino tambin los iniciales e intermedios, son directamente proporcionales a la
concentracin de sorbato del medio. Estos resultados sugieren que, para superar la
<
inhibicin que ejerce el sorbato sobre las levaduras, stas desarrollan un mecanismo de
degradacin del mismo, que ser tanto ms activo cuanto mayor sea la concentracin del
conservante presente en el medio, de manera que ste sea eliminado en el menor tiempo
posible y la levadura pueda crecer en el medio, una vez que este proceso de destoxificacin
haya tenido lugar.
Por ltimo, se pueden comparar los valores finales de pentadieno medidos en los
medios inoculados con la cepa lE de 21 rouxii (3,91, 7,27 y 11,11 pL) y los
correspondientes inoculados con la cepa 3E de D. hansenj (2,82, 4,85 y 19,44). Para las
concentraciones iniciales de 0,25 y 0,50 gIL de sorbato, la cantidad de pentadieno
producida por 21 rouxii fue aproximadamente el doble de la producida por D. hansenii,
mientras que frente a una concentracin inicial de 1,00 gIL de sorbato fue la cepa 3E la
156
E- Discusion
que produjo casi el doble de pentadieno. Estos valores concuerdan con las concentraciones
de sorbato remanentes en estos medios, reflejadas en la Tabla 21, y< sugiere que la primera
especie, en presencia de la concentracin ms elevada de sorbato, necesita transformar
menor cantidad del conservante en pentadieno.
V.5.3.- Recuentos celulares
Las Tablas 24 y 25 muestran los recuentos de clulas para ls cepas lE de 21 rouxii

y 3E de D. hansenii, respectivamente, antes de la incubacin <y tras cuatro das de
incubacin en ausencia de sorbato y en presencia de tres concentraciones crecientes de
sorbato. Se puede observar, en primer lugar, que el nmero de clulas que se inocul de
cada cepa aument una unidad logartmica tras el perodo de incubacin. Los recuentos de
la cepa de 21 rouxii, habiendo inoculado los medios con 4,0 x o~ UFC/mL, tras la
incubacin en presencia de 0,25, 0,50 y 1,00 gIL de sorbato, fueron muy similares: 3,6, 4,0
y 4,0 x 106 UFC/mL, respectivamente; en ausencia de sorbato, el nmero de clulas tras
la incubacin fue de 5,0 x 106 UFC/mL. En el caso de la cepa de D. hansenji, de la que
se inocularon 1,5 x 106 UFC/mL, los recuentos en presencia de las concentraciones
crecientes de sorbato tambin fueron muy similares: 1,5, 1,0 y 1,6 x l0~ UFC/mL,
respectivamente; en ausencia de sorbato, el nmero de clulas se increment hasta 7,5 x
l0~ UFC/mL, valor aproximadamente cinco veces superior que en presencia de sorbato.
Cuando las levaduras crecen en presencia de cido srbico, se produce un aumento

en la duracin de la fase de latencia durante la cual, como mecanismo de resistencia al
conservante, los protones deben ser bombeados por la ATPasa de membrana (Cole y
Keenan, 1987; Stratford y Anslow, 1996). La duracin de la fase de latencia depende por
tanto de la severidad del estrs producido por el cido (Holyoak et aL, 1996), aumentando
sta exponencialmente con la concentracin de cido srbico (Nevs et aL, 1994). En este
trabajo, al no haberse realizado curvas de crecimiento con recuentos intermedios de clulas
durante el perodo de incubacin, no se ha estudiado este efecto. Sin embargo, el estudio
estadstico s desvel una importante discrepancia en el comportamiento en presencia de
sorbato entre las cepas lE de 21 rouxii y 3E de D. hansenii atendiendo a los recuentos
antes y despus de la incubacin. En el caso de 21 rou.xii, el anlisis de la varianza no
157
Y- Discusin
revel ninguna diferencia significativa dentro del conjunto de recuentos. Este hecho pone
de manifiesto que la presencia de sorbato, en cualquiera de las tres concentraciones
ensayadas, no ejerce ningn efecto apreciable sobre el crecimiento de la levadura, pues ste
no disminuye sensiblemente respecto al crecimiento en el mismo medio sin sorbato.
Por el contrario, el mismo anlisis estadstico aplicado los recuentos de D.

