Departamento de Inmunologa

Facultad de Medicina

MEDIDAS DE INTERACCIN ANTGENO-ANTICUERPO

DETERMINACIN DE GRUPO SANGUNEO: HEMAGLUTINACIN

I. Introduccin.

La determinacin del grupo sanguneo es una prctica habitual e imprescindible

para la transfusin de componentes hemticos. Ello es debido a que el sistema inmune
de algunos individuos rechaza los hemates de otros. Esta reaccin inmunolgica est
mediada por anticuerpos y es fcilmente visualizable in vitro mediante reacciones de
aglutinacin.

Se conocen ms de 20 grupos de antgenos eritrocitarios codificados en otros

tantos loci gnicos, para los cules existen mltiples variantes allicas. El resultado son
ms de 200 antgenos eritrocitarios identificables. Estos antgenos varan en su
inmunogenicidad. Los ms importantes a efectos transfusionales son los antgenos de
sistema H/ABO y los del sistema Rhesus (Rh).

II. Conceptos

Se define antgeno como la sustancia capaz de unirse a los receptores especficos de

los linfocitos y desencadenar una respuesta inmunitaria especfica. Para que una
sustancia sea antignica debe de poseer una serie de caractersticas :

Composicin qumica variable.

Peso molecular elevado.

Se define inmungeno aquellas molculas capaces de generar una respuesta

inmunitaria. Mientras que se define como hapteno una sustancia que tiene la capacidad
de unirse al receptor de los linfocitos, pero es incapaz de generar una respuesta
inmunolgica.

El proceso de reconocimiento o de unin del antgeno no sucede de forma

global, sino que se trata de un reconocimiento parcial de dicha molcula, dicha regin se
conoce como determinante antignico o epitopo. La presencia de determinantes
mltiples se conoce como multivalencia, o en el caso de un nmero excesivo de
determinantes, polivalencia. Se diferencian dos grandes tipos de determinantes
antignicos :

a) Secuenciales o lineales
b) Conformacionales.
c) Neoantgenos
 En los primeros, el reconocimiento se establece a nivel de la secuencia. P.ej.
secuencia de aa. Mientras que en los determinantes conformacionales se produce el
reconocimiento en la estructura nativa del antgeno, a nivel de su estructura secundaria o
terciaria.
Por ltimo, los neoantgenos, las protenas pueden estar sometidas a
modificaciones covalentes como fosforilacin o protelisis especfica. Estas
modificaciones, que alteran la estructura covalente, pueden producir nuevos eptopos
antignicos, pudiendo ser reconocidos por anticuerpos especficos.

Interaccin antgeno-anticuerpo:

La interaccin entre antgeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces dbiles,

como puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Wals e interacciones electrostticas e
hidrofbicas. La suma de todos estos enlaces genera una interaccin estable entre el
lugar de unin del anticuerpo (paratopo) y el lugar de unin del antgeno (eptopo).

La relacin entre un antisuero o anticuerpo determinado y el antgeno que ha

dado lugar a su produccin se conoce como interaccin especfica. Cuando el antisuero
da reaccin positiva con otros antgenos, relacionados o no con el utilizado en la
inmunizacin, se habla de reaccin cruzada.

Definicin de afinidad y avidez:

La suma de estas fuerzas de atraccin y de repulsin se conoce como afinidad

del anticuerpo.

Los anticuerpos son molculas multivalentes en su interaccin con el antgeno. Las

molculas de inmunoglobulina presentan un mximo de 10 (IgM) y un mnimo de 2
brazos de unin con el antgeno. En el caso de que este ltimo tambin sea multivalente,
presentar un mnimo de dos puntos de anclaje para el anticuerpo correspondiente. Esta
interaccin multivalente entre antgeno y anticuerpo permite introducir el concepto de
avidez.

Para la deteccin de anticuerpos se utilizan diversos tipos de pruebas que se

agrupan segn necesiten o no un sistema indicador de que se ha producido la unin
antgeno-anticuerpo.

Interacciones primarias:

Son pruebas en las que la unin antgeno-anticuerpo no produce cambios fsicos

que pongan de manifiesto la interaccin, por lo que debe utilizarse un sistema indicador.
Son tcnicas ms sensibles y especficas. Algunas de las ms utilizadas dentro de este
grupo son:

a) Inmunoflorescencia
b) ELISA
c) Immunoblotting
Inmunoflorescencia. En la mayor parte de los casos se utiliza la inmunofluorescencia
indirecta, en la que la reaccin antgeno-anticuerpo se revela con un segundo anticuerpo
marcado con una molcula fluorescente. Si el anticuerpo marcado con la molcula
fluorescente es el que reacciona directamente con el antgeno se denomina
inmunofluorescencia directa.

