CONDICIONES AMBIENTALES DE CRECIMIENTO DE

ALGAS

ABSTRACT
Chlorella sp, is an ellipsoidal green algae, which grows in the form of simple
cells. It belongs to the Chlorophyta division and the Chlorophyceae class. The
objective of this work was to identify the culture medium that would allow a
maximum growth of Chlorella sp, ten culture media were studied with the
presence of: light, oxygen, carbon, nitrogen and salts; glucose, yeast extract,
NaCl, distilled water and Chlorella at different concentrations. Many factors
contribute to the optimal development of microalgae cultures, some of which
affect growth characteristics such as the lack of any of the aforementioned.
Microalgae require growth, as already mentioned, water, light, CO2, and
mineral salts, among which are mainly some source of nitrogen such as
nitrate or ammonium and a source of phosphorus that is usually some
inorganic phosphate. Knowing that; The culture medium is an aqueous
solution that transports the inorganic nutrients that the microalgae need for
their growth. The supply of culture medium and nutrient concentrations must
be coupled with the production of biomass so that they are supplied in
sufficient quantity so that there is never a limitation that would result in a
decrease in biomass productivity or even some dysfunction of the crop as the
photo-inhibition.
The main nutrients for its development are:
- Water: besides transport, it is a nutrient that supplies the electrons
needed to reduce CO2.
- Carbon: normally supplied separately as CO2, although it can be
supplied as bicarbonate.
- Oxygen: supplied by both H2O and CO2. However, it is only the CO2
oxygen that is incorporated into the biomass.
- Nitrogen: the fourth most important element by volume since it is part
of the proteins and nucleotides of biomass. Supplied as NO3- or NH4 +.
Additionally there is a large amount of other nutrients that may be necessary
depending on the species. Depending on the quantity in which they are
needed, they are usually classified as macronutrients or micronutrients, since
it is important for the preparation of the medium.
- Macronutrients: salts such as sodium and magnesium chloride,
sulfates and calcium salts. They can appear in concentrations of up to 30 g /
L when it comes to marine species and up to 100 g / L in halophilic microalgae.
These macronutrients are not consumed in the generation of biomass or are
incorporated to a very small extent. Its main objective is to maintain the
osmotic pressure and electrolyte balance.
 - Micronutrients: They are elements that act as cofactors of enzymes
and appear in very small quantities, sometimes of micrograms per liter. If they
are put in excess they can act as a poison, as is the case of copper, which is
a known algaecide.

RESUMEN
Chlorella sp, es un alga verde de forma elipsoidal, la cual crece en forma de clulas
simples. Pertenece a la divisin Chlorophyta y a la clase de las Chlorophyceae. El
objetivo de este trabajo fue identificar el medio de cultivo que permitiera un mximo
crecimiento de Chlorella sp, se estudiaron diez medios de cultivo con presencia de:
luz, oxigeno, carbono, nitrgeno y sales; glucosa, extracto de levadura, NaCl, agua
destilada y Chlorella a diferentes concentraciones. Muchos factores contribuyen
para el desarrollo ptimo de los cultivos de microalgas, algunos de stos afectan las
caractersticas del crecimiento como la falta de alguno de los mencionados
anteriormente. Las microalgas requieren para su crecimiento, como ya se ha dicho,
agua, luz, CO2, y sales minerales entre las que se encuentran principalmente
alguna fuente de nitrgeno como nitrato o amonio y una fuente de fosforo que suele
ser algn fosfato inorgnico. Conociendo que; el medio de cultivo es una disolucin
acuosa que transporta los nutrientes inorgnicos que necesitan las microalgas para
su crecimiento. El suministro de medio de cultivo y las concentraciones de los
nutrientes deben estar acoplado con la produccin de biomasa de forma que se
suministren en cantidad suficiente para que nunca se produzca una limitacin que
tendra como consecuencia una disminucin en la productividad de biomasa o
incluso alguna disfuncin del cultivo como la foto-inhibicin.
Los principales nutrientes para su desarrollo son:

- Agua: adems de transporte, es un nutriente que suministra los electrones

necesarios para la reduccin del CO2.