hansenj si revel la existencia de diferencias significativas entre es<tos valores, diferencias
que desaparecen al eliminar el valor correspondiente al recuento final de la levadura en el
medio sin sorbato. Estos resultados se pueden interpretar como un cierto efecto inhibidor
del sorbato sobre el crecimiento de D. hansenii, al menos la cepa estudiada, de igual
magnitud independientemente de la concentracin de conservante presente en el medio.
As, aunque las dos especies de levadura se consideran resistentes al sorbato los
resultados confirman el hecho conocido de la elevada resistencia de 21 rouxii a los cidos
dbiles, en este caso al sorbato, pues la CMI calculada es de 1,2 gIL, como se muestra en
la Tabla 19 de Resultados, y las concentraciones inferiores no son capaces de disminuir de
forma apreciable el crecimiento de la misma. Sin embargo, D. hansenji, que present una
CMI de sorbato de 0,9 g/L, que aparece en la misma tabla, consigui alcanzar una
poblacin sensiblemente menor en presencia de concentraciones subinhibitorias del
conservante, de manera que una concentracin tan baja como 0,25 g/L fue capaz de
provocar una disminucin considerable en el crecimiento de esta levadura. En este sentido,
cabe recordar de nuevo los resultados, que ya se han discutido, de las Tablas 22 y 23, en
las que se recoge la cantidad de pentadieno producida por 21 rouxii (cepa lE) y D. hansenj
(cepa 3E) respectivamente, a partir de las mismas concentraciones iniciales de sorbato; en
ellos ya se pone de manifiesto que la primera levadura necesita destoxificar menor cantidad
de conservante al crecer en presencia de la mayor de las tres concentraciones ensayadas.
No obstante, no parece adecuado realizar una generalizacin de estos resultados, pues slo
se llev a cabo un experimento y con una nica cepa de cada especie.
Una limitacin muy importante al uso de sorbato es, por tanto, la seleccin de
microorganismos resistentes al mismo que finalmente provocan la <alteracin del alimento
en el que se desarrollan. As, las medidas encaminadas a la prevencin de estas alteraciones
158
Y- Discusion
deben dirigirse, en primer lugar, a impedir el contacto de estos microorganismos peligrosos

con el alimento, principalmente a travs de unas estrictas medidas< de higiene, que deben
aplicarse antes, durante y despus de la fabricacin de los productos.
V.6.- Prueba estandarizada
Mientras que la reproduccin del olor a petrleo y/o gas se comprob en todas
las cepas aisladas, la prueba estandarizada se estableci con varios de los primeros
aislamientos: lE, 3E, 19D, 24E1, 26E1, 32E1, 35E1(2), representantes de las dos especies
productoras de olor a petrleo, 21 rouxii (LE, 19D, 24E1, 26E1, 32E1 35E1(2)) y D.
hansenii (3E).
Los resultados de las distintas condiciones de inoculacin \ preincubacin de las

levaduras pusieron de manifiesto que para detectar con certeza el olor a petrleo es
necesario un perodo de incubacin de 24 horas en el medio con sorbato. La preincubacin
en YMB, independientemente de la duracin de sta, no redujo la duracin de este perodo
de incubacin.
Asimismo, para la rpida reproduccin del efecto es necesario inocular un nmero

elevado de clulas, de manera que con la suspensin densa se consigui una produccin
ms rpida del olor a petrleo que con la inoculacin de una colonia aislada. Para
conseguir los mismos efectos con una colonia aislada, la placa debera incubarse durante
un perodo de tiempo tal que la colonia estuviese muy desarrollada, lo que equivale, en
trminos de duracin del ensayo, a resembrar en masa la levadura.
La utilidad de este ensayo de laboratorio es su aplicacin a la industria. Realizando

