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Revista Mexicana de Fitopatología ISSN: 0185-3309 mrlegarreta@prodigy.net.mx Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C.

Revista Mexicana de Fitopatología

ISSN: 0185-3309 mrlegarreta@prodigy.net.mx Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. México

Martínez Espinoza, Alfredo Dick; Ruiz Herrera, José; Gold, Scott E. Las Vías de Transducción de Señales en la Patogénesis y la Morfogénesis de Hongos: los Casos de Ustilago maydis y Magnaporthe grisea Revista Mexicana de Fitopatología, vol. 18, núm. 1, enero-junio, 2000, pp. 55- 60 Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. Texcoco, México

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=61218108
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Revista Mexicana de FITOPATOLOGIA/55

Las Vías de Transducción de Señales en la Patogénesis y la Morfogénesis de Hongos: Los Casos de Ustilago maydis y Magnaporthe grisea

Alfredo Dick Martínez-Espinoza, José Ruiz-Herrera, . Departamento de Ingeniería Genética de Plantas, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados Unidad Irapuato, Irapuato Guanajuato, México CP 36500; y Scott E. Gold, Department of Plant Pathology, University of Georgia, Athens, Georgia, EUA 30602. Correspondencia: sgold@arches.uga.edu

(Recibido: Febrero 11, 2000 Aceptado: Junio 27, 2000)

Resumen. La visión clásica de los procesos patogénico- invasivos, es que los hongos fitopatógenos poseen una serie de estrategias como son el cambio de forma, el desarrollo de fuerzas mecánicas ejercidas contra la epidermis de los huéspedes, la produción de enzimas que desintegran los componentes estructurales de la planta o la produción de toxinas que alteran el metabolismo del huésped. Sin embargo, recientemente los conceptos de virulencia, patogénesis y morfogénesis en los hongos se han expandido para involucrar otros fenómenos, entre los que se puede destacar la transducción de señales. Este proceso permite que el hongo responda ante los estímulos provenientes del huésped y del medio ambiente y que se manifiestan a nivel de morfogénesis y diferenciación celular. Recientemente se ha acumulado una cantidad importante de información que revela la importancia de las vías de transducción de señales en la morfogénesis, patogénesis y virulencia de los hongos fitopatógenos. Se describen dos ejemplos donde se ha colectado información crucial de la función de algunos de los componentes de estas vías en la morfogénesis y la patogenicidad.

Palabras clave adicionales: Proteínas cinasas, AMPc, hongos fitopatógenos, virulencia, diferenciación celular

Abstract. The classic vision of invasive-pathogenic processes is that phytopathogenic fungi have developed a series of strategies including morphogenesis change, mechanical forces exerted against the wall of the hosts, production of enzymes that degrade the structural components of the plant and the production of toxins which alter the metabolism of the host. However, recently the concepts of virulence, pathogenesis and morphogenesis in fungi have expanded to involve other phenomena, like signal transduction. This process allows the fungus to respond to stimuli coming from the host and the environment the result of which may be seen at the level of morphogenesis and cell differentiation. Recently, significant information has acumulated which reveals the importance of signal transduction in morphogenesis, pathogenicity and virulence

of phytopathogenic fungi. Here, two examples where information regarding the role of signal tranduction components is crucial to morphogenesis and pathogenicity, are described.

Additional keywords: MAP kinases, cAMP, phytopathogenic fungi, virulence, cellular diferentiation.

Los hongos fitopatógenos han desarrollado una variedad de procesos para reconocer sus huéspedes susceptibles, para penetrar las barreras físicas de los mismos, para sobreponerse a las defensas de las plantas, y para poder sobrevivir de las substancias producidas por ellas. Una vez que reúnen estos requisitos, son capaces de proliferar dentro de los tejidos invadidos, multiplicarse, y finalmente dispersarse (Agrios, 1988). La visión clásica de estos procesos patogénico- invasivos, es que los hongos fitopatógenos poseen una serie de estrategias, como son el desarrollo de fuerzas mecánicas ejercidas contra la epidermis de los huéspedes, la produción de enzimas que desintegran los componentes estructurales de la planta y degradan substancias de las mismas formando productos que utilizan en su propia nutrición, la produción de toxinas que alteran el metabolismo del huésped, al grado de matarlo, la síntesis de reguladores de crecimiento que ejercen efectos hormonales en el organismo parasitado, y la formación de polisacáridos que afectan la translocación de agua y nutrientes. Todo ello, para obtener nutrimentos y desarrollarse (Agrios, 1988). Sin embargo, recientemente el concepto de virulencia, patogénesis y morfogénesis en los hongos se ha expandido para involucrar otros fenómenos, entre los que destaca la transducción de señales. Este proceso permite que el hongo responda ante los estímulos provenientes del huésped. Ademas, estos mecanismos participan en otros fenómenos por medio de los cuales los hongos reaccionan a los estímulos del medio ambiente y que se manifiestan a nivel de morfogénesis y diferenciación (Kronstad, 1997; Banuett, 1998). Existen dos vías principales de transducción de señales adecuadamente documentadas. Una es la cascada de señales que involucra al adenosin-

