MATERIALES Y METODOS

Aislamiento de Hongos Degradantes de AFB1

Para el aislamiento fngico, se utiliz Agar DRBC (Diclorn-Rosa bengala-Cloranfenicol) (BD

Difco). Cada aislamiento se transfiri en agar de dextrosa de patata (PDA) y se prepararon
suspensiones de esporas con solucin de Tween 80 al 0,05%. Las suspensiones de esporas
fngicas se almacenaron en una solucin de glicerol al 20% a -20C hasta su uso. El medio para
determinar la capacidad de degradacin de AFB1 fue el medio Soytone-Czapek (SC).

AGAR BD DIFCO

Tradicionalmente, se ha utilizado agar dextrosa de patata para una cuantificacin general de

hongos. Sin embargo, este medio no presenta una fuente nutritiva adecuada y puede inhibir la
recuperacin de las clulas daadas debido a su bajo pH (3,5) [15]. Ms recientemente, los
medios suplementados con antibiticos y colorantes, como el diclorano rosa de bengala y
cloranfenicol [10], surgi como una alternativa ms eficiente. Estos medios muestran un efecto
menos txico a las clulas daadas, son ms eficaces para inhibir el desarrollo bacteriano y el
uso para inducir una menor cantidad de partculas de alimentos precipitacin debido a su mayor
pH (5-6) [15]. Rutinariamente, dicloran rosa de bengala se ha aplicado con xito para controlar
la tasa de diseminacin de las especies de hongos, lo que limita la rpida propagacin de
zygomycetes en la superficie de la placa [10]. Posteriormente, se introdujeron medios con
actividad reducida de agua (Aw), como el dicloran glicerol agar 18% (Aw 0,95), para una
cuantificacin general de hongos moderadamente xerfilos, aquellos con crecimiento fastidioso,
que en un medio con actividad tradicional de agua Aw 0,99) puede tener su crecimiento inhibido
debido al rpido desarrollo de otras especies [9].

TWEEN 80 CONTEO DE ESPORAS- concentracin de esporas

MEDIO SC: medicin del crecimiento de hongos filamentosos. Agar Czapek-Dox (modificado): En
este medio el hongo desarrolla colonias afieltradas con una coloracin rosada que se va
intensificando a medida que pasan los das, tomando un color rosado intenso casi naranja por
el reverso de la colonia, con bordes filamentosos. Medio para el cultivo de hongos y bacterias
capaces de utilizar el nitrato de sodio como nica fuente de nitrgeno.

Para identificar la capacidad de degradacin, los aislamientos fngicos se cultivaron en 50 ml de

medio SC que contena 40 g / l de AFB1 despus de inocular 105 esporas de hongos. El cultivo
se incub a 25 C con agitacin a 130 rpm.
AFB1 Anlisis de Biodegradacin por TLC

Para el anlisis cualitativo de la biodegradacin de AFB1, se realiz un anlisis de TLC. AFB1 en

medio de cultivo, que se cultivaron como se ha descrito anteriormente, se extrajo por extraccin
lquido-lquido (LLE). Brevemente, el caldo de cultivo de hongos se filtr usando papel de filtro
de vidrio Whatman GF / A (Whatman Inc., USA) despus de la incubacin durante 7 y 14 das. A
continuacin, se mezclaron 1 ml de filtrado y 3 ml de acetato de etilo mediante agitacin en
vrtex durante 30 segundos.

Despus del desarrollo, se retir la placa de TLC del tanque, se sec a temperatura ambiente y
se ilumin bajo luz UV a = 365 nm en una cmara oscura (Chambre Noires darkroom, Vilber
Lourmat, Francia) [32 - 34].

TLC

La TLC es uno de los mtodos tradicionales de deteccin de micotoxinas. Esta tcnica permite la
deteccin de gran nmero de muestras, fcil identificacin y es rentable. Una capa de gel de
slice es la ms comnmente usada; Sin embargo, tambin se han utilizado fenilo no polar,
silanizado y poliamida (Lin et al., 1998). Las micotoxinas se visualizan en la placa de TLC
observando bajo luz UV o pulverizando productos qumicos que reaccionan con micotoxinas y
aumentan la fluorescencia o producen productos de color (Betina 1985). Las aflatoxinas, la
citrinina y la ochatoxina son compuestos fluorescentes naturales; Por lo tanto, se identifican
basndose en sus propiedades fluorescentes. Por ejemplo, las aflatoxinas B y G se diferencian
por fluorescencia azul y verde, respectivamente, mientras que la citrinina se identifica por
fluorescencia amarilla (Betina 1985). Las aflatoxinas se han identificado mediante confirmacin
qumica por pulverizacin de cido trifluoroactico y cido sulfrico en la placa de TLC (Stack y
Pohland 1975). Serralheiro y Quinta (1985) han informado de que la pulverizacin de cido
sulfrico mejora el lmite de deteccin de la aflatoxina M1 de 0,5 g / kg a 0,3 g / kg. El anlisis
semi-cuantitativo se ha llevado a cabo para las micotoxinas por TLC; Sin embargo, el mtodo
tiene baja sensibilidad. El mtodo de TLC se ha mejorado en la cromatografa de capa fina de
alto rendimiento (HPTLC) para mejorar la resolucin y precisin. El HPTLC se ha utilizado para
determinar las aflatoxinas en los productos de cacahuete y se ha demostrado que es equivalente
a la cromatografa lquida en precisin, precisin y sensibilidad (Tosch et al., 1984).