esta prueba en paralelo a los recuentos rutinarios en la industria, algunas levaduras
potencialmente peligrosas, en nmero inferior al mximo permitido, pueden serrpidamente
detectadas, y el lote de productos retenido en la fbrica para evitar el deterioro posterior
a su distribucin y el rechazo por parte del consumidor.
159
VL CONCLUSIONES
-
VI.- Conclusiones
1.- La levadura aislada con mayor frecuencia de productos altamente azucarados,

principalmente productos de mazapn, es Zygosaccharomyces rouxii, que junto con algunas
cepas de Debaryomyces hansenii, es responsable de la alteracin de estos productos.
2.- La tcnica de enriquecimiento en medios de cultivo con alta concentracin de azcar

facilita la recuperacin de levaduras osmotolerantes a partir de alimentos azucarados.
3.- El medio recomendado para inducir la esporulacin en levadurs es el V8 diluido diez

veces, que debe incubarse a temperatura subptima -200C- y durante un perodo de tiempo
variable, dependiendo de la cepa. La observacin microscpica debe realizarse con 1000
aumentos, no siendo necesario aplicar la tcnica de tincin de esporas.
4.- Algunas cepas de levaduras y de hongos filamentosos son capces de resistir elevadas
concentraciones de sorbato en alimentos y sustratos altamente azucarados mediante la
conversin del compuesto en un metabolito sin actividad antimicrobiana, identificado como
1,3-pentadieno. Este compuesto, que se genera por descarboxilacin del sorbato, es el
responsable de la aparicin en ciertas muestras de un olor caracterstico a petrleo.
5.- Las cepas de levadura capaces de descarboxilar el sorbato a 1,3pentadieno pertenecen

a la especies 21 rouxi y D. hansenl, y las de hongos filamentosos a diversas especies del
gnero Pencillium y a la especie Aspergillus niger. Esta capacidad ya haba sido descrita
en Penicillium, pero es la primera referencia de la misma en levaduras y en A. nger.
6.- El desarrollo de este mecanismo de resistencia, junto con la tolerancia a elevadas

concentraciones de azcar, convierte a estas especies de levaduras y hongos filamentosos
en organismos potencialmente peligrosos en cuanto a la conservacin de los alimentos.
7.- La aparicin de licuefacciones puntuales en pasta de almendra e~ una manifestacin del

desarrollo de 21 rouxii en presencia de elevadas concentraciones de azcar y de sorbato;
el metabolismo de la levadura genera humedad y da lugar a la prdida de masa slida
alrededor de la zona de crecimiento, lo cual, junto con la aparicin del caracteerstico olor
a petrleo, da cuenta de la alteracin del producto.
161
VI. Conclusiones
-
8.- El diseo de una prueba rpida y sencilla para discriminar los microorganismos que
toleran altas concentraciones de azcar y son resistentes al sorbato resulta de gran utilidad
para las industrias productoras de alimentos azucarados. Esta prueba puede ser incluida en
el control de calidad rutinario y aplicarse a las levaduras y hongos filamentosos aislados
en este <tipo de anlisis.
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177
VIIL- APENDICES
Apndice 1
APNDICE 1.- MEDIOS DE CULTIVO
Medios generales para el aislamiento y crecimiento de microorganismos
PDA (Potato Dextrose Agar [SA <TrvDtone Soy Agar

Deshidratado (Difco). Deshidratado (Oxoid).
YMA (Yeast Morvhologv ARar) (g/L)

glucosa 10,0
peptona proteosa (Difco) 5,0
extracto de levadura (Difco) 3,0 Esterilizar a 1210C, 20.
extracto de malta (Difco) 3.0
agar 20,0
YMB (Yeast Moryhologv Broth)con 330 ~/L de glucosa (g/L)

glucosa 330,0
peptona proteosa 5,0 Esterilizar a 1150C, 1O
extracto de levadura 3,0 (Golden y Beuchat, 1990, 1992b).
extracto de malta 3,0
Medios empleados para la identificacin de levaduras
Agar urea de Christensen (g/L)

glucosa 1,0
peptona proteosa 1,0
NaC 5,0 0C, 20),
Tras autoclavar (121
KH aadir 20 mL de una solucin de urea
2PO4 2,0
al 20% esterilizada por filtracin.
rojo fenol (indicador) 0,012
agar 20,0
agua destilada 900,0 mL
179
)
Apndice 1
Corn Meal Atar

