Blancoerika Parte1

UNIVE
ERSIDAD DE
D LOS ANDES
FAC
CULTAD DE E CIENCIA
AS
DEPARRTAMENTO O DE BIOLOOGA
LABORAATORIO DE FIJACIN BIOLGICA DE NIT TRGENO
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TRO
Efecto
os de caarbamaatos sobre la viabilid
v dad de
rizo
obios y la gerrminaciin, nod
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n y creecimien
nto
de Vicia
V fab
ba L.
Trabajo Especial
E de Grado para
a optar al ttulo de Lice
enciada en Biologa
Br. Errika Lorena Blanco Ca

arrero
Tutora: Proff. Mara Eu
T ugenia Marq
quina
Mrida
a, Marzo de
e 2009
Este trabajo recibi financiamiento de la Universidad de Los Andes, a travs del
Consejo de Desarrollo Cientfico, Humanstico y Tecnolgico (CDCHT) Proyecto C-
1612-08-01-F
iii

Dedicatoria
Quiero dedicarle este trabajo a mi hermanito Joffre Alejandro, Mi Mueco

bello!, quien es mi mayor amor, fuente de inspiracin, dulzura y alegra para mi
familia y para m, y por haber sido la persona que ms me ayud durante la
realizacin de este trabajo. Eres un angelito de Dios, un corazn puro que vino a
este mundo a hacernos mejores seres humanos y la personita ms especial en mi
vida! Bendita sea la hora en que naciste hermanito, no hay palabras para describir el
amor que siento por ti
Te Adoro, Mi Mueco!!!
iv

Agradecimientos
A Dios y a la Virgen, por protegerme, guiarme, iluminarme y ensearme el rumbo a

seguir durante mi carrera universitaria.
A mis padres, Joffre y Gisela, por haberme dado la vida, por todo su cario, amor,
apoyo durante toda mi vida y sobretodo en mis estudios, por esforzarse siempre por
mantenerme en el buen camino, porque a pesar de la lejana, siempre los sent a mi
lado y estuvieron conmigo cada vez que los necesit, ahora estoy aqu
agradeciendo todo lo que han hecho por m Pap y Mam, lo logr!!!
A mis hermanos, Darling y Alejandrito, por estar siempre pendientes de m, por todo
su cario. Gracias hermana y gracias mi mueco bello por todo lo que me ayudaste
en el trabajo de laboratorio y por tu compaa e incondicional amor!
A Ronald, Mi Amor!, por todo tu apoyo, amor, colaboracin, porque cada vez que te
necesito siempre ests ah para ayudarme, muchas gracias mi amor, no sabes
cunto te agradezco todo lo que haces por m y el amor que me das!
A mis abuelos y especialmente a mi nona Hermelinda, por darme siempre buenos

consejos y quien desde el cielo me sigue cuidando y guiando.
A mi ta Zoila, por ayudarme y apoyarme en todo momento y por las atenciones y el

cario que de t recibo!
A mi ta Luisa y a mi prima Andrena, por estar siempre pendientes de m, dndome

palabras de aliento para seguir adelante.
A la Profesora Mara Eugenia Marquina, por su orientacin, confianza y dedicacin

durante el desarrollo de este trabajo, por sus adecuadas correcciones, y por su
amistad!
A Yulimar Castro Yuli, por haber sido partcipe de este trabajo, por toda su
colaboracin, por dedicar parte de su tiempo a ensearme y por su amistad.
v

A los Profesores Roberto Skwierinski, Mara Vielma y Benito Briceo, mis jurados,
por sus sugerencias en el desarrollo de este trabajo y por sus enseanzas durante mi
carrera universitaria.
A los Profesores Eulogio Chacn y Samuel Segnini, por sus consejos y colaboracin
para la realizacin de este trabajo.
A mis amigos Yetsenia Yet Yet, Manuel y Arlene por su colaboracin especial en la
realizacin de este trabajo y por su grandiosa amistad incondicional!
Al Ing. Agrnomo Alexandro Barbosa, por su asesoramiento en los anlisis

estadsticos de los resultados de este trabajo.
A Ral Rojas y a su amigo Marco Garca, por su colaboracin para la determinacin

de las DL50 de los carbamatos.
Al personal docente, investigativo y tcnico de la opcin de Botnica, Profesora

Thas, Melangel, Edgar, Zulay de Ecologa Vegetal, y especialmente a Gladys,
Auxiliadora y Josefina, por su colaboracin, apoyo y nimo durante la realizacin de
este trabajo, por hacer tan agradable el ambiente de trabajo y por su amistad!
A mis amigas Claudia Claudys, Liset Lis y Maricef, por haber sido mis
compaeras de estudio, amigas solidarias e incondicionales durante mi carrera
universitaria.
A Sioly por su extraordinario trabajo administrativo en el Departamento de Biologa

de la Facultad de Ciencias.
Al Sr. Jess Parra y familia, al Ing. Rafael Romero y al encargado de su finca, el Sr.
Miguel Pabn, por haber sido tan receptivos, amables, colaboradores y atentos, y por
haberme permitido trabajar con muestras de suelos de sus fincas.
vi

Al Laboratorio de Fijacin Biolgica de Nitrgeno y Cultivo de Tejidos Vegetales in
vitro, al Instituto de Ciencias Ambientales y Ecolgicas (ICAE), al Laboratorio de
Biotecnologa de Microorganismos (LABIOMI) de la Facultad de Ciencias, y al
Laboratorio de Suelos de la Escuela de Geografa de la Facultad de Ciencias
Forestales de la Universidad de Los Andes, por permitir realizar este trabajo y
algunos anlisis de l en sus instalaciones.
Al CDCHT por haber dado financiamiento para la realizacin de este proyecto.
A Milagros y a Yixon por haberme recibido en su hogar, por su confianza durante

tantos aos y por su amistad, y ahora a Liliana y a su mam, la seora Josefa, por
ser ms que compaeras, amigas, y por haber estado all brindndome su
colaboracin cuando ms la necesit.
Al Sr. Freddy, Sra. Coromoto y a Yennifer, por estar siempre pendientes de m y por
su cario en todo momento.
A mis queridos alumnitos de Preparadura de Biologa Vegetal, por haberme hecho

ms profesional, de todos ustedes tambin aprend.
A mi disciplina deportiva, el Atletismo, y a mi especialidad la Marcha Olmpica,

porque gracias a ellas he aprendido que solo con constancia y perseverancia se
logran las metas propuestas en la vida.
A mis amigos de Salsa Casino de Ciencias, Ingeniera y por supuesto a mi grupo

Guateque & Son, por bridarme tantos momentos de alegra y bonitas experiencias en
la etapa final de mi carrera universitaria, especialmente a mis amigas Virginia Virgi
y a Iria.
A mis compaeros de estudio Victor y Juan, con quienes compart durante mi carrera
universitaria, a mis amigos de San Cristbal, y a todas aquellas personas que de una
u otra manera colaboraron en la realizacin de este trabajo, para ustedes mi ms
sincero agradecimiento
vii

RESUMEN
Los carbamatos son sustancias orgnicas utilizadas en su mayora como fungicidas,

que contaminan y tienen efecto principalmente neurotxico sobre el hombre. En este
trabajo se evidenci la resistencia de carbamatos por parte de los rizobios y la
incidencia en la germinacin, nodulacin y crecimiento de Vicia faba L. Se
capturaron, aislaron, purificaron y autenticaron rizobios (con dos plantas de amplio
rango hospedador) a partir de suelos tratados con carbamatos adems de otro suelo
no tratado qumicamente, que se consider como control, todos provenientes de la
poblacin de Mucuches - Edo. Mrida, Venezuela. Los carbamatos usados en
principio fueron Carbodan, Dithane, Previcur, Vondozeb y Zineb con cuatro
concentraciones menores a la aplicada en campo (original). Se hicieron pruebas
cualitativas y cuantitativas, determinando el crecimiento de rizobios en medio YMm
(manitol y sacarosa) en presencia de carbamatos. Se evalu su capacidad de
metabolizar los carbamatos como nica fuente carbonada y nitrogenada con
resultados negativos. Se determin la DL50 para Carbodan y Previcur verificando
una mayor resistencia del aislado ES1 del suelo tratado con carbamatos, en
comparacin con el aislado EV1 proveniente del suelo no tratado con carbamatos.
Los resultados sugieren que los aislados rizobiales son capaces de cometabolizar
los carbamatos en presencia de otras fuentes carbonadas. En cuanto a la
germinacin de Vicia faba L., esta fue inhibida por las concentraciones originales de
Carbodan y Zineb, y no fue afectada por la concentracin original de Previcur. La
nodulacin fue afectada desfavorablemente por el Previcur en su concentracin
original, mientras que, el incremento de los niveles nitrogenados en la parte area de
las plantas tratadas con Previcur, indican que este carbamato es fitoacumulado en
esta zona de dicha leguminosa.
Palabras clave: Carbamatos, rizobios, viabilidad, cometabolismo, Vicia faba L.
viii

Abstract
The carbamates are organic substances used mostly like fungicides, which
contaminate and principally have a neurotic effect mankind. In this work the
carbamates resistance was demonstrated on the part of the rhizobia and the incidence
in the germination, nodulation and Vicia faba L. growth. They were captured, isolated,
purified and authenticated rhizobios (with two plants of wide status host). One were
soils treated with carbamates and the other soil not treated chemically. The second
isolated was considered to be a control, all originated ones of the population in the city
of Mucuches in Merida, Venezuela. The secondhand carbamates at first were
Carbodan, Dithane, Previcur, Vondozeb and Zineb with four minor concentrations to
applied in field (original). Qualitative and quantitative tests were done, determining the
rhizobia growth in medium YMm (mannitol and sucrose) in the presence of carbamates.
Its aptitude to metabolize the carbamates as the only source of carbon and nitrogen
were evaluated with negative results. The LD50 decided that Carbon and Previcur
verified a major resistance of the isolated one ES1 (of the soil treated with carbamates)
compared to the isolated other EV1 (originated from the soil not treated with
carbamates). The results suggest that the isolated from rhizobia are capable of co-
metabolizing the carbamates in the presence of other carbon sources. As for the
germination of Vicia faba L., this one was inhibited by the original concentrations of
Carbon and Zineb, and it was not affected by the original Previcur concentration. The
nodulation was affected unfavorably by the Previcur in it's original concentration,
whereas, the increase of the nitrogen levels in the aerial part of the plants dealt with
Previcur. This indicates that this carbamate is able to phytocoagulate in the leguminous
zone.
Key words: Carbamates, rhizobia, viability, cometabolism, Vicia faba L.
ix

NDICE GENERAL
Introduccin 1
1. Pesticidas Carbamatos 3
1.1 Vas de absorcin, procesos de biotransformacin y de
eliminacin. 5
1.2 Biotransformacin de los pesticidas carbamatos por bacterias
del suelo 7
1.2.a Metabolismo 8
1.2.b Cometabolismo 8
2. Simbiosis rizobio-leguminosa 13
2.1 Los Rizobios. 15
3. Vicia faba L. (haba) 17
Hiptesis 21
Objetivos 21
Materiales y mtodos 22
1. rea de estudio 22
1.1 Captura de rizobios a partir del suelo, empleando como
cultivo trampa Phaseolus vulgaris L. y Macroptilium lathyroides L. 23
1.2 Aislamiento y purificacin de las bacterias en medio YMA
con rojo congo 25
2. Autenticacin de los aislados en Macroptylium lathyroides L. y
Phaseolus vulgaris L. 26
2.1. Observaciones macromorfolgicas de las colonias 27
rizobiales.
3. Curvas de calibracin del crecimiento de los aislados rizobiales
ES1 y EV1. 28
4. Prueba cualitativa de viabilidad de los aislados rizobiales en
presencia de carbamatos. 28
x