Identificacin de Aislamientos Fngicos

Para la identificacin morfolgica, se inocularon hongos en el PDA y se incubaron a 25C durante

5 das. Para identificar los aislados fngicos en el nivel de gnero, se observaron morfologas de
colonias y microscpicas. Para la identificacin molecular, se inocularon esporas de hongos
(105) en un caldo de dextrosa de patata (PDB) y se incubaron a 25C durante 48 h. Despus de
que los micelios fngicos se recogieron de los medios, el ADN cromosmico total se extrajo
utilizando un HiGene Genomic DNA Prep Kit (BIOFACT, Corea).

La regin beta-tubulina se seleccion para la identificacin molecular y la PCR se realiz con dos
cebadores especficos.
Debido a su alta sensibilidad, su especificidad y rapidez, la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) es el mtodo de eleccin para este propsito (Figura 2). La PCR es un mtodo in vitro para
amplificar selectivamente secuencias de ADN de longitud definida. Esto se realiza mediante 25
a 40 ciclos repetitivos de desnaturalizacin por calor, alineacion del cebador y extensin del
cebador enzimtico; Generando as miles de millones de copias de la secuencia de ADN entre
los sitios de unin del cebador.

La tcnica de la PCR se basa en provocar la elaboracin de copias de determinadas regiones del

genoma (totalidad del DNA de un individuo), que se denominan secuencias diana, Este proceso
se denomina amplificacin. El principio de esta tcnica se muestra grficamente en la Fig. 3, e
incluye tres etapas caracterizadas, cada una de ellas, por una temperatura determinadas.
a.- DESNATURALIZACiN DEL DNA.- Separacin, a alta temperatura (superior a los 90C), de las
dos cadenas de la doble hlice. El aumento de la temperatura intensifica la agitacin de las
molculas, con lo que stas se rompen por sus enlaces ms dbiles (los puentes de hidrgeno)
con lo que se separan las dos cadenas de la doble hlice. En un DNA totalmente desnaturalizado
todas las cadenas son simples.
b.- HIBRlDACIN DE LOS INICIADORES.- Los iniciadores ("primers") son pequeas cadenas de
DNA de cadena simple (tpicamente de unos 15 a 30 nucletidos) que han sido diseados para
unirse por complementariedad de bases a determinadas zonas del genoma. Este proceso se
denomina hibridacin. Nonnalmente se utilizan dos iniciadores que se hibridan a los extremos de
la secuencia diana y que son complementarios, cada uno de ellos, a uno de los dos filamentos.
La hibridacin se lleva a cabo disminuyendo rpidamente la temperatura de la mezcla. Al
disminuir la temperatura, las cadenas complementarias tenderan a reasociarse, pero debido a
la elevada concentracin de los iniciadores aadidos a la mezcla de la reaccin, la formacin de
complejos DNA-molde e iniciadores se ve favorecida respecto a la reasociacin de las cadenas
sencillas.
C.- EXTENSiN DE INlCIADORES.- Mediante la accin de una polimerasa de DNA, se consigue que
el extremo 3'-OH de cada iniciador aumente su longitud utilizando como molde el DNA original
y, como materiales de construccin, los cuatro nucletidos trifosfato. Desde 1989 se utiliza, para
esta etapa, una polimerasa que proviene de la arqueobacteria tennfila Thermus aqualicus
(Taqpolimerasa) capaz de soportar una y otra vez las altas temperaturas necesarias para la
desnaturalizacin, lo que evita tener que aadir nueva polimerasa en cada ciclo de la
amplificacin. Por esta razn, la polimerizacin se realiza a 72C, que es la temperatura ptima
de funcionamiento de la Taq-polimerasa. En esta etapa, es crtica la concentracin de Mg -1+,
un catin decisivo para el correcto funcionamiento de la enzima. Esta serie de etapas o ciclo
elemental se repite sucesivamente entre 20 y 40 veces.