Deshidratado (Difco).
Crecimiento en 50% (o/u) de glucosa

extracto de levadura 10,0 g
glucosa 500,0 g Esterilizar a 115C, 10.
agar 20,0 g
agua destilada 500 mL
Crecimiento en 60% (p/n~ de glucosa

extracto de levadura 10,0 g
glucosa 600,0 g Esterilizar a 1150C, 10.
agar 20,0 g
Hidrlisis de arbutina (g/L)

extracto de levadura 1,0 Tras autoclavar (1210C,
20), aadir 10 mL de solucin
arbutina 5,0
de citrat frrico-amnico al 1%.
agar 20,0
Medio base para fermentacin (g/L)

Esterili~ar a 1210C, 20.
extracto de levadura 4,5
azul de bromotimol (indicador) a saturacin
Tolerancia a la cicloheximida (g/L)

YNB (Yeast Nitrogen Base) (Difco) 67,0 Esterilizar porfiltracin.
glucosa 100.0
cicloheximida 0,1 (0,01%) 1(0,1%)
180
Apndice
Vitamin-free medium (g/L)

(NH4)2S04 5,0
KH2PO4 1,0
MgSO4 0,5
NaC 0,1
CaCl2 ~2H20 0,1 Esterilizar por filtracin.
B acto dextrosa 10,0
L-histidina 0,01
DL-metionina 0,02
DL-triptfano 0,02
Aadir 1 mL de las soluciones A y B de oligoelementos, estriles por filtracin:
Solucin oligo A (g/L) Soluci oligo B (g/L)

H3B03 10,0 CuSO4 5H20 0,08
Kl 2,0 FeCl3 -6H20 0,4

Na2MoO4 -2H20 4,0 MnSO4 4H20 0,8
ZnSO4 ~7H,O 0,8
Ajustar a pH 3,0 con CR.
Medios de esporulacin
Agar acetato segn Fowell (g/L)

acetato sdico anhidro 4,0 Ajustarla pH 6,5-7,0.
0C, 20.
agar 15,0 Esterilizar a 121
Agar acetato segn Klevn (g/L)

acetato sdico anhidro 5,0
Ajustar a pH 6,9-7,1.
glucosa 0,62
Esterilizar a 1210C, 20.
NaC 0,62
agar 15,0
181
Apndice
Asar acetato segn McClarv (g/L)

acetato potsico 9,8
glucosa 1,0
NaC 1,2
0C, 20.
MgSO4 ~7H2O 2,5 Esterilizar a 121
agar 20,0
Corn Meal Atar

identificacin d levaduras.
Ver apartado de medios empleados para la
Extracto de malta (gIL)

EMB (eosina-azul de metileno
extracto de malta 40,0
Deshidratado (Oxoid).
agar 24,0
Agar Gorodkowa (g/L) -

MAc (Manitol-cido actico) (g/L)
glucosa 1,0 manitol 10,0
peptona 10,0 extracto de levadura 10,0
NaC 5,0 agar 20,0
agar 20,0 Tras autoclavar<(1210C, 20), aadir5,0
Esterilizar a 1210C, 20. mL de cido actico.
PDA
Ver apartado de medios generales.
PRE-1 (g/L) PRE-2 (g/L)

glucosa 10,0 glucosa 100,0
extracto de levadura 10,0 extracto de levadura 8,0
peptona 10,0 peptona 3,0
agar 20,0 agar 20,0
182
Apndice 1
SPO- 1 (gIL) SPO-2 (gIL)

acetato potsico 5,0
acetato potsico 10,0
glucosa 0,5
glucosa 0,5
20,0
agar 20,0 agar
VS (8 ve2eta1es~ VS diluido 1/10

