Espectrofotometra

Introduccin

La espectrofotometra es uno de los mtodos de anlisis ms usados, y se basa en la

relacin que existe entre la absorcin de luz por parte de un compuesto y su
concentracin. Cuando se hace incidir luz monocromtica (de una sola longitud de onda)
sobre un medio homogneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra
transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a
P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido.

Dependiendo del compuesto y el tipo de absorcin a medir, la muestra puede estar en

fase lquida, slida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro
electromagntico, la muestra es generalmente disuelta para formar una solucin. Cada
sustancia tiene su propio espectro de absorcin, el cual es una curva que muestra la
cantidad de energa radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de
onda del espectro electromagntico, es decir, a una determinada longitud de onda de la
energa radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de radiacin que es distinta a la
que absorbe otro compuesto.

La espectrofotometra estudia los fenmenos de interaccin de la luz con la materia.

En general, cuando una lmpara ilumina cualquier objeto, pueden suceder algunos
fenmenos: La luz puede ser emitida, reflejada, transmitida o absorbida. Desde que
sabemos que la energa no puede ser destruida, la cantidad total de luz debe ser igual al
100%; por lo tanto, cuando un objeto es iluminado, se puede medir cunta radiacin ha
sido reflejada o transmitida y podemos decir entonces cunta fue absorbida, cul es la
cantidad que ha interactuado con el objeto.

La espectroscopia ha jugado una parte importante en el desarrollo de la bioqumica. Se ha

utilizado para medir velocidades de reaccin catalizadas por enzimas, para medir
concentraciones de compuestos, determinar conformaciones estructurales e interacciones
moleculares.

En los aos sesentas y setentas esta tcnica se volvi muy utilizada que fue una
continuacin de la colorimetra. En estas dcadas se hacan anlisis de sustancias
inorgnicas, principalmente metales a niveles de traza. En combinacin con la extraccin
lquido-lquido, se conseguan determinaciones de compuestos de inters.

Las longitudes de onda utilizadas en el laboratorio comprenden a la luz visible y

ultravioleta. Para entender mejor cmo se lleva a cabo el fenmeno de la espectroscopia,
es necesario entender lo que es la radiacin electromagntica y la Ley de Lambert-Beer.

Un espectrofotmetro es un instrumento utilizado para determinar a qu longitud de onda

la muestra absorbe la luz y la intensidad de la absorcin. Aunque varan en el diseo,
todos los espectrofotmetros consisten de una fuente de luz, un selector de longitud de
onda, un contenedor transparente en el cual se deposita la muestra, un detector de luz y
el medidor.
Resumen
Un espectrofotmetro es un aparato electrnico que se utiliza para medir las
proporciones de luz de diferentes longitudes de onda, que son absorbidas y trasmitidas
por una solucin usualmente coloreada.

La luz del sol es una forma de energa conocida como energa electromagntica, tambin
llamada Radiacin que viaja en ondas rtmicas. La distancia entre las crestas de las ondas
electromagnticas se conoce con el nombre de longitud de onda, se representa por una
letra griega llamada lambda y su dimensional se expresa en nanmetros (1 nm = 10^-9m).

La radiacin nos proporciona un espectro electromagntico que posee longitudes de onda

que van desde 10^-5 nm hasta un poco ms de 1,000 m. Este espectro electromagntico
est constituido por los rayos gamma, los rayos X, la energa ultravioleta, la luz visible, la
energa infrarroja, las microondas y las ondas de radio. Los rayos gamma poseen las
longitudes de onda ms cortas (10^-5 a 10^-3 nm), luego los rayos X (10^-3 a 1 nm) y
despus la energa ultravioleta (1 nm a 400 nm).

La luz visible es el segmento de energa ms importante para la vida y posee una banda
estrecha de longitudes de onda que van desde los 400 nm a los 700 nm. Esta radiacin
es conocida como la luz visible porque el ojo humano puede detectarla en la forma de
diversos colores. En el espectro de luz visible el color violeta corresponde al extremo de
longitud de onda ms corta y el color rojo corresponde al extremo de longitud de onda
ms larga.