Proceso:

La mezcla de reaccin contiene la secuencia de DNA que se quiere amplificar,

dos oligonucletidos sintticos (P1 y P2) que servirn como cebadores, una
DNA polimerasa termoestable (Taq) y los cuatro desoxirribonucletidos
trifosfato dATP, dGTP, dCTP y dTTP.

La mezcla de reaccin se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de
desnaturalizacin, una de hibridacin o alineacin y una de elongacin.

a) Durante la desnaturalizacin, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95C, se separan

las dos cadenas del ADN molde.

b) Durante la hibridacin, la temperatura de incubacin se reduce para permitir el apareamiento

de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria.

c) Durante la fase de elongacin, la mezcla se calienta a 72C y la enzima Taq ADN polimerasa
se usa para replicar las hebras de DNA. La Taq polimerasa comienza el proceso de extensin de
la cadena complementaria a partir del extremo 3 de los cebadores. Al finalizar cada ciclo, la
cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble.

Prueba de produccin de aflatoxinas por aislados de hongos

Con el fin de determinar si la aflatoxina es producida o no por los aislamientos de A. oryzae, se

realizaron anlisis moleculares a nivel de ADN y anlisis de produccin por cultivos fngicos.
Para el anlisis molecular de la aflatoxigenicidad, el anlisis gentico de 17 genes en la va
biosinttica aflatoxina se llev a cabo de acuerdo con Tao y Chung [36]. Para el ensayo de
produccin de aflatoxinas, se utilizaron medios de extracto de levadura-sacarosa (medio YES:
extracto de levadura al 2%, sacarosa al 20%) [39] y medios SC. La cantidad de aflatoxinas en el
medio de cultivo se analiz por HPLC despus de LLE.

La cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)

HPLC proporciona mayor precisin y precisin en la determinacin de micotoxinas. La HPLC de
fase inversa y normal se utiliza con una variedad de sistemas de deteccin. Los detectores UV y
de fluorescencia son los ms utilizados. Pons y Franz (1978) informaron de una deteccin precisa
y sensible de todas las aflatoxinas a niveles de 0,3-1 g / kg, mientras que las aflatoxinas B1 y
B2 fueron detectadas por un detector de UV a 360-365 nm y G1 y G2 por fluorescencia. Akiyama
et al. (1998) detectaron micotoxinas no fluorescentes, fumonisinas, mediante la derivatizacin
post-columna de o-ptalaldehdo y luego la deteccin por detector de fluorescencia. El lmite de
deteccin de la fumonisina por este mtodo se inform que era de 10 g / kg de maz. La
ocratoxina A en el vino ha sido detectada con precisin por HPLC despus de la limpieza por
inmunoafinidad con un lmite de deteccin de 0,01 ng / ml (Visconti et al., 1999). HPLC con
detector de fluorescencia se ha utilizado para detectar la aflatoxina B1, la citrinina y la
ocratoxina en el arroz, y un lmite de deteccin de 0.07, 0.11 y 0.08 g / kg, respectivamente,
para estas micotoxinas fue informado por Nguyen et al. (2007).

METODO LLE - Extraccin lquido-lquido

La extraccin (separacin) lquido-lquido, tambin conocida como extraccin con solventes o
extraccin con disolventes, es un proceso qumico empleado para separar una mezcla de lquidos
aprovechando la diferencia de solubilidad de sus componentes entre dos lquidos inmiscibles o
parcialmente miscibles (por ejemplo, agua y cloroformo, o ter etlico y agua).

En la extraccin lquido-lquido se extrae del seno de un lquido A una sustancia (soluto) poniendo
A en contacto con otro lquido B, inmiscible o parcialmente miscible con A, que tiene mayor
afinidad por el soluto, pasando la sustancia del seno del lquido A al seno de B.

Con esta operacin se busca concentrar un analito o bien separarlo de una matriz compleja o
con interferentes.

AFB1 Anlisis de biodegradacin por HPLC

Para el anlisis cuantitativo de la biodegradacin de AFB1, los medios de cultivo fngicos se

tomaron a los 0, 1, 3, 5, 7, 10 y 14 das en triplicados. Despus de que el medio de cultivo se
filtr a travs de un filtro de microfibra de vidrio (GF / A, Whatman Inc.), se extrajo AFB1 de 1
ml de filtrado con 3 ml de acetato de etilo mediante LLE como se ha descrito anteriormente.
Para el ensayo de unin micelial AFB1, se recogieron los micelios de A. oryzae MAO 103 y MAO
104 de cultivos de 7 das y 14 das y se secaron, y la toxina se extrajo con 10 ml de acetato de
etilo.