levadura de panadera 7,1 g levadura de panadera 0,71
agar 20,0 g agar 20,0
sopa Campbell 8 vegetales 500,0 mL sopa Campbell 8 vegetales 50,0 mL
agua destilada 500,0 mL agua destilada 950 mL
YEGP (extracto de levadura- Rlucosa-peDtona) (g/L)

glucosa 20,0 Esterilizar a 1210C, 20.
peptona 10,0
agar 20,0
YMA YMA 2% NaC

Ver apartado de medios generales. NaC 20,0 g
YMA 1000 mL
Los medios que no se adquirieron deshidratados se prepararon en liquido, y en

slido, agregando un 2% de agar.
183
Apndice 1
Medios para la identificacin de hongos filamentosos
Concentrado de Czapek (gIL)

NaNO3 300,0
KCl 50,0
MgSO4-7H20 50,0 No necesita esterilizacin.
FeSO4 -7H20 1,0
ZnSO4 7H,O 1,0
CuSO4 7H20 0,5
CYA 20% (n/v) <sacarosa

Czapek-Yeast extract A2ar (CY=t)(gIL) (CY2OS) (g/L)
K
K2HPO4 1,0 2HPO4 1,0
concentrado de Czapek lOmL concentrado de Czapek 10 mL
sacarosa 30,0 sacarosa 200,0
agar 15,0 agar 15,0

0C, 20.
Esterilizar a 121
Aear nitrato alicerol al 25% (G25N) (g/L) A2ar extracto de malta (MEA) (g/L)
de malta 20,0
K2HPO4 0,75 extracto
1,0
concentrado de Czapek 7,5 mL peptona
20,0
extracto de levadura 3,7 glucosa
20,0
glicerol (para anlisis) 250,0 agar
agar 12,0
H20 750 mL
0C, 20.
Esterilizar a 121
184
Apndice
Medios para la reproduccin de las alteraciones
Medio base para la reproduccin del olor a petrleo

Caldo Nutritivo n0 2 (Oxoid) 500 mL
azcar refinado 500 g Esterilizar a 1150C. 10.
A este medio base se le aaden las concentracione de sorbato potsico

especificadas en los correspondientes apartados, ajustando el pH si es necesario.
66% (n/p) sacarosa + 34% (n/rO almendra 1% (u/o) sacarosa + 99% (ufp) almendra
azcar refinado 66,0 g azcar refinado 1,0 g
almendra pulverizada 34,0 g almendra pulverizada 99,0 g
extracto de levadura 1,0 g extracto de levadura 1,0 g
660 2/L sacarosa + 5 2IL almendra

azcar refinado 66,0 g
almendra pulverizada 0,5 g Enrasar a 100,0 mL.
extracto de levadura 0,5 g Esterilizar a 1150C, 10,.
agar 1,5 g
660 g/L sacarosa + indicadores

sacarosa 660,0 g
extracto de levadura 10,0 g Esterilizar a 1150C, 10.
agar 15,0 g
Concentracin de los indicadores: 0,01% para azul de bromofenol, rojo Congo y

verde de bromocresol, que se incorporan en el medio antes de atoclavarlo. El rojo de
metilo, que es insoluble en agua, se aade a los cultivos tras la incubacin en forma de
solucin:
185
Apndice
rojo de metilo 0,05 g

etanol de 960 lOmL
Chalk Atar (gIL)

glucosa 50,0
0C, 20.
extracto de levadura 10,0 Esterilizar a 121
CaCO3 5,0
agar 20,0
Medio Gorodkowa yara liDolisis (gIL)

glucosa 1,0 Una vez autoclavado (1210C, 20),
peptona 10,0 aadir 50 mL de aceite de almendras y agitar
NaC 5,0 hasta conseguir una emulsin homognea.
agar 15,0
Revelado: aadir una solucin saturada de SO

4Cu, estril por filtracin, manteniendo
15 minutos sobre la placa.
Agar de Frazier (agar caseinato clcico