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monofosfato cíclico (AMPc), y la otra, el módulo de proteínas cinasas normalmente conocidas por su acrónimo en inglés MAPK (mitogen-activated protein kinases) (Kronstad, 1997). Transducción de señales a través del AMP cíclico. La vía de

transducción de señales en la que participa el AMPc, involucra un receptor en la superficie de la célula que responde

a las señales extracelulares. Este receptor usualmente está

unido a una proteína G con actividad de GTPasa, la cual puede

ser heterotrimérica o monomérica de bajo peso molecular. Ésta

a su vez, modula la actividad de la adenilato ciclasa. La

actividad de esta enzima produce el segundo mensajero llamado AMPc, el cual controla la actividad de las proteínas cinasas dependientes del AMPc (PKA). La unión del AMPc

a la subunidad regulatoria de la PKA produce su disociación

de la subunidad catalítica, y consecuentemente la activacion de ésta, la cual se manifiesta en fosforílación de proteínas blanco que pueden ser factores de trascripción específicos, enzimas metabólicas, etc. (Fig. 1) (Kronstad, 1997). Módulo de la cascada de las proteínas cinasas MAPK. Esta cascada es un elemento esencial que interviene en la respuesta de la célula ante señales provenientes de la superficie. Existen tres clases de proteínas cinasas conservadas que constituyen

este módulo. La llamada MAPK también conocida como cinasa regulada extracelularmente (ERK), o MAPK (regulada por mitógeno), MAPKK o MAPK cinasa, y MAPKKK (MAPK cinasa cinasa). El funcionamiento de este módulo ocurre a través de una activación secuencial de estas cinasas mediante una fosforilación específica. La MAPK se fosforila por medio de la MAPKK en sitios serina/treonina/tirosina. Ésta a su vez se activa por medio de fosforilación, en sitios serina/treonina por medio de la MAPKKK. Esta última es activada por una señal externa, usualmente percibida por un receptor transmembranal, en una reacción en la que interviene una proteína G heterotrimérica (Fig. 2) (Banuett, 1998). AMPc y MAP Cinasas en la patogénesis y el dimorfismo en Ustilago maydis. El hongo basidiomiceto Ustilago maydis (DC.) Cda. es el patógeno causante del carbón común en el maíz (Zea mays L.). Probablemente originario de Mesoamérica de donde es nativo su huésped, tiene actualmente una distribución mundial, probablemente porque ha acompañado al maíz durante su exportación al resto del planeta. En su fase saprofítica, el hongo crece en forma de levaduras haploides (también llamados esporidios) que se reproducen por gemación. El apareamiento de cepas compatibles da lugar a la

EFECTOR

El apareamiento de cepas compatibles da lugar a la EFECTOR Receptor γ β α Proteína G
Receptor γ β α
Receptor
γ
β
α

Proteína G

Membrana Plasmática

Receptor γ β α Proteína G Membrana Plasmática ADENILATO CICLASA CITOPLASMA ATP cAMP cAMP rPKA

ADENILATO CICLASA

CITOPLASMA

G Membrana Plasmática ADENILATO CICLASA CITOPLASMA ATP cAMP cAMP rPKA rPKA AMPc Unido

ATP

cAMP
cAMP
cAMP
cAMP
rPKA
rPKA
rPKA
rPKA

AMPc Unido

a Subunidad

Regulatoria

cPKA
cPKA
cPKA
cPKA

Subunidad Catalítica Activa

Genes Blanco

P
P
cAMP
cAMP

Subunidad Regulatoria

rPKA rPKA cPKA cPKA Proteína CINASA dependiente de AMPc
rPKA
rPKA
cPKA
cPKA
Proteína CINASA
dependiente de AMPc
cAMP
cAMP

Subunidad Catalítica

Genes Blanco

dependiente de AMPc cAMP Subunidad Catalítica Genes Blanco Figura 1. Transducción de señales a través del

Figura 1. Transducción de señales a través del AMP cíclico.

