UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUMBES

MAESTRA DE BIOTECNOLOGA MOLECULAR

GUA DE PRCTICA
14 de Noviembre 2017.

Extraccin de Protenas y Electroforesis en geles de Poliacrilamida.

Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en la clula, ellas constituyen
ms del 50% del peso seco de la clula. Cada tipo celular, tiene un rol especfico
determinado por su composicin proteica. Esta composicin depende del conjunto de genes
que se estn activando y esto est relacionado directamente con las seales que recibe la
clula, de su micro ambiente y de las caractersticas celulares que le son propias.
Esta expresin diferencial de protenas puede ponerse en evidencia mediante una
electroforesis en gel de poliacrilamida. Para esto es necesario extraer las protenas a partir
de las clulas que constituyen los tejidos u rganos. Los mtodos ms utilizados se basan
esencialmente en la homogenizacin de los tejidos y la destruccin de los lmites celulares
por medio de diferentes procedimientos mecnicos y/o qumicos. Obtenindose lo que se
denomina extracto crudo, si es necesario se pueden realizar centrifugaciones diferenciales
para obtener fracciones subcelulares o para aislar organelos especficos. Bsicamente, las
protenas asociadas a membrana quedarn en el pellet y las solubles en el sobrenadante.

Espectrometra de masas MALDI-TOF/TOF

MALDI-TOF/TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time-Of-Flight) es una

tcnica de ionizacin suave utilizada en espectrometra de masas para el anlisis de
pptidos e incluso protenas enteras hasta un cierto tamao. Los pptidos o protenas son
ionizados por la incidencia de un lser sobre la muestra. La ionizacin se favorece por la
mezcla del material proteico con una matriz slida, generalmente el cido alfa-ciano-4-
hidroxicinmico. En este tipo de ionizacin los pptidos toman o pierden un nico protn
(z=+1). En un primer anlisis de masas (MS) se determina el valor m/z de los pptidos, y
algunos de estos son seleccionados de forma individual, aislados y fragmentados. Los
fragmentos generados se separan y analizan en un segundo anlisis de masas, obteniendo
el espectro de fragmentacin o MS/MS de cada pptido, que contiene informacin tanto de
la masa del pptido precursor como de la secuencia de aminocidos de este. Los
espectrmetros de masas de tipo MALDI TOF/TOF son muy utilizados para identificar
protenas por varias razones: son altamente sensibles, cuentan con un elevado poder de
resolucin y son capaces de medir con excelente exactitud la masa. La aplicacin de la
tcnica MALDI TOF/TOF a la Protemica, junto con la disponibilidad de bases de datos y
el desarrollo de herramientas informticas ha supuesto un gran avance en la identificacin
de protenas

PROTOCOLO DE EXTRACION DE PROTEINAS SOLBLES DE BACTERIAS

Ciudadela Universitaria Salvador Allende, Av. Kennedy y Delta. Facultad de Ciencias Mdicas, Edificio Administrativo, 2do. Piso alto. Telf: 2282665
Concepto Azul, Ciudadela Vernaza Norte, Mz 10, V34. Telefax: 2284615/2284066/ Guayaquil
 Centrifugar los cultivos bacterianos 10000 rpm por 10 minutos
Eliminar el sobrenadante.
Congelar el sedimento celular 30 minutos en -20 c .
Adicionar 100ul de buffer lisis nativo (conteniendo lyzosyme benzonase)
Incubar en hielo 30 minutos (en nevera -4c ).
Homogenizar por inversin suave cada diez minutos.
Centrifugar 14000 g por 30 minutos a 4c.
El sobrenadante contiene la fraccin soluble de la protena de clulas
bacterianas.
Mezclar 30ul de proteina y 20ul de buffer loading protein incubar en bao
seco a 95 c por 5 minutos enfriar y cargar en el gel
Buffer lisis nativo 10ul de lyzosyme,1 ul de benzonase volumen final 1ml

PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA GELES SDS PAGE

SOLUCIN MIX DE ACRILAMIDE 30%:

REACTIVO CANTIDAD VOLUMEN CONCENTRACIN

Acrilamide 73.00 gr 250ml 29.2%

Bis acrilamide 2.00 gr 250ml 0.8%

Agua BD 250ml 250ml

Para pesar el Bis acrilamide se tiene que tomar las medidas de prevencin
porque es neutoxico.