- Carbono: normalmente suministrado aparte como CO2, aunque puede

suministrarse como bicarbonato.

- Oxgeno: suministrado tanto por el H2O como por el CO2. Sin embargo,
es slo el oxgeno del CO2 el que se incorpora en la biomasa.

- Nitrgeno: el cuarto elemento ms importante por volumen ya que forma

parte de las protenas y nucletidos de la biomasa. Suministrado como NO3- o
NH4+.

Adicionalmente existe una gran cantidad de otros nutrientes que pueden ser
necesarios dependiendo de la especie. Segn la cantidad en la que se necesiten
se suelen clasificar como macronutrientes o micronutrientes, ya que es importante
para la preparacin del medio.
 - Macronutrientes: sales como cloruro de sodio y magnesio, sulfatos y
sales de calcio. Pueden aparecer en concentraciones de hasta 30 g/L cuando se
trata de especies marinas y hasta de 100 g/L en microalgas halfilas. Estos
macronutrientes no se consumen en la generacin de biomasa o se incorporan en
muy pequea medida. Su objetivo principal es mantener la presin osmtica y el
equilibrio de electrolitos.

- Micronutrientes: Son elementos que actan como cofactores de enzimas

y aparecen en muy pequeas cantidades, a veces de microgramos por litro. Si se
ponen en exceso pueden actuar como un veneno, como es el caso del cobre, que
es un conocido alguicida.

1. OBJETIVOS
 GENERAL.

Identificar los medios que condicionen un mejor crecimiento o produccin de

microalgas chlorella sp y optimice su capacidad de sintetizar los nutrientes
y viabilidad de las condiciones externas e internas.

ESPECIFICOS.

Cultivar Chlorella bajo condiciones ambientales de laboratorio.

Analizar las caractersticas de desarrollo y crecimiento coloracin de chlorella

Estudiar las afectaciones que sufren las microalgas en su crecimiento cuando

existen falta de algn nutriente.

I. INTRODUCCION
Las microalgas son microorganismos unicelulares que tienen capacidad de realizar
la fotosntesis, son capaces de generar biomasa orgnica a partir de CO2 y luz,
usando el agua como fuente de electrones y transformndola a O2; usan para su
crecimiento la luz como fuente de energa y el CO2 como fuente de carbono y
nutriente. Las algas tienen o necesitan condiciones especficas nitrogenadas para
su desarrollo como lo es el nitrato, amonio o aminocidos.
Las microalgas son organismos fotosintticos, son imprescindibles en el
mantenimiento de la vida en la tierra, ya que nos proporcionan compuestos
orgnicos reducidos y oxigeno que es primordial para el sostenimiento de la vida en
la tierra. Las microalgas tienen una composicin bioqumica compleja debido a la
presencia del aparato fotosinttico que le proporciona una alta pigmentacin y
componentes como citocromos y cidos poliinsaturados de cadena larga esto
proporciona un elevado contenido de factores de alto valor como carotenoides
astaxatina como captadores de CO2 y asimiladoras de nitrgeno adems de ser
una fuente sostenible de biocombustible y biofertilizantes. La caracterstica mas
importante de las microalgas es que crecen rpidamente y tienen el potencial de
generar una gran cantidad de biomasa en un tiempo relativamente corto.
Esta plasticidad metablica les permite adaptarse a diferentes ecosistemas y
procesos biotecnolgicos, generando biomasa que puede ser usada en la
produccin de alimentos, concentrados, compuestos bioactivos, biocombustibles,
en la biorremediacin y la produccin de biofertilizantes. Las algas pueden estar
presentes sobre la vegetacin, en el aire, en el agua y en el suelo. Sus esporas
microscpicas se introducen continuamente en las piscinas y en otros depsitos de
agua debido al viento, a las tormentas de polvo, la escorrenta de la lluvia, etc.
Crecen rpidamente en aguas estancadas cuando se exponen a la luz del sol y a
temperaturas por encima de 4 grados Celsius. Pueden formar limo perjudicial y/u
oloroso. Pueden perturbar la filtracin y aumentar mucho la demanda de cloro. Los
fosfatos y nitratos en el agua estimulan su crecimiento.
Funcin de los nutrientes presentes en el desarrollo de la experimentacin
planteada
HIDRGENO

El hidrgeno es una gran parte de la materia viva en general y de la biomasa

microalgas en particular, especialmente si se mide en base molar.