ELISA. El antgeno est fijado sobre un soporte slido y la reaccin antgeno

anticuerpo se revela con un segundo anticuerpo marcado con un enzima que produce
una reaccin coloreada al aadir un sustrato cromognico.
Immunoblotting. Se utiliza para estudiar la presencia de anticuerpos frente a mezclas
complejas de antgenos. En primer lugar se separan los antgenos segn su peso
molecular por medio de una electroforesis y los antgenos se transfieren a la superficie
de lminas de nitrocelulaosa donde pueden reaccionar con los anticuerpos. La reaccin
antgeno anticuerpo se revela con un segundo anticuerpo marcado con un enzima que
produce una reaccin coloreada al aadir un sustrato cromognico.

Interacciones secundarias:

Pruebas que no necesitan un sistema indicador de la unin antgeno-anticuerpo,

ya que se dan cambios fsicos que ponen de manifiesto que ha ocurrido la interaccin.
Las pruebas ms utilizadas dentro de este grupo son:
a) Inmunoprecipitacin
b) Aglutinacin

Inmunoprecipitacin. Se utiliza para detectar anticuerpos contra un antgeno o para

comparar los antgenos presentes en mezclas antignicas complejas. En esta prueba se
utilizan antgenos solubles que se depositan en un pocillo de un gel de agarosa
enfrentado a otro pocillo que contiene los anticuerpos. A partir de ambos pocillos se
produce una difusin radial y en la zona donde se encuentran el antgeno y el anticuerpo
en las proporciones adecuadas se produce un precipitado que pone de manifiesto la
reaccin antgeno-anticuerpo. Esta tcnica recibe diferentes denominaciones (doble
inmunodifusin, inmunoelectroforesis, contrainmunoelectroforesis, etc.) dependiendo
de algunas variaciones tcnicas que se han introducido para el estudio de mezclas
antignicas complejas. En general, es una tcnica poco sensible para detectar bajos
niveles de anticuerpos.

Aglutinacin. Se utiliza para detectar anticuerpos contra antgenos localizados en la

superficie de clulas o de partculas de ltex. Los anticuerpos al unirse al antgeno
producen una unin de las clulas o partculas denominada algutinacin. Esta tcnica es
ms sensible que la inmunoprecipitacin.

III. Grupos sanguneos

Sistema H/ABO

El primer sistema descubierto, en 1900, fue el AB0, por ser la principal causa de
la incompatibilidad entre las sangres de distintos individuos en las transfusiones de
sangre. Dicha incompatibilidad se basa en una reaccin de carcter inmunolgico
altamente especfica, consistente en la unin qumica de antgenos extraos contenidos
en los eritrocitos del donante y las aglutininas o anticuerpos especficos presentes en el
plasma sanguneo del receptor.
El grupo sanguneo AB0 lo determina un locus situado en el extremo del brazo largo del
cromosoma 9. Constituye un caso de alelismo mltiple basado en la existencia de tres
alelos:

A que da lugar a la produccin de antgenos A.

B que da lugar a la produccin de antgenos B.
0 que determina no produccin de antgenos.
Los alelos A y B son codominantes, mientras que 0 es recesivo frente a ambos.
Estas caractersticas determinan la existencia de cuatro fenotipos. El sistema AB0 puede
resumirse en el siguiente cuadro:

Fenotipos Genotipos Antgenos en los eritrocitos Anticuerpos en

suero
A A/A A/0 A anti-B
B B/B B/0 B anti-A
0 0/0 Ninguno anti-A y anti-B
AB A/B AyB ninguno

Las personas que poseen en sus eritrocitos un tipo de antgeno carecen del
anticuerpo respectivo, pero este ltimo est presente en el suero de las personas que
carecen de dicho antgeno. Por lo tanto, en una transfusin se producir reaccin de
aglutinacin antgeno-anticuerpo o no segn los casos, tal como se indica en el siguiente
cuadro:

Origen del suero (receptor)

A B AB 0
Origen de los eritrocitos (donante)

A - + - +

B + - - +

AB + + - +

0 - - - -
Sistema Rhesus

El sistema Rhesus descubierto por Landsteiner, Wienes y Levine en 1940. En un

primer anlisis y para simplificar se consideran dos grupos en este sistema:
- Rh+, individuos que poseen antgenos Rh.
- Rh-, indviduos que no poseen antgenos Rh.
Los anticuerpos anti-Rh no son anticuerpos naturales, no existen normalmente
en la sangre, pero aparecen en individuos Rh- que han recibido antgenos Rh como
consecuencia de una transfusin de un donante Rh+ o despus de un embarazo. La
madre Rh- se sensibiliza por los eritrocitos Rh+ del primer hijo, produciendo
anticuerpos anti-Rh. El segundo embarazo de un nio Rh+ produce un aumento masivo
de anticuerpos, que pasan a travs de la placenta y aglutinan los glbulos rojos del nio.
Este sistema revel la explicacin de una enfermedad hemoflica que se produce en el
recin nacido, la eritroblastosis fetal, adems de las reacciones de aglutinacin que
ocurran en transfusiones de sangre entre personas del mismo tipo respecto al sistema
AB0.
Las bases genticas del sistema Rh son complejas, al estar constituido por un gran
nmero de antgenos eritrocitarios distintos. Este sistema est codificado por tres loci
muy prximos entre s (C, D, E y sus recesivos respectivos c, d, y e) en el brazo corto
del cromosoma 1. Cada uno de los alelos produce un antgeno y los anticuerpos
correspondientes aparecen para todos menos para el d.
El alelo D, es de un inters primordial al ser el responsable de la codificacin
del antgeno D que es muy antignico y provoca la sensibilizacin. Es por esto que para
fines prcticos las personas se consideran Rh+ si poseen el antgeno D y Rh- si carecen
del antgeno D segn la siguiente tabla:
Genotipo Rh
DD +