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EFECTOR

Receptor Membrana Plasmática CITOPLASMA γ RAS y/o β Proteína G α
Receptor
Membrana Plasmática
CITOPLASMA
γ
RAS
y/o
β
Proteína G
α
Plasmática CITOPLASMA γ RAS y/o β Proteína G α Factor de Transcripción MAPKKK Módulo de MAPKK
Plasmática CITOPLASMA γ RAS y/o β Proteína G α Factor de Transcripción MAPKKK Módulo de MAPKK
Plasmática CITOPLASMA γ RAS y/o β Proteína G α Factor de Transcripción MAPKKK Módulo de MAPKK
Plasmática CITOPLASMA γ RAS y/o β Proteína G α Factor de Transcripción MAPKKK Módulo de MAPKK
Plasmática CITOPLASMA γ RAS y/o β Proteína G α Factor de Transcripción MAPKKK Módulo de MAPKK
Plasmática CITOPLASMA γ RAS y/o β Proteína G α Factor de Transcripción MAPKKK Módulo de MAPKK

Factor de Transcripción

γ RAS y/o β Proteína G α Factor de Transcripción MAPKKK Módulo de MAPKK las MAP
MAPKKK Módulo de MAPKK las MAP CINASAS MAPK Genes Específicos
MAPKKK
Módulo de
MAPKK
las MAP
CINASAS
MAPK
Genes Específicos
de MAPKK las MAP CINASAS MAPK Genes Específicos Genes de virulencia, patogénesis, morfogénesis, etc.

Genes de virulencia, patogénesis, morfogénesis, etc.

Figura 2. Transducción de señales a través del módulo de las proteínas cinasas.

formación de un micelio dicariótico, el cual es capaz de invadir la planta. En el interior de la célula, el micelio crece extensivamente, y finalmente produce teliosporas de color negro, las cuales constituyen el estadío diploide del hongo, y llenan los tumores que se desarrollan en la planta durante la infección. Al ser liberadas y caer en un medio favorable, las teliosporas germinan con formación del llamado promicelio, en el cual ocurre la meiosis, dando lugar a las basidiosporas las cuales se multiplican por gemación, completando así el ciclo de vida (Ruiz-Herrera y Martínez-Espinoza, 1998; Martínez-Espinoza y Ruiz-Herrera, 1998). La conjugación y la transición dimórfica de levadura a micelio en U. maydis, se regula a través de los loci de apareamiento denominados a y b. El locus a está involucrado en el reconocimiento célula- célula (Bolker et al., 1992), la conjugación y el mantenimiento del crecimiento micelial (Banuett y Herskowitz, 1989). El locus a existe en la naturaleza como dos idiomorfos, los cuales ocupan el mismo lugar en el cromosoma pero poseen una secuencia nucleotidíca diferente (a1 y a2 ). Cada idiomorfo posee dos marcos abiertos de lectura (acrónimo en inglés ORF’s) que codifican respectivamente una feromona, y el

receptor de la feromona producida por la cepa compatible (Bolker et al., 1992). El locus b regula las etapas del desarrollo sexual que ocurren después de la fusión de las cepas haploides. El locus b es más complejo que el a, existiendo más de 25 alelos en la naturaleza. Cada uno de estos alelos posee dos marcos abiertos de lectura que se transcriben en dirección opuesta, correspondientes a los genes bE y bW. La presencia de diferentes alelos a y b, es un pre-requisito para que ocurra el apareamiento, y para iniciar el crecimiento miceliar y la formación de tumores (Gillisen et al., 1992; Schulz et al., 1990; Ruiz-Herrera y Martínez-Espinoza, 1998; Martínez- Espinoza y Ruiz-Herrera, 1998). La respuesta morfogenética a las feromonas (apareamiento), depende de las vías de transducción de señales de las MAP cinasas y del AMPc, existiendo una interrelación entre ambas vías. El descubrimiento del papel del AMPc en la virulencia y el dimorfismo en U. maydis, se originó a partir del aislamiento de mutantes haploides que presentaban un fenotipo micelial constitutivo, muy parecido a aquél que se forma posteriormente al proceso de apareamiento (Gold et al., 1994; Barret et al., 1993). Se demostró que estas mutantes estaban

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afectadas en el gen que codifíca para la adenilato ciclasa

respectivamente. Los genes son requeridos para el

(uac1) (Gold et al., 1994). La adición de AMPc exógeno al medio de cultivo restauraba el fenotipo levaduriforme de las mutantes, y al mismo tiempo alteraba el sitio de gemación y la separación de la célula hija (citocinesis). Las mutantes afectadas en la adenilato ciclasa son avirulentas, no inducen

crecimiento micelial y actúan como factores de virulencia (Mayorga y Gold, 1998; Mayorga y Gold, 1999, Gold et al., resultados no publicados ). La colección de todos estos resultados indican que la transducción de señales a través de las vías del AMPc y las MAPK son absolutamente

la

formación de antocianinas ni tumores en plántulas de maíz.

requeridas para la morfogénesis y la patogénesis de U. maydis.