El origen de la mayor parte del hidrgeno presente en la biomasa es el agua. sta

es la fuente de electrones que permiten reducir el NADP+ a NADPH creando
poder reductor para ser usado posteriormente en el ciclo de Calvin.

La rotura del agua tiene lugar en el fotosistema II y la reaccin da como

subproducto el oxgeno molcula que liberan al aire todas las plantas, algas y
microalgas.

Es muy importante que nunca falte agua para que no se detenga el PSII. Sin
embargo, puesto que el agua es una parte tan importante del medio de cultivo (es
una disolucin acuosa), en la prctica nunca se agota y podemos
despreocuparnos del agua.

CARBONO

Las microalgas foto-autotrficas, por definicin, tienen como nica fuente de

carbono al CO2. El CO2 puede estar en el medio como alguna sal derivada, tal
como carbonato o bicarbonato, pero su reduccin e incorporacin a la biomasa en
el ciclo de Calvin siempre se produce teniendo como sustrato al CO2molecular.

El carbono constituye aproximadamente un 50% de la biomasa en peso medido en

base seca libre de cenizas.

El CO2 es condensado con la ribulosa 1,5 difosfato, un azcar de 5 carbonos

activada con grupos fosfato. El producto de la reaccin son dos molculas de
fosfoglicerato, por lo que el resultado neto de la reaccin es que se tiene un
carbono orgnico ms (pasamos de 5 carbonos orgnicos en la ribulosa 1,5
bifosfato a seis en las dos molculas de fosfoglicerato).

Esta reaccin es catalizada por un enzima llamado RuBisCO (ribulosa 1,5

difosfato carboxilasa) que es la que condensa la ribulosa con el dixido de
carbono. Esta enzima es probablemente la ms abundante sobre la corteza
terrestre y es literalmente la que produce todos los alimentos que sostienen a
animales, bacterias, hongos ...etc; es decir, a todos los seres vivos.

Es til sealar que la RUBISCO adems de ser una carboxilasa es adems una
oxigenasa. Es decir, que tambin cataliza la adicin de oxgeno a la Rubis
produciendo unos intermedios metablicos bastante intiles e indeseables, en algo
que puede considerarse un cortocircuito de la fotosntesis denominado
FOTORRESPIRACIN.

Esta reaccin es lenta en la naturaleza, ya que la afinidad de la Rubisco por el

CO2 es mucho ms alta que por el O2. Sin embargo, en foto-biorreactores la
actividad fotosinttica es intensiva y el elevado consumo de CO2 acompaado por
una alta generacin de O2 pueden provocar el agotamiento del primero y la
sobresaturacin del segundo. En estas circunstancias la foto-rrespiracin se hace
importante y se produce una importante prdida de productividad.

Por tanto, es necesario mantener siempre un suministro de CO2 suficiente, bien

acoplado a la generacin de biomasa pero sin gran exceso para evitar prdidas
antieconmicas, y evacuar eficientemente el O2 generado de manera que se
mantenga la menor concentracin posible.

NITROGENO

El nitrgeno constituye una parte relativamente importante de la biomasa,

aproximadamente el 5% (masa sobre peso seco), ya que entra en la composicin
de protenas y nucletidos.

Las principales fuentes de nitrgeno son:

- Nitrato (NO3-) : es, en general, la forma mejor absorbida, pese a que en

esta especie el nitrgeno est muy oxidado (+5) y debe ser reducido hasta el
estado de oxidacin del grupo amino (-NH2) que es como se encuentra en las
proteinas (-3). Esto consume una gran cantidad de poder reductor (NADPH) y
eleva el pH al consumir H+. El nitrato, normalmente suministrado como nitrato
sdico, es bien tolerado en concentraciones muy altas, del orden de varios gramos
por litro, si bien en base molar el contenido en nitrgeno es relativamente bajo.