Los rayos Infrarrojos poseen longitudes de onda que van desde los 700 nm a los 10^6 nm,
la banda de microondas va de 10^6 nm a 1 m y finalmente las ondas de radio van desde
1 m hasta un poco ms de 1000 m.
Marco Terico

La espectrofotometra es una tcnica que mide la interaccin de molculas con la

radiacin electromagntica. La luz que se encuentra en la luz visible y la luz ultravioleta de
los espectros electromagnticos presenta una energa de 150 - 400 kJ/mol. La energa de
la luz es usada para promover electrones de un estado de excitacin a otro. Un espectro
es obtenido cuando la absorcin de luz es medida en funcin de una frecuencia o
longitud.

Molculas con electrones deslocalizados en sistemas aromticos a menudo absorben la

luz a 150-400 nm (ultravioleta) o en la regin visible de 400-800 nm. El espectrofotmetro
es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una
solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una
cantidad conocida de la misma sustancia.

Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser
completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro
visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo.

La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura

de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa

radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la
luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de
onda no absorbida.

Aunque existen muchos tipos de espectroscopia, las ms utilizadas en qumica orgnica

se agrupan en cuatro categoras:

- espectroscopia de resonancia magntica nuclear (RMN)

- espectroscopia de infrarrojo

- espectroscopia de ultravioleta

- espectrometra de masas.

Las molculas orgnicas absorben la radiacin electromagntica en paquetes discretos

de energa, o cuantos. La absorcin se produce solamente cuando la radiacin que incide
sobre la sustancia proporciona el cuanto de energa adecuado. La absorcin de energa
provoca algn tipo de movimiento electrnico o mecnico en la molcula, proceso que
se denomina excitacin. La energa radiante presenta caractersticas ondulatorias. Las
radiaciones aparentemente tan distintas tienen en comn ser radiaciones
electromagnticas y son ondas que viajan a la velocidad de la luz y solamente difieren
unas de otras en su frecuencia o longitud de onda.
La frecuencia de una onda es el nmero de ciclos ondulatorios que pasan por un punto
fijo en un segundo. La frecuencia, representada por la letra griega (nu) se mide
generalmente en hercios. La longitud de onda es la distancia entre dos picos (o dos
valles) cualquiera de la onda. La longitud de onda se representa por la letra griega
(lambda). La longitud de onda y la frecuencia son inversamente proporcionales y se
relacionan mediante la siguiente ecuacin:

Otra forma de describir la frecuencia de la radiacin electromagntica es el nmero de

onda, muy utilizado en la espectroscopia de infrarrojo. Esta unidad se refiere al nmero de
ondas que hay en 1 cm:

Las ondas electromagnticas viajan como fotones que son paquetes de energa sin masa.

La energa de un fotn es directamente proporcional a su frecuencia e inversamente

proporcional a su longitud de onda. Su energa viene dada por la siguiente expresin:

E = h donde es la constante de Planck

Bajo ciertas condiciones cuando una molcula colisiona con un fotn puede absorber la
energa de ste, producindose un aumento de la energa de la molcula en una cantidad
igual a la energa del fotn. El espectro electromagntico es el rango de todas las
frecuencias posibles y va desde las frecuencias de radio ms bajas, hasta las altsimas
frecuencias de los rayos gamma. La siguiente figura muestra las relaciones entre la
frecuencia, la longitud de onda y la energa de las diferentes partes del espectro
electromagntico, que es un espectro continuo. Las posiciones exactas de las lneas
divisorias entre las distintas regiones son arbitrarias. En la parte superior del espectro se
encuentran las frecuencias ms altas, por tanto, las longitudes de energa ms cortas y
energas ms altas. Hacia la parte inferior se encuentran las frecuencias ms bajas, por
tanto, las longitudes de energa ms largas y energas ms bajas.