5. Prueba de utilizacin de carbamatos como nica fuente
carbonada y nitrogenada. 30
6. Prueba cuantitativa de viabilidad de los aislados rizobiales
en presencia de carbamatos. 32
7. Determinacin de la dosis letal media DL50 34
8. Prueba de germinacin de Vicia faba L. en presencia de
carbamatos. 37
8.1 Descripcin del material vegetal. 37
9. Prueba de nodulacin y crecimiento de Vicia faba L. 40
9.1 Esterilizacin y germinacin de las semillas de V. faba L. 41
10. Composicin de medios de cultivo utilizados 44
Resultados y Discusin 48
1. Aislamiento y purificacin de cepas rizobiales a partir de
suelos tratados con y sin carbamatos 48
1.1 Captura de rizobios a partir del suelo empleando como cultivo
trampa plantas de Phaseolus vulgars L. y Macroptilium lathyroides L. 48
1.2 Aislamiento y purificacin en medio YMAmrc y medio
Glucosa peptona agar (GPA) (Ferrera Cerrato et al., 1993) 51
1.2a.- Crecimiento en Medio YMAmrc 52
1.2b.-Crecimiento en medio glucosa- peptona, prpura de
bromocresol (GPA) 52
2. Autenticacin de los aislados en Macroptylium lathyroides L.

y Phaseolus vulgaris L. 52
3. Curvas de calibracin del crecimiento de los aislados rizobiales
ES1 y EV1. 55
4. Prueba cualitativa de viabilidad de los aislados rizobiales en
5. Prueba de utilizacin de carbamatos como nica fuente

59
carbonada y nitrogenada.
xi

6. Prueba Cuantitativa de viabilidad de los aislados rizobiales en
7. Dosis Letal media (DL50) 69
8. Prueba de germinacin de Vicia faba L. en presencia de

carbamatos. 72
9. Pueba de nodulacin y crecimiento de Vicia faba L. en
presencia de carbamatos 74
Conclusiones 91
Recomendaciones 93
Referencias bibliogrficas 94
Anexos 104
xii

NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificacin de los pesticidas (Ferrer, 2003). 3
Tabla 2. Nombre genrico y comercial de los carbamatos ms

conocidos (Primo y Carrasco, 1980). 5
Tabla 3. Descripcin de los pesticidas carbamatos a utilizar (Indice

Agropecuario, 2001). 7
Tabla 4. Clasificacin de los rizobios nodulantes y bacterias que

originan malformaciones en especies vegetales. 17
Tabla 5. Clasificacin Taxonmica de Vicia faba L. segn Cronquist,

1981. 18
Tabla 6. Pesticidas a usar en los ensayos, composicin qumica y

concentraciones aplicadas en campo. 29
Tabla 7. Concentraciones de los carbamatos usados en los ensayos. 30
Tabla 8. Concentraciones de los carbamatos para la prueba de

utilizacin como fuentes carbonadas y nitrogenadas. 32
Tabla 9. Concentraciones de los carbamatos a la dilucin para la

elaboracin de la curva de crecimiento en presencia de
carbamatos. 33
Tabla 10. Concentraciones de los carbamatos para determinar la DL50. 35
Tabla 11. Concentraciones de los carbamatos para la prueba de

germinacin de Vicia faba L. para 400 ml de solucin
Hoagland de todos sus compuestos. 39
Tabla 12. Anlisis de suelos de las parcelas cultivadas con Solanum

tuberosum L. y Allium sativum L. 49
Tabla 13. Autenticacin de los aislados de los suelos y ndulos en

Macroptylium lathyroides L. y Phaseolus vulgaris L. 53
xiii

Tabla 14. Caractersticas de las colonias aisladas del suelo tratado con
carbamatos (Solanum tuberosum L.) y sin carbamatos (Vicia
faba L.). 54
Tabla 15. Prueba de viabilidad en presencia de carbamatos, del

aislado rizobial (ES1) proveniente del suelo cultivado con
Solanum tuberosum L. (tratado con agroqumicos). 57
Tabla 16. Tamao del halo de inhibicin (cm) de crecimiento celular

alrededor del papel filtro para el aislado ES1. 57
Tabla 17. Prueba de viabilidad en presencia de carbamatos, del

aislado rizobial (EV1) proveniente de ndulos de Vicia faba
L. cultivada en suelos sin tratamientos de agroqumicos. 58
Tabla 18. Tamao del halo de inhibicin del crecimiento celular

alrededor del papel filtro para el aislado EV1. 59
Tabla 19. Utilizacin de carbamatos como nica fuente carbonada

para el aislado ES1 proveniente del suelo cultivado con
Solanum tuberosum L. 60
Tabla 20. Utilizacin de carbamatos como nica fuente nitrogenada

para el aislado ES1 proveniente del suelo cultivado con
Tabla 21. Utilizacin de carbamatos como nica fuente carbonada

para el aislado EV1 del suelo cultivado con Vicia faba L. 60
Tabla 22. Utilizacin de carbamatos como nica fuente nitrogenada

para el aislado EV1 del suelo cultivado con Vicia faba L. 60
Tabla 23. Comparaciones mltiples. Pruebas de post hoc (Curvas

D.O/ Tiempo) para ES1. 65

D.O/ Tiempo) para EV1. 65
xiv

UFC/ml/ Tiempo) para ES1. 68
UFC/ml/ Tiempo) para EV1. 69
Tabla 27. ANOVA simple para resultados de germinacin de V. faba

L. con p < 0,05 y contraste mltiple de rango con un nivel de
confianza del 95,0% segn los tratamientos. 74
Tabla 28. ANOVA simple para resultados de N de ndulos de V. faba

L. con p < 0,05 y contraste mltiple de rango con un nivel de
confianza del 95,0%, segn los tratamientos. 78
Tabla 29 ANOVA simple para resultados de peso fresco de ndulos

de V. faba L. con p < 0,05 y contraste mltiple de rango con
un nivel de confianza del 95,0%, segn los tratamientos. 80
Tabla 30. ANOVA simple para resultados de peso seco de ndulos de

V. faba L. con p < 0,05 y contraste mltiple de rango con un
nivel de confianza del 95,0%, segn los tratamientos. 80
Tabla 31. ANOVA simple para longitud de vstago de V. faba L. con p

< 0,05 y contraste mltiple de rango con un nivel de
Tabla 32. ANOVA simple para resultados de longitud de raz con p

< 0,05 y contraste mltiple de rango con un nivel de
Tabla 33. ANOVA simple para resultados de peso fresco del vstago
de V. faba L. con p < 0,05 y contraste mltiple de rango con
un nivel de confianza del 95,0% segn los tratamientos. 84
Tabla 34. ANOVA simple para resultados de peso seco del vstago de
Tabla 35. ANOVA simple para resultados de peso fresco de la raz de

xv

Tabla 36. ANOVA simple para resultados de peso seco de la raz de
Tabla 37. ANOVA simple para resultados de anlisis de contenido de

nitrgeno de la parte area de V. faba L. con p < 0,05 y
contraste mltiple de rango con un nivel de confianza del
95,0%, segn los tratamientos. 90
xvi

NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura del cido carbmico (Primo y Carrasco, 1980). 4
Figura 2. Estructura qumica del cido N-metil o dimetilcarbmico

(Daz y De la Sovera, 2009) 4
Figura 3. Estructura qumica de algunos carbamatos (Daz y De la

Sovera, 2009). 5
Figura 4. Va propuesta del metabolismo del Carbaryl en las cepas

C4, C5, y C6 de Pseudomonas sp. (Vandana y Prashant,
2005). 10
Figura 5. Ubicacin geogrfica de las parcelas de donde se

tomaron las muestras para capturar rizobios. (a) Mapa de
Venezuela con la silueta del estado Mrida. (b) Mapa del
estado Mrida delimitando las carreteras principales. (c)
Ampliacin del sitio de estudio en Mucuches, Misteque y
Mucumpate, mostrando las ubicacin de las parcelas del
cultivo de papa, ajo y la no cultivada (1) y la parcela
cultivada con haba (2). 25
Figura 6. Esquema metodolgico para el aislamiento, purificacin,

autenticaciones de rizobios y diferentes ensayos
realizados con ellos. 36
Figura 7. Esquema metodolgico para la prueba de germinacin n

de semillas de V. faba L. en presencia de carbamatos. 42
Figura 8. Esquema metodolgico para la prueba de nodulacin y

crecimiento de Vicia faba L. 40
Figura 9. Curva de calibracin (UFC/ml Vs. D.O) en medio YMm

para el aislado ES1. 55
Figura 10. Curva de calibracin (UFC/ml Vs. D.O) en medio YMm

para el aislado EV1. 56
xvii

Figura 11. Curva de crecimiento del aislado ES1, proveniente del
suelo tratados con carbamatos, cultivado con Solanum
tuberosum L. (papa), creciendo en medio YMm en
presencia de carbamatos. Las concentraciones para
Carbodan y Previcur corresponden a 12,45l/15ml YMm
y 9,3 l/15ml YMm respectivamente. 62
Figura 12. Curva de crecimiento del aislado EV1, proveniente del

suelo no tratado con carbamatos cultivado con Vicia faba
L. (haba), creciendo en medio YMm en presencia de
carbamatos. Las concentraciones para Carbodan y
Previcur corresponden a 12, 45l/15ml YMm y 9,3
l/15ml YMm respectivamente. 63
Figura 13. Unidades formadoras de colonias del aislado ES1,

proveniente del suelo tratados con carbamatos y
cultivado con Solanum tuberosum L. (papa), creciendo en
medio YMm en presencia de carbamatos. Las
concentraciones para Carbodan y Previcur
corresponden a 12,45l/15ml YMm y 9,3 l/15ml YMm
respectivamente. 66
Figura 14. Unidades formadoras de colonias del aislado EV1,

proveniente del suelo no tratado con carbamatos,
cultivado con Vicia faba L. (haba), creciendo en medio
YMm en presencia de carbamatos. Las concentraciones
para Carbodan y Previcur corresponden a
12,45l/15ml YM y 9,3 l/15ml YM respectivamente. 67
Figura 15. Dosis letal media de Carbodan para el aislado rizobial

ES1del suelo tratado con carbamatos y cultivado con
Figura 16. Dosis letal media de Previcur para el aislado rizobial ES1
del suelo tratado con carbamatos y cultivado con
xviii

Figura 17. Dosis letal media de Carbodan para el aislado rizobial
EV1 del suelo no tratado con carbamatos y cultivado con
Vicia faba L. 71
Figura 18. Dosis letal media de Previcur para el aislado rizobial EV1
del suelo no tratado con carbamatos cultivado con Vicia
faba L. 71
Figura 19. Porcentaje total de germinacin de las semillas de Vicia

faba L. a los 6 das de acuerdo a los tratamientos.
Tratamientos l g/400ml de Sol. Hoagland 1/4:
Carbodan orig: 660 l; Carbodan : 330l; Carbodan 1/4:
165l; Carbodan 1/6: 110l. Previcur orig: 500l; Previcur
: 250l; Previcur : 125l; Previcur 1/6: 83,3l. Zineb
orig: 1g; Zineb : 0,5g; Zineb : 0,25g; Zineb 1/6: 0,16g.
Control: 400ml Sol. Hoagland . 73
Figura 20. Nmero de ndulos formados en plantas de Vicia faba L.