- Amonio (NH4+) : el amonio tambin es absorbido por muchas especies

como fuente de nitrgeno aunque resulta ligeramente txico para otras. En general
se acepta que es bien tolerado en concentraciones de hasta 50 mg/L, aunque
algunas especies aguantan concentraciones sustancialmente ms altas. El amonio
como nutriente tiene gran importancia en el tratamiento de aguas residuales.

- Aminocidos y urea : son otras fuentes potenciales con un estado de

reduccin favorable (-3) aunque son poco usados y no presentan ventajas
significativas y s un coste sustancialmente ms elevado.
 - Nitrgeno molecular (N2) : Algunas cianobacterias, como Anabaena, son
capaces de fijar el nitrgeno de la atmsfera gracias a una clulas especiales
denominadas heterocitos. A la derecha puede ver un filamento de Anabaena con
un heterocito en el centro. Estas cianobacterias tienen la ventaja de no necesitar
nitrgeno en el medio ya que lo cogen de la atmsfera. Al carecer de N en el
medio, los cultivos son resistentes a invasiones aunque su crecimiento es lento.

OXGENO

El caso del oxgeno es trivial.

Aunque es una parte muy importante de la biomasa, est presente tanto en el

agua como en el CO2, por lo que no es necesario suministrarlo de otra manera.
De hecho tanto el CO2 como el agua contienen ms oxgeno que carbono e
hidrgeno respectivamente. l oxgeno que se incorpora a la biomasa es el que de
la molcula de CO2. El que se libera como O2 es el de la molcula de agua.

Rendimiento estimado y clculo de necesidades de nutrientes

Conociendo la composicin de la biomasa y el contenido en nutrientes de un
medio, es posible calcular la concentracin de biomasa que se puede obtener de
una determinada frmula.

De forma similar, si se dese alcanzar una concentracin final de biomasa

determinada, es posible calcular la concentracin de nutrientes necesaria que
habra que poner inicialmente o, si estamos trabajando en continuo, la
productividad deseada permite calcular la tasa de entrada necesaria (caudal de
medio por concentracin de nutriente).

El proceso es sencillo:

- Se determina cual es el nutriente limitante en el medio. En la mayora de

los casos es el nitrgeno.

- Se calcula el contenido en nutriente limitante del medio utilizando la

concentracin de ste y la estequiometria del compuesto.

- Usando la composicin de la biomasa, se establece una proporcin que

nos da la concentracin de biomasa que contendr ese nitrgeno una vez
metabolizado.

- O, viceversa, para una concentracin de biomasa esperada, se calcula la

concentracin de N que necesitara en el medio y con la estequiometra de las sal
se calcula la concentracin necesaria de nutriente.
Hagamos algunos ejemplos resolviendo las siguientes cuestiones (debajo).
Supongamos que la biomasa contiene un 5% en peso de N en todos los casos y
que el N es el nutriente limitante.

II. MATERIALES
Microscopio
10 frascos de vidrio con sus respectivas tapas.
Agua destilada.
NaCl.
Extracto de levadura.
Glucosa.
Suplemento nutricional.
Centrifuga.
Espectrofotmetro.
Potencimetro.
Celdas o cubetas.
Pipeta Pasteur.
Jeringas.
Tubos de ensayo.
Caja negra.
Motor de oxgeno.
Manguera de 1 (1 metro).
Cinta de enmascarar.
Rotuladores.