Dd +

dd -
Test de Coombs
Detecta anticuerpos contra los glbulos rojos en circulacin. Es importante para la
determinacin de la compatibilidad entre donante y receptor en el caso de transfusiones
de sangre. Detecta tambin la presencia de anticuerpos anti Rh en la madre durante el
embarazo. Evala la necesidad de administrar inmunoglobulina Rho (D). Ayuda a
confirmar el diagnstico de anemia hemoltica.

Sistema Duffy:

Los alelos de este sistema (Fya y Fyb) estn controlados por alelos codominantes. Es
destacable el hecho de que muchos individuos de raza negra con alta endecimicidad al
paludismo por Plasmodium vivax presenten un tercer alelo alternativo Fy (a-b-). Esto
ocurre en comunidades con alta endemicidad, donde la exposicin a los anofelinos
infectantes es contnua durante muchos aos, los adultos muestran resistencia a la
enfermedad, relacionada con la ausencia del factor Duffy en sus eritrocitos.

Sistema Kell:

Este sistema inclua inicialmente el par allico K y k, siendo este ltimo el ms

frecuente. El sistema comprende ahora dos pares allicos adicionales y algunas
variantes. El antgeno K es muy inmunognico y uno de cada 20 individuos
transfundidos con clulas K+ desarrolla el anticuerpo.

Importancia clnica.

Anemias hemolticas por aloanticuerpos. Reacciones hemolticas

postransfusionales.

Las reacciones hemolticas postransfusionales se producen cuando se

transfunden hemates que contienen antgenos para los cules el receptor tiene
anticuerpos. Estos pueden ser naturales (sistema ABO) o inmunes (Rh y otros sistemas).
El cuadro clnico es muy variable y depende del grado de respuesta del receptor, la
capacidad antignica del antgeno, la avidez del anticuerpo y la temperatura ptima de
accin de ste. Puede manifestarse por una simple reaccin de escalofros e hipertermia,
hasta un cuadro clnico grave con dolor lumbar, hipotensin, shock e insuficiencia renal.
El diagnstico se efecta al comprobar una aumento de la LDH srica, un descenso de
la haptoglobina, hemoglobinemia y hemoglobinuria. Estas reacciones pueden ser
fcilmente evitadas administrando hemates compatibles y no cometiendo errores de
identificacin, tanto de muestras como de pacientes.

Enfermedad hemoltica del recin nacido

La enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN) se produce cuando existe

una incompatibilidad entre los antgenos eritrocitarios de la madre y los del feto.
Aunque el ejemplo clsico es la isoinmunizacin por el antgeno D del sistema Rh (por
ser el ms inmunognico), cualquier antgeno de grupo sanguneo ausente de la madre y
presente en el feto puede inducir la formacin de aloanticuerpos que causan la hemlisis
neonatal.
 Diagnstico.

Se puede efectuar antes del nacimiento mediante la deteccin de anticuerpos en

el suero de la gestante. En el momento de nacer, la prueba de la antiglobulina directa
(Test de Coombs directo) sobre los hemates del recin nacido e indirecta (Test de
Coombs indirecto) en el suero de la madre con otras ictericias neonatales. En el caso de
la EHRN por mecanismo inmune ambas pruebas son positivas.

IV. Protocolo:

Objetivo de la prctica.

Interpretar las reacciones de aglutinacin.

Determinacin de los grupos ABO y Rh.

Reactivos y Materiales.

Antisueros anti-A, anti-B y anti-D.

Portaobjetos.
Lancetas de un solo uso.
Algodn y alcohol etlico.

1. Se limpia el dedo con alcohol y algodn y se pincha con la lanceta.

2. Sobre un portaobjetos se depositan tres gotas de aproximadamente 0,5 cm de
dimetro, bien separadas.
3. Sobre cada gota se adiciona el antisuero correspondiente con la pipeta Pasteaur y
se mezcla con la punta de la misma durante unos segundos (OJO!! cada
antisuero con una pipeta diferente). El orden recomendable es A, B y D.

-A -B -D

4. Determinar la aglutinacin e interpretar el resultado.

5. Determinar la frecuencia de cada grupo en la clase y compararla con las
frecuencias establecidas.
Fenotipos Individuos Frecuencia del grupo Frecuencia poblacional
(%) (%)

0 45

A 40

B 11

AB 4

Rh+ 85

Rh- 15