Control (sin aislado y sin Previcur), ES1 (aislado ES1 sin
Previcur), EV1 (aislado EV1 sin Previcur), P+EV1
(Previcur + EV1), P+ES1 (Previcur + ES1), Previcur
(Previcur sin aislado). 75
Figura 21. Pesos fresco y seco promedio de ndulos por tratamiento

en Vicia faba L.. Control (sin aislado y sin Previcur), ES1
(aislado ES1 sin Previcur), EV1 (aislado EV1 sin
Previcur), P+EV1 (Previcur + EV1), P+ES1 (Previcur +
ES1), Previcur (Previcur sin aislado). 79
Figura 22. Longitud promedio de vstago y raz de plantas de Vicia

faba L. Control (sin aislado y sin Previcur), ES1 (aislado
ES1 sin Previcur), EV1 (aislado EV1 sin Previcur), P+EV1
Figura 23. Pesos fresco y seco promedio de vstago de Vicia faba

L.. Control (sin aislado y sin Previcur), ES1 (aislado ES1
sin Previcur), EV1 (aislado EV1 sin Previcur), P+EV1
xix

Figura 24. Pesos fresco y seco promedio de raz de Vicia faba L..
Control (sin aislado y sin Previcur), ES1 (aislado ES1 sin
Previcur), EV1 (aislado EV1 sin Previcur), P+EV1
Figura 25. Anlisis del contenido de nitrgeno de la parte area de

Vicia faba L. (%). Control (sin aislado y sin Previcur),
ES1 (aislado ES1 sin Previcur), EV1 (aislado EV1 sin
Previcur), P+EV1 (Previcur + EV1), P+ES1 (Previcur +
ES1), Previcur (Previcur sin aislado). 88
xx

NDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Parcelas de donde fueron tomadas las muestras de

suelo. a) Parcela cultivada con Solanum tuberosum L.
(papa) tratada con agroqumicos; b) Parcela cultivada
con Allium sativum L. (ajo) tratada con agroqumicos; c)
Parcela natural o no cultivada sin tratamiento
agroqumico. 104
Anexo 2. Parcela cultivada con Vicia faba L. (haba) sin

tratamiento agroqumico y que fue tomada como control. 104
Anexo 3. Captura de rizobios con cultivos trampa. a) Plantas de

Phaseolus vulgaris L. (caraota); b) Plantas de
Macroptilium lathyroides L. (siratro). 105
Anexo 4. Ndulos de donde fueron aislados los rizobios. a)

Ndulos formados en plantas de Phaseolus vulgaris L.;
b) Ndulos de las plantas de Vicia faba L. 105
Anexo 5. Bacterias rizobiales aisladas creciendo en medio

YMAmrc. a) Aislado ES1 proveniente del suelo cultivado
con Solanum tuberosum L. tratado con carbamatos; b)
Aislado EV1 proveniente del suelo cultivado con Vicia
faba L. no tratado con carbamatos (control). 106
Anexo 6. Prueba cualitativa de discos de papel impregnados con

las distintas concentraciones de los carbamatos para
observar la viabilidad de los rizobios en presencia de
estos compuestos. a) Aislado ES1 en YMA + Carbodan
(hubo crecimiento); b) Aislado ES1 en YMA +
Vondozeb 1/6 (mostrando halo de inhibicin); c) Aislado
EV1 en YMA + Vondozeb 1/6 (no hubo crecimiento). 106
Anexo 7. Trabajo experimental en el laboratorio realizando las

curvas de crecimiento de rizobios en presencia de
carbamatos. 107
xxi

Anexo 8. Prueba de germinacin de semillas de Vicia faba L. en
Anexo 9. Preparacin de la prueba de nodulacin y crecimiento

de Vicia faba L. a) Lavado de la arena nueva; b) Secado
de la arena en estufa a 120C; c) Llenado y preparacin
de los potes; d) Esterilizacin de los potes 1,5 Psi
(1Atm)x1h/3 das. 107
Anexo 10. Plantas de Vicia faba L. en el invernadero en la prueba

de nodulacin y crecimiento de esta especie. 108
Anexo 11. Plantas de Vicia faba L. nodulada (ES1) y no nodulada

(control) en el desmontaje de la prueba de nodulacin y
crecimiento de esta especie. 108
Anexo 12. Medicin de algunas de las variables en la prueba de

nodulacin y crecimiento de Vicia faba L. a) Longitud de
raz (cm); b) Peso fresco del vstago (g); c) Peso fresco
de ndulos (g). 109
Anexo 13. Preparacin de las muestras para el anlisis de

nitrgeno de la parte area de Vicia faba L.. 109
xxii

INTRODUCCIN
Desde hace 150 aos el hombre ha fabricado diversos compuestos qumicos con
objeto de satisfacer las necesidades crecientes del desarrollo tecnolgico y mejorar
su calidad de vida. Desde el inicio de la revolucin industrial, se estiman en ms de
120.000 las sustancias qumicas de nueva sntesis y los subproductos derivados de
stas producidos por la actividad humana, censo que se incrementa da a da y que
parece no tener fin si se considera que se incorporan a la lista cerca de 2.000 nuevos
compuestos cada ao (Olea y Fernndez, 2001).
En el caso de la liberacin ambiental de las nuevas sustancias qumicas, tanto el

ambiente fsico como los seres vivos resultan fcilmente expuestos, ya sea en el
momento de su fabricacin, a travs de los procesos de distribucin y uso, o bien
durante la degradacin medioambiental de esas sustancias. Las consecuencias de la
interaccin entre los seres vivos y muchos de esos compuestos no son bien
conocidas, pero se ha advertido sobre la peligrosidad de algunos de ellos y se han
sugerido medidas preventivas para disminuir la exposicin, especialmente para
aquellos que son difcilmente degradados y persisten en el medio durante aos (Olea
y Fernndez, 2001).
Usualmente se ha manifestado que la mecanizacin y el uso de compuestos

qumicos han brindado un beneficio sustancial en la produccin agrcola, sealando
que el empleo de plaguicidas, herbicidas y fertilizantes, se han reflejado en un
incremento de las cosechas de manera significativa y las prdidas en la produccin
se han reducido de forma espectacular (Hotchkiss, 1992). Indudablemente ha habido
un gran beneficio derivado del empleo de los plaguicidas en los programas de salud
y en la lucha contra enfermedades transmitidas por vectores o huspedes
intermediarios (Maroni y Fait, 1993). Pero tambin se ha sealado el riesgo potencial
para la vida animal y humana derivado de la exposicin continuada a compuestos
qumicos diseados como biocidas (Longnecker et al., 1997).
El uso de los plaguicidas qumicos comenz en el siglo XIX cuando se dieron a

conocer los sulfuros y se les encontr una aplicacin prctica como fungicidas.
Posteriormente se utilizaron los compuestos de arsnico para el tratamiento de las
plagas de insectos en la produccin agrcola. En ambos casos se trataba de
sustancias de una elevada toxicidad lo que limit su empleo generalizado. Fue en
1940 cuando aparecieron en el mercado los primeros pesticidas organoclorados que
tienen su mximo exponente en el dicloro difenil tricloroetano o DDT. Desde
entonces se han empleado tanto en los tratamientos agrcolas como en el control de
plagas portadas por insectos. Debido a que, en principio, estos organoclorados
presentaban baja toxicidad, su uso se vi enormemente favorecido y ocuparon una
posicin dominante entre los plaguicidas qumicos de nueva sntesis. Inicialmente, la
persistencia de estos productos se consider como una cualidad excepcional ya que
el efecto biocida duraba largo tiempo en el medio de aplicacin. Posteriormente se
manifestaron los inconvenientes de este comportamiento, ya que la alta lipofilidad
junto con la estabilidad qumica, resultaron en una gran persistencia medioambiental
y en una exacerbacin de los efectos biolgicos indeseables (Dich et al., 1997).
Se denomina plaguicidas a las sustancias que sirven para combatir los parsitos de
los cultivos, del ganado, de los animales domsticos y del hombre y su ambiente
(Primo y Carrasco, 1980). Entre los plaguicidas se encuentran los insecticidas,
acaricidas, herbicidas, funguicidas, antibiticos y rodenticidas. Los pesticidas se han
clasificado segn la plaga para los que han sido diseados y en relacin a la
estructura qumica del mismo, lo que proporciona mayor informacin sobre su
toxicidad (Ferrer, 2003) (Tabla 1).
Tabla 1. Clasificacin de los pesticidas (Ferrer, 2003)
Insecticidas Fungicidas Herbicidas Raticidas

Organoclorados
Organoclorados Bipiridilos
Organofosforados
Dicumarnicos
Carbamatos
Organomercuriales Organoclorados
Piretroides
1. Pesticidas Carbamatos
En la poca de la segunda guerra mundial ocurri un desarrollo industrial qumico

impulsado por esta contienda blica. En ese marco aparecieron los carbamatos junto
con los organofosforados, primero como desarrollo militar (gases neurotxicos) y
luego de la guerra con un amplio uso agrcola.
Los carbamatos son sustancias orgnicas de sntesis conformadas por derivados del
cido carbmico (Figura 1). Sus caractersticas principales son: alta toxicidad, baja
estabilidad qumica y nula acumulacin en los tejidos, esta propiedad los posiciona
en ventaja con respecto a los organoclorados de baja degradabilidad y gran
acumulacin, y tienen propiedades xido reductoras. En la poca de la segunda
guerra mundial ocurri un desarrollo industrial qumico en donde los carbamatos
primero fueron usados como gases neurotxicos y luego de la guerra con un amplio
uso agrcola. Existen muchos casos de resistencia de insectos a carbamatos
producto principalmente de un uso excesivo de estos insecticidas. Dentro de los
carbamatos se incluyen insecticidas, nematicidas, herbicidas y fungicidas. Por otra
parte, la resistencia generada por los organofosforados, otro grupo de insecticidas,
conlleva la resistencia a los carbamatos y viceversa. (Daz y De la Sovera, 2009).
O

H2N C OH
Figura 1. Estructura del cido carbmico (Primo y Carrasco, 1980).
El grupo qumico de los carbamatos corresponde a steres derivados de los cidos

N-metil o dimetil carbmico que se muestra en la Figura 2 (Daz y De la Sovera,
2009).
O
R1
N C OR3
R 2
Figura 2. Estructura qumica del cido N-metil o dimetilcarbmico (Daz y De la

Sovera, 2009)
En donde:
R1 y R2 suelen ser grupos H radicales alqulicos

R3 suele ser un grupo arlico (aromtico) (R3=H c. carbmico)
En la Figura 3 se muestra la estructura qumica de algunos carbamatos ms usados:
Methomyl
Aldicarb
Carbaryl Carbofuran Propoxur
Figura 3. Estructura qumica de algunos carbamatos (Daz y De la Sovera, 2009).

Seguidamente en la Tabla 2 se incluyen ejemplos de nombres genricos y
comerciales de algunos plaguicidas carbamatos ms conocidos:
Tabla 2. Nombre genrico y comercial de los carbamatos ms conocidos (Primo y

Carrasco, 1980).
Nombre genrico Nombre comercial Espectro de accin

Aldicarb Aldicarb, Temik Insecticida
Propoxur Baygn, Undn Insecticida
Zineb Zineb Fungicida
Propineb Metilzineb, Mezineb Fungicida
Carbaryl Sevn Insecticida
Methiocarb Mesurol Insecticida
1.1 Vas de absorcin, procesos de biotransformacin y de eliminacin.
Los carbamatos son sustancias liposolubles e ingresan al organismo por las vas
cutnea, respiratoria y digestiva. La vida media de los compuestos carbamatos y de
sus productos de biotransformacin, es relativamente corta, no se acumulan en el
organismo. Dicho proceso se lleva a cabo en los mamferos, a travs de tres

mecanismos bsicos: hidrlisis, oxidacin y conjugacin. Son hidrolizados
enzimticamente por el hgado y los productos de degradacin se excretan por los
riones y la bilis (Daz y De la Sovera, 2009).
Los organofosforados y carbamatos tambin pueden inhibir la accin de la

acetilcolinesterasa de los organismos. Esto se debe a que ambos tipos de
compuestos tienen una estructura molecular y una distribucin de las polaridades
anlogas a las de la acetilcolina; sin embargo, los carbamatos producen una
inhibicin competitiva, fijndose reversiblemente a la enzima y ocupando el sitio de la
acetilcolina, ya que la carbamilacin de la enzima da compuestos menos estables
que la fosforilacin (Primo y Carrasco, 1980). La intoxicacin por estos productos
causa sntomas como malestar, debilidad muscular, mareo, transpiracin, dolor de
cabeza, salivacin, nuseas, vmitos y dolor abdominal entre otros (Daz y De la
Sovera, 2009).
Adems de estas acciones peligrosas de estos compuestos, los N-nitrosocarbamatos

que se forman son mutgenos potentes. De otra manera, estos pesticidas
generalmente no se mantienen en el suelo por largo tiempo, y la persistencia de los
mismos es debida a la frecuencia con la que sean aplicados. Desde esta
perspectiva, es necesario el entendimiento del mecanismo de degradacin de ellos
para su mantenimiento en el suelo (Hashimoto et al., 2001).
En la siguiente Tabla (3) se describen los carbamatos a usar en este trabajo:
Tabla 3. Descripcin de los pesticidas carbamatos a utilizar (Indice Agropecuario,

2001).
Nombre Ingrediente Nombre Qumico Frmula Indole

activo qumica
Carbofuran 2,3-dihidro- Insecticida
Carbodan 2,2- dimetil- y/o
Carbofuran C12H15NO3
48F benzofuran-7-il-metil Nematicida
carbamato
Producto de
Dithane coordinacin del in