Las energas en el rango ultravioleta-visible excitan los electrones a niveles de energa

superiores dentro de las molculas.

Las energas infrarrojas provocan las vibraciones moleculares y las energas de

microondas provocan las rotaciones.

Las frecuencias de onda de radio provocan transiciones en el espn nuclear, que son las
que se observan en la espectroscopia de Resonancia Magntica Nuclear (RMN).
Los compuestos pueden absorber energa radiante pasando de un estado energtico a
otro superior. Si registramos la cantidad de energa que absorbe un compuesto en funcin
de la longitud de onda tenemos la espectroscopia. Los espectrmetros son los
instrumentos que registran la absorcin de la radiacin. Un espectrmetro posee una
fuente de radiacin electromagntica de frecuencia adecuada a la regin de estudio. El
aparato est diseado para permitir el paso de radiacin de una longitud especfica a
travs de la muestra. La frecuencia de la radiacin incidente cambia constantemente, y su
intensidad relativa con respecto al haz de referencia se mide en un detector y se registra
sobre un papel. En ausencia de absorcin, el registro es una lnea recta o lnea base. Sin
embargo, cuando la muestra absorbe la radiacin incidente, el cambio de intensidad se
registra en forma de seal, o desviacin de la lnea base. El grfico resultante es el
espectro de la muestra.

La espectroscopia astronmica

La espectroscopia astronmica es la tcnica de espectroscopia usada en astronoma.

Dado que la espectroscopia queda bien descrita en su propio artculo, aqu nos
centraremos en su uso en astronoma. El objeto de estudio es el espectro de la radiacin
electromagntica, incluida la luz visible, que radia desde estrellas y otros objetos celestes.
La espectroscopia se puede usar para averiguar muchas propiedades de estrellas y
galaxias distantes, tales como su composicin qumica y movimiento, mediante efecto
Doppler.
Espectrofotmetro

La palabra espectrofotmetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa

imagen, y de la palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotmetro,
construido mediante procesos avanzados de fabricacin, es uno de los principales
instrumentos diagnsticos y de investigacin desarrollados por el ser humano. Utiliza las
propiedades de la luz y su interaccin con otras sustancias, para determinar la naturaleza
de las mismas. En general, la luz de una lmpara de caractersticas especiales es guiada
a travs de un dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada longitud de
onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es
captada y comparada con la intensidad de la luz que incidi en la muestra y a partir de
esto se calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la
concentracin de la sustancia.

Descripcin del funcionamiento del fotmetro

La luz blanca que emite la lmpara, se hace pasar a travs de un prisma, el cual
descompone la luz, separndola en sus colores constituyentes (segn su longitud de
onda), formando un abanico de colores, como en los experimentos de fsica de la luz. El
espectrofotmetro tiene un mecanismo que modifica la posicin del prisma de acuerdo a
la cifra de longitud de onda que se programa. Para cada cifra programada corresponde
diferente color. El rayo de luz es dirigido hacia una rejilla metlica (monocromador), por la
cual podr pasar la luz del color que en ese momento se haya escogido.
Simultneamente, cuando cambia el color, aparece en la ventana de lectura la longitud de
onda del color que estamos usando.

Despus de la rejilla, est el espacio donde se colocan los tubos de ensayo con las
sustancias que se estn estudiando. El tubo de ensayo (denominado en estos casos
cubeta ptica) recibe un rayo de luz monocromtica que posee una determinada longitud
de onda, en funcin de su color (*Io = luz incidente), con 100% de intensidad.