Deshidratado (Merck).
Para este trabajo, se aadieron 0,5 gIL de glucosa. Si n se observan halos de

proteolisis, se puede cubrir la placa con una solucin de cido actico al 2%, que precipita
la casena no hidrolizada.
Base de agar tributirina

Deshidratada (Oxoid)
Para 990 mL de medio base, aadir 10 mL de tributirina o, bara este trabajo, 10 mL

de aceite de almendras. Tambin se incorporaron 0,5 gIl de glucosa.
186
Apndice
YMA+ gelatina YMA+ almidn

YMA 1000,0 mL YMA 1000.0 mL
gelatina 10 g almidn 10 g
Medio inductor de pectinasa (g/L)

NaOH 1,0
cido mlico 3,0
NH
4NO3 2,0 Para este trabajo se aadieron 5 gIL de glucosa.
KH2PO4 1,0 El pH del medio se ajst a 6,0.
0C, 20.
MgSO~7H2O 0,1 Esterilizar a 121
pectina de manzana 10,0
agar 15,0
Revelado: mediante una solucin de bromuro de hexadecil trimetilamonio al 1% o,

en su defecto, de cido clorhdrico iN.
18>7
Apndice
APNDICE II.- DENOMINACIN ACTUAL DE LEVADURAS QUE APARECEN

EN ALGUNAS REFERENCIAS Y HAN CAMBIADO DE NOMBRE
Denominacin antigua Denominacin actual Referencias

Candida claussenii Candida albicans Sofos, 1989
Hansenula anomala Pichia anoinala Vaughn et aL, 1972
var. anomala [ilbury, 1976
Schizosaccharomyces
Octosporomyces octosporus Barnett et aL, 1990
octospo rus
Procandida albicans Candida albicans Sofos, 1989
Procandida tropicalis Candida tropicalis Sofos, 1989
Saccharomyces acidifaciens Zygosaccharomyces rouxii Restaino et aL, 1982
Sofos, 1989
Saccharomyces bailil Zygosaccharomyces bailii Tilbury, 1976
Warth, 1977
Bils ei al., 1982
Restaino et aL, 1982
Sofos, 1989
Saccharomyces bailil Zygosaccharomyces rouxii Tilbury, 1976
var. osmophilus Seiler, 1977
Restaino a aL, 1982
Sofos, 1989
Saccharomyces bisporus Zygosaccharomyces Seiler, 1977
bisporus Restaino et aL, 1982
Saccharornyces bisporus Zygosaccharomyces rouxii [ilbury, 1976
var. mellis
Saccharomyces mellis Zygosaccharomyces rouxii Seiler, 1977
Saccharomyces oleaginosus Saccharomyces cerevisiae Vaughn et aL, 1972
Saccharomyces rouxii Zygosaccharomyces rouxii Windisch, 1969
Brown y Simpson, 1972
Tilbury, 1976
Seiler, 1977
Bils et al., 1982
Restaino et al., 1982
Sofos, 1989
Saccharomyces rouxii Zygosaccharomyces rouxii Bla~chke-Hellmessen y
Boutroux Teuschel, 1970
Torulopsis apicola Candida apicola [ilbury, 1976
Torulopsis bacillaris Candida apicola Tilbury, 1980 =
Torulopsis candida Debaryomyces hansenii [ilbury, 1976

[ilbury, 1980 fl~flL 01< E OA
Torulopsis lactis-condens Candida lactis-condensi [ilbury. 1976
188