Mancozeb zinc con el etilen- C4H6N2S4 Fungicida
M-45 bisdithiocarbamato de
manganeso
Propyl 3-dimethylamino
C9H20N2O2 x
Previcur N Propamocarb propylcarbamate Fungicida
HCl
hydrocloride
Etilenbisditiocarbamato
Vondozeb
Mancozeb de manganeso con ion C4H6N2S4 Fungicida
80 PM
zinc
Zineb
Etileno-bis- C4H8N2S4Mn
Zineb Fungicida
ditiocarbamato x Zn
75 PM
1.2 Biotransformacin de los pesticidas carbamatos por bacterias del suelo

Se conocen dos formas en las que los microorganismos pueden degradar el
pesticida: (a) cuando la sustancia favorece el crecimiento microbiano y es empleada
como fuente de carbono o energa y otras veces como fuente de nitrgeno y azufre,
bajo este evento el nmero de microorganismos aumenta y el aislamiento se realiza
utilizando el pesticida como nica fuente de nutrientes, y luego que el compuesto es
degradado las poblaciones decrecen, y (b) por cometabolismo, cuando el compuesto
no acta directamente como fuente de nutrientes sino que se deben emplear otras
fuentes, como la glucosa, que al disminuir este compuesto en el medio induzca la
produccin de enzimas necesarias para la degradacin del pesticida (Alexander,
1977).
1.2.a Metabolismo
Una de las formas en las que los microorganismos pueden reducir los pesticidas en
los suelos, se refiere a la capacidad de metabolizarlos o degradarlos que consiste en
la transformacin de estos compuestos en otros ms simples y menos contaminantes
(Snchez y Rodrguez, 2002).
1.2.b Cometabolismo
El trmino cometabolismo define la transformacin de un compuesto llamado

cosustrato, en presencia obligada de un sustrato durante el crecimiento o por clulas
en reposo en ausencia del sustrato de crecimiento (Perry, 1979). El cosustrato o
cometabolito no aporta energa, carbono o algn otro nutriente y en consecuencia es
incapaz de soportar la replicacin celular. El sustrato de crecimiento acta como un
donador de electrones que proporciona poder reductor y energa para el crecimiento
y el mantenimiento celular (Janke y Fristche, 1985; Criddle, 1993). La presencia del
cosustrato no induce la actividad de las enzimas involucradas en su transformacin,
ya que se trata de una transformacin colateral a la degradacin del sustrato el cual
si induce la actividad enzimtica (Garca-Rivero y Peralta-Prez, 2008).
Los microorganismos del suelo juegan un papel importante en la reduccin de los

niveles de pesticidas aplicados para el control de las plagas. A partir de suelos se
han aislado y caracterizado varios gneros bacterianos capaces de degradar
pesticidas carbamatos y tambin se han estudiado las caractersticas bioqumicas
de algunas hidrolasas involucradas en la degradacin de estos compuestos. Sin
embargo, poco se conoce acerca de los genes de estas enzimas. En este sentido se
ha identificado el gen mcd que codifica para una hidrolasa del carbofurano,
localizado en la regin 100-kb de un plsmido llamado pPDL11, y ha sido clonado en
Achromobacter sp. cepa WM111. Este gen ha mostrado estar presente en muchas
bacterias y est ubicado entre los 100- 105, o 124-kb de un plsmido que se
encuentra en diversas bacterias aisladas de distintas reas geogrficas. No obstante,
los genes que degradan la estructura del insecticida carbamato no han sido
reportados todava, aunque la secuencia de nucletidos del gen mcd est disponible
en el GenBank (N de acceso AF160188) (Hashimoto et al., 2001).
Vandana y Prashant, en el 2005 encontraron que las cepas C4, C5 y C6 de

Pseudomonas sp. aisladas de suelos contaminados con carbaryl utilizan este
carbamato como nica fuente de carbono y energa, y sugieren que el carbaryl es
metabolizado via 1-naphtol, 1,2-dihydroxynaphthaleno, y gentisato proponiendo la va
metablica del Carbaryl 1-naphtol 1,2-dihydroxynaphthaleno Salicylaldehydo
Salicilato Gentisato Maleylpyruvato como se muestra en la Figura 4.
Figura 4. Va propuesta del metabolismo del Carbaryl en las cepas C4, C5, y C6 de
Pseudomonas sp. (Vandana y Prashant, 2005).
10

De esta misma forma Arthrobacter sp. cepa RC100 aislada de suelo tratado con
carbaryl, es capaz de utilizar este carbamato como nica fuente de carbono y en este
estudio se demostr que en la va degradativa de este compuesto estaban
involucrados dos plsmidos (pRC1 y pRC2); adems de estos han sido reconocidos
en varias investigaciones otros plsmidos involucrados en la degradacin de
pesticidas y tambin los genes para la degradacin de Phenmediphan, EPTC (ethyl
dipropyl-thiocarbamate), Carbofuran, Bromoxynil y Paration fueron identificados en
los plsmidos de manera que los plsmidos juegan un importante papel en la
evolucin de las capacidades para degradar pesticidas, sin embargo poco se conoce
acerca de la degradacin de pesticidas carbamatos mediada por plsmidos
(Hayatsu et al., 1999).
Larkin y Day (1984) determinaron que la tasa de hidrlisis enzimtica del carbaryl por
Pseudomonas sp. disminuye a medida que disminuye el pH, y conforma una cintica
de primer orden, es decir que el tiempo de vida media del carbaryl que fue medido
por la produccin de 1-naphtol aumenta de 16.5 a 171.4 das cuando disminuye el
pH de 7,0 a 6,0. Posteriormente Larkin y Day (1985) aislan de suelo de jardn tres
cepas bacterianas capaces de degradar Carbaryl, las cepas de Pseudomonas sp.
(NCIB 12042 y 12043) y Rhodococcus sp. (NCIB 12038), de ellas la NCIB 12042 y
12038 usaron el Carbaryl como nica fuente de carbono y de nitrgeno a un pH 6.8,
mientras que la NCIB 12043 fue seleccionada de una columna enriquecida con pH
5,2 y aumentaba la actividad enzimtica de la hidrlisis de Carbaryl.
Chapalamadugu y Chaudhry, en 1991 trabajaron con dos aislados de Pseudomonas

sp. (50552 y 50581), los cuales fueron capaces de degradar 1-naphthol y carbaryl,
unos pesticidas N-methylcarbamatos respectivamente; el 1-naphthol fue
completamente metabolizado a CO2 por el aislado 50552, mientras que el carbaryl
fue primero hidrolizado a 1-naphthol y fue convertido a un compuesto de color
marrn por el aislado 50581, aunque este metabolito no fue degradado, el 1-naphthol
producido por el aislado 50581 en su fase exponencial de crecimiento fue
metabolizado por el aislado 50552 , y de ah que construyeron un consorcio bacterial
11

usando los dos aislados que cataboliza completamente el carbaryl a CO2, el aislado
50581 alberga un plsmido de 50 kb (pCD1) que no fue encontrado en el aislado
50552, de manera que sugieren que el aislado individual o en consorcio puede ser
usado como destoxificante de ciertos desechos de industrias y de la agricultura.
Son muy escasos los estudios referentes a la capacidad degradativa de los

carbamatos, por bacterias simbiticas fijadoras de nitrgeno tales como los rizobios.
En este sentido, ha sido identificado y secuenciado, un gen de la hidrolasa del
carbaryl (cehA). Esta enzima fue extrada y purificada de la cepa AC100 de
Rhizobium sp. que fue capaz de degradar este compuesto. El marco de lectura
abierto incluye a este gen en la regin 10-kb del plsmido pAC200 y el anlisis de la
secuencia mostr que el gen est flanqueado por dos copias de secuencias de
insercin ligadas, sugiriendo que puede estar formando parte de un transposn
(Hashimoto et al., 2001).
Los primeros estudios acerca del cometabolismo datan de finales de los aos 50,
cuando Leadbetter y Foster (1959) observaron que Pseudomonas methanica
oxidaba el etano pero no poda utilizarlo como fuente de carbono; luego Foster y su
grupo observaron que esta bacteria poda transformar diferentes hidrocarburos.
Dichos estudios concluyeron que P. methanica no poda crecer utilizando el etano
debido a su incapacidad para asimilar los productos de oxidacin en sus vas
metablicas centrales y en 1962 defini este fenmeno como co-oxidacin. Por otro
lado en 1963 Jensen (citado por Garca-Rivero y Peralta-Prez, 2008), observ que
este gnero era capaz de crecer en monocloroacetato y deshalogenar tricloroacetato,
sin usar a ste ltimo como fuente de carbono para el crecimiento, y con estos
resultados Jensen generaliz el trmino co-oxidacin para incluir otro tipo de
reacciones como las deshalogenaciones y lo llam co-metabolismo, trmino que
actualmente se ha extendido para incluir diversas reacciones como son
hidroxilaciones, desnitracin, desaminacin, hidrlisis, acilaciones o rompimiento de
enlaces ter (Alexander, 1999).
12

La especificacin de los intermediarios producidos durante la degradacin metablica

de pesticidas, proporciona informacin importante del proceso de mineralizacin
porque estos metabolitos podran ser ms txicos, ms persistentes o poseer
diferentes movilidades comparados con la molcula origen en el mismo ambiente
microbiano (Lal y Saxena, 1982). Aunque los microorganismos son agentes
determinantes en la acumulacin y metabolismo de pesticidas, pueden sin embargo,
ser susceptibles a la toxicidad por estos compuestos. La naturaleza de accin de los
pesticidas sobre los microorganismos depende de la naturaleza, concentracin del
pesticida, tipos de microorganismos y el ambiente en el cual estos microorganismos
crecen; entendindose el trmino crecimiento microbiano como la multiplicacin de la
poblacin, la cual decrece, se incrementa o no se ve afectada por la adicin de
pesticidas. (Lal y Saxena, 1982).
En ambientes naturales, los microorganismos pueden estar expuestos a diferentes

contaminantes simultneamente, las interacciones de los compuestos qumicos con
los insecticidas pueden influir en la tolerancia a estos. En Estados Unidos, el 37% de
los sitios contaminados con compuestos orgnicos tambin contienen contaminantes
inorgnicos tales como metales pesados (Kovalick, 1991, citado por Castro, 2008).
2. Simbiosis rizobio-leguminosa
El nitrgeno es un elemento muy abundante en la atmsfera, sin embargo, las

plantas no pueden utilizarlo en su forma elemental, por lo que stas pueden
obtenerlo del suelo en forma de nitratos o amonio (Wang, 2001).
La fijacin biolgica de N2 es catalizada por el complejo enzimtico nitrogenasa, que

se encuentra exclusivamente en procariotas. La capacidad de un organismo para
fijar N2 puede determinarse experimentalmente por incorporacin de N2, o por la
reduccin de acetileno a etileno (Lodeiro et al., 2003). Se conoce colectivamente
13

como rizobios, al grupo de bacterias que inducen en las races (o en el tallo) de las
leguminosas la formacin de estructuras especializadas, los ndulos, dentro de los
cuales el nitrgeno gaseoso es reducido a amonio. En estos ndulos, la planta
husped obtiene nutrientes nitrogenados de la bacteria (rizobios), y le aporta a sta
una fuente de carbono y un ambiente favorable para fijar nitrgeno (Wang, 2001).
Dentro de las leguminosas, el porcentaje de familias que han sido noduladas por
rizobios es distinto: 97% de las Fabaceae (anteriormente Papilionoidea segn
Ricardi, 1992), 90% de las Mimosaceae y solo el 23% de las Caesalpiniaceae
(Werner, 1992).
Los genes asociados con la fijacin de nitrgeno son designados como genes nif y
estn bajo un intensivo estudio en una variedad de organismos, partiendo de los
estudios iniciales en Klebsiella pneumoniae (Smith y Gallon, 1993).
La fijacin biolgica de nitrgeno est ejemplificada por la siguiente reaccin:
N2 + 10H+ + 8e- 2 NH4+ + H2
en esta reaccin, 16 molculas de ATP son hidrolizadas por cada molcula de

nitrgeno reducido, y tambin el hidrgeno es producto de esta reaccin (Smith y
Gallon, 1993).
La nitrogenasa es irreversiblemente inactivada por el oxgeno (Shaw y Brill, 1977).