Estos datos son evidencia de que la vía de la tranducción de señales mediada por el AMPc es indispensable para el proceso de infección (Gold et al., 1994). Mediante el análisis de supresores del fenotipo micelial de las mutantes uac1, se identificaron cerca de 150 mutantes capaces de revertir el crecimiento micelial, las cuales se denominaron mutantes ubc. Una de ellas identifica un gen, que se denomina como ubc1, y el cual codifíca para la subunidad regulatoria de la proteína cinasa A (PKA). La actividad de este gen se requiere para eventos normales de miceliación después del apareamiento y para la respuesta a factores ambientales (Gold

El papel de la transducción de señales en la formación del apresorio, la penetración, el crecimiento y la patogenesis en Magnaporthe grisea. La enfermedad denominada como “quema del arroz” es producida por el hongo Magnaporthe grisea (Hebert) Barr (estado asexual, Pyricularia grisea Sacc.), siendo una de las enfermedades más devastadoras en todas las áreas productoras de arroz (Oryza sativa L.) en el mundo (Agrios, 1988). Además, al igual que en el caso de U. maydis, M. grisea ha sido usado como modelo en numerosos estudios relacionados con la interacción planta-patógeno. La infección ocurre después de llevarse a cabo una serie de

et al., 1994). El gen ubc1 es también importante en el progreso normal de la enfermedad (Gold et al., 1997), ya que mutantes ubc1 colonizan parcialmente la planta, pero no son capaces

eventos regulados en forma compleja. Este proceso es iniciado por la adhesión de los conidios a la superficie de la planta, proceso en el que intervienen proteínas y compuestos

de

producir agallas. Estos resultados sugieren que se requiere

adhesivos producidos por el hongo. Después de este evento,

una regulación apropiada de la PKA para la infección, así como para transmitir las señales que inducen el desarrollo de los tumores. Recientemente se han aislado dos genes que codifícan elementos involucrados en la vía de AMPc; estos son los que codifícan a las subunidades catalíticas que parecen ser dos PKA diferentes, que han sido denominados como adr1 y ukc1. La inactivación de uno u otro gen tuvo

se produce un tubo germinal. Esta germinación ocurre selectivamente en la superficie del huésped específico, sugiriendo un proceso de reconocimiento del mismo. Inmediatamente después, cesa el crecimiento polarizado del tubo germinativo y se produce en su extremo, la formación de una estructura altamente melanizada y lobular, denominada apresorio. La presión hidrostática dentro del apresorio

efectos muy diferentes. Mientras que las mutantes adr1 son avirulentas y crecen constitutivamente como micelio; la inactivación del gen ukc1 no tuvo efecto alguno en la morfología y patogénesis de U. maydis (Durrenberger et al., 1998). Tomando ventaja de un procedimiento desarrollado

incrementa y esto ayuda a la penetración de la hifa en los tejidos de la planta. Los mecanismos que regulan el inicio y la formación del apresorio han sido estudiados intensamente (Lee y Dean, 1993; 1994). La hidrofobicidad, la dureza, así como la presencia de cutina en la superficie de la planta han

para inducir la transición dimórfica (Ruiz-Herrera et al., 1995),

sido implicados como los primeros factores ambientales que

se aislaron mutantes que son incapaces de crecer como micelio

inducen la formación del apresorio. Se ha demostrado que el

a pH ácido (mutantes myc-). La caracterización del

AMPc tiene también una función importante en la formación

comportamiento patogénico de las mutantes en plántulas de maíz reveló que las mutaciones recesivas en patogénesis lo fueron también para la morfogénesis in vitro (es decir son monomórficas y no patogénicas). Estos resultados conducen a concluir que algunos genes afectados en los mutantes myc-

de estas estructuras (Lee y Dean, 1993), habiéndose demostrado que la adición de AMPc induce la formación de apresorios en ausencia de la planta. Otros compuestos como el AMP y el ATP no indujeron la formación de estas estructuras (Lee y Dean, 1993). En relación con este papel,