III. METODOLOGIA
Cultivo de microalga.
Chlorella spp. Adquirida por ayuda del docente Deivis Gutierrez. Cultivada a
temperatura de (28 a 34C), durante (21 das).
 Se usaron 10 frascos de vidrio de aproximadamente de 237ml (altura de 17 cm
x dimetro de 17,5 cm). En el cual primero se esterilizo en el autoclave durante
dos horas, con el fin de eliminar cualquier microorganismo del frasco que pudiera
afectar el cultivo. Se le agrego 150 ml de agua destilada, a 7 frascos
respectivamente y a su vez nutrientes tales como (glucosa, NaCl y extracto de
levadura) a los 3 frascos restantes se les agrego 195 ml de agua destilada los
cuales seran nuestra muestra en blanco, en el cual se mostrara la diferencia de
crecimiento de microalgas entres las muestras. Y por ltimo se le adiciono la
Chlorella como tipo de alga. Con suministro de aire continuo por burbuje,
Expuestas a la luz solar y a los nutrientes del medio agregado.
Mejoramiento del cultivo.
Con fin de aumentar el nivel de biomasa se plantearon micro cultivos
mixotrficos con base en diferentes concentraciones de oxgeno, glucosa, luz,
sales minerales, y nitrgeno (extracto de levadura). Las concentraciones se
manejaron dependiendo el tratamiento, los cuales se especifican en la tabla 1 y
2. Con el fin de obtener datos ms especficos, se tomaron muestras sin agregar
el alga chlorella spp, como muestras en blanco y se tomaron resultados con base
a esta.

X: NO LLEVA
O: SI LLEVA
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
LUZ X O O O O X O O X X
OXIGENO O X O O O X O O X O
CARBONO O O X O O X O X O X
NITROGENO O O O X O X O X O O
SALES O O O O X X O X O O
Tabla 1: diseo experimental para el medio de cultivo con nitrgeno, carbono, luz,
sales, oxigeno.
TRATAMIENTOS: SIN OXIGENO CON OXIGENO
GLUCOSA (gr). 1,25 0,95
EXTRACTO DE 0,75 0,57
LEVADURA (gr).
NaCl (gr). 1,25 0,95
AGUA DESTILADA (ml). 195 150
CHLORELLA spp (ml). 50 38,5
SUPLEMENTO (ml). 2 2
Tabla 2: Diseo experimental para el medio de cultivo con los nutrientes en
diferentes concentraciones.
 A partir de las diferentes concentraciones podemos deducir que se crea un micro
clima para el cultivo de la chlorella spp.
Cuantificacin de la biomasa.
Potencimetro: Al momento de sacar las muestras al laboratorio lo primero que
se hizo fue medir el pH de cada cultivo, donde se neutralizaba el pH en agua
destilada, despus se meda la muestra y se tomaba el dato para saber si creca
en un medio alcalino, neutro o acido. As mismo, antes de seguir con las dems
muestras se esterilizaba con agua destilada y se segua el mismo procedimiento
con cada uno de los tratamientos.
Espectrofotometra: Se encendi el espectrofotmetro y se dej estabilizar por
un determinado tiempo, posteriormente se tom una cubeta para
espectrofotmetro y se lav con agua destilada, luego se sec la cubeta por
fuera con papel absorbente suave, teniendo el cuidado de no rayar el material ni
dejar huellas o partculas en la superficie que puedan influenciar en el resultado.
En el ajuste de blanco: Se llen una cubeta con el medio de cultivo
estril y con la medicin de 420nm y 520nm donde se meda
primeramente el color y luego la biomasa, comparndola con el medio de
cultivo de cada tratamiento en otra cubeta (limpia y seca) donde se meda
la absorbancia y al finalizar de cada proceso se lav y se sec para que
este no se afectara en los registros.
Centrifuga: Se obtuvieron en 10 tubos de ensayos una muestra de 5ml del
medio de cultivo de algas, donde en 30 Rev/min durante 5 minutos,
obtendramos la sedimentacin de la biomasa, y observaramos si a medida que
iban pasando los das creceran las microalgas, si haba aumento o disminucin
de la biomasa.