Por lo tanto, la fijacin de nitrgeno requiere de sistemas de proteccin de la
nitrogenasa frente al O2, y sta es proporcionada por la leghemoglobina, que es una
protena de color rojo capaz de unir y transportar oxgeno con gran afinidad,
permitiendo que dentro del ndulo, las concentraciones de oxgeno sean unas 104
105 veces menores que las concentraciones de oxgeno encontradas habitualmente
en los fludos de los tejidos aerbicos (Lodeiro et al., 2003).
14

2.1 Los Rizobios.

Los rizobios tienen morfologa normalmente bacilar (0,5-0,9 x 1,2-3,0 m), no forman
esporas, y a menudo contienen grnulos de poli--hidroxibutirato (Jordan, 1984).
Son aerobios Gram negativos, mviles por medio de 1 6 flagelos que pueden ser
peritricales o sub polares. Las colonias son blancas o color beige, mucilaginosas y
pueden utilizar una gran variedad de azcares como fuente de carbono (Wang et al.,
2001).
Estas bacterias tienen tres modalidades de vida: a) Son saprfitos en el suelo o
medio de cultivo b) Son capaces de establecer una relacin simbitica con las
leguminosas formando ndulos en la raz o en el tallo y c) Pueden comportarse
como endfitos colonizando plantas no leguminosas (Wang et al., 2001). Estas
asociaciones entre rizobios y plantas no leguminosas pueden mejorar el crecimiento
de las plantas, as como ocurre en R. leguminosarum asociado a las races de
Brassica napus, B. campestris y Lactuca sativa, cuyo efecto promotor posiblemente
est relacionado con la produccin de reguladores de crecimiento y en este caso los
rizobios desempearan el papel de las denominadas rizobacterias promotoras del
crecimiento (PGPR), ms que como fijadores de nitrgeno (Noel et al., 1996).
Los rizobios comparten el ambiente edfico con muchos otros organismos vivos,
entre ellos bacterias de diferentes especies, actinomicetes, hongos, microalgas,
protozoos, nematodos, lombrices y otros invertebrados, adems de las plantas. En
un suelo con textura media y clima templado hmedo, la biomasa bacteriana puede
estar alrededor de 108 a 109 clulas por gramo de suelo. Entre todas las especies
bacterians que componen esta biomasa, los rizobios, cuando estn presentes son
una pequea fraccin, de alrededor de 102 a 106 clulas por gramo de suelo,
dependiendo de si hay o no leguminosas, en cuyo caso la poblacin de rizobios est
cerca del lmite superior (Lodeiro et al., 2003).
15

La clasificacin taxonmica propuesta para los rizobios en la segunda edicin del

Manual de Sistemtica Bacteriolgica de Bergeys (citado por Madigan et al., 2000)
es mostrada en la Tabla 4, donde se incluyen diferentes familias con varios gneros
formadores de ndulos y de algunas mal formaciones en especies vegetales.
Algunos autores incluyen el gnero Allorhizobium dentro de la familia Rhizobiaceae
(Wang et al., 2001). Pero la taxonoma rizobial actual, basada en tcnicas
moleculares y aproximaciones polifsicas (caractersticas morfolgicas, bioqumicas,
fisiolgicas, genticas), es continuamente reexaminada, y es objeto de
modificaciones. Tal es el caso del gnero Sinorhizobium, cuyo nombre fue cambiado
por la denominacin ms antigua, gnero Ensifer (Young, 2003) y los gneros
Allorhizobium y Agrobacterium, que han sido incluidos dentro del gnero Rhizobium.
16

Tabla 4. Clasificacin de los rizobios nodulantes y bacterias que originan

malformaciones en especies vegetales.
Reino Phylum Clase Orden Familia Gnero

Agrobacterium
10 spp.
Ensifer 1sp.
Rhizobiaceae Rhizobium 20 spp
Sinorhizobium
6spp
Bacteria Proteobacteria Rhodospirilli Rhizobiales Mesorhizobium
7spp
Phyllobacteriaceae
Phyllobacterium
2spp
Hyphomicrobiaceae Azorhizobium 1sp

Bradyrhizobiaceae Bradyrhizobium
3spp
3. Vicia faba L. (haba)
El gnero Vicia L., el haba, es una planta anual, bianual o perenne, trepadora
herbcea rastrera de tallos semi-erectos que se enredan entre ellas. Hojas
paripinnadas con pice entero o dentado, peciolada, usualmente en numerosos
pares, con foliolos anchos ovales- redondeados, flores axilares azules, violetas,
amarillas o blancas, presentes en racimos de 2 a 8 unidades, alcanzan hasta metro y
medio de altura. Tiene especies representativas distribuidas en distintas reas con
diferentes temperaturas, muchas especies son nativas de Europa y otras de regiones
adyacentes de Asia (Allen & Allen, 1981).
17

La especie Vicia faba L., Sp. Pl. 737. 1753, es una planta erecta robusta con una
cobertura de hojas anual, de 2-6 hojas oblongas, elpticas, usualmente de 5-6cm de
largo por 1-2cm de ancho, con hoja terminal ausente o algunas veces reemplazada
por un zarcillo rudimentario. Sus flores son subssiles en las axilas de las hojas, son
de color blanco con una mancha larga negra o negra-azulada, alrededor de 2.5 cm
de longitud, vaina al principio erecta y despus colgante, con un largo de 1dm y un
ancho de 4cm aproximadamente, con una pubescencia de muy corto plazo, las
semillas son frecuentemente amarillas o marrones doradas (beige). Comnmente
son cultivadas alrededor de los 3700 msnm, son usadas como alimento, tanto sus
semillas como sus vainas tiernas, y como plantas forrajeras; su origen es
desconocido pero probablemente son nativas de frica y del suroeste de Asia
(Macbride, 1943).
La clasificacin taxonmica de esta especie se observa en la Tabla 5 a continuacin:
Tabla 5. Clasificacin taxonmica de Vicia faba L. segn Cronquist, 1981.
Reino Plantae
Divisin Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Rosidae
Orden Fabales
Familia Fabceas
Gnero Vicia
Especie Vicia faba L.
El consumo excesivo de Vicia faba L. est asociado con lo que se conoce con el
nombre de Fabismo, una anemia hemoltica en hombres y animales. Usualmente se
origina por el consumo de semillas o inhalacin del polen por parte de individuos con
deficiencia de glucosa-6-fosfato, lo que produce una hemlisis o ruptura de los
eritrocitos. La aparicin del Fabismo est ligada a factores genticos de los
individuos afectados (Allen & Allen, 1981).
18

Los rizobios de Vicia como miembros de Rhizobium leguminosarum forman ndulos

sobre races de Lathyrus, Pisum, y especies de Lens, y viceversa. El crecimiento
sobre medio agar manitol es rpido, con tendencia a extenderse, las colonias son
levantadas, semitraslcidas y blancas, con consistencia mucoide a viscosa. Los
tipos de ndulos de Vicia son alargados, ovales o multiramificados y muchos se
agrupan en racimos coraloides (Allen & Allen, 1981).
Nan et al., en el 2002, observaron que el tratamiento con pesticidas en Vicia faba L.
durante dos aos consecutivos es efectivo para la reduccin de la mortalidad de la
planta en un 31.9%, la produccin de semillas increment en un 19.6% en semillas
tratadas con el fungicida Triadimefon, y demuestran que el tratamiento con este
pesticida es efectivo para controlar la pudricin de la semilla, promover el crecimiento
de la planta e incrementar la cosecha de semillas de habas.
Efectos del Carbendazim, Captan, Thiram y Mancozeb sobre la vitalidad de la planta

Cicer arietinum fueron probados por Aamil et al., en el 2004, en donde la aplicacin
de 1,5 g/Kg de todos estos pesticidas no afect significativamente el vigor de la
planta, cosecha de semillas, ni el contenido de nitrgeno y protenas, mientras que el
tratamiento con Thiram y Mancozeb de 2 g/kg s causaron una reduccin de estos
parmetros. Adems, las semillas tratadas con bajas concentraciones de estos
fungicidas incrementaron significativamente la nodulacin (nmero de ndulos por
planta) y fue compatible con el inculo de Mesorhizobium usado, y a pesar de que la
concentracin de 2 g/Kg de Carbendazim no tuvo efectos fitotxicos bajo condiciones
de invernadero, si redujo el contenido de clorofila, nodulacin y contenido de
nitrgeno en las races.
19

La aplicacin de pesticidas reduce o anula la nodulacin por Rhizobium sp. en

leguminosas, en principio porque stos afectan la viabilidad de la bacteria, en
consecuencia la Fijacin Biolgica de Nitrgeno (Alexander, 1977).
La utilizacin de agroqumicos para la obtencin de cultivos ms productivos es una

prctica muy comn en Venezuela, especialmente en la regin andina, donde los
cultivos de hortalizas se realizan de manera intensiva constituyendo el sustento de
los campesinos y tambin parte del alimento de la poblacin en general. Pero la
aplicacin de estos fertilizantes y pesticidas generalmente, se efecta
indiscriminadamente, sin ningn tipo de proteccin ni medidas mnimas de seguridad.
Gran parte de la composicin de estos qumicos es en base a carbamatos, razn por
la cual se usaron como recurso en este trabajo. Por otra parte se decidi usar como
material vegetal el haba (Vicia faba L.) por ser un cultivo que en el pramo merideo
tiene varios fines; es usado como alimento, incorporador de nitrgeno al suelo, como
cultivo trampa y recientemente est utilizndose como recuperador de suelos por la
red de agroecologa de esa zona.
En vista de esta situacin perjudicial para el hombre y el medio ambiente segn todo
lo expuesto anteriormente, referente a los carbamatos es necesario hacer estudios
sobre la incidencia que tienen estos pesticidas sobre microorganismos del suelo,
especficamente en rizobios. Siendo importante lograr el aislamiento y seleccin de
bacterias rizobiales que sean capaces de metabolizar estos compuestos y a las que
no les sean afectadas sus capacidades de nodular leguminosas, permitiendo as
establecer bases cientficas y proyectar la idea de utilizarlas como biofertilizantes y
as disminuir el dao que estos productos puedan ocasionar en aquellos
organismos para los cuales no son aplicados.
20

Hiptesis
a) Las bacterias rizobiales presentes en suelos tratados con carbamatos podran ser
capaces de metabolizar estos compuestos.
b) La aplicacin de altas concentraciones de carbamatos podra afectar

desfavorablemente la germinacin y nodulacin de Vicia faba L.
Objetivos
Objetivo General:
Evidenciar la resistencia de carbamatos por parte de los rizobios y la incidencia en la

germinacin, nodulacin y crecimiento de Vicia faba L.
Objetivos Especficos:
Aislar, purificar y autenticar cepas rizobiales a partir de suelos tratados con

carbamatos y sin carbamatos.
Determinar el crecimiento de los rizobios en presencia de carbamatos

cualitativamente y cuantitativamente.
Detectar la capacidad de los rizobios para utilizar los carbamatos como nica fuente
carbonada y nitrogenada.
Determinar la Dosis Letal Media de los carbamatos usados.
Probar el efecto de carbamatos en la germinacin, nodulacin y crecimiento de Vicia

faba L.
Determinar el contenido de nitrgeno total, como medida de la Fijacin de Nitrgeno.
21

MATERIALES Y MTODOS
1.- rea de estudio
Se realiz una salida de campo para inspeccionar el sitio de trabajo, ubicado en

Mucuches, Municipio Rangel Edo. Mrida, Venezuela, latitud 8 46N longitud
7054O, altitud 2960 msnm, temperatura media anual 11,1C y una precipitacin
media anual de 640 mm (Machado, 2005) (Fig 5). En esta localidad se hallaban
parcelas cultivadas con Solanum tuberosum L. (papa) y Allium sativum L. (ajo),
ambas tratadas con carbamatos y otros agroqumicos, adems de otro terreno
mantenido bajo condiciones naturales que nunca haban sido cultivado, por lo tanto
no tratado qumicamente, la cual se consider como control (Anexo 1). Las
parcelas cultivadas son parte de la Finca La Flor propiedad del Sr. Jess Parra,
ubicada en el casero Misteque parte alta a la altura de 3150 msnm (Fig 5). Este
suelo tiene ms de 30 aos de cultivado, siempre con abundantes aplicaciones de
pesticidas durante el cultivo de estos y al principio de la siembra le colocan gallinazo
al suelo. Se usan cultivos rotatorios contnuos. Las dimensiones aproximadas del
rea de la parcela cultivada con Solanum tuberosum L. es 30 m x 10 m y la de Allium
sativum L. 100 m x 50 m (esta ltima con la particularidad de haber durado 10 aos
en descanso). Se tomaron al azar 5 submuestras de suelo de cada una de ellas,
utilizando implementos limpios y nuevos (guantes y bolsas plsticas nuevas), para
preparar luego una muestra compuesta. Se recolectaron porciones de suelo
rizosfricos tanto de las plantas de ajo como papa, entre los 10 y 15 cm de
profundidad, que es donde se halla la mayor poblacin de microorganismos y
probablemente las bacterias rizobiales. Luego estas muestras fueron llevadas al
laboratorio. La parcela no cultivada tiene un rea de 40 m x 20 m aproximadamente.
22