se

encuentran involucrados tanto en el dimorfismo como en

Mitchell y Dean (1995) aislaron e inactivaron el gen

la

patogenicidad, estableciendo una correlación directa entre

denominado cpka que codifíca la subunidad catalítica de la

estos dos procesos (Martinez-Espinoza et al., 1997). La miceliación por efecto del pH ácido sigue la vía de la transducción de señales de las MAP cinasas y AMPc tiene un efecto en esta reacción (Martinez-Espinoza, et al., resultados no publicados). En nuestro laboratorio se han aislado 4 genes, ubc2, ubc3, ubc4 y ubc5. ubc2 codifíca una proteína que posee caracteristicas estructurales de proteína ancla y al parecer es miembro del módulo de las MAP cinasas (Gold et al., resultados no publicados). Los últimos 3 genes codifícan para los diferentes componentes del módulo de las proteínas cinasas, MAPK, MAPKKK y MAPKK,

proteína cinasa A (PKA), observando que las mutantes correspondientes no formaban apresorios en superficies hidrofóbicas y eran incapaces de penetrar en las plantas de arroz. La adición de AMPc exógeno era incapaz de promover la formación de apresorios. Así mismo Choi y Dean (1997) clonaron e inactivaron el gen de la adenilato ciclasa en M. grisea. Su inactivación derivó en un crecimiento vegetativo reducido, una conidiación también reducida y una magra germinación de los conidios. Las mutantes afectadas en este gen son incapaces de invadir plantas de arroz susceptibles son estériles y no producen peritecios. Al agregar AMPc

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exógenamente, la formación de apresorios se restablece a niveles normales (Choi y Dean, 1997). Una evidencia adicional del papel del AMPc en la patogénesis y la morfogénesis de M. grisea viene de la caracterización del gen mpg1, que codifíca una hidrofobina involucrada en la adhesión de los conidios a la superficie de la planta. Mutantes en este gen son deficientes en la formación de apresorios, y la adición de AMPc restaura la capacidad de producir apresorios a niveles semejantes a los de las cepas silvestres (Beckerman y Ebbole, 1996). Se ha visto también que la señalización a través del módulo de las MAP cinasas es importante en la patogénesis y morfogénesis de M. grisea. El gen pmk1 codifíca a una MAP cinasa y es esencial para la formación y maduración del apresorio, así como para el crecimiento invasivo dentro de la planta de arroz (Xu y Hamer, 1996). Sin embargo pmk1 no está involucrado en las etapas tempranas de patogénesis como lo son la adhesión a las plantas y la formación y engrosamiento del tubo germinativo (Xu y Hamer, 1996). Otra MAP cinasa codificada por el gen mps1 (Xu et al., 1998) ha sido implicada en la penetración del apresorio en los tejidos de la planta. Las mutantes que carecen este gen son completamente avirulentas. Análisis más sofisticados de esta interacción indican que esta MAP cinasa se requiere para remodelar la pared celular y el citoesqueleto del apresorio. Sin embargo, las mutantes incitan respuestas tempranas de defensa de la planta (Xu et al., 1998). Estos resultados en conjunto, sugieren una acción cooperativa y entrelazada de las vías de las MAP cinasas y aquélla dependiente del AMP cíclico.

DISCUSIÓN El estudio de las vías de transducción de señales en hongos fitopatógenos ha llegado a ser una área de investigación intensa. Es predecible que esta área experimentará en el futuro una enorme acumulación de información, esto debido a la importancia que revisten y al papel que juegan en procesos tan importantes como lo son la patogénesis y la diferenciación celular. Para obtener nuevas formas de combate de enfermedades de plantas producidas por hongos que sean efectivas, duraderas y ambientalmente seguras, se debe conocer primero sus bases genéticas de la patogénesis y la morfogénesis. Al estudiar la transducción de señales en hongos se abre una serie de posibilidades para desarrollar nuevas estrategias de control. Por ejemplo, se ha encontrado que cada uno de los componentes de la MAP cinasas es indispensable para la expresión de una virulencia completa en U. maydis, por lo tanto, éstos constituyen blancos potenciales muy importantes. Es, sin embargo, de igual importancia el estudiar las interconecciones que existen entre las diferentes vías de transducciones de señales, su regulación y los diferentes componentes existentes en los diferentes hongos. Tomando en cuenta la complejidad de los genomas fúngicos y la inmensa diversidad de las especies de hongos, así como sus diferentes formas de vida, es claro que estos temas proveen campos fértiles de investigación.

Agradecimientos Agradecemos a la Dra. María D. García-Pedrajas por la revisión

y comentarios al manuscrito y a John D. Egan por sus

comentarios e información proporcionada antes de su

publicación. Este trabajo ha sido parcialmente apoyado por

el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT).

ADME y JRH son investigadores nacionales.

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