El contenido de la cubeta ptica (que tendr solvente y soluto) podr absorber alguna
parte de la energa de ese rayo luminoso a su paso a travs de la misma, y la luz que
logre atravesar la solucin (**I = luz emergente), llevar una intensidad menor. Este rayo
ms dbil seguir su curso hasta chocar contra un dispositivo (foto celda o tubo
fotoelctrico) sensible a la cantidad de energa que logra pasar, convirtindola en
electricidad y trasladndola, por medio de un galvanmetro, a una pantalla, donde
aparece la cifra que demuestra la cantidad de energa que logr llegar a la foto celda. Si el
rayo luminoso no hubiera encontrado ningn obstculo en su camino, impactara la foto
celda con toda su potencia y la pantalla mostrara su energa en el 100%. En la figura
anterior se ejemplifica el caso de una sustancia que absorbe la mitad de la energa del
rayo luminoso: en la pantalla veramos la cifra correspondiente al 50%.
Propsito del equipo

El espectrofotmetro se usa en el laboratorio con el fin de determinar la concentracin de

una sustancia en una solucin, permitiendo as la realizacin de anlisis cuantitativos.

Principios de operacin

Como principio bsico se considera que la luz es una forma de energa electromagntica,
que en el vaco tiene una velocidad constante [C] y universal de aproximadamente 3 x 10
m/s. En cualquier otro medio (transparente) por el que pase la luz, su velocidad ser
ligeramente inferior y podr calcularse mediante la siguiente ecuacin:

Dnde:

v = velocidad a travs del medio por el que pasa la luz

n = ndice de refraccin del medio, cuyo valor oscila, por lo general, entre 1,0 y 2,5

La energa electromagntica dispone de una muy amplia gama de longitudes de onda.

Algunos ejemplos se muestran en la siguiente tabla:

La luz, al pasar o interactuar con diversos medios, presenta una serie de fenmenos,
entre los que destacan la reflexin, refraccin, difraccin, absorcin, difusin, polarizacin
y otros que son utilizados en diversos instrumentos y dispositivos. La siguiente tabla
muestra los rangos de longitud de onda en donde se utiliza el espectro luminoso para
realizar pruebas de espectrofotometra.
Con respecto a la interaccin de la luz con la materia, el siguiente esquema ayuda a
entender la complejidad de los fenmenos que ocurren:

Interaccin de la luz con la materia

El esquema muestra que la radiacin incidente [Io] sufre una serie de transformaciones.
Parte de la misma se refleja [Ir], parte se transmite [It], parte se difunde [Id] y parte se
absorbe e incide directamente en fenmenos como la fluorescencia [If]. Los fenmenos en
los que se basa la espectrofotometra son principalmente la absorcin y la transmisin.

Para entender cmo se utilizan, es necesario adicionalmente tener en cuenta la ley de

Beer Lambert.

Ley de Beer Lambert.

Se conoce tambin como ley de Beer o de Beer Lambert Bouguer e identifica la relacin
existente entre la concentracin de la muestra y la intensidad de la luz transmitida a travs
de la misma. Con relacin a la ley en mencin hay implcitos dos conceptos: transmitancia
[T] y absorbancia [A]. La transmitancia [T] es la fraccin de la luz incidente que a una
determinada longitud de onda pasa a travs de la muestra. Se define por la siguiente
relacin:

Dnde:

It = intensidad de la radiacin transmitida

Io = intensidad de la radiacin incidente

El porcentaje de transmitancia [%T] puede expresarse por la siguiente ecuacin:

La concentracin de molculas absorbentes de luz en la muestra es proporcional a la
absorbancia [A] de la muestra. Matemticamente se expresa as:

Dnde:

A = absorbancia medida
= coeficiente de absortividad molar [litros/moles/cm]
l = distancia de la trayectoria recorrida por la luz dentro de la muestra
c = concentracin de la muestra [moles/litros]

La absorbancia [A] se relaciona con la transmitancia [T] mediante la siguiente ecuacin:

El siguiente esquema explica el fenmeno de la absorbancia A:

Fenmeno de absorbancia

Las curvas que se presentan a continuacin muestran cmo vara la absorbancia [A] y la
transmitancia [T] en funcin de la concentracin [C], de acuerdo con la ley de Beer
Lambert, en la que se basa la espectrofotometra.