1.1 Captura de rizobios a partir del suelo, empleando como cultivo trampa
Phaseolus vulgaris L. y Macroptilium lathyroides L..
Una vez llevadas las muestras de suelo al laboratorio se procedi a la captura de los
rizobios utilizando como cultivo trampa plantas de Phaseolus vulgaris L. (caraota) y
Macroptilium lathyroides L.(siratro), ya que la primera de ellas se considera como
husped promiscuo u hospedador no selectivo por ser una especie cosmopolita, que
ha sido nodulada por ms de 100 especies de Rhizobium (Michiels et al., 1998) y la
segunda tambin por ser una planta de amplio rango hospedador, ya que al gnero
al cual pertenece nodula con especies de rizobios de crecimiento lento al contrario
que la primera (Odee et al., 1996).
Se prepar una muestra de suelo compuesta mezclando las 5 submuestras de cada

una de las parcelas, para llenar los recipientes de plstico de 11 cm de ancho por
13 cm de alto. Luego fueron colocadas semillas de Phaseolus vulgaris L.
germinadas para capturar los rizobios en los ndulos que se formaron en sus races.
Las semillas de Phaseolus vulgaris L. fueron previamente esterilizadas segn el
protocolo descrito en (Skwierinski y Marquina, 2006). Para ello se colocaron las
semillas en agua jabonosa y se frotaron un poco imbibindolas en agua corriente
por 30 min. Luego de lavar bien las semillas se desinfectaron con hipoclorito de
sodio al 1% por 7 min, efectuando de 8 -10 lavados con agua destilada estril,
seguidamente fue eliminado el exceso de agua con servilletas estriles y sembradas
en medio TY agarizado al 0.8% (Beringer, 1974) e incubadas a 25C en condiciones
de semioscuridad por 3 das aproximadamente. Las semillas de siratro fueron
escarificadas con un papel lija pasndolas sobre ellas unas 200 veces
aproximadamente. Luego se imbibieron con agua de chorro por 30 min y fueron
esterilizadas superficialmente con hipoclorito de sodio al 1% durante 6 min.
Seguidamente fueron lavadas con abundante agua estril. Por ltimo se sembraron
en cpsulas de Petri con medio TY agarizado (0.8%), e incubadas en el cuarto de luz
a una temperatura de 25C y fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad por 3 das
para permitir la germinacin. Las semillas germinadas fueron trasplantadas a los
23

recipientes plsticos de 8 cm de ancho por 10 cm de alto con las muestras de suelo.

Se hicieron 5 repeticiones por cada parcela. Estas plntulas se mantuvieron en el
cuarto de luz con fotoperiodo de 16h luz y 8h de oscuridad a 25C durante una
semana y luego fueron llevadas al invernadero con temperaturas promedio mnimas
de 18C y mximas de 28C durante 45 das (Anexo 3). Las plantas de caraota se
regaron con 30 ml y las de siratro con 20 ml de agua destilada estril cada 3 das.
Luego se desmontaron las plantas y se tomaron resultados de la nodulacin.
Debido a que no se lograron capturar rizobios en el suelo natural porque no se

formaron ndulos con ninguna de los dos cultivos trampa, se decidi aislar los
rizobios a partir de ndulos de plantas de Vicia faba L. cultivadas en suelo sin ningn
tratamiento qumico, de una zona cercana, ubicada a 1000 metros aproximadamente
ms abajo del sitio donde se recolectaron las muestras de suelo, considerando estos
aislados rizobiales como trminos comparativos. Este cultivo es parte de la Finca El
Tejar propiedad del Sr. Rafael Romero que se encuentra en el casero Mucumpate a
una altura de 2937 msnm (Fig 5), en donde se usan las habas como cultivo trampa
contra el dptero Liriomiza sp. y tambin tiene 30 aos de cultivo con la modalidad de
ser rotatorio pero sin aplicaciones de agroqumicos. Las dimensiones aproximadas
de la parcela son de 20 m x 5 m (Anexo 2).
24

UbicacinGeogrfica
N
(a)
RoChama
CarreteraTrasandina
(2)Mucumpate Parcela
Cultivohaba
Mucuches
(1)Misteque ParcelasCultivo
papa,ajo,ynocultivada
(c)
(b)
ProyeccinUTM:(1)Coordenadasx:290766y:967314h:3150msnm
Zona19N(2)Coordenadasx:290102y:968091h:2937msnm

Figura 5. Ubicacin geogrfica de las parcelas de donde se tomaron las muestras para capturar
rizobios. (a) Mapa de Venezuela con la silueta del estado Mrida. (b) Mapa del estado Mrida
delimitando las carreteras principales. (c) Ampliacin del sitio de estudio en Mucuches, Misteque y
Mucumpate, mostrando las ubicacin de las parcelas del cultivo de papa, ajo y la no cultivada (1) y la
parcela cultivada con haba (2).
1.2 Aislamiento y purificacin de las bacterias en medio YMA modificado

con rojo congo.
Una vez obtenidos los ndulos se procedi con la metodologa descrita en (CIAT,
1988) que consisti en separar los ndulos de las races de la planta y lavarlos con
agua corriente para eliminarle restos de suelo, luego se sumergieron en agua
destilada estril para que se imbibieran. Seguidamente se hizo una esterilizacin
superficial en tubos de ensayo con dos extremos abiertos y uno de ellos cubierto con
gasa, all se colocaron los ndulos y primero se sumergieron en etanol al 95% por un
minuto, luego se trasladaron a una solucin desinfectante de hipoclorito de sodio al
1,5% donde se dejaron por 1 minuto agitando de vez en cuando y por ltimo se
lavaron 5 veces con agua destilada estril. Despus se maceraron los ndulos
25

separadamente en un tubo de ensayo con 1 gota de agua estril y se tom con el

asa una muestra de ese macerado y se sembr en medio YMA modificado (manitol
2,5 g/L, sacarosa 7,5 g/L) con rojo congo (25 g/ml), original de Vincent (1975) y para
el cual se us la nomenclatura YMAmrc, efectuando cultivos sucesivos (incubando
las cajas de Petri en cmara de crecimiento a 30C) hasta obtener los aislados,
reconociendo las colonias rizobiales por su color blanquecino o crema y algunas
colonias que pueden teirse dbilmente en contraposicin a los contaminantes que
se tornan rojos intensos (Marquina, 2005).
La pureza de dichos cultivos fue verificada mediante siembra por agotamiento en

medio agarizado YMAmrc y medio glucosa peptona ms prpura de bromocresol
(100g/ml) (GPA) (Rodrguez - Mendoza y Ferrera Cerrato, 1984). Esta prueba
permite verificar la pureza de los cultivos de Rhizobium ya que se desarrolla muy mal
en este medio porque el crecimiento bacteriano y el cambio de color en el medio
indica la presencia de contaminantes (Rodrguez Mendoza y Ferrera Cerrato,
1984). Se seleccionaron dos aislados de la parcela cultivada con Solanum tuberosum
L. denominados ES1 y ES2 y dos del suelo cultivado en Allium sativum L.
denominados EA1 y EA2 ambas tratadas con pesticidas, y otro aislado del suelo no
tratado con agroqumicos en donde creca Vicia faba L. denominado EV1.
2. Autenticacin de los aislados en Macroptylium lathyroides L. y

Phaseolus vulgaris L.
Una vez obtenidos los aislados purificados se autenticaron en plantas de amplio

rango de husped Macroptylium lathyroides L. (siratro) y Phaseolus vulgaris L.
(caraota) (Marquina, 2006). El protocolo de esterilizacin de las semillas de caraota y
siratro fue descrito en la seccin 1.1. Se llenaron recipientes plsticos de 8 cm de
ancho por 10 cm de alto para las plantas de siratro y de 11 cm de ancho por 13 cm
de alto para las plantas de caraota con arena. El protocolo de esterilizacin de arena
comenz con el tamizado de la arena nueva, luego se aplic hipoclorito de sodio
comercial (3.5%) durante 12 h y seguidamente fue lavada con agua de chorro
26

durante un da removiendo continuamente la arena. Despus se coloc a secar en

estufa a 120C durante un da y seguidamente se llenaron los recipientes plsticos,
humedeciendo la arena con agua destilada y esterilizando a 120 C, 15 psi (1atm)
durante 1h por 3 das consecutivos.
Una vez germinadas las semillas se colocaron en estos recipientes y se llevaron al

cuarto de luz a temperatura de 25C y fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad
durante 1 semana y luego las plantas fueron llevadas al invernadero con
temperaturas mnimas de 20C y mximas de 30C durante 45 das. Se hicieron 5
repeticiones por cada aislado obtenido, ms 5 repeticiones del control (sin inocular).
Las inoculaciones con las bacterias se realizaron con 5 ml de cultivo celular denso
(D. O.600nm de 0,8 equivalente a 108 cel/ml aproximadamente) crecido durante 2 das
en estufa a 30 C; agitacin continua 85 rpm, la primera se realiz cuando los
cotiledones haban emergido de la arena, y la reinoculacin a los 8 das con 3 ml del
inculo (108 cel/ml aproximadamente). Las plantas de caraota fueron regadas con 50
ml y las de siratro con 30 ml de agua destilada estril cada 3 das y una vez a la
semana los tratamientos controles eran regados con 30 ml de solucin Hoagland
de la concentracin de nitrgeno y las plantas inoculadas con 30 ml de Solucin
Hoagland sin nitrgeno. Despus se desmontaron las plantas y se verific la
nodulacin. Luego se reaislaron los rizobios segn la metodologa descrita en la
seccin 1.2.
2.1. Observaciones macromorfolgicas de las colonias rizobiales.
Una vez realizada la autenticacin, se tomaron los aislados que resultaron infectivos
(ES1 y EV1) y se sembraron en medio agarizado YMAmrc incubados a 30C y se
determinaron las siguientes caractersticas morfolgicas de las colonias: forma, color,
borde, aspecto y dimetro de la colonia.
27

3. Curvas de calibracin del crecimiento de los aislados rizobiales ES1 y EV1.
Para cuantificar el crecimiento de los aislados fue necesario elaborar las curvas de
calibracin en medio lquido YMm (YM modificado) de dos aislados tipo, uno
proveniente del suelo tratado con carbamato (ES1) y otro sin carbamato (EV1),
tomando 200l de un preinculo de cada bacteria y agregndolo a 15 ml de este
medio contenido en Erlenmeyer a los que se les haba adaptado un tubo de ensayo
de 1 cm x 10 cm, para tener una densidad ptica inicial a 600nm de 0,02. Se
mantuvo en agitacin continua en un agitador orbicular marca Boeco, modelo OS -
20 dentro de la estufa marca Prolabo N 28946 a 115 rpm y 30 C, midiendo la
Absorbancia en un Spectronic 20 a 600 nm, por duplicado para cada tratamiento,
durante 24 horas continuas. Dependiendo del crecimiento de cada aislado se
eligieron los intervalos de medicin hasta alcanzar la fase estacionaria, en la fase lag
cada 2 h, al comienzo de la fase exponencial cada hora y al inicio de la fase
estacionaria cada 1 h y media, hasta que no hubo ms crecimiento.
4. Prueba cualitativa de viabilidad de los aislados rizobiales en presencia de

carbamatos.
Partiendo de colonias aisladas de los rizobios, se prepar para cada uno de los
aislados provenientes de cada parcela (ES1 y EV1) un cultivo de 25 ml, incubado en
una estufa a 30 C con agitacin continua a 85 rpm durante 2 das, hasta obtener un
cultivo denso (108 cel/ml densidad ptica a 600 nm 0,8). Con un isopo estril
impregnado en cada cultivo rizobial se cubri la totalidad de la superficie del medio
agarizado YM sin rojo congo contenido en las cajas de Petri para crear un csped
bacteriano. Luego se colocaron sobre ese csped segn el mtodo experimental de
discos de papel filtro (Ferrera et al., 1993), discos impregnados con los siguientes
tratamientos:
Los agroqumicos ensayados son los siguientes:
28