Para la derivatizacin de AFB1, se us cido trifluoroactico (TFA, Sigma-Aldrich, EE.UU.) como

agente de marcaje. Las muestras de cultivo secas se trataron con 1 ml de TFA-acetonitrilo al 10%
(10:90 (v / v)) y se mezclaron mediante un mezclador vrtice (Fisher Scientific, EE.UU.) durante
30 segundos. La mezcla se coloc en la oscuridad durante 3 h, y luego se filtr a travs de un
filtro de jeringa (13 mm x 0,2 \ mu m, GHP). La mezcla patrn AFB1 tambin se derivatiz con
TFA usando el mismo procedimiento.

La determinacin de AFB1 se llev a cabo utilizando un detector de fluorescencia con 360 nm y

440 nm para la excitacin y la emisin, respectivamente [30, 40].
Como las aflatoxinas B1 y G1 muestran una fluorescencia natural dbil, este mtodo emplea la
reaccin de ellas con cido trifluoroactico (TFA) para convertirlas en las aflatoxinas hidrxi-
derivadas B2a y G2a, respectivamente. Con esto se busca aumentar su intensidad de
fluorescencia para el anlisis. Las aflatoxinas B2 yG2 no reaccionan con el TFA.

Prueba Ames (finalidad)

Se utilizaron cepas de Salmonella typhimurium TA98 (CCARM 0272) y TA100 (CCARM 0273)
como cepas de ensayo.

https://books.google.com.ec/books?id=vwB0fgirgN0C&pg=PA363&lpg=PA363&dq=PRUEBA+DE+AMES+
aflatoxinas&source=bl&ots=xZodE5oizl&sig=SoG9CGZUdhkyF5OVoSJOtwH7Aqc&hl=es-
419&sa=X&ved=0ahUKEwjm3YeL2MHVAhVRziYKHSnTBYoQ6AEISDAG#v=onepage&q=PRUEBA%20DE%2
0AMES%20aflatoxinas&f=false

En la actualidad se emprenden trabajos dirigidos a inhibir los efectos mutagnicos de las

aflatoxinas, incluso se han llegado a postular algunos mecanismos de antimutagenicidad. Estos
avances sugieren grandes perspectivas en la lucha por la reduccin de la incidencia del cncer
causado por la exposicin a dichas sustancias.

El ensayo de reversin en Salmonella typhymurium es una de las pruebas ms usadas en la

actualidad para medir dao gentico inducido por agentes qumicos. Este consiste en el empleo
de cepas de dicha bacteria que son auxtrofas para la histidina, pero que en presencia de un
agente mutagnico revierten hacia la prototrofia para este aminocido como consecuencia de
una accin mutagnica. Dado que el ensayo se realiza en un medio selectivo, slo se
multiplicarn las clulas que puedan sintetizar la histidina, dando lugar a la formacin de
colonias llamadas revertantes. Si en los tratamientos se aade adems un agente que reduzca
la accin del mutgeno, el nmero de colonias revertantes disminuir proporcionalmente a la
potencia antimutagnica de dicho agente.
AFB1 Produccin de A. flavus M 2034 Co-cultivado con AFB1- Biodegradacin de A. oryzae en
medio a base de soja.

Cada AFB1 biodegarding A. oryzae aislamiento o A. oryzae KACC 46464 fue co-cultivado con
aflatoxignica A. flavus M 2034 (aislado de meju) [42] en soja a base de medios. Cada cepa de
A. oryzae se inocul en el lado derecho de la placa y A. flavus M 2034 en el lado izquierdo y se
incub durante 7 das. La cantidad de AFB1 producido por A. flavus M 2034 en el medio a base
de soja se analiz por HPLC despus de la extraccin. Cada experimento se realiz por triplicado.

Tabla 1. Nmero y frecuencia de aislamientos fngicos del men

Muestras.
Frequency
Fungal species Number (%)
Aspergillus section
Flavi 47 35.1
Aspergillus section
Nigri 6 4.5
Other Aspergillus sp. 25 18.7
 Penicillium sp. 20 14.9
Mucor sp. 27 20.1
Unknown 9 6.7
Total 134 100
The fungal strains were obtained from DRBC agar plates, transferred onto PDA plates, and incubated for
5 days at 25oC. Los resultados se consideraron significativos cuando los valores de p fueron <0,05.Las
pruebas de comparacin mltiple de Tukey se utilizaron cuando se encontr la diferencia. Los anlisis
estadsticos fueron Realizado con el software SPSS (SPSS, USA).