Grfica transmitancia
Grfica absorbancia

Como conclusin puede inferirse que, a medida que aumenta la concentracin de una
sustancia, la transmitancia disminuye y que, al aumentar la concentracin de la sustancia,
aumenta la absorbancia.

La linealidad de la ley de Beer Lambert se ve afectada, si se presentan las siguientes

condiciones:

1. Corrimientos en el equilibrio qumico de la muestra como una funcin de la

concentracin.

2. Desviaciones en los coeficientes de absortividad, concentraciones mayores de

0,01 M debido a la interaccin electrosttica entre molculas cercanas.

3. Cambios en el ndice de refraccin a altas concentraciones del analito.

4. Difusin de la luz debido a partculas en la muestra.

5. Fluorescencia o fosforescencia de la muestra.

6. Radiacin no monocromtica

Componentes del Espectrofotmetro

El esquema que se presenta a continuacin describe la interrelacin de los diversos

componentes de un espectrofotmetro. Los ms importantes son los siguientes:

1. La fuente luminosa
2. El monocromador
3. El portador de muestras
4. El sistema detector
5. El sistema de lectura
Se recuerda que los componentes mencionados corresponden a los bsicos o generales
de este instrumento y no a los que hayan sido incorporados por diversos fabricantes como
consecuencia del avance tecnolgico. Una breve explicacin de los mismos se encuentra
a continuacin del esquema.

Componentes del espectrofotmetro

Fuente luminosa

Dependiendo del tipo de espectrofotometra, la fuente luminosa puede ser una lmpara
con filamento de tungsteno para luz visible, o una lmpara de arco de deuterio para luz
ultravioleta.

Algunos fabricantes han diseado espectrofotmetros con lmparas intermitentes de

xenn de alta duracin que emiten luz en el rango de la luz visible y ultravioleta. La
lmpara o lmparas vienen montadas de fbrica en una base que permite asegurar una
determinada posicin, para que se mantengan las condiciones de ajuste ptico y enfoque
cuando est en operacin o se requiere reemplazarla. La energa radiante tpica que
emite una lmpara de tungsteno est entre los 2 600 y los 3 000 K (grados Kelvin).

Monocromador

Est compuesto por un conjunto de elementos.

En general, dispone de una rendija o ranura de entrada que limita la radiacin lumnica
producida por la fuente y la confina en un rea determinada, un conjunto de espejos para
pasar la luz a travs del sistema ptico, un elemento para separar las longitudes de onda
de la radiacin lumnica, que puede ser un prisma o una rejilla de difraccin, y una rendija
de salida para seleccionar la longitud de onda con la cual se desea iluminar la muestra.
Las rejillas de difraccin tienen la ventaja de eliminar la dispersin no lineal y son
insensibles a los cambios de temperatura.
Portador de muestras

Est diseado para sostener la muestra que se quiere analizar dentro del rayo de luz de
longitud de onda determinada por el monocromador.

El elemento que contiene la muestra es una celda o cubeta, por lo general, rectangular.
Las celdas o cubetas se fabrican de vidrio, si se requieren efectuar estudios en el rango
de los 340 a los 1 000 nm y de slice, si el anlisis est en el rango comprendido entre los
220 y los 340 nm. Tambin hay celdas en materiales plsticos como estireno o
poliestireno. El portador de muestras lo disean los fabricantes de acuerdo al tipo de
espectrofotmetro y de muestra a analizar, por ello se encuentran portadores de muestra
con microceldas, aunque tambin tubos de ensayo y otras variantes como las celdas de
flujo contino.

Sistema Detector

El sistema de deteccin puede estar diseado con fotoceldas, fototubos, fotodiodos o

fotomultiplicadores.

Esto depende de los rangos de longitud de onda, de la sensibilidad y de la velocidad de

respuesta requeridas. El sistema de deteccin recibe la energa lumnica proveniente de
la muestra y la convierte en una seal elctrica proporcional a la energa recibida. La
seal elctrica puede ser procesada y amplificada, para que pueda interpretarse a travs
del sistema de lectura.

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