Tabla 6. Pesticidas a usar en los ensayos, composicin qumica y

concentraciones aplicadas en campo.
Pesticida con Ingrediente activo Concentracin

Carbamato (% p/p) aplicada en campo
Carbodan Carbofuran 41% 1L/600L
Dithane Mancozeb 80% 500g/200L
Previcur Propamocarb 70% 500ml/400ml
Vondozeb Mancozeb 80% 500g/200L
Zineb Zineb 75% 500g/200L
Antes de iniciar el ensayo, se prepar una serie de diluciones en 100 ml de agua

destilada estril, para cada uno de los agroqumicos sealados en la Tabla 6.
Partiendo de la solucin que se denomin original, ya que contiene la misma
concentracin del pesticida que emplean en el campo, los agricultores dueos de
esas parcelas. En estas diluciones se sumergieron los discos de papel filtro
Whatman nmero 42 de 1cm de dimetro y se colocaron 3 discos por placa haciendo
2 repeticiones por tratamiento. Las diluciones se prepararon segn lo sealado en la
Tabla 7.
29

Tabla 7. Concentraciones de los carbamatos usados en los ensayos.
Diluciones de la solucin original de

Concentracin carbamato
Pesticida Solucin
con Original de 1
carbamato carbamato /6
(l o g/
100mlH2O)
Concentracin (l o g /100ml H2O)
Carbodan 165 l 83 l 41 l 27,5 l
Dithane 0.25 g 0.125 0,063 g 0,041 g
Previcur 125 l 62,5 l 31,3 l 20,8 l
Vondozeb 0.25 g 0.125 g 0,063 g 0,041 g
Zineb 0.25 g 0.125 g 0,063 g 0,041 g
Control H2O H2O H2O H2O
Se registraron los resultados tomando en cuenta el crecimiento cualitativo de la

bacteria alrededor y sobre el papel filtro impregnado con el pesticida y se midi el
halo de inhibicin formado alrededor de l a los 2 das de incubacin en la estufa a
30C, y segn estos resultados se elabor una curva de crecimiento para cada
aislado rizobial en los que se obtuvieron la mejor respuesta cualitativa (es decir la
que no inhibi el crecimiento celular y no form halo de inhibicin alrededor del papel
filtro o en otras palabras produjo un abundante crecimiento celular) para poder
cuantificar el crecimiento de la bacteria en presencia del carbamato (Prueba
cuantitativa de viabilidad de los aislados rizobiales en presencia de carbamatos).
5. Prueba de utilizacin de carbamatos como nica fuente carbonada y

nitrogenada.
En base a los resultados de la prueba cualitativa de la viabilidad de los rizobios en

presencia de carbamatos (mtodo de discos de papel), se seleccionaron 3 pesticidas
carbamatos, donde hubo crecimiento rizobial, significando que son bacterias
30

resistentes a estos agroqumicos. Por lo tanto, se realizaron las pruebas de

crecimiento para los aislados ES1 y EV1 para comprobar si lograban metabolizarlos
como nica fuente carbonada y nitrogenada. Para esta prueba se prepararon
cultivos rizobiales en medio YMm (25 ml) de ambos aislados, aadiendo 5 ml de un
preinculo fresco, se incubaron en una estufa a 30 C y agitacin continua 90 rpm,
para permitir el crecimiento hasta obtener una DO 600 nm 0,9 que corresponde a 5 x
108 cel/ml para el aislado ES1 y 0,75 que corresponde a 6 x 108 cel/ml para el aislado
EV1. Luego se sigui el protocolo citado por Marquina (2006), para carenciar las
bacterias por fuentes carbonadas y nitrogenadas en medio salino M9 (Miller, 1972).
El procedimiento consisti en tomar 4 ml del cultivo rizobial con una DO600nm de 0,9
y se centrifug a 4000 rpm en una centrfuga marca Eppendorf, modelo 5702 R,
durante 15 min, y se descart el sobrenadante. Luego se resuspendi el pellet en
1ml de NaCl 0,8% para lavar las clulas y se centrifug a 2500 rpm por 5 min, se
descart el sobrenadante y se repiti este lavado. Por ltimo se resuspendi el pellet
en 300 l de medio M9 sin la fuente que se va a probar (sin sacarosa para fuente de
carbono y sin NH4Cl para fuente nitrogenada, y luego se le agreg 3ml ms de ese
medio y se incub en una estufa a 30C con agitacin contnua a 85 rpm por 24 h.
Al cabo de ese tiempo se tomaron 200 l de ese inculo crecido en M9 para ES1 y
400 l para EV1 y se le agregaron a 15 ml de medio YMm (sin extracto de levadura y
sin sacarosa) que contiene lo siguiente segn cada tratamiento por duplicado y se
comenz a medir la curva de crecimiento:
Para fuente carbonada:

Control positivo: medio YMm + manitol + NH4NO3
Control negativo: medio YMm manitol + NH4NO3
Tratamiento: medio YMm manitol + NH4NO3 + carbamato
31

Para fuente nitrogenada:

Control positivo: medio YMm + manitol + NH4NO3
Control negativo: medio YMm + manitol - NH4NO3
Tratamiento: medio YMm + manitol - NH4NO3 + carbamato
Para esta prueba se tomaron las cantidades de carbamato suficientes para que el
ingrediente activo alcanzara una concentracin de 0.1% (Marquina, 2006) como se
muestra en la tabla 8.
Tabla 8. Concentraciones de los carbamatos para la prueba de utilizacin como

fuentes carbonadas y nitrogenadas.
Concentracin de carbamato Concentracin de
Carbamato para los tratamientos carbamato para el
(l g/ 15 ml YMm) blanco (l g/ 5 ml
YMm)
Carbodan 36.5 l 12.16 l
Previcur 21.4 l 7.13 l
Zineb 0.0195 g 0.0065 g
El blanco para medir la D.O se prepar con 5 ml de medio YMm (sin extracto de
levadura y sin sacarosa) sin cultivo bacteriano ms carbamato para los tratamientos
y sin carbamato para los controles.
6. Prueba cuantitativa de viabilidad de los aislados rizobiales en presencia de

carbamatos.
Segn los resultados de la prueba cualitativa, se preparon cultivos rizobiales para los
aislados ES1 y EV1 en Erlenmeyer a los que se le adapt un tubo de ensayo de 1 cm
x 10 cm conteniendo medio YM modificado lquido (15 ml) ms el carbamato que
arroj mejor resultado para cada aislado y con su respectiva concentracin (Tabla 9).
32

Se mantuvo en agitacin continua dentro de la estufa en un agitador orbicular a 115

rpm y 30 C, registrando la Absorbancia en un Spectronic 20 a 600 nm, por
duplicado para cada tratamiento, durante 24 horas continuas. Dependiendo del
crecimiento de cada aislado se realizaron los intervalos de medicin hasta alcanzar
la fase estacionaria, cada 2h en la fase lag, al comienzo de la fase exponencial cada
hora y al inicio de la fase estacionaria cada 1h y media, hasta que no hubo ms
crecimiento). El cultivo tomado como control contena YM modificado lquido sin
carbamato y la densidad ptica como punto de partida fue de 0,02 para la cual era
necesario 200 l del preinculo del aislado ES1 proveniente del suelo cultivado con
papa y 400 l del preinculo para el aislado EV1 del suelo con cultivo de haba,
ambos en 15 ml del medio YM para todos los tratamientos (la diferencia de
volmenes se debe a que el cultivo de ES1 es ms denso que el de EV1 con el
mismo tiempo de cultivo). El conteo viable fue realizado en medio TY agarizado al
1%, sembrando alcuotas de 0,1 ml (provenientes de diluciones seriadas 1/10) de
cultivo celular esparcidas con rastrillo (Anexo 7). Realizando los ensayos por
triplicado para cada dilucin segn la densidad ptica registrada (se plaque cada
vez que cambiaba de orden de medicin la D.O). El blanco para medir la D.O se
prepar con 5 ml de medio YMm sin cultivo bacteriano, sin carbamato para el control,
y con carbamato para los tratamientos.
Tabla 9. Concentraciones de los carbamatos a la dilucin para la elaboracin de la

curva de crecimiento en presencia de carbamatos.
Concentracin de carbamato Concentracin de
Carbamato para los tratamientos carbamato para el
(dilucin ) (l / 15 ml YMm) blanco (l / 5 ml YMm)
Carbodan 18.07 4.15
Previcur 9.38 3.13
33

Tanto para las medidas de densidad pitca como para el conteo viable se aplic una
Prueba de Medidas Repetidas con el programa SPSS para analizar los resultados
estadsticamente.
7. Determinacin de la dosis letal media DL50
Segn Miranda (2006), la DL50 o Dosis Letal media, no es ms que la dosis individual
de una sustancia que provoca la muerte del 50% de la poblacin animal debido a la
exposicin a la sustancia por cualquier va distinta a la inhalacin. Normalmente
expresada como miligramos o gramos de material por kilogramo de peso del animal.
En este caso la DL50 es la cantidad de pesticida (l/100ml de medio de cultivo) que
elimina el 50% de la poblacin rizobial.
En la realizacin de esta prueba fueron tomados en cuenta los dos carbamatos

(Carbodan y Previcur) que se estudiaron en la prueba cuantitativa de viabilidad de
los rizobios en presencia de carbamatos para ambos aislados, ya que este ensayo
arroj unos resultados que permitieron obtener una nocin en donde podra
encontrarse la DL50 gracias a las curvas de crecimiento. Para ello se prepararon
cultivos de ambos aislados ES1 y EV1 se permiti el crecimiento hasta alcanzar el
orden de 108 cel/ml (DO 600nm 0,95 a 1,0). Se prepararon las cajas de Petri con medio
YMA modificado sin rojo congo conteniendo la concentracin del carbamato a probar,
dichas concentraciones se muestran en la Tabla 10:
34

Tabla 10. Concentraciones de los carbamatos para determinar la DL50
Concentraciones de carbamatos
Aislado rizobial (l/ 100ml de medio YMAm sin rojo congo)
Carbodan Previcur Control
ES1 - = 83 l - = 62,5 l Medio YM

suelo cultivado Original = 165 l Original = 125 l modificado sin
con S. tuberosum + = 206 l + = 156,3 l rojo congo
L. (papa) + = 248 l + = 187,5 l
Doble = 250 l
1 1
EV1 /6- = 27,5 l /6- = 20,8 l Medio YM
suelo cultivado - = 41 l - = 31,3 l modificado sin
con V. faba L. - = 83 l - = 62,5 l rojo congo
(haba) Original = 165 l Original = 125 l
Una vez alcanzada la D.O mencionada anteriormente, se realiz el carenciamiento

por fuentes carbonadas a cada aislado rizobial en medio M9 (descrito en la seccin
5), durante 21 h para el aislado ES1 y 16 h para el aislado EV1, con la finalidad de
eliminar o disminuir cualquier crecimiento celular residual que no sea producido por
el carbamato. Luego se prepararon diluciones seriadas para cada bacteria, partiendo
del cultivo carenciado (100 l del suspensin bacteriana en 900 l de H2O estril), y
de acuerdo a los resultados obtenidos en el tratamiento control de la prueba
cuantitativa de viabilidad de los rizobios (seccin 6), se seleccion una dilucin que
permitiera obtener colonias contables (dicha dilucin fue para ES1 10-5 y para EV1
10-2) , sembrando 0,1ml de la misma en las cajas de Petri que tenan medio YMAm
sin rojo congo con las concentraciones (por triplicado) de los carbamatos
esterilizadas por filtracin (0.45 m) sealadas en la Tabla 3. En esta prueba se tom
como 100% de la poblacin rizobial el nmero mayor de unidades formadoras de
colonia (UFC/ml) y de all que el 50% sera esa cantidad dividida entre dos.
35