IV. ANALISIS DE RESULTADOS

Como se pudo observar en los diferentes estudios realizados a las muestras, las
algas son organismos los cuales pueden verse afectadas por las condiciones
externas que lo rodean como (la luz, los nutrientes, el oxgeno y la cantidad de
carbono).
 Estos son fundamentales para un buen desarrollo de estos organismos, la falta de
alguno de ellos puede llevar a una falencia en su desarrollo como se vio en las
muestras que alguna de estas no se desarrollaron de la mejor manera, por
alteraciones en sus componentes como es el caso de los tratamientos (1, 2, 3, 5, 7,
9 y 10) que por la coloracin parda obtenida por el extracto de levadura afectaron la
entrada de luz y esto causo un bajo crecimiento, he incluso se podra llegar a decir
que fue nulo, no obstante la falta de luz pudo llevar a la muerte de las microalgas
puesto que estas necesitan la luz para hacer su proceso de fotosntesis y de ah
tambin se podra decir que provena su fuerte olor por la descomposicin de las
algas muertas y/o fermentacin de la levadura fermentacin, produccin de CO2.
En los tratamientos (4, 6, 8 y el caso regular del 2) donde la entrada de luz era
prcticamente directa es decir envases translucidos el crecimiento era favorable y
el olor era mnimo ya que los procesos de la fotosntesis eran estables, y esto
ayudaba a un buen desarrollo de los organismos que se encuentran en su interior.
Por otra parte los diferentes aparatos del laboratorio como el Espectrofotmetro,
Centrifuga, Potencimetro nos permiten comparar cada uno de los tratamientos,
los efectos que tienen de acuerdo a su composicin o preparacin tanto como el
color, la biomasa, el PH, y la temperatura.
03- DE OCTUBRE 2017
REGISTRO 1 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Marron Marron Marron
COLOR Dorado Blanco Dorado Blanco Dorado Blanco dorado Blanco Pardo Pardo
OLOR - - - - - - - - - -
PH 7 7 7 7 6 7 7 7 7 7
420,0 nm <-0,1A <-0,1A <-0,1A 0,020A -0,050A 0,019A -0,076A 0,027A -0,059A <-0,1A
540,0 nm <-0,1A <-0,1A -0,031A 0,021A -0,093A 0,014A -0,021A 0,016A -0,082A -0,065A

CENTRIFUGA 30 Rev/min 5 min

OBSERVACIONES: En su primer estudio: Su olor fue normal, y su color variaba

depende a su tratamiento, debido a que la levadura afectaba la entrada de la luz.
Su PH estaba neutro, y se observ poca sedimentacin de partculas de biomasa.

06 OCTUBRE 2017
REGISTRO
2 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
COLOR
OLOR SUAVE S S S S S S S S
PH 5,05 5,12 7,35 6,72 5,05 6,72 4,79 6,99 5,53
420,0 nm <-0,1A 0,833A 1,493A 0,346A 1,699A <-0,1A 0,293A <-0,1A
<-0,1A
540,0 nm -0,047A 0,557A 0,291A 0,171A <-0,1A <-0,1A <-0,1A <-0,1A
<-0,1A
Presencia
de nata,
Presencia Presencia Manto Mayor mayor
de Present de nata verde, Presencia Manto presencia Manto turbiedad
costras gas, nata; mayor poco gas; de nata verde y de nata y verde y menor
mayor menos turbiedad menor mayor poca costras poca presencia
turbiedad. turbiedad. y gas. turbiedad. turbiedad. turbiedad. pequeas. turbiedad. de gas.
OBS

VALOR PH -CHLORELLA
10

0
M1 M2 M3 M4 M5
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
 TURBIEDAD MEDIDA CON EL ESPECTROFOTOMETRO A 420,0 nm.
2.5

1.5

0.5

0
M1 M2 M3 M4 M5

-0.5

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10

CRECIMIENTO DE LA BIOMASA MEDIDA EN ESPECTROFOTOMETRO A

540,0 nm.
2

1.5

0.5

0
M1 M2 M3 M4 M5

-0.5

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
 V.
VI. CONCLUSION
VII. BIBLIOGRAFIA
https://w3.ual.es/~jfernand/ProcMicro70801207/tema-1---generalidades/1-3-
nutrientes.html
http://www.fao.org/docrep/009/y5720s/y5720s07.htm
http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/1251/Capitulo6.pdf
http://www.scielo.org.co/pdf/rori/v16n1/v16n1a02.pdf
http://www.fao.org/docrep/field/003/ab473s/AB473S02.htm
http://repository.uamerica.edu.co/bitstream/20.500.11839/6035/1/1014249411-
2017-I-IQ.pdf