SOLUCIN DE FIJACIN:

REACTIVO CANTIDAD VOLUMEN CONCENTRACIN

Metanol 500ml 1000ml 50%

cido actico 100ml 1000ml 10%

Agua BD 400ml 1000ml 40%

SOLUCIN DE LAVADO:

REACTIVO CANTIDAD VOLUMEN CONCENTRACIN

Metanol 450ml 1000ml 45%

cido actico 100ml 1000ml 10%

Agua BD 450ml 1000ml 45%

SOLUCIN DE TINCIN:

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 REACTIVO CANTIDAD VOLUMEN CONCENTRACIN

Metanol 100ml 200ml 50%

cido actico 2ml 200ml 10%

Azul de coomasin 0.2gr 200ml 0.1%

Agua BD 98ml 200ml

PREPARACIN DE BUFFER TANK 5X:

REACTIVO CANTIDAD VOLUMEN CONCENTRACIN

Tris 30.28gr 2L 124mM

Glycina 144.13gr 2L 960mM

SDS 10.00gr 2L 0.5%

Agua BD 2 litros 2L

PREPARACIN DE AGUA SATURADA CON BUTANOL:

REACTIVO CANTIDAD

Butanol 50ml

Agua BD 5ml

PREPARACIN DEL APS(PERSULFATO DE AMONIO):

REACTIVO CANTIDAD CONCENTRACIN

Persulfato de Amonio 0.1gr 10%
Agua BD 1ml

NOTA: el APS se prpara en el momento de preparacin del Gel.

PREPARACIN DEL BUFFER LOADING PROTEIN:

REACTIVO CANTIDAD VOLUMEN CONCENTRACIN

1M Tris pH (6.8) 1.25ml 10ml 125mM

10% SDS 4.00ml 10ml 4%
glycerol 2.00ml 10ml 20%
Azul de bromofenol 0.002gr 10ml 0.02%
DTT 0.31gr 10ml 200mM
Agua BD 2.75ml 10ml

NOTA: Se almacena a -20C en aliquotas de 0.5ml.

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 SOLUCIONES PARA PREPARACIN DE GELES SDS-PAGE:

Gel de alineamiento

REACTIVOS PARA PREPARACIN

1 30% de mix de acrilamida.
2 1M Tris pH 6.8.
3 10% SDS.
4 10% APS.
5 TEMED.
6 Agua Bidestilada.

Gel separador X%

REACTIVOS PARA PREPARACIN

1 30% de mix de acrilamida .
2 1.5M Tris pH 8.8.
3 10% SDS.
4 10% APS.
5 TEMED.
6 Agua Bidestilada.

NOTA: El agua Bidetilada se autoclava para preparar todas las soluciones

que se preparan para el Gel SDS-PAGE.

PREPARACIN DE GEL DE ALINEAMIENTO (stacking o apilamiento)

Solucin Stacking:

1ml 2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 8ml 10ml

Agua Bidestilada 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8
30% Mix Acrila. 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7
1 M tris ph 8.8 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 1.0 1.25
10% SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1
10% APS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1
TEMED 0.001 0.002 0.003 0..004 0.005 0.006 0.008 0.01

PREPARACIN DE GEL DE SEPARACIN (de resolucin)

Concentracin al 12%:

5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml

Agua Bidestilada 1.7 3.3 5.0 6.6 8.3 9.9 13.2 16.4
30% Mix Acrila. 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 20.0
1.5M tris ph 8.8 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10% APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02

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 PROTOCOLO DE DECOLORACIN DE LAS BANDAS DE GEL TEIDAS CON
AZUL DE COOMASSIE SEGN SHEVCHENKO
Reactivos a usar:

REACTIVO
100mM de bicarbonato de amonio
Acetonitrilo Puro

Procedimiento:
Se agrega 100ul de 100mM de bicarbonato de amonio/Acetonitrilo
(V/V).
Se incuba durante 30 minutos vortexsiando ocasionalmente a
temperatura ambiente.
Se retira el sobrenadante quedando solo la pieza del gel y agregar
500ul de Acetonitrilo e incubar a temperatura ambiente vortexsiando
ocasionalmente hasta que la pieza del gel se torne de color blanco y
se encojan y eliminar el Acetonitrilo.

NOTA: Las muestras pueden ser almacenadas a .20C hasta ser digeridas en un
futuro y pueden estar algunas semanas.

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