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

MICROORGANISMOS RESPONSABLES DE ALTERACIONES

ESPERANZA CASAS ALCANTARILLA

MICROORGANISMOS RESPONSABLES DE ALTERACIONES

Memoria presentada por

)C 12- U*S2 11-o

y0 B0 la Directora del trabajo

Dra. M~ Jos Valderrama Conde

II.- OBJETIVOS DEL TRABAJO 27

u V.5.1.- Cuantificacin de sorbato

u VI.- CONCLUSIONES 160

VIII.- APNDICES 178

E Apndice 1.- Medios de cultivo

1.1.- Levaduras contaminantes de alimentos

As, se conocen alteraciones debidas a levaduras contaminantes en alimentos como

Respecto a la alteracin producida por levaduras, una primera manifestacin puede

Tabla 1.- Principales especies de levaduras responsables de deterioro, por orden

Especie de levadura Alimentos alterados

Dekkera intermedia Cerveza, vino, refrescos, yogur

Issarchenkia orientalis Leche, queso, yogur, salsa de tomate

Kloeckera apiculata Tomates, higos, cerezas en lata, yogur

Pichia membranzfaciens Salmuera de aceitunas, conservas en vinagre, salsa de

Rhodotorula spp. Frutas tratadas trmicamente, nata, mantequilla, helado,

Saccharomyces cerevisiae Refrescos, zumos de frutas, queso, yogur, pan

Saccharomyces exiguus Refrescos, carnes, marisco, chucrut

Schizosaccharomyces pombe Jarabes de azcar

Zygosaccharomyces bailii, Zumos concentrados y jarabes de fruta, vino, salsa de

Zygosaccharomyces rouxii Jarabes concentrados, zumos de fruta, rellenos de

Modificado de Tudor y Board (1993>.

.2.- Alimentos altamente azucarados y microor2anismos osniotolerantes

Los productos altamente azucarados se incluyen dentro de un amplio grupo de

Tabla 2.- Principales productos azucarados de humedad intermedia, junto con su

Las levaduras resistentes a elevadas concentraciones de azcar se denominan, en

De igual forma, se han propuesto diferentes clasificaciones de acuerdo con la

El problema fundamental de la contaminacin por levaduras osmotolerantes de los

1996). En estos alimentos, pueden desarrollarse poblaciones de levaduras de hasta l06~l09

La mayora de las levaduras osmotolerantes implicadas en el deterioro de productos

su crecimiento es de 0,95 (Deak y Beuchat, 1996). Otras especies de Zygosaccharornyces

Tabla 3.- Principales levaduras osmotolerantes asociadas con el deterioro de alimentos

Levadura MCG* (% p/p) Alimento

Zygosaccharomyces bailii 50 Concentrados de frutas, melazas,

Zygosaccharomyces bisporus 50 Mermelada, jarabes, azcar sin

Candida lactis-condensi 57 Fruta confitada, frutas desecadas,

Adaptado de Tilbury (1976), Rose y Harrison (1993) y Deak y Beuchat (1996).

1.2.1- Adaptacin de las levaduras a altas concentraciones de azcar

Las elevadas concentraciones de solutos en el medio conducen a la plasmolisis

reduccin en el tamao de poro (Golden y Beuchat, 1992a). Por ejmplo, en cerevisiae,

Las levaduras tolerantes a altas concentraciones de azcar presentan una serie de

Las levaduras osmotolerantes, sin embargo, son capaces de sintetizar y retener

Z rouxii y otras levaduras osmotolerantes puede ser aprovechada industrialmente para la

Otros factores implicados en la resistencia a elevadas concentraciones de soluto son

1.3.- Los sorbatos como conservantes

El cido srbico o cido 2,4-hexadienoico (CH3-CH=CH-CH=CH-COOH) se incluye

dentro de un conjunto de compuestos ampliamente utilizados como antimicrobianos, cuyas

El cido srbico y sus sales, conocidos como sorbatos, se consideran fungistticos

Los cidos dbiles poseen la capacidad de penetrar en su forma protonada a travs

A pesar de que se considera que el efecto antimicrobiano del sorbato depende de

A valores de pH por encima de 6,0, la acidificacin en el i~iterior celular no puede

1.3.1.- Mecanismos de actividad antimicrobiana del sorbato

No se conocen con certeza los mecanismos implicados en la inhibicin del

El mecanismo global de inhibicin puede adems diferir en bacterias, mohos y

1.3.1.1- Alteraciones morfolgicas como variaciones en el tamao y forma celulares,

1.3.1.2.- Alteraciones en la funcin metablica