En la Figura 6 se muestra un esquema metodolgico para el aislamiento,

purificacin, autenticaciones de rizobios y los diferentes ensayos realizados con
ellos.
Figura 6. Esquema metodolgico para el aislamiento, purificacin, autenticaciones de rizobios

y diferentes ensayos realizados con ellos.
36

8. Prueba de germinacin de Vicia faba L. en presencia de carbamatos.
8.1 Descripcin del material vegetal.
Se us Vicia faba L., el haba, ya que en la zona de donde se tomaron las muestras
de suelo, se cultiva esta especie que es denominada variedad criolla por los
productores de esa zona. Esta especie en campo tiene una floracin a los 3-4
meses.
En Mucuches y caseros aledaos utilizan esta planta en los sistemas de rotacin de

cultivo como mejoradora de suelos por su capacidad de fijar N2, preparan sopas con
los granos, la consumen como habas tostadas, preparan platos como el buche de
siete granos (preparado con licor) y el fororo de siete granos (preparado sin licor),
como cultivo trampa para un dptero, Liriomiza sp.. y tambin han comenzado a
usarla en la recuperacin de suelos por la red de agroecologa de la zona.
El dueo actual de la finca donde fue recolectada V. faba L. (Ing. Rafael Romero) la
hered desde hace 12 aos, y como dato curioso luego de 5 aos en un anlisis de
suelo que hicieron a su terreno todava haba residuos de pesticidas (carbofurano)
porque en una parcela aledaa el dueo anterior cultivaba ajo (informacin general
proporcionada por el Ing. Rafael Romero).
Para esta prueba se utilizaron semillas de Vicia faba L. 100% viables verificadas con
cloruro de tetrazolium 1g/100ml de H2O destilada estril, tindose de un color
rosado todas las partes esenciales del embrin (Mpula-Larraeta, 2008).
Las semillas de V. faba L. fueron esterilizadas siguiendo el procedimiento

estandarizado previamente: se colocaron las semillas en agua jabonosa, frotndolas
un poco, permaneciendo all durante 30 min, luego se lavaron con agua corriente y
se imbibieron durante 30 min. Seguidamente se esterilizaron en hipoclorito de sodio
al 1% por 20 min, lavando 10 veces con agua destilada estril, efectuando una
segunda imbibicin en Erlenmeyer con agua destilada estril y agitacin fuerte 150
37

rpm por 24 h. Las semillas esterilizadas e imbibidas se lavaron de nuevo 3 veces

con agua destilada estril y se colocaron en las cmaras de germinacin preparadas
en cajas de plstico de 17 cm de ancho por 8 cm de alto, que contenan doble papel
absorbente sobre una capa de algodn hidroflico (todo bajo condiciones estriles),
humedecidas con 100 ml de solucin Hoagland diluida a la concentracin de
todos sus compuestos, agregando los carbamatos que resultaron positivos en la
prueba de viabilidad de rizobios en presencia de carbamatos con todas las
concentraciones descritas en la Tabla 6. En cada caja se colocaron 10 semillas y
cada tratamiento tena 4 repeticiones, es decir 40 semillas por tratamiento (Anexo 8).
El control contena la solucin Hoagland diluida a de sus compuestos, pero sin
carbamato. Las cmaras de germinacin se mantuvieron a temperatura ambiente
(22 C) en semi oscuridad, tomando resultados a partir del tercer da hasta el da 6
que no hubo ms germinacin. Por ltimo se aplic un ANOVA simple con el
programa Statgraphics para analizar los resultados estadsticamente. En la Tabla 11
se muestran las concentraciones y los carbamatos usados para esta prueba.
38

Tabla 11. Concentraciones de los carbamatos para la prueba de germinacin de Vicia faba
L. para 400 ml de solucin Hoagland de todos sus compuestos.
Tratamientos Concentracin Concentracin de las sol. carbamatos

Pesticida con de la sol. Diluciones (l g/ 400ml)
carbamato original de
1
carbamato 1
/2 1
/4 /6
(l g/ 400ml)
Carbodan +
(solucin 660l 330l 165l 110l
Hoagland )
Previcur +
(solucin 500l 250l 125l 83,3l
Hoagland )
Zineb + (solucin
1g 0,5g 0,25g 0,16g
Hoagland )
Control (solucin
Sol Hoagland Sol Hoagland Sol Hoagland Sol Hoagland
Hoagland )
En la Figura 7 se muestra un esquema metodolgico para la prueba de germinacin de

semillas de V. faba L. en presencia de carbamatos.
39

22C, semioscuridad
Figura 7. Esquema metodolgico para la prueba de germinacin de semillas de V. faba

L. en presencia de carbamatos.
9. Prueba de nodulacin y crecimiento de Vicia faba L.
Se comenz con el tamizado de arena nueva, la misma fue esterilizada con cloro
comercial (3.5%) durante 12 horas y luego lavada con agua corriente durante 24 horas
con agitacin frecuente y se sec en una estufa a 120C por 24 horas. Efectuando el
llenado de los recipientes plsticos de 7 cm de ancho por 15 cm de alto, y
humedecindolos con agua destilada a capacidad de campo, luego se cubrieron con
papel aluminio y tirro y fueron esterilizados a 120C y 1,5 psi (1 atm) de presin
durante 1h por 3 das consecutivos (Anexo 9).
40

9.1 Esterilizacin y germinacin de las semillas de V. faba L.

Las semillas de haba se esterilizaron de la siguiente manera: se colocaron en agua
jabonosa y se frotaron frecuentemente durante 1h, luego se lavaron con agua de chorro
por 8 h permitiendo as la imbibicin y luego se colocaron en cloro al 3% (se aument la
concentracin de cloro ya que haba disminudo la calidad del cloro comercial) durante
15 minutos con agitacin frecuente, se descart el cloro y se lavaron las semillas 10
veces con agua destilada estril. Luego se sembraron en medio TY al 0.8% en
cpsulas de Petri cubiertas casi por completo con papel aluminio para permitir la
entrada de O2. Se dejaron en temperatura ambiente (22C) y a los 6 das o mejor dicho
cuando la gran mayora de las semillas haba germinado, se trasplantaron a los
envases de plstico debidamente esterilizados con arena, a los cuales se les hizo un
agujero pequeo para la entrada de la semilla a travs del aluminio y se sembraron a
menos de de profundidad del envase cada semilla en cada uno de ellos y se tap el
agujero en con algodn estril. Se colocaron en el cuarto de luz a temperatura de 25C
y con fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad y se regaron con 40 ml de agua
destilada estril 2 o 3 veces por semana hasta que los cotiledones emergieron. Se les
coloc una fertilizacin inicial con solucin Hoagland de la solucin con nitrgeno a
todas las plantas. Se escogieron al azar los grupos de 6 plantas de 8 10 cm de
longitud aproximadamente correspondientes para cada tratamiento segn se seala a
continuacin:
1. Control (sin aislado rizobial y sin carbamato) x 6 plantas
2. ES1 (Inoculado con la aislado ES1 sin carbamato) x 6 plantas
3. EV1 (Inoculado con la cepa aislado sin carbamato) x 6 plantas
4. P + ES1 (Inoculado con la aislado ES1 + carbamato) x 6 plantas
5. P + EV1 (Inoculado con la aislado EV1 + carbamato) x 6 plantas
6. Previcur (inoculado con carbamato sin aislado rizobial) x 6 plantas
41

Se aplic 5 ml del pesticida Previcur (ya que fue el que dio mejores resultados tanto en
las pruebas con los rizobios como en la prueba de germinacin de semillas) en su
concentracin original (125 l/ 100 ml H2O) usada en campo para asemejar las
condiciones a las de l, y 24 h despus se inocularon las plantas con los cultivos
rizobiales ES1 y EV1 con 5 ml del inculo del rizobio. A los 8 das se repiti el proceso
pero con 3 ml solo del inculo del rizobio y se mantuvieron las plantas en el invernadero
con temperaturas promedio mnimas de 18C y mximas de 28C durante 50 das.
Estas se distribuyeron por el mtodo de bloques al azar en una matriz 6 x 6 en donde
en cada columna estaba presente un representante de cada tratamiento para que los
resultados no se afectaran por el gradiente de luz (Anexo 10). Las plantas del control y
tratamiento Previcur se regaron una con 50 ml de solucin Hoagland a con nitrgeno
y los dems tratamientos con solucin Hoagland sin nitrgeno y cada 3 das todos los
tratamientos con 50 ml de agua destilada estril. Por ltimo, se desmontaron las
plantas y se midieron las variables a estudiar: longitud de vstago, raz, peso fresco y
peso seco de vstago y raz, nmero, posicin y coloracin de ndulos por planta
(Anexo 12). Adems para el anlisis de nitrgeno foliar fue necesario moler las
muestras de cada vstago en un molino de bola que fue facilitado por el Instituto de
Ciencias Ambientales y Ecolgicas (ICAE) de la ULA (Anexo 13). Seguidamente se
llevaron estas muestras al Laboratorio de Suelos de la Escuela de Geografa de la
Facultad de Ciencias Forestales y Ambientales de la ULA en donde realizaron dicho
anlisis a travs del mtodo Kjeldahl. Por ltimo se realiz el anlisis estadstico para
las pruebas, consistiendo en un ANOVA simple con el programa Statgraphics igual que
en la prueba de germinacin.
En la Figura 8 se muestra un esquema metodolgico para la prueba de nodulacin y

crecimiento de Vicia faba L.
42

Figura 8. Esquema metodolgico para la prueba de nodulacin y crecimiento de Vicia

faba L.
43

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Los carbamatos son sustancias orgnicas utilizadas en su mayora como fungicidas,

Palabras clave: Carbamatos, rizobios, viabilidad, cometabolismo, Vicia faba L.

Key words: Carbamates, rhizobia, viability, cometabolism, Vicia faba L.

2. Autenticacin de los aislados en Macroptylium lathyroides L.

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Tabla 1. Clasificacin de los pesticidas (Ferrer, 2003). 3

Tabla 2. Nombre genrico y comercial de los carbamatos ms

Tabla 3. Descripcin de los pesticidas carbamatos a utilizar (Indice

Tabla 4. Clasificacin de los rizobios nodulantes y bacterias que

Tabla 5. Clasificacin Taxonmica de Vicia faba L. segn Cronquist,

Tabla 6. Pesticidas a usar en los ensayos, composicin qumica y

Tabla 7. Concentraciones de los carbamatos usados en los ensayos. 30

Tabla 8. Concentraciones de los carbamatos para la prueba de

Tabla 9. Concentraciones de los carbamatos a la dilucin para la

Tabla 10. Concentraciones de los carbamatos para determinar la DL50. 35

Tabla 11. Concentraciones de los carbamatos para la prueba de

Tabla 12. Anlisis de suelos de las parcelas cultivadas con Solanum

Tabla 13. Autenticacin de los aislados de los suelos y ndulos en

Tabla 15. Prueba de viabilidad en presencia de carbamatos, del

Tabla 16. Tamao del halo de inhibicin (cm) de crecimiento celular

Tabla 17. Prueba de viabilidad en presencia de carbamatos, del

Tabla 18. Tamao del halo de inhibicin del crecimiento celular

Tabla 19. Utilizacin de carbamatos como nica fuente carbonada

Tabla 20. Utilizacin de carbamatos como nica fuente nitrogenada

Tabla 21. Utilizacin de carbamatos como nica fuente carbonada

Tabla 22. Utilizacin de carbamatos como nica fuente nitrogenada

Tabla 23. Comparaciones mltiples. Pruebas de post hoc (Curvas

Tabla 24. Comparaciones mltiples. Pruebas de post hoc (Curvas

Tabla 25. Comparaciones mltiples. Pruebas de post hoc (Curvas

Tabla 27. ANOVA simple para resultados de germinacin de V. faba

Tabla 28. ANOVA simple para resultados de N de ndulos de V. faba

Tabla 29 ANOVA simple para resultados de peso fresco de ndulos

Tabla 30. ANOVA simple para resultados de peso seco de ndulos de

Tabla 31. ANOVA simple para longitud de vstago de V. faba L. con p

Tabla 32. ANOVA simple para resultados de longitud de raz con p

Tabla 35. ANOVA simple para resultados de peso fresco de la raz de

Tabla 37. ANOVA simple para resultados de anlisis de contenido de

Figura 1. Estructura del cido carbmico (Primo y Carrasco, 1980). 4

Figura 2. Estructura qumica del cido N-metil o dimetilcarbmico

Figura 3. Estructura qumica de algunos carbamatos (Daz y De la

Figura 4. Va propuesta del metabolismo del Carbaryl en las cepas

Figura 5. Ubicacin geogrfica de las parcelas de donde se

Figura 6. Esquema metodolgico para el aislamiento, purificacin,

Figura 7. Esquema metodolgico para la prueba de germinacin n

Figura 8. Esquema metodolgico para la prueba